Wytwarzanie i zastosowanie wielokanałowych elektrod typu „piggy-back” do farmakologicznych manipulacji odpowiedziami neuronalnymi in vivo

Celem tej procedury jest jonforetyczne podawanie środków farmakologicznych do mikroukładów w mózgu przy jednoczesnym rejestrowaniu aktywności neuronalnej. Najpierw wypal jednokanalową elektrodę szklaną do rejestracji pojedynczych komórek i zegnij jej końcówkę. Następnie wypal wielokanalową elektrodę szklaną i przełam jej końcówkę do pożądanej średnicy.

Przystąp do montażu obu elektrod. Ostatecznie tak przygotowana elektroda służy do rejestracji pozakomórkowej in vivo, podczas której na żądanie można podawać środki farmakologiczne w celu manipulowania mikroobwodami neuronalnymi. Dzień dobry, nazywam się dr Achim Klu, a nasze laboratorium pokaże Państwu dzisiaj, jak wytwarzać wielokanałowe elektrody typu piggyback.

Elektrody te mogą być wykorzystane do wprowadzania jonoforowych agonistów i antagonistów neuronalnych do mikrośrodowiska neuronu, a tym samym do manipulowania obwodami neuronalnymi neuronu in vivo. Dzień dobry, jestem dr An Zillow. Jestem pracownikiem postdoktorskim w laboratorium dr Ah him Crow i dzisiaj zaprezentuję tę procedurę. W przypadku elektrody jednokanałowej należy użyć jednokanałowej kapilary szklanej z włóknem i wyciągnąć końcówkę do średnicy około 1 do 2 µm oraz długości trzpienia od 10 do 12 mm.

Sporadycznie weryfikuj rezystancję wyciągniętej elektrody, napełniając ją trzymolowym roztworem chlorku sodu i testując standardnym omometrem w 0,9% soli fizjologicznej. Po napełnieniu elektrody roztworem soli, wysycha on szybko, co czyni elektrodę bezużyteczną. Dlatego należy przeprowadzać wyłącznie to badanie.

Wybierz elektrody, które nie będą wykorzystywane do produkcji typu piggyback. Aby stworzyć pełną elektrodę wielokanałową, wyciągnij szkło do końcówki pipety o całkowitej średnicy około 10 µm lub mniej. Elektroda z prawidłowo wyciągniętą końcówką jest kluczowa dla powodzenia procedury.

Oprócz bycia długim i cienkim, wierzchołek musi pozostać sztywny i łatwo łamać się do pożądanej średnicy. W kolejnym kroku wierzchołek zostanie złamany do właściwej średnicy. Zatem dokładny rozmiar wierzchołka jest mniej istotny podczas procesu łączenia niż ogólny kształt końcówki elektrody, która powinna być długa i stosunkowo cienka.

Teraz trzymaj elektrodę z pojedynczym otworem pod kątem około 45 stopni, z końcówką skierowaną w dół, i przesuń ją przez płomień stosunkowo szybko. Dąż do tego, aby płomień stopił szkło w obszarze przejścia, około 10 milimetrów od końcówki elektrody, aby wygiąć ją o około 20 stopni. Umieść elektrodę z wieloma otworami w warstwie gliny modelarskiej na szkiełku przedmiotowym, a następnie włóż ją do stolików mikroskopowych.

Uchwyt do slajdów. Używając manipulatorów XY stolika mikroskopu, delikatnie przesuń końcówkę elektrody w stronę kawałka pleksiglasu. Obserwuj przełamanie końcówki przez okulary mikroskopu. Tutaj przedstawiono konfigurację zestawu elektrody.

Elektroda wielokanałowa jest zamocowana na szkiełku przedmiotowym na stole mikroskopu. Jednokanałowa elektroda jest natomiast utrzymywana przez manualny manipulator wieloosiowy, który pozwala użytkownikowi z dużą precyzją opuścić pipetę jednokanałową na pipetę wielokanałową. Opuść elektrodę jednokanałową bezpośrednio w zagłębienie elektrody wielokanałowej, utworzone przez układ pięciu kanałów, tak aby jej końcówka wystawała poza końcówkę elektrody wielokanałowej o około 5-10 µm.

