Name: Analiza sekwencyjna RNA transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną i kontrolnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 30 s
Description: Poznaj metodę RNA-seq do analizy transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną. Protokół obejmuje izolację RNA, budowę bibliotek i sekwencjonowanie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Stephenowi Kingsmore'owi i Centrum Medycyny Genomu Pediatrycznego w Szpitalach i Klinikach Miłosierdzia Dziecięcego za wykorzystanie ich klastrów obliczeniowych do analizy danych, zespołowi usług terenowych Illumina (Elizabeth Boyer, Scott Cook i Mark Cook) oraz zespołowi konsultantów technicznych za szybkie odpowiedzi i pomocne sugestie dotyczące działania instrumentu do sekwencjonowania DNA nowej generacji, HiScanSQ i analiza jakości danych. Praca ta była częściowo wspierana przez National Institutes of Health Grant HL080042 (dla S.Q.Y.) oraz fundusz początkowy i fundację Children's Mercy Hospitals and Clinics, University of Missouri w Kansas City (dla S.Q.Y.).

Schemat blokowy przedstawiający ten protokół jest wyświetlany na rysunku 1.
1. Leczenie komórek trombiną, izolacja RNA, ocena jakości i kwantyfikacja RNA
<ol>
	<li>Hodowla ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc (HMVEC-LBl) do 90-100% konfluencji w płytkach 6-dołkowych w pożywce EGM-2 z 5% FBS, czynnikami wzrostu i antybiotykami (Lonza, kat. # CC-3202).</li>
	<li>Zmienić pożywkę na pożywkę głodową (0% FBS) 30 minut przed leczeniem trombiną.</li>
	<li>Potraktować komórki trombiną o stężeniu 0,05 U/ml lub pozostawić bez leczenia jako kontrolę przez 6 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Wyizoluj całkowite RNA z komórek poddanych działaniu środka i kontrolnych za pomocą zestawu Ambion mirVana zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Oceń jakość RNA za pomocą chipa eukariotycznego RNA Experion StdSense zgodnie ze standardowym protokołem na automatycznej stacji elektroforezy Experion (<a href="http://www.bio-rad.com" target="_blank">www.bio-rad.com</a>).</li>
	<li>Określić ilościowo RNA przy użyciu standardowej metody spektrofotometrycznej.</li>
</ol>
2. Budowa i sekwencjonowanie bibliotek
<ol>
	<li>Jako materiał wyjściowy należy użyć 1 μg wysokiej jakości całkowitego RNA na próbkę.</li>
	<li>Aby zbudować bibliotekę, postępuj zgodnie ze standardową procedurą firmy Illumina (protokół # 15008136 Rev. A). W tym protokole wykonywane są dwie rundy selekcji poli(A) zawierającej mRNA w celu usunięcia rRNA w celu zminimalizowania sekwencjonowania rRNA.</li>
	<li>Oceń jakość bibliotek za pomocą chipa Experion DNA 1K zgodnie ze standardowym protokołem na Automatycznej Stacji Elektroforezy Experion (<a href="http://www.bio-rad.com" target="_blank">www.bio-rad.com</a>).</li>
	<li>Określ ilościowo bibliotekę za pomocą qPCR: Użyj biblioteki, która została wcześniej zsekwencjonowana jako krzywa standardowa i startery specyficzne dla ligowanych adapterów. Użyj zakresu rozcieńczeń nieznanych bibliotek (np. 1:100, 1:500 i 1:1,000). Uruchom qPCR zgodnie z protokołem SyberGreen MM i oblicz pierwotne stężenie zapasów w każdej bibliotece.</li>
	<li>Rozcieńczyć zapasy biblioteczne do 10 nM i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będą gotowe do grupowania w komórkę przepływową.</li>
	<li>Gdy będziesz gotowy do grupowania komory przepływowej, rozmrozić płytkę odczynnika cBot w łaźni wodnej. cBot to instrument firmy Illumina używany do usprawnienia procesu generowania klastrów.</li>
	<li>Umyj instrument cBot.</li>
	<li>Denaturuj biblioteki: Połącz 13 μl biblioteki 1x TE i 6 μl 10 μM, a z boku probówki dodaj 1 μl 1 N NaOH (dostarczone przez Illumina). Wirować, odwirować, inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut i umieścić zdenaturowane biblioteki na lodzie.</li>
	<li>Rozcieńczyć biblioteki: Rozcieńczyć zdenaturowane biblioteki wstępnie schłodzonym buforem hybrydyzacyjnym (HT1, dostarczonym przez Illumina) poprzez połączenie 996 μl HT1 i 4 μl zdenaturowanej biblioteki w celu uzyskania końcowego stężenia 12 pM. Umieść zdenaturowane i rozcieńczone biblioteki na lodzie.</li>
	<li>Odwróć każdy rząd probówek na płytce cBot, upewniając się, że wszystkie odczynniki są rozmrożone. Zakręć płytką, usuń/przebij uszczelki foliowe i załaduj na cBota.</li>
