Name: Produkcja i wykorzystanie elektrod wielolufowych typu piggy-back do farmakologicznych manipulacji in vivo odpowiedziami neuronalnymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Poznaj produkcję elektrod wielolufowych typu piggy-back do jonoforezy agonistów i antagonistów neuronalnych podczas rejestracji in vivo. Ta metoda umożliwia precyzyjną manipulację mikrośrodowiskiem neuronu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez granty R01 DC 011582 (AK) oraz RO1 DC011555 (DJT).

1. Wytciąganie elektrod szklanych
<ol>
	<li>Wyciągnij elektrodę jednokanałową. Użyj jednokanałowej kapilary szklanej z włóknem i wyciągnij końcówkę do średnicy około 1-2 µm, długości trzonu 10-12 mm i odpowiadającej rezystancji elektrody około 12 MOhm (zakres 5-20 MOhm) mierzonej w 0,9% roztworze NaCl. Niższa rezystancja elektrod spowodowałaby większą aktywność tła, a tym samym większe trudności w izolowaniu aktywności jednostkowej z poszczególnych neuronów. Do wyciągania tej elektrody użyj wyciągacza poziomego lub pionowego z włóknami grzejnymi lub cewkami grzejnymi.</li>
	<li>Wyciągnij elektrodę wielokanałową. Ze względu na znacznie większą średnicę szkła wielokanałowego i potrzebę równomiernego rozkładu ciepła wokół całego wielokanału, wymagany jest wydajny wyciągacz z cewką grzejną o większej średnicy, a nie z włóknem grzejnym. Pipetę wielokanałową należy umieścić w centrum elementu grzejnego, bez kontaktu z cewką grzejną. Należy pamiętać, że poza opisanymi tutaj pipetami 5-kanałowymi, dostępne są komercyjnie alternatywy 3-kanałowe lub 7-kanałowe. Wyciągnij szkło do końcówki pipety o całkowitej średnicy około 10 µm lub mniejszej. Końcówka zostanie przełamana do właściwej średnicy w następnym kroku, więc dokładny rozmiar końcówki jest mniej istotny podczas procesu wyciągania niż ogólny kształt końcówki elektrody, która powinna być długa i stosunkowo cienka. Pożądany kształt końcówki elektrody przedstawiono na obrazie w Rysunku 1C. Krótkie i tępe kształty elektrod (Rysunek 1B) spowodują znaczne uszkodzenie tkanki podczas wprowadzania do mózgu, natomiast bardzo długie i cienkie kształty elektrod (Rysunek 1A) będą się wyginać, co utrudni przełamanie końcówki elektrody do właściwej średnicy (patrz krok 2).</li>
</ol>
2. Modyfikacja końcówek elektrod
Zanim dwie elektrody zostaną ze sobą sklejone, muszą one zostać zmodyfikowane. Trzon pojedynczej elektrody należy wygiąć przed przymocowaniem jej do elektrody wielokanałowej, aby upewnić się, że łączny trzon gotowej elektrody typu „piggy-back” będzie tak cienki, jak to możliwe. Dodatkowo należy odłamać końcówkę elektrody wielokanałowej, aby zapewnić niską rezystancję podczas jontoforezy.
<ol>
	<li>Zgiąć trzpień elektrody jednokanałowej o około 20 stopni. Należy użyć jak najmniejszego płomienia palnika Bunsena. Typowe „małe” palniki Bunsena z oferty standardowych dostawców sprzętu laboratoryjnego generują płomienie zbyt duże do tego zastosowania. Aby rozwiązać ten problem, należy użyć najmniejszego dostępnego komercyjnie palnika Bunsena, przymocować do jego górnej części igłę strzykawki (~ 18 G) i uszczelnić połączenie cementem dentystycznym. Podczas pracy płomień powinien być słabo widoczny, mieć średnicę około 5 mm lub mniej i wysokość około 8 mm. Każdy ruch powietrza w pomieszczeniu może zgasić taki płomień, dlatego zaleca się pracę w zamkniętym pomieszczeniu lub stosowanie osłon przeciwwietrznych. Przesunąć elektrodę jednokanałową przez płomień, aby zgiąć ją o około 20 stopni. Należy dążyć do tego, aby płomień palnika stopił szkło w obszarze przejścia, około 10 mm od końcówki elektrody. Aby uniknąć stopienia końcówki elektrody, sugerujemy trzymanie jej pod kątem około 45 stopni, z końcówką skierowaną w dół, i stosunkowo szybkie przesuwanie elektrody przez płomień.</li>
	<li>Odłamać końcówkę elektrody wielokanałowej. Aby zapewnić kontrolę wizualną podczas odłamywania końcówki elektrody, należy użyć mikroskopu z obiektywem minimum 10x i okularami 10x. Do pomiaru rozmiaru końcówki niezbędna będzie również skala pomiarowa umieszczona w okularze. Do mikroskopu należy przymocować kawałek pleksi w taki sposób, aby jego krawędź była widoczna w około jednej trzeciej lub połowie pola widzenia mikroskopu. W naszym przypadku fragment pleksi ma wymiary około 25 x 70 mm, grubość 5 mm i jest przymocowany za pomocą śruby wkręconej w specjalnie wykonany gwint w stoliku mikroskopu. Ważne jest, aby konstrukcja pozwalała na niezależne przesuwanie pleksi względem preparasu. Elektrodę wielokanałową należy umieść w masie plastycznej na szkiełku przedmiotowym, a następnie włożyć szkiełko z elektrodą do uchwytu w stoliku mikroskopu. Używając manipulatorów xy stolika mikroskopu, należy delikatnie przesunąć końcówkę elektrody w stronę kawałka pleksi i obserwować odłamywanie końcówki przez okulary mikroskopu. Należy dążyć do czystego odłamania końcówki elektrody wielokanałowej tak, aby jej średnica całkowita wynosiła około 25-35 µm. Należy odrzucić pipety, których końcówki odłamały się w zbyt dużym rozmiarze lub mają nierówną krawędź przełomu. Odrzucamy około 30% naszych elektrod wielokanałowych ze względu na niepożądany kształt końcówki.</li>
</ol>
3. Montaż elektrody typu piggy-back
<ol>
	<li>Ustawienie elektrod. Usuń element z pleksiglasu użyty w kroku 2.2 ze stołu mikroskopu. Zabeziecz gotową elektrodę wielokanałową w plastelinie na szkiełku przedmiotowym, tak aby końcówka była skierowana lekko ku górze. Skierowanie końcówki w górę będzie istotne w kroku 3.2 podczas sklejania dwóch elektrod. Dzięki temu klej spływa z końcówki, co zapobiega ich zaklejeniu. Włóż zgiętą elektrodę jednokanałową do uchwytu elektrody w wykonanym na zamówienie mikromanipulatorze (Rysunek 2). Opierając się najpierw na prowadzeniu wizualnym, a następnie mikroskopowym, opuść elektrodę jednokanałową na elektrodę wielokanałową. Elektroda jednokanałowa powinna zostać opuszczona bezpośrednio w zagłębienie utworzone przez układ 5 kanałów, tak aby jej końcówka wystawała poza końcówkę elektrody wielokanałowej o około 5-10 µm. Podczas opuszczania elektrody jednokanałowej uważnie obserwuj kąt tworzony między obiema elektrodami. Aby uzyskać najlepszy rezultat, unikaj kątów, w których końcówki są skierowane od siebie; zamiast tego staraj się opuścić elektrodę jednokanałową na wielokanałową idealnie równolegle lub nawet tak, aby jej końcówka najpierw dotknęła elektrody wielokanałowej, tworząc BARDZO niewielki układ w kształcie „klina”. Ponieważ końcówka jednokanałowa jest bardzo elastyczna, wygnie się ona, gdy elektroda zostanie opuszczona nieco niżej po tym, jak końcówka osiągnie górną powierzchnię elektrody wielokanałowej, tworząc czystą końcówkę kompozytową z niewielką wbudowaną sprężystością, która pomaga utrzymać końcówki razem. Jeśli jednak kąt między elektrodą jednokanałową a wielokanałową będzie zbyt stromy (zbyt duży klin), siła sprężystości będzie zbyt wysoka i wygnie układ elektrod w dół.</li>
	<li>Sklejenie trzonów elektrod. Sklej trzony obu elektrod, używając cyjanoakrylanu (superglue). Nanieś małą kroplę kleju na wąską stronę płaskiej wykałaczki i dotknij nią zespołu elektrod. Zacznij od miejsca najbardziej oddalonego od końcówek i powoli przesuwaj wykałaczkę z kroplą kleju wzdłuż trzonów w stronę końcówek elektrod. Użycie zbyt dużej ilości kleju lub naniesienie go zbyt blisko końcówek elektrod spowoduje zaklejenie otworów elektrod, co sprawi, że elektroda stanie się przynajmniej częściowo niefunkcjonalna.</li>
	<li>Stabilizacja połączenia cementem dentystycznym. Wymieszaj niewielką ilość cementu dentystycznego i akrylu dentystycznego w małym jednorazowym plastikowym naczyniu lub łódce wagażowej, używając płaskiej wykałaczki. Poczekaj, aż cement stanie się plastyczny, i nałóż niewielką ilość na połączenie między dwiema elektrodami, aby je ustabilizować (materiał różowy na Rysunku 3). Pozostaw do wyschnięcia na około 15 min.</li>
	<li>Wyjęcie i przechowywanie elektrody. Ostrożnie wyjmij gotową elektrodę typu piggy-back najpierw z uchwytu mikromanipulatora, a następnie odłącz ją od szkiełka przedmiotowego i przechowuj w pojemniku pyłoszczelnym.</li>
</ol>
4. Przygotowanie roztworów wypełniających elektrody
Przygotuj roztwory do napełnienia elektrod. Ponieważ jontoforeza wymaga cząsteczek naładowanych, większość substancji musi zostać rozpuszczona albo w środowisku kwasowym, albo zasadowym (zazwyczaj odpowiednio przy pH około 3-4 lub pH około 8-10). W Tabeli 1 wymieniono szereg substancji chemicznych często stosowanych w jontoforezie. W przypadku substancji niewymienionych w tabeli, na podstawie wartości pKa określ, czy łatwiej będzie zastosować cząsteczkę w środowisku kwasowym czy zasadowym, aby utrzymać jej ładunek, i rozpuść ją odpowiednio. Dla uzyskania najlepszych rezultatów wszystkie roztwory należy przygotowywać codziennie na świeżo.
5. Napełnianie i przygotowanie elektrod
Bezpośrednio przed użyciem elektrody, należy wypełnić każdą z kanalików odpowiednim lekiem, używając igieł z włókna węglowego o rozmiarze 28 - 34 G przymocowanych do strzykawek z filtrami strzykawkowymi. Wypełnij 4 zewnętrzne kanaliki w konfiguracji 5-kanalikowej wybranymi lekami, a kanalik centralny 3M NaCl, który będzie służył jako kanalik równoważący. Pojedynczy kanalik elektrody rejestrującej należy również wypełnić 3M NaCl. Dodanie do roztworu NaCl barwnika, takiego jak fast green lub czerwień fenolowa, ułatwi widoczność końcówki elektrody podczas jej umieszczania na powierzchni mózgu. Włóż elektrodę do uchwytu elektrody w układzie rejestrującym i wprowadź wszystkie przewody do odpowiednich szklanych kanalików. Użyj izolowanego srebrnego drutu, z którego końcówki zdjęto około 1 cm izolacji. Dla elektrody wielokanałowej powinno być 5 przewodów (4 do kanalików z lekiem i jeden do kanalika równoważącego), plus przewód wzmacniacza, który należy wprowadzić do pojedynczego kanalika elektrody rejestrującej.
6. Włącz moduły pompy do jontoforezy
Włącz moduły pompy do jontoforezy i przetestuj wszystkie cylindry. Funkcja testowania elektrod w każdym module pompy pomoże określić, czy cylinder elektrody jest sprawny. Aby zapobiec wyciekowi leków z cylindrów w czasie, gdy nie są one używane, należy zastosować napięcie zatrzymujące o polaryzacji przeciwnej do ładunku cząsteczki.