Sklej trzpienie obu elektrod za pomocą cyjanoakrylanu. Rozpocznij od pozycji najbardziej oddalonej od końcówek, a następnie powoli przesuwaj wykałaczkę z kroplą kleju wzdłuż trzpieni elektrod w stronę ich końcówek. Nałożenie kleju zbyt blisko końcówek elektrod spowoduje ich zapchanie i sprawi, że elektroda stanie się przynajmniej częściowo niefunkcjonalna.

Wymieszaj niewielką ilość cementu stomatologicznego. Pozostaw do wyschnięcia na około 15 minut. Następnie ostrożnie wyjmij gotową elektrodę typu piggyback.

Najpierw z uchwytu mikromanipulatora, a następnie z szkiełka przedmiotowego. Bezpośrednio przed użyciem elektrody należy przygotować do wypełnienia wstecznego każdą z tulejek odpowiednim lekiem. Cztery zewnętrzne tulejki w konfiguracji pięciotulejkowej należy wypełnić czterema wybranymi lekami, a tulejkę środkową trzymolarowym chlorkiem sodu w celu zapewnienia równowagi.

Następnie należy napełnić pojedynczą elektrodę rejestrującą 3 M NaCl. Teraz włącz moduły pomp do jonoforezy i przetestuj wszystkie kanały. Funkcja testowania elektrod w każdym module pompy pozwoli ustalić, czy kanał elektrody jest sprawny do głębokich rejestracji z mózgu.

Gotowa elektroda pięciobeczkowa, zmontowana wraz z pojedynczą elektrodą rejestrującą, posiada długi trzpień o długości około siedmiu milimetrów. Do jontoforezy powszechnie stosuje się kilka agonistów i antagonistów synaptycznych w celu blokowania inhibicji glicynowej za pomocą leków takich jak antagoniści receptorów glicynowych. Wodorochlorek strychniny zazwyczaj zwiększa częstotliwość wyładowań neuronów.

Te przykładowe dane mierzą funkcję częstotliwości wyładowań neuronów słuchowych w zależności od natężenia i pokazują odpowiedzi na sinusoidalne bodźce dźwiękowe o rosnącym natężeniu dostarczane do uszu zwierzęcia. Głośniejsze dźwięki skutkowały wyższymi częstotliwościami impulsów przed zastosowaniem rygorystycznego progu. Funkcja natężenia częstotliwości neuronów wykazuje niskie częstotliwości impulsów.

Przyłożenie początkowego prądu jontoforezy o natężeniu 15 nano amps stymuluje niewielki wzrost prądu wypierania. Progresywnie wyższe prądy wypierania blokują coraz więcej receptorów glicynowych w neuronie, co skutkuje sukcesywnie wyższą częstotliwością wyładowań. Przy natężeniu prądu 45 nano amps wszystkie receptory glicynowe tego neuronu wydają się być zablokowane przez strychninę hydrochlorowian.

Dalszy wzrost prądu wtrysku oraz uwolnienie jeszcze większej ilości substancji nie spowodowało dodatkowych zmian. Funkcja poziomu częstości wyładowań neuronów po zakończeniu jontoforezy wykazuje powrót odpowiedzi neuronalnych do poziomu wyjściowego po około 25 minutach. Proces regeneracji ten jest zależny od rodzaju i ilości wstrzykniętego leku.

Należy pamiętać, że lek będzie dyfundował w sąsiedztwo miejsca rejestracji i może również blokować receptory w sąsiednich neuronach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak połączyć elektrodę rejestrującą z wielokanałową elektrodą do podawania leków, aby uzyskać niskoszumowe rejestracje z głębokich struktur mózgu, wraz z kontrolowanym czasowo podawaniem do czterech agentów farmakologicznych.