	<li>Podwielokrotność 120 μl rozcieńczonych, zdenaturowanych bibliotek do probówki paskowej, oznaczonej 1-8. Dodaj 1,2 μl rozcieńczonej, zdenaturowanej biblioteki kontrolnej PhiX (od Illumina) do każdej probówki jako kontrolę skokową. Wiruj i zakręć rurki w dół i załaduj je na cBot we właściwej orientacji (rura #1 po prawej).</li>
	<li>Załaduj komórkę przepływową i kolektor do cBota.</li>
	<li>Zakończ sprawdzanie przepływu i rozpocznij przebieg klastrowania.</li>
	<li>Po zakończeniu przebiegu sprawdź dostarczanie odczynnika na wszystkich torach. Zanotuj wszelkie nieprawidłowości. Albo natychmiast rozpocząć sekwencjonowanie, albo umieścić komórkę przepływową w dostarczonej probówce w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Rozmrozić odczynniki do sekwencjonowania przez syntezę (SBS, Illumina).</li>
	<li>Załaduj odczynniki w odpowiednie miejsca na tackach na odczynniki, uważając, aby nie dotknąć innych odczynników po dotknięciu mieszanki rozszczepienia.</li>
	<li>Używając komory przepływowej bez sekwencjonowania (tj. takiej, która została wcześniej zsekwencjonowana), dwukrotnie zalać linie odczynników.</li>
	<li>Dokładnie wyczyść komórkę przepływową sekwencjonowania 70% EtOH i Kimwipes, a następnie 70% EtOH i papierem do soczewek. Sprawdź komórkę przepływową pod kątem smug. W razie potrzeby wyczyść go ponownie.</li>
	<li>Załaduj komórkę przepływową do sekwencera i przeprowadź kontrolę przepływu, aby upewnić się, że uszczelnienie między kolektorami a komorą przepływową jest szczelne.</li>
	<li>Rozpocznij sekwencjonowanie.</li>
	<li>Oceń metryki jakości (np. gęstość klastrów, klastry przechodzące filtr, Q30, intensywność), gdy stają się dostępne podczas uruchamiania.</li>
	<li>Monitoruj intensywność przez cały bieg.</li>
	<li>Po zakończeniu 101 cykli wykonaj proces chemiczny, aby zakończyć drugi odczyt: Rozmrozić sparowane odczynniki końcowe i drugi odczyt bufora inkorporacji (ICB, składnik odczynników SBS, Illumina) i załaduj odczynniki.</li>
	<li>Kontynuuj sekwencjonowanie, oceniając intensywność odczytu 2.stopnia, Q30 i inne wskaźniki jakości w miarę postępu przebiegu.</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Użyj najnowszej wersji CASAVA (Illumina, obecnie 1.8.2), aby przekonwertować pliki podstawowych plików wywołań (.bcl) na pliki .fastq, ustawiając fastq-cluster-count na 0, aby zapewnić utworzenie jednego pliku fastq dla każdej próbki. Rozpakuj pliki fastq w celu dalszej analizy.</li>
	<li>Wykonaj wyrównanie sparowanych końców przy użyciu najnowszych wersji TopHat (1.4.1)5, który wyrównuje odczyty sekwencyjne RNA do genomów ssaków za pomocą ultra wysokowydajnego wyrównywacza krótkiego odczytu (Bowtie,0.12.7)6 i SAMtools (0.1.17)7. SAMtools implementuje różne narzędzia do wyrównania po przetwarzaniu w formacie SAM. Referencyjny transkryptom człowieka można pobrać ze strony iGenomes (<a href="http://www.illumina.com" target="_blank">www.illumina.com</a>). Uruchamiając TopHat, użyliśmy wszystkich domyślnych ustawień parametrów, w tym opcji typu biblioteki jako fr-unstranded (domyślnie).</li>
	<li>Korzystając z programu CuffDiff, części pakietu oprogramowania CuffLinks (1.3.0)8, porównaj komórki traktowane trombiną z komórkami kontrolnymi, aby odsiać transkrypty genów o zróżnicowanej ekspresji w tych pierwszych na podstawie ludzkiego transkryptomu referencyjnego. To porównanie wykrywa różnicową ekspresję znanych transkryptów. Użyj programu Microsoft Excel, aby zwizualizować wynik w formie tabeli. Uruchamiając program Spinki do mankietów, użyliśmy wszystkich domyślnych ustawień parametrów. Te transkrypty genów z FPKM<0,05 i p>0,05 są odfiltrowywane.</li>
	<li>Aby wykryć nowe izoformy, uruchom spinki do mankietów bez transkryptomu referencyjnego. Porównaj pliki transkrypcji próbki z genomem referencyjnym za pomocą Cuffcompare i przetestuj ekspresję różnicową za pomocą Cuffdiff, używając połączonych plików transkryptów trombiny jako genomu referencyjnego dla jednej analizy i połączonych kontrolnych plików transkryptów jako genomu referencyjnego dla drugiej analizy. Użyj programu Microsoft Excel, aby zwizualizować wynik w formacie tabelarycznym. Ponownie, te transkrypty genów z FPKM<0,05 i p>0,05 są odfiltrowywane. Po tym kroku badacze mogą zdecydować się na przesłanie listy nowo zgłoszonych transkryptów na stronę internetową UCSC Genome Browser (<a href="http://genome.ucsc.edu/" target="_blank">http://genome.ucsc.edu/</a>) w celu zweryfikowania ich ważności poprzez ręczną inspekcję.</li>