<ol><li>Curtis, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+assembly+of+%22parallel%22+micro-pipettes%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr.+Clin.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">A method for assembly of "parallel" micro-pipettes.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 24, 587-589 (1968).</li>
<li>Carette, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+of+manufacturing+multi-barrelled+micropipettes+with+projecting+recording+barrel%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr.+Clin.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">A new method of manufacturing multi-barrelled micropipettes with projecting recording barrel.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 44, 248-250 (1978).</li>
<li>Crossman, A. R., Walker, R. J., Woodruff, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Problems+associated+with+iontophoretic+studies+in+the+caudate+nucleus+and+substantia+nigra%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Problems associated with iontophoretic studies in the caudate nucleus and substantia nigra.</a> Neuropharmacology. 13, 547-552 (1974).</li>
<li>Havey, D. C., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+constructing+%22piggy-back%22+multibarrel+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr.+Clin.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">A simple technique for constructing "piggy-back" multibarrel microelectrodes.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 48, 249-251 (1980).</li>
<li>Verberne, A. J., Owens, N. C., Jackman, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+reliable+method+for+construction+of+parallel+multibarrel+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">A simple and reliable method for construction of parallel multibarrel microelectrodes.</a> Brain Res. Bull. 36, 107-108 (1995).</li>
<li>Oliver, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+contribution.+A+simple+rapid+method+for+preparing+parallel+micropipette+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr.+Clin.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Technical contribution. A simple rapid method for preparing parallel micropipette electrodes.</a> Electroencephalogr. Clin. Neurophysiol. 31, 284-286 (1971).</li>
<li>Oswald, J. P., Klug, A., Park, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaural+intensity+difference+processing+in+auditory+midbrain+neurons%3A+effects+of+a+transient+early+inhibitory+input%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interaural intensity difference processing in auditory midbrain neurons: effects of a transient early inhibitory input.</a> J. Neurosci. 19, 1149-1163 (1999).</li>
<li>Park, T. J., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+shapes+a+topographic+organization+of+response+latency+in+the+mustache+bat%27s+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA shapes a topographic organization of response latency in the mustache bat's inferior colliculus.</a> J. Neurosci. 13, 5172-5187 (1993).</li>
<li>Park, T. J., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+shapes+sensitivity+to+interaural+intensity+disparities+in+the+mustache+bat%27s+inferior+colliculus%3A+implications+for+encoding+sound+location%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA shapes sensitivity to interaural intensity disparities in the mustache bat's inferior colliculus: implications for encoding sound location.</a> J. Neurosci. 13, 2050-2067 (1993).</li>
<li>Peterson, D. C., Nataraj, K., Wenstrup, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycinergic+inhibition+creates+a+form+of+auditory+spectral+integration+in+nuclei+of+the+lateral+lemniscus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Glycinergic inhibition creates a form of auditory spectral integration in nuclei of the lateral lemniscus.</a> J. Neurophysiol. 102, 1004-1016 (2009).</li>
<li>Ramsey, L. C. B., Sinha, S. R., Hurley, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-HT1A+and+5-HT1B+receptors+differentially+modulate+rate+and+timing+of+auditory+responses+in+the+mouse+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">5-HT1A and 5-HT1B receptors differentially modulate rate and timing of auditory responses in the mouse inferior colliculus.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 368-379 (2010).</li>
<li>Wenstrup, J. J., Leroy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+Integration+in+the+Inferior+Colliculus%3A+Role+of+Glycinergic+Inhibition+in+Response+Facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spectral Integration in the Inferior Colliculus: Role of Glycinergic Inhibition in Response Facilitation.</a> J. Neurosci. 21, RC124(2001).</li>
<li>Yang, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+ipsilaterally+evoked+inhibition+in+the+dorsal+nucleus+of+the+lateral+lemniscus%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Res%22%5BJournal%5D)">Features of ipsilaterally evoked inhibition in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus.</a> Hear. Res. 122, 125-141 (1998).</li>
<li>Yang, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+and+glycine+have+different+effects+on+monaural+response+properties+in+the+dorsal+nucleus+of+the+lateral+lemniscus+of+the+mustache+bat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">GABA and glycine have different effects on monaural response properties in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus of the mustache bat.</a> J. Neurophysiol. 71, 2014-2024 (1994).</li>
<li>Yang, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+GABAergic+and+glycinergic+inhibition+on+binaural+processing+in+the+dorsal+nucleus+of+the+lateral+lemniscus+of+the+mustache+bat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">The roles of GABAergic and glycinergic inhibition on binaural processing in the dorsal nucleus of the lateral lemniscus of the mustache bat.</a> J. Neurophysiol. 71, 1999-2013 (1994).</li>
<li>Yang, L., Pollak, G. D., Resler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+circuits+sharpen+tuning+curves+and+modify+response+properties+in+the+mustache+bat+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">GABAergic circuits sharpen tuning curves and modify response properties in the mustache bat inferior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 68, 1760-1774 (1992).</li>
<li>Faingold, C. L., Gehlbach, G., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+GABA+as+an+inhibitory+neurotransmitter+in+inferior+colliculus+neurons%3A+iontophoretic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">On the role of GABA as an inhibitory neurotransmitter in inferior colliculus neurons: iontophoretic studies.</a> Brain Res. 500, 302-312 (1989).</li>
<li>Faingold, C. L., Hoffmann, W. E., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+excitant+amino+acids+on+acoustic+responses+of+inferior+colliculus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of excitant amino acids on acoustic responses of inferior colliculus neurons.</a> Hear. Res. 40, 127-136 (1989).</li>
<li>Hurley, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+shifts+first-spike+latencies+of+inferior+colliculus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serotonin shifts first-spike latencies of inferior colliculus neurons.</a> J. Neurosci. 25, 7876-7886 (2005).</li>