	<li>Prześlij listy genów o zróżnicowanej ekspresji do Ingenuity Pathway Analysis (IPA, <a href="http://www.ingenuity.com" target="_blank">www.ingenuity.com</a>) w celu scharakteryzowania genów i szlaków, na które wpływa leczenie trombiną. Na tym etapie badacze mogą zdecydować się na użycie CummeRbund (<a href="http://compbio.mit.edu/cummeRbund/" target="_blank">http://compbio.mit.edu/cummeRbund/</a>), pakietu R, który został zaprojektowany, aby pomóc i uprościć zadanie analizy danych wyjściowych RNA spinki do mankietów, aby pomóc w zarządzaniu, wizualizacji i integracji wszystkich danych uzyskanych w wyniku analizy Cuffdiff.</li>
</ol>
4. Walidacja wyników sekwencjonowania RNA za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)
<ol>
	<li>Przeprowadzić całkowitą izolację RNA z komórek kontrolnych i HMVEC-LBl traktowanych trombiną, ocenę jakości RNA i kwantyfikację RNA opisano w krokach od 1.4 do 1.6.</li>
	<li>Wygeneruj komplementarne DNA z 1 μg całkowitego RNA każdej próbki za pomocą zestawów RT SuperScript III First-Strand Synthesis System, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (Invitrogen, 18080-051).</li>
	<li>Wykonaj analizę qRT-PCR w systemie PCR w czasie rzeczywistym Applied Biosystems ViiA 7 przy użyciu oligonukleotydów zaprojektowanych przez Taqman Assay-on-Demand do wykrywania CUGBP, członka rodziny podobnego do Elav1 (CELF1, Hs00198069_m1), fankonianemii, grupy komplementacji D2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), czynnika 1 związanego z receptorem TNF (TRAF1, Hs01090170_m1) i β-aktyny (ACTB, Hs99999903_m1). Każda próbka miała matrycę odpowiadającą 5 ng całkowitego RNA. Zmierz ilościowo za pomocą metody DDCt i znormalizuj do β-aktyny. Każdy test przeprowadzono na co najmniej trzech kontrpróbach biologicznych.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li>
<li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq%3A+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).</li>
<li>Zhang, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+Reveals+Novel+Transcriptome+of+Genes+and+Their+Isoforms+in+Human+Pulmonary+Microvascular+Endothelial+Cells+Treated+with+Thrombin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin.</a> PLoS One. 7, e31229(2012).</li>
<li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat%3A+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10, R25(2009).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).</li>
<li>Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+years+of+pathway+analysis%3A+current+approaches+and+outstanding+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002375(2012).</li>
<li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+with+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Working with RNA.</a> Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).</li>
<li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+assembly+and+analysis+of+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">De novo assembly and analysis of RNA-seq data.</a> Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).</li>
<li>Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+methods+for+transcriptome+annotation+and+quantification+using+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq.</a> Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).</li>
<li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+transcriptome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Kluczowe kroki
Postępowanie z RNA: RNazy degradują nawet RNA o najwyższej jakości, dlatego należy zachować ostrożność podczas izolacji, przechowywania i stosowania RNA10. Rękawice są zawsze noszone, aby zapobiec zanieczyszczeniu RNazami znajdującymi się na ludzkich dłoniach. Rękawiczki należy często zmieniać, szczególnie po dotknięciu skóry, klamek lub innych wspólnych powierzchni. Zestaw pipet powinien być dedykowany wyłącznie do pracy z RNA, a wszystkie końcówki i ru...

<table><tbody><tr><td>Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka płuc</td><td>Lonza</td><td>CC-2815</td><td></td></tr><tr><td>Lonza, zestaw pocisków</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td>Zawiera EGM-2, FBS, czynniki wzrostu i antybiotyki</td></tr><tr><td>Trombin</td><td>Sigma</td><td>T4393</td><td></td></tr><tr><td>Ambion mirVana Kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM 1560</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Zap</td><td>Life Technologies</td><td>AM9782</td><td></td></tr><tr><td>Experion StdSens RNA</td><td>Bio-Rad</td><td>700-7103</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania RNA TruSeq</td><td>Illumina</td><td>FC-122-1001</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki AMPureXP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Indeks górny Odwrotna transkryptaza II</td><td>Life Technologies</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Experion DNA 1K</td><td>Bio-Rad</td><td>700-7107</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect SyberGreen Qiagen</td><td>204163</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do generowania klastrów PE</td> Zestaw sterujący <td>Illumina</td><td>PE-401-3001</td><td></td></tr><tr><td>PhiX</td><td>Zestaw kontrolny Illumina</td><td>FC110-301</td><td></td></tr><tr><td>200 cykli SBS</td><td>Illumina</td><td>FC-401-3001</td><td></td></tr><tr><td>HiScanSQ* </td><td>Illumina</td><td>SY-103-2001</td><td></td></tr><tr><td>cBot</td><td>Illumina</td><td>SY-301-2002</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna qPCR - Viia7</td><td>Life Technologies</td><td>Model #VIIA7 / Sprzęt #10631261</td><td>Lub równoważny </td></tr><tr><td>Experion System </td><td>Bio Rad</td><td>7007001</td><td>Bioanalyzer to alternatywny system</td></tr><tr><td>Spektrofotometr </td><td>Bio-Tek</td><td>Epoch Spektrofotometr mikropłytkowy</td><td>Lub równoważny</td></tr><tr><td>Wirówka - Sorvall Legend XTR </td><td>Thermo Scientific</td><td>75004521</td><td>Lub równoważny</td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny</td><td>Life Technologies</td><td>AM10027</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowy termocykler</td><td>Ogólny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr> laboratoryjny<td colspan="4">Tabela 3. Lista kluczowych odczynników i głównych urządzeń. *, Na filmie zademonstrowano HiSeq1000 zamiast HiScanSQ.</td></tr></tbody></table>

analiza sekwencyjna rna transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną i kontrolnych

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

Charakterystyka ekspresji genów w komórkach poprzez pomiar poziomu mRNA jest użytecznym narzędziem do określenia, jak na maszynerię transkrypcyjną komórki wpływają sygnały zewnętrzne (np. leczenie farmakologiczne), lub jak komórki różnią się między stanem zdrowym a chorym. Wraz z pojawieniem się i ciągłym udoskonalaniem technologii sekwencjonowania DNA nowej generacji, sekwencjonowanie RNA (sekwencjonowanie RNA) staje się coraz bardziej popularną metodą analizy transkryptomu w celu skatalogowania wszystkich gatunków transkryptów, określenia struktury transkrypcyjnej wszystkich wyrażonych genów oraz ilościowego określenia zmieniających się poziomów ekspresji całkowitego zestawu transkryptów w danej komórce, tkance lub organizmie1,2 . RNA-seq stopniowo zastępuje mikromacierze DNA jako preferowaną metodę analizy transkryptomu, ponieważ ma zalety profilowania całego transkryptomu, zapewniając dane typu cyfrowego (numer kopii dowolnego transkryptu) i nie opierając się na żadnej znanej sekwencji genomu3.