<li>Hurley, L., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+effects+on+frequency+tuning+of+inferior+colliculus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Serotonin effects on frequency tuning of inferior colliculus neurons.</a> J. Neurophysiol. 85, 828-842 (2001).</li>
<li>Hurley, L. M., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+differentially+modulates+responses+to+tones+and+frequency-modulated+sweeps+in+the+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serotonin differentially modulates responses to tones and frequency-modulated sweeps in the inferior colliculus.</a> J. Neurosci. 19, 8071-8082 (1999).</li>
<li>Klug, A., Bauer, E. E., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+components+of+ipsilaterally+evoked+inhibition+in+the+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Multiple components of ipsilaterally evoked inhibition in the inferior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 82, 593-610 (1999).</li>
<li>Klug, A., Park, T. J., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycine+and+GABA+influence+binaural+processing+in+the+inferior+colliculus+of+the+mustache+bat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Glycine and GABA influence binaural processing in the inferior colliculus of the mustache bat.</a> J. Neurophysiol. 74, 1701-1713 (1995).</li>
<li>Moore, M. J., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strychnine+blocks+binaural+inhibition+in+lateral+superior+olivary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Strychnine blocks binaural inhibition in lateral superior olivary neurons.</a> J. Neurosci. 3, 237-242 (1983).</li>
<li>Nataraj, K., Wenstrup, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+inhibition+in+creating+complex+auditory+responses+in+the+inferior+colliculus%3A+facilitated+combination-sensitive+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Roles of inhibition in creating complex auditory responses in the inferior colliculus: facilitated combination-sensitive neurons.</a> J. Neurophysiol. 93, 3294-3312 (2005).</li>
<li>Fukui, I., Burger, R. M., Ohmori, H., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+inhibition+sharpens+the+frequency+tuning+and+enhances+phase+locking+in+chicken+nucleus+magnocellularis+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic inhibition sharpens the frequency tuning and enhances phase locking in chicken nucleus magnocellularis neurons.</a> J. Neurosci. 30, 12075-12083 (2010).</li>
<li>Burger, R., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+inactivation+of+the+dorsal+nucleus+of+the+lateral+lemniscus+reveals+its+role+in+the+processing+of+multiple+sound+sources+in+the+inferior+colliculus+of+bats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversible inactivation of the dorsal nucleus of the lateral lemniscus reveals its role in the processing of multiple sound sources in the inferior colliculus of bats.</a> J. Neurosci. 21, 4830-4843 (2001).</li>
<li>Burger, R. M., Pollak, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+role+of+inhibition+in+shaping+responses+to+sinusoidally+amplitude-modulated+signals+in+the+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the role of inhibition in shaping responses to sinusoidally amplitude-modulated signals in the inferior colliculus.</a> J. Neurophysiol. 80, 1686-1701 (1998).</li>
<li>Coleman, W. L., Fischl, M. J., Weimann, S. R., Burger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+and+glycinergic+inhibition+modulate+monaural+auditory+response+properties+in+the+avian+superior+olivary+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">GABAergic and glycinergic inhibition modulate monaural auditory response properties in the avian superior olivary nucleus.</a> J. Neurophysiol. 105, 2405-2420 (2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Opisujemy technikę umożliwiającą manipulację mikroobwodem pojedynczego neuronu in vivo, przy jednoczesnym rejestrowaniu odpowiedzi tego neuronu podczas manipulacji eksperymentalnej. Obwody neuronalne są manipulowane poprzez jontoforetyczne podawanie agonistów i antagonistów synaptycznych. Główną zaletą jontoforezy w porównaniu z wtryskiem ciśnieniowym jest to, że jontoforeza nie wymaga fizycznego przemieszczania cieczy z elektrody do tkanki nerwowej, dzięki czemu nie ma ryzyka uszkodzenia tkanki przez przyłożone ciśnienie lub objętość cieczy. Głównym ograniczeniem tej techniki jest brak informacji o bezwzględnym stężeniu leku w tkance oraz o objętości objętej działaniem. Jednakże, ponieważ ilości środków farmakologicznych podawanych za pomocą jontoforezy są znacznie mniejsze i znacznie bardziej precyzyjnie kontrolowalne niż w przypadku wtrysku ciśnieniowego, powrót do stanu wyjściowego po podaniu leku jest zazwyczaj znacznie szybszy i pełniejszy. Mikrojontoforezę z powodzeniem stosowano w wielu systemach neuronalnych, sensorycznych i innych, a najskuteczniej znajduje ona zastosowanie w obszarach mózgu z niewielkim lub brakiem wewnętrznego przetwarzania sygnałów. Wynika to z faktu, że część podanego środka farmakologicznego może dyfundować z miejsca aplikacji do sąsiedniego neuronu i w ten sposób modyfikować właściwości odpowiedzi tego neuronu.
Oddzielne wytwarzanie elektrod jednokanałowych i wielokanałowych pozwala na łączenie elektrod o dowolnych i niezależnych właściwościach. Wyciąganie wspólnie kanałów elektrod i wykorzystywanie niektórych do rejestracji, a innych do jontoforezy, skutkowałoby powstaniem końcówek o bardzo zbliżonych właściwościach, przez co byłyby one albo zbyt duże do rejestracji z pojedynczej komórki, albo zbyt małe do aplikacji leku. Ponadto wysunięcie końcówki jednokanałowej poza końcówki elektrody wielokanałowej o około 20 µm znacznie redukuje szumy w rejestracjach i eliminuje możliwe zakłócenia efektów prądowych wynikających z prądów retencyjnych lub wyrzutowych wpływających na wyładowania neuronu 3.
Elektrody wielokanałowe typu „piggy-back” zostały po raz pierwszy opisane ponad 30 lat temu 4-6 i z dużym sukcesem wykorzystywano je do analizy obwodów neuronalnych 7-18 19-29. Zatem sama metoda per se nie jest nowatorska ani unikalna. Jednakże szczegóły przygotowania i zastosowania elektrod ulegały modyfikacjom na przestrzeni lat, a zestaw instrukcji opisany w niniejszym opracowaniu okazał się szczególnie prosty i skuteczny, a nie został szczegółowo opublikowany w innym miejscu w literaturze. W szczególności zgięcie końcówki elektrody jednokanałowej pozwala na uzyskanie relatywnie cienkiej końcówki końcowej elektrody typu piggy-back (Rysunek 3), co umożliwia rejestrację z głębokich jąder przy minimalnym uszkodzeniu mózgu; wysunięcie elektrody jednokanałowej ponad elektrodę wielokanałową eliminuje niemal wszystkie efekty prądowe, które często przywoływano jako wadę tej techniki 3. Nowe szczegóły przedstawione tutaj, takie jak skierowanie końcówki elektrody do góry podczas procesu klejenia oraz osadzenie elektrody jednokanałowej w rowku elektrody wielokanałowej, zapewnią wysoką skuteczność przy tworzeniu elektrod typu piggy-back. Technika ta jest stosunkowo łatwa i zazwyczaj może zostać opanowana przez osobę początkującą w ciągu kilku dni.

<table><tbody><tr><td>Palnik Bunsena</td><td></td><td>17928-027</td><td>&lt;silny&gt;Dostępne w&lt;/strong&gt;VWR</td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Dwuskładnikowy cement dentystyczny:&lt;/strong&gt; &quot;Utwardzanie na zimno&quot; materiał stomatologiczny</td><td>Co-oral-ite Dental Mfg. Co</td><td>525000</td><td>&lt;silny&gt;Dostępne w&lt;/strong&gt;A-M Systems, Inc.</td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Dwucomponentowy cement dentystyczny:&lt;/strong&gt; Sieciowanie materiału protetycznego Liquid Compound</td><td>Co-oral-ite Dental Mfg. Co</td><td>525000</td><td>&lt;silny&gt;Dostępne w&lt;/strong&gt;A-M Systems, Inc</td></tr><tr><td>Klej w płynie</td><td>Henkel</td><td>01-06849</td><td>&lt;silny&gt;Dostępne w&lt;/strong&gt;Loctite Super Glue</td></tr><tr><td>Urządzenie do mikrojonforezy: Neurophore BH-2</td><td>Harvard Apparatus</td><td>65-0200 &amp;amp; 65-0203</td><td>&lt;silny&gt;Dostępne w&lt;/strong&gt;Harvard Apparatus</td></tr><tr><td>Izolowany drut srebrny</td><td>AM-Systems</td><td>785500</td><td>&lt;silny&gt;Dostępne w&lt;/strong&gt;AM-Systems</td></tr><tr><td>Wyciąg poziomy</td><td>Uniwersalny dystraktor Zeitz DMZ-Universal Puller</td><td>ND</td><td>&lt;silny&gt;Dostępne w&lt;/strong&gt;AutoMate Scientific</td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Elementy mikromanipulatora:&lt;/strong&gt; uchwyt elektrody</td><td>WPI</td><td>M3301EH</td><td>&lt;silny&gt;Dostępne w&lt;/strong&gt;WPI</td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Elementy mikromanipulatora:&lt;/strong&gt; stół liniowy</td><td>Seria Newport 423</td><td>423</td><td>&lt;silny&gt;Dostępne w&lt;/strong&gt;Newport</td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Elementy mikromanipulatora:&lt;/strong&gt; stół obrotowy</td><td>Newport RSP-2</td><td>RSP-2</td><td>&lt;silny&gt;Dostępne w&lt;/strong&gt;Newport</td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Elementy mikromanipulatora:&lt;/strong&gt; z translacja</td><td>Seria Newport 433</td><td>433</td><td>&lt;silny&gt;Dostępne w&lt;/strong&gt;Newport</td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Elementy mikromanipulatora: &lt;/strong&gt;kątownik 90° &amp;deg; montaż osi Z oraz XY</td><td>Newport 360-90</td><td>360-90</td><td>&lt;silny&gt;Dostępne w&lt;/strong&gt;Newport</td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Elementy mikromanipulatora:&lt;/strong&gt; tłumaczenie osi x / stopień liniowy</td><td>Seria Newport 423</td><td>423</td><td>&lt;silny&gt;Dostępne od&lt;/strong&gt;Newport</td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Elementy mikromanipulatora:&lt;/strong&gt; przesuw przesuwu osi y / stopień liniowy</td><td>Newport 423</td><td>423</td><td>&lt;silny&gt;Dostępne w&lt;/strong&gt;Seria Newport</td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Mikroskop&lt;/strong&gt;</td><td>Leitz Laborlux 11</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Mikroskop:&lt;/strong&gt; cel</td><td>Leitz Wetzlar 10x, NA 0,25</td><td>519760</td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Mikroskop:&lt;/strong&gt; okulary**</td><td>Leitz Wetzlar, Periplan 10x/18</td><td>519748</td><td></td></tr><tr><td>&lt;silny&gt;Mikroskop: &lt;/strong&gt;etap</td><td>Leitz Wetzlar</td><td>513544</td><td></td></tr><tr><td>Kapilara wielokanałowa</td><td>N/D</td><td>612000</td><td>&lt;silny&gt;Dostępne w&lt;/strong&gt;A-M systems, Inc</td></tr><tr><td>Kapilara jednokanałowa (GC 150F-10)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0057</td><td>&lt;silny&gt;Dostępne w&lt;/strong&gt;Harvard Apparatus</td></tr><tr><td>Wyciągacz pionowy</td><td>Narishige model PE-2</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Elementy mikromanipulatora wykonane na zamówienie (zaznaczone jasnoniebieskim kolorem w &lt;silny&gt;Rycina 1&lt;/strong&gt;)</td></tr><tr><td>płyta stalowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>podstawa z funkcją przechylania</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>uchwyt do holderów elektrod</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;p class=&quot;Proszę podać treść do przetłumaczenia (tekst źródłowy z JoVE).&quot;&gt;&lt;silny&gt;Tabela 2.&lt;/strong&gt; Producenci i numery katalogowe wszystkich urządzeń i materiałów wykorzystanych w procedurze.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie i zastosowanie wielokanałowych elektrod typu „piggy-back” do farmakologicznych manipulacji odpowiedziami neuronalnymi in vivo

Manufacturing and Using Piggy-back Multibarrel Electrodes for In vivo Pharmacological Manipulations of Neural Responses

In vivo rejestracje z pojedynczych neuronów pozwalają badaczowi na analizę właściwości wyładowań neuronów, na przykład w odpowiedzi na bodźce sensoryczne. Neurony zazwyczaj otrzymują wiele pobudzających i hamujących sygnałów doprowadzających (aferentnych) i/lub odprowadzających (eferentnych), które integrują się ze sobą, a ostateczne, zmierzone właściwości odpowiedzi neuronu są kształtowane przez neuronalną integrację tych sygnałów. Aby badać przetwarzanie informacji w układach neuronalnych, konieczne jest zrozumienie różnych sygnałów wpływających na neuron lub układ neuronalny oraz specyficznych właściwości tych sygnałów. Potężną i technicznie stosunkowo prostą metodą oceny funkcjonalnej roli określonych sygnałów docierających do danego neuronu jest dynamiczne i odwracalne tłumienie lub eliminowanie tych sygnałów i mierzenie zmian w odpowiedzi wyjściowej neuronu wywołanych tą manipulacją. Można to osiągnąć poprzez farmakologiczne modyfikowanie bezpośredniego otoczenia neuronu za pomocą wielokanałowych elektrod typu „piggy-back”. Elektrody te składają się z pojedynczej elektrody rejestrującej oraz wielokanałowej elektrody do podawania leków, która może transportować do 4 różnych agonistów lub antagonistów synaptycznych. Substancje farmakologiczne mogą być podawane jontoforetycznie w wybranych momentach podczas eksperymentu, co pozwala na kontrolowane w czasie dostarczanie leków i odwracalną rekonfigurację sygnałów synaptycznych. W związku z tym farmakologiczna manipulacja mikrośrodowiskiem stanowi potężną i niezrównaną metodę testowania konkretnych hipotez dotyczących funkcji obwodów neuronalnych.
W niniejszym materiale opisujemy sposób wytwarzania elektrod typu piggy-back oraz ich zastosowanie w eksperymentach in vivo. System piggy-back pozwala badaczowi na połączenie jednokanałowej elektrody rejestrującej o dowolnych właściwościach (oporność, rozmiar końcówki, kształt itp.) z wielokanałową elektrodą do podawania leków. Stanowi to istotną przewagę nad standardowymi elektrodami wielokanałowymi, w których wszystkie kanały mają mniej więcej podobne kształty i właściwości. Elektrody wielokanałowe zostały wprowadzone ponad 40 lat temu 1-3 i przeszły szereg ulepszeń konstrukcyjnych 2,3, aż do wprowadzenia typu piggy-back w latach 80. XX wieku 4,5. Przedstawiamy tutaj zestaw istotnych ulepszeń w laboratoryjnej produkcji elektrod piggy-back, które umożliwiają głęboką penetrację mózgu w nienaruszonych preparatach zwierzęcych in vivo dzięki stosunkowo cienkiemu trzonowi elektrody, który powoduje minimalne uszkodzenia. Ponadto elektrody te charakteryzują się niskim poziomem szumów podczas rejestracji oraz niską opornością kanałów do podawania leków, co zapewnia bardzo skuteczną jontoforezę wybranych czynników farmakologicznych.

W tym eksperymencie jontoforetycznie podano hydrochlororek strychniny, który jest antagonistą receptora glicynowego. Blokowanie inhibicji glicynergicznej zazwyczaj zwiększa częstotliwość wyładowań neuronów. Rysunek 4 przedstawia przykładowe dane z neuronu słuchowego, w którym zarejestrowano odpowiedzi na sinusoidalne bodźce dźwiękowe o rosnącym natężeniu dostarczane do uszu zwierzęcia. Ten rodzaj eksperymentu określa się mianem funkcji częstotliwości wyładowań neuronu w zależności od natężenia bodźca. Głośniejsze dźwięki skutkowały wyższą częstotliwością impulsów (krzywa czarna). Początkowy prąd jontoforezy zastosowany w tym eksperymencie wynosił 15 nA. Po włączeniu prądu i ustabilizowaniu się zmian w funkcji natężenia częstotliwości wyładowań na nowym poziomie (krzywa ciemnoniebieska), prąd wypychania był stopniowo zwiększany do 30, 45 i 60 nA (odpowiednio krzywe pomarańczowa, zielona i jasnoniebieska). W każdym przypadku rejestrowano odpowiedzi neuronu w tym samym zakresie natężeń dźwięku po tym, jak zmiany w funkcjach częstotliwości wyładowań w odpowiedzi na nowy prąd wypychania uległy stabilizacji. Najbardziej odpowiednim prądem wypychania do zastosowania w tym przykładzie był prąd od 45 nA do 60 nA, ponieważ poziomy te nie zmieniały już w różny sposób odpowiedzi neuronu. Wynik ten sugeruje, że przy prądzie 45 nA wszystkie receptory glicynowe tego neuronu zostały już zablokowane przez hydrochlororek strychniny. Każdy dalszy wzrost prądu wypychania i uwolnienie jeszcze większej ilości strychniny nie skutkowało dalszą zmianą funkcji poziomu częstotliwości wyładowań neuronu. Po zakończeniu protokołu prąd wypychania został wyłączony. Powrót odpowiedzi neuronalnych do poziomu bazowego nastąpił po około 25 min (linia czerwona). W zależności od rodzaju i ilości wypchniętego leku proces ten może trwać od kilku sekund do kilkudziesięciu minut.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lek</td>
			<td>Stężenie</td>
			<td>pH roztworu</td>
			<td>Rozpuszczalnik</td>
			<td>Firma</td>
			<td>Nr kat.</td>
			<td>Typowy prąd retencyjny</td>
			<td>Typowy prąd wyrzutu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABA</td>
			<td>500 mM</td>
			<td>3.5-4.0</td>
			<td>dH2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-2129</td>
			<td>-15 nA</td>
			<td>+5 nA do +100 nA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glicyna</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>3.5-4.0</td>
			<td>dH2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-7126</td>
			<td>-15 nA</td>
			<td>+5 nA do +100 nA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jodek bikukuliny</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>3.0</td>
			<td>0.165 M NaCl w dH2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-6889</td>
			<td>-15 nA</td>
			<td>+5 nA do +60 nA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorowodorek strychniny</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>3.0</td>
			<td>0.165 M NaCl w dH2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-8753</td>
			<td>-15 nA</td>
			<td>+5 nA do +80 nA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas L-glutaminowy</td>
			<td>500 mM</td>
			<td>8.0</td>
			<td>dH2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-1251</td>
			<td>+30 nA</td>
			<td>-10 nA do -150 nA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas L-asparaginowy</td>
			<td>500 mM</td>
			<td>8.0</td>
			<td>dH2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-8949</td>
			<td>+30 nA</td>
			<td>-10 nA do -150 nA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas kainowy</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>9.0</td>
			<td>dH2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K-0250</td>
			<td>+30 nA</td>
			<td>-10 nA do -100 nA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Powszechnie stosowane leki wraz z pH rozpuszczalnika i stężeniem. Tabela zawiera najczęściej używane agoniści i antagoniści synaptyczni stosowani w jontoforezie. Wymienione środowisko pH wynika z konieczności polaryzacji tych substancji, a sugerowane stężenie uwzględnia zmienność skuteczności między różnymi lekami.
<img alt="Porównanie końcówek mikropipet; schemat przedstawiający rozmiary A, B, C dla precyzyjnej analizy laboratoryjnej." src="/files/ftp_upload/4358/4358fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Trzy pipety wielokanałowe o różnej długości końcówek. A: Końcówka tej elektrody 5-kanałowej została wyciągnięta zbyt długo i jest zbyt cienka. Zauważmy, że końcówka jest wygięta i bardzo wiotka. Taki typ końcówki jest bardzo trudny do złamania do pożądanej średnicy. B: Końcówka tej elektrody jest zbyt krótka i tępa. Podczas wprowadzania w głębsze obszary mózgu elektroda ta spowoduje niepotrzebne uszkodzenia tkanki mózgowej z powodu faktu, że staje się ona stosunkowo gruba zaledwie kilka milimetrów za końcówką. C: Przykład elektrody z prawidłowo wyciągniętą końcówką. Mimo że końcówka jest długa i cienka, pozostaje sztywna i można ją łatwo złamać do pożądanej średnicy końcówki.
<img alt="Schemat układu eksperymentalnego, obrót uchwytu elektrody, pochylenie; metoda badania spektroskopowego." src="/files/ftp_upload/4358/4358fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Rysunek zestawu manipulatora elektrody.Zestaw manipulatora jest używany wraz z mikroskopem do montażu elektrod typu piggy-back. Elementy zaznaczone na szaro są produktami dostępnymi w handlu i są wymienione w Tabeli 2. Elementy zaznaczone na niebiesko zostały wykonane na zamówienie w warsztacie naszej instytucji. Są to: 1) stalowa płyta o grubości 1/4 cala o wymiarach 43x26 cm z wywierconymi otworami pod scenę Newport 423, zgodnie ze schematem otworów dostarczonym przez Newport; 2) scena pochylna, która umożliwia pochylenie zestawu pod dowolnymi kątami; 3) łącznik, który montuje uchwyt elektrody do górnej sceny translacyjnej.
<img alt="Równowaga statyczna; balans; pipeta; wspornik gliniany, demonstracja koncepcji, eksperyment fizyczny." src="/files/ftp_upload/4358/4358fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Zdjęcie przykładowej elektrody typu piggy-back. Gotowa elektroda pięciokanałowa zmontowana z pojedynczą elektrodą rejestrującą. Zwróć uwagę na długi trzpień o długości około 7mm, umożliwiający głębokie rejestracje z mózgu.
<img alt="Wykres odpowiedzi neuronalnej; liczba impulsów względem natężenia dźwięku; analiza progu słyszenia." src="/files/ftp_upload/4358/4358fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Miareczkowanie prądów wypychania. Wykres przedstawia funkcje częstość-natężenie zarejestrowane z pojedynczego neuronu słuchowego podczas stymulacji uszu zwierzęcia tonami o różnych natężeniach. Głośniejsze dźwięki miały tendencję do wywoływania wyższej częstotliwości wyładowań. Przed aplikacją leku funkcja częstość-natężenie neuronu wykazywała najniższe częstotliwości impulsów (krzywa czarna). Stopniowo zwiększane prądy wypychania blokowały coraz więcej receptorów glicynowych w neuronie, co skutkowało sukcesywnym wzrostem częstotliwości wyładowań. Optymalny prąd wypychania w tym neuronie wynosił 45-60 nA. Przy tych prądach wypychania osiągnięto całkowitą blokadę wszystkich receptorów glicynowych neuronu. Po zakończeniu protokołu eksperymentalnego przerwano jontoforezę i pozwolono neuronie na regenerację. Pełna regeneracja została osiągnięta, gdy funkcja częstość-natężenie w fazie regeneracji pokryła się z początkową funkcją przed podaniem leku. Powielono za zgodą American Physiological Society, z Klug et al, 1995.

Jontoforeza agonistów i antagonistów neuronalnych podczas zewnikomórkowych rejestracji in vivo jest potężnym sposobem manipulowania mikrośrodowiskiem neuronu. Manipulacje te można najłatwiej przeprowadzić za pomocą wielokanałowych elektrod typu „piggy-back”. W niniejszej pracy opisujemy sposób ich wykonania oraz zastosowania podczas rejestracji słuchowych.

Wytwarzanie i zastosowanie wielokanałowych elektrod typu „piggy-back” do farmakologicznych manipulacji odpowiedziami neuronalnymi in vivo

Rejestracje in vivo z pojedynczych neuronów pozwalają badaczowi na analizę właściwości wyładowań neuronów, na przykład w odpowiedzi na bodźce sensoryczne. ...

Celem niniejszej procedury jest jonoforetyczna aplikacja środków farmakologicznych do mikroobwodów w mózgu przy jednoczesnym rejestrowaniu aktywności neuronalnej. Najpierw wyciągnij jednokanałową elektrodę szklaną do rejestracji pojedynczych komórek i zagnij jej końcówkę. Następnie wyciągnij wielokanałową elektrodę szklaną i odłam jej końcówkę do pożądanej średnicy.Przejdź do montażu obu elektrod. Ostatecznie otrzymana elektroda jest wykorzystywana do pozakomórkowych rejestracji in vivo, podczas których na żądanie można stosować środki farmakologiczne w celu manipulacji mikroobwodami neuronalnymi. Dzień dobry, nazywam się dr Achim Klu i nasze laboratorium pokaże Państwu dzisiaj, jak wykonać wielokanałowe elektrody typu piggyback.Elektrody te mogą być wykorzystywane do wprowadzania jonoforowych agonistów i antagonistów neuronalnych do mikrośrodowiska neuronu, a tym samym do manipulowania obwodami neuronalnymi neuronu in vivo. Dzień dobry, jestem dr An Zillow. Pracuję jako stażysta podoktorski w laboratorium dr. Ah him Crow i dzisiaj zaprezentuję tę procedurę. W przypadku elektrody jednokanałowej należy użyć szklanej kapilary jednokanałowej z włóknem i wyciągnąć końcówkę do średnicy około 1–2 µm oraz długości trzonu od 10 do 12 mm.Okresowo weryfikuj rezystancję wyciągniętych elektrod, napełniając je trzymolowym roztworem chlorku sodu i testując je za pomocą standardowego miernika O w 0,9% soli fizjologicznej. Po napełnieniu elektrody roztworem soli, wysycha on szybko, co czyni elektrodę bezużyteczną. Dlatego należy przeprowadzać wyłącznie takie testowanie.Odmierz elektrody, które nie będą wykorzystywane do produkcji typu piggyback. Aby stworzyć pełną elektrodę wielokanałową, wyciągnij szkło do uzyskania końcówki pipety o całkowitej średnicy około 10 µm lub mniejszej. Elektroda z prawidłowo wyciągniętą końcówką ma kluczowe znaczenie dla powodzenia procedury.Oprócz tego, że końcówka musi być długa i cienka, powinna być jednocześnie sztywna i łatwa do przełamania do pożąnej średnicy. Przełamanie końcówki do właściwej średnicy nastąpi w kolejnym kroku. Zatem dokładny rozmiar końcówki jest mniej istotny podczas procesu łączenia niż ogólny kształt końcówki elektrody, która powinna być długa i stosunkowo cienka.Następnie trzymając elektrodę jednokanałową pod kątem około 45 stopni, z końcówką skierowaną w dół, przesuń ją stosunkowo szybko przez płomień. Dąż do tego, aby płomień stopił szkło w obszarze przejścia, około 10 mm od końcówki elektrody, w celu wygięcia jej o około 20 stopni. Umieść elektrodę wielokanałową w masie z plasteliny na szkiełku przedmiotowym, a następnie wprowadź ją do stolika mikroskopu.Uchwyt do szkiełek Przedmiotowych Korzystając z manipulatorów XY stolika mikroskopu, ostrożnie przesuń końcówkę elektrody w stronę elementu z pleksiglasu. Obserwuj przełamanie końcówki przez okulary mikroskopu. Tutaj przedstawiono konfigurację zestawu elektrody.Elektroda wielokanałowa jest zamocowana na szkiełku przedmiotowym na stole mikroskopu. Elektroda jednokanałowa jest natomiast utrzymywana przez ręczny manipulator wieloosiowy, który umożliwia precyzyjne opuszczenie pipety jednokanałowej na pipetę wielokanałową. Opuszczamy elektrodę jednokanałową bezpośrednio w zagłębienie elektrody wielokanałowej, utworzone przez układ pięciu kanałów, tak aby jej końcówka wystawała poza końcówkę elektrody wielokanałowej o około 5 do 10 µm.Sklej trzpienie obu elektrod za pomocą cyjanoakrylanu. Rozpocznij od miejsca najbardziej oddalonego od końcówek i powoli przesuwaj wykałaczkę z kroplą kleju wzdłuż trzpieni elektrod w kierunku ich końcówek. Nałożenie kleju zbyt blisko końcówek elektrod spowoduje ich zapchanie i sprawi, że elektroda stanie się co najmniej częściowo niefunkcjonalna.Wymieszać niewielką ilość cementu dentystycznego. Pozostawić do wyschnięcia przez około 15 minut. Następnie ostrożnie wyjęć gotową elektrodę typu piggyback.Najpierw odłącz od uchwytu mikromanipulatora, a następnie od szkiełka przedmiotowego. Tuż przed użyciem elektrody przygotuj do wstecznego napełnienia każdej kapilary odpowiednim lekiem. Napełnij cztery zewnętrzne kapilary w konfiguracji pięciokapilarnej czterema wybranymi lekami, a kapilarę środkową 3 M NaCl jako kapilarę równoważącą.Następnie napełnij elektrodę do rejestracji z jedną kanapką (single barrel) trzymolowym roztworem chlorku sodu. Teraz włącz moduły pompy do jonoforezy i przetestuj wszystkie kanały. Funkcja testowania elektrod w każdym module pompy pomoże określić, czy kanał elektrody jest sprawny do rejestracji z głębokich obszarów mózgu.Gotowa elektroda pięciokanałowa zmontowana z pojedynczą elektrodą rejestrującą posiada długi trzpień o długości około siedmiu milimetrów. W jonteforezie powszechnie stosuje się kilka agonistów i antagonistów synaptycznych w celu blokowania inhibicji glicynowej za pomocą leków takich jak antagoniści receptorów glicynowych. Strychnina w formie hydroponianu zazwyczaj zwiększa częstotliwość wyładowań w neuronach.Te przykładowe dane mierzą funkcję częstotliwości wyładowań neuronów słuchowych w zależności od natężenia i pokazują odpowiedzi na sinusoidalne bodźce dźwiękowe o rosnącym natężeniu dostarczane do uszu zwierzęcia. Głośniejsze dźwięki skutkowały wyższymi częstotliwościami impulsów przed zastosowaniem ścisłego progu. Funkcja natężenia częstotliwości neuronów wykazuje niskie częstotliwości impulsów.Przyłożenie początkowego prądu jontoforetycznego o natężeniu 15 nA stymuluje niewielki wzrost prądu wyrzutowego. Stopniowo wyższe natężenia prądu wyrzutowego blokują coraz więcej receptorów glicynowych w neuronie, co prowadzi do progresywnego zwiększenia częstotliwości wyładowań. Przy prądzie 45 nA wszystkie receptory glicynowe w tym neuronie wydają się być zablokowane przez chlorowodorek strikniny.Dalszy wzrost prądu wyrzutu oraz uwalnianie jeszcze większej ilości substancji nie spowodowało kolejnych zmian. Funkcja poziomu częstotliwości wyładowań neuronów po zakończeniu jontoforezy wykazuje pełny powrót odpowiedzi neuronalnych do poziomu bazowego po około 25 minutach. Proces ten zależy od rodzaju i ilości wyrzuconego leku.Należy pamiętać, że lek podawany w ten sposób będzie dyfundował w okolice miejsca rejestracji i może również blokować receptory w sąsiednich neuronach. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak połączyć elektrodę rejestrującą z wielokanałową elektrodą do podawania leków, aby uzyskać niskoszumne rejestracje z głębokich struktur mózgu, wraz z czasowo kontrolowanym podawaniem do czterech czynników farmakologicznych.

manufacturing-using-piggy-back-multibarrel-electrodes-for-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wytwarzanie i używanie elektrod wieloczułkowych typu „piggy-back” do in vivo farmakologicznych manipulacji odpowiedzi neuronalnych

Opisano technikę implantacji czterech elektrod in vivo w celu monitorowania neuromięśniowej kontroli zachowania żerowania u Aplysia californica.

Wytwarzanie i implantacja elektrod u Aplysia californica do wielokanałowych rejestracji aktywności neuronalnej i mięśniowej u nienaruszonych zwierząt w swobodnym zachowaniu

Zrozumienie neuronalnych substratów zachowania wymaga nagrania zespołu obwodów mózgowych. Ze względu na swoją podatność genetyczną, mysz oferuje model do rozwarstwiania obwodów i mimikry choroby. W tym miejscu opisano metodę projektowania i wytwarzania zminiaturyzowanych sond, która jest odpowiednia do celowania w głęboką strukturę mózgu u myszy.

Projektowanie i produkcja ultralekkich, regulowanych sond wieloelektrodowych do zapisów elektrofizjologicznych u myszy

Demonstrujemy wykonanie, kalibrację i właściwości dwóch typów mikroelektrod selektywnych jonowo (dwulufowych i koncentrycznych) do pomiaru stężeń jonów w tkance mózgowej. Są one następnie wykorzystywane w przygotowaniu plastra hipokampa myszy, aby pokazać, że aktywność pobudzająca zmienia zarówno zewnątrzkomórkowe stężenie potasu, jak i sodu.

Dwulufowe i koncentryczne mikroelektrody do pomiaru zewnątrzkomórkowych sygnałów jonowych w tkance mózgowej

Prezentujemy metody budowy elektrod do jednoczesnego rejestrowania zewnątrzkomórkowej aktywności neuronalnej i uwalniania wielu substancji neuroaktywnych w pobliżu miejsc rejestracji u obudzonych myszy. Technika ta pozwala na szczegółową analizę przypuszczalnych lokalnych wejść synaptycznych do neuronu będącego przedmiotem zainteresowania.

Zewnątrzkomórkowy zapis aktywności neuronalnej w połączeniu z mikrojonoforowym zastosowaniem substancji neuroaktywnych u obudzonych myszy

To badanie bada nowatorskie zastosowanie technologii matryc mikroelektrod opartych na enzymach (MEA) do monitorowania in vivo aktywności neuroprzekaźników  u prosiąt.Postawiono hipotezę, że rozregulowanie glutaminianu przyczynia się do mechanizmu neurotoksyczności znieczulającej. W tym miejscu przedstawiamy protokół adaptacji technologii MEA do badania mechanizmu neurotoksyczności wywołanej znieczuleniem.

Adaptacja technologii matryc mikroelektrod do badania neurotoksyczności wywołanej znieczuleniem w nienaruszonym mózgu prosiąt

Sondy elektroniczne Mesh bezproblemowo integrują się i zapewniają stabilny, długoterminowy zapis na poziomie pojedynczego neuronu w mózgu. Protokół ten wykorzystuje elektronikę siatkową do eksperymentów in vivo, obejmujących wytwarzanie elektroniki siatkowej, ładowanie do igieł, wstrzykiwanie stereotaktyczne, łączenie wejść / wyjść, eksperymenty rejestracyjne i histologię tkanki zawierającej sondy siatkowe.

Elektronika siatkowa do wstrzykiwania strzykawki dla stabilnej elektrofizjologii przewlekłych gryzoni

Wykazaliśmy, że wytrawianie nano-architektury w wewnątrzkorowych urządzeniach mikroelektrodowych może zmniejszyć reakcję zapalną i ma potencjał do poprawy zapisów elektrofizjologicznych. Opisane w niniejszym dokumencie metody nakreślają podejście do wytrawiania nanoarchitektur na powierzchni niefunkcjonalnych i funkcjonalnych mikroelektrod krzemowych z pojedynczym trzpieniem wewnątrzkorowym.

Litografia z użyciem skupionej wiązki jonów do wytrawiania nanoarchitektur w mikroelektrodach

Ten protokół opisuje procedurę konstruowania układów mikroelektrod z włókna węglowego do przewlekłych i ostrych zapisów elektrofizjologicznych in vivo u myszy (Mus musculus) i fretki (Mustela putorius furo) z wielu obszarów mózgu. Każdy krok, po zakupie surowych włókien węglowych do implantacji matrycy mikroelektrodowej, jest szczegółowo opisany, z naciskiem na budowę matrycy mikroelektrodowej.

Budowa i implementacja układów mikroelektrod z włókna węglowego do przewlekłych i ostrych nagrań in vivo

Tutaj prezentujemy metodę długoterminowej oceny wydajności i bezpieczeństwa miękkich matryc elektrod podtwardówkowych w modelu minipig, opisując metodę i narzędzia chirurgiczne, pooperacyjny rezonans magnetyczny, elektrofizjologię kory słuchowej, właściwości elektrochemiczne implantu oraz immunochemię pośmiertną.

Implantacja matrycy podtwardówkowej miękkiej elektrokortykografii (ECoG) i długotrwała rejestracja kory mózgowej u świnek miniaturowych

Naszym celem było dostarczenie zaktualizowanego, łatwego do zrozumienia przewodnika na temat produkcji i testowania elektrod do elektromiografii epimysalnej. W tym celu udostępniamy instrukcje dotyczące pozyskiwania materiałów oraz szczegółowy przewodnik po procesie produkcji i testowania.

Opracowanie taniej elektrody do elektromiografii epimysjalnej: uproszczony przepływ pracy przy produkcji i testowaniu

Poznaj produkcję elektrod wielolufowych typu piggy-back do jonoforezy agonistów i antagonistów neuronalnych podczas rejestracji in vivo. Ta metoda umożliwia precyzyjną manipulację mikrośrodowiskiem neuronu.

Produkcja i wykorzystanie elektrod wielolufowych typu piggy-back do farmakologicznych manipulacji in vivo odpowiedziami neuronalnymi (Wideo) | JoVE Journal

Wytwarzanie i zastosowanie wielokanałowych elektrod typu „piggy-back” do farmakologicznych manipulacji odpowiedziami neuronalnymi in vivo

Przeglądaj więcej filmów