Tutaj prezentujemy kompletny i szczegółowy protokół zastosowania sekwencyjnego RNA do profilowania transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc z leczeniem trombiną lub bez niej. Protokół ten opiera się na naszym niedawno opublikowanym badaniu zatytułowanym "RNA-seq ujawnia nowy transkryptom genów i ich izoform w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną", w którym z powodzeniem przeprowadziliśmy pierwszą pełną analizę transkryptomu ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną przy użyciu sekwencji RNA. Dostarczyło to bezprecedensowych zasobów do dalszych eksperymentów w celu uzyskania wglądu w mechanizmy molekularne leżące u podstaw dysfunkcji śródbłonka za pośrednictwem trombiny w patogenezie stanów zapalnych, raka, cukrzycy i choroby niedokrwiennej serca, a także dostarcza potencjalnych nowych wskazówek dla celów terapeutycznych dla tych chorób.
Opisowy tekst tego protokołu jest podzielony na cztery części. W pierwszej części opisano leczenie ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc za pomocą izolacji trombiny i RNA, analizy jakości i kwantyfikacji. Druga część opisuje budowę i sekwencjonowanie biblioteki. Trzecia część opisuje analizę danych. Czwarta część opisuje test walidacyjny RT-PCR. Wyświetlane są reprezentatywne wyniki kilku kluczowych kroków. Przydatne wskazówki lub środki ostrożności, które pomogą Ci osiągnąć sukces w kluczowych krokach, znajdują się w sekcji Dyskusja. Chociaż protokół ten wykorzystuje ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczone trombiną, można go uogólnić w celu profilowania transkryptomów zarówno w komórkach ssaków, jak i innych ssaków oraz w tkankach traktowanych różnymi bodźcami lub inhibitorami, lub w celu porównania transkryptomów w komórkach lub tkankach między stanem zdrowym a stanem chorobowym.

Dla kroku 1: Stosunek 28s:18s jest tradycyjnie używany jako wskaźnik degradacji RNA. Idealnie byłoby, gdyby szczyt 28s miał około dwa razy większą powierzchnię niż pasmo 18s (stosunek 2), jednak ten idealny stosunek często nie jest spotykany w praktyce. Co więcej, proporcje 28s:18s uzyskane metodami spektrofotometrycznymi mogą zaniżać stopień degradacji RNA. Aby dokładniej określić ilościowo degradację, a tym samym jakość próbki RNA, system Experion oblicza liczbę wskaźnika jakości RNA (RQI). Algorytm RQ...

Ten protokół przedstawia kompletną i szczegółową procedurę zastosowania sekwencjonowania RNA, potężnej technologii sekwencjonowania DNA nowej generacji, do profilowania transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc z leczeniem trombiną lub bez. Protokół ten można uogólnić na różne komórki lub tkanki dotknięte różnymi odczynnikami lub stanami chorobowymi.

Analiza sekwencyjna RNA transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną i kontrolnych

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Ogólnym celem tej procedury jest przedstawienie kompletnego i szczegółowego procesu zastosowania RNA-Seq, potężnej technologii sekwencjonowania DNA nowej generacji, do profilowania transkryptomów. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie całkowitego RNA z ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc z leczeniem trombiną lub bez niej i sprawdzenie jakości RNA. Drugim krokiem jest skonstruowanie bibliotek DNA z tych próbek RNA.Usprawnij generowanie klastrów za pomocą instrumentu cbot i wykonaj zadanie sekwencjonowania DNA na HighSeq 1000. Następnie przeprowadzana jest analiza danych, aby ostatecznie zidentyfikować i wyświetlić transkrypty genów o zróżnicowanej ekspresji. Ostatnim krokiem jest walidacja wyników RN aeq przez RT TP CR. Główną zaletą IC w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikromacierz DNA do analizy transkryptomu, jest to, że IC może profilować cały transkryptom, dostarczać dane cyfrowe i nie polegać na żadnej znanej genomizacji ekspresji genów w komórkach.Pomiar poziomu MRA jest użytecznym narzędziem w określaniu, w jaki sposób sygnały zewnętrzne wpływają na transkrypcję maszynerii komórki lub jak komórki różnią się między stanem zdrowia a stanem chorobowym. W tym protokole zademonstrujemy analizę IC transkryptomów w komórkach Indo syn leczonych trobiną i kontrolnych ludzkich mikronaczyniowych komórkach Indo. Protokół ten opiera się na naszym niedawno opublikowanym badaniu, w którym z powodzeniem przeprowadziliśmy pierwszą pełną analizę transkryptomu ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc traktowanych trombiną przy użyciu RNA-Seq na High SEQ 1000, popularnej platformie sekwencjonowania DNA nowej generacji.Pani Suman Shaha zademonstruje sekwencjonowanie DNA na instrumencie o wysokim SEQ 1000, a także eksperyment walidacyjny R-T-P-C-R. Korzystając z systemu VS seven R-T-P-C-R, dr Denova zademonstruje leczenie trombiną ludzkich komórek płucnych, mikronaczyniowych komórek śródbłonka i izolację całkowitego komórkowego RNA. Pani Margaret Gibson zademonstruje system Experian do sprawdzania jakości RNA i biblioteki DNA, a także generowania klastrów na cbocie.A dr Dimitri Gregor zademonstruje analizę danych, aby rozpocząć tę kulturę protokołu. Ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego płuc do zbiegu od 90 do 100% w sześciu płytkach dołkowych w pożywce EGM dwie z 5% czynnikami wzrostu FBS i antybiotykami. Zmienić pożywkę na pożywkę głodową 30 minut przed leczeniem trombiną.Po 30 minutach potraktuj komórki 0,05 jednostki na mililitr, trombiną lub pozostaw bez leczenia jako kontrolę. Inkubuj komórki przez sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po sześciogodzinnej kuracji.Wyizoluj całkowite RNA z leczonych i kontrolnych komórek za pomocą zestawu Nirvana zgodnie z instrukcjami producenta. Oceń jakość RNA za pomocą eukariotycznego chipa RNA Experian o standardowym wyczuwalnym wymyśle, zgodnie ze standardowym protokołem na automatycznej stacji elektroforezy Experian. Na koniec określ ilościowo RNA przy użyciu standardowej metody spektrofotometrycznej do budowy biblioteki.Użyj jednego mikrograma wysokiej jakości całkowitego RNA na próbkę jako materiału wyjściowego do budowy biblioteki. Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem producenta. W tym protokole przeprowadzane są dwie rundy selekcji poli zawierających Mr.mRNA.Aby usunąć nasze RNA, aby zminimalizować sekwencjonowanie RNA, oceń jakość bibliotek za pomocą chipa Experian DNA one K. Zgodnie ze standardowym protokołem na zautomatyzowanej stacji elektroforezy Experian. Określ ilościowo bibliotekę za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym.W skrócie Q-R-T-P-C-R zgodnie z opisem w pisemnym protokole. Dołączając ten film, uruchom Q-R-T-P-C-R zgodnie z protokołem cyber green MM i oblicz pierwotne stężenie zapasów każdej biblioteki. Rozcieńczyć zapasy biblioteczne do 10 nanomolowych i przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza.Gdy komora przepływowa będzie gotowa do zgrupowania, rozmrozić płytkę odczynnika cbot w łaźni wodnej. CBOT jest instrumentem służącym do usprawnienia procesu generowania klastrów. Po umyciu instrumentu cbot należy zdenaturować biblioteki, najpierw łącząc 13 mikrolitrów jednego XTE i sześć mikrolitrów 10 nanomolowych.Biblioteka następnie z boku każdej probówki, dodaj jeden mikrolitr jednego normalnego wodorotlenku sodu, wiruj probówki w dół i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie umieść zdenaturowane biblioteki na lodzie. Następnie rozcieńczyć zdenaturowane biblioteki wstępnie schłodzonym buforem hybrydyzacyjnym, łącząc 996 mikrolitrów buforu i 4,0 mikrolitrów zdenaturowanej biblioteki, aby uzyskać końcowe stężenie 12 pikomolowców.Umieść zdenaturowane, rozcieńczone biblioteki na. Następnie odwróć każdy rząd probówek na płytce cbot, upewniając się, że wszystkie odczynniki są rozmrożone. Po odwirowaniu płyty zdejmij uszczelkę foliową z rzędu rurek z wodorotlenkiem sodu i załaduj na podwielokrotność cbot.120 mikrolitrów rozcieńczonych, zdenaturowanych bibliotek do probówki paskowej oznaczonej od jednego do ośmiu. Dodaj 1,2 mikrolitra rozcieńczonej, zdenaturowanej biblioteki kontrolnej PHI X do każdej probówki jako skok kontroli. Po wirowaniu i obracaniu rurek, załaduj je na cbot we właściwej orientacji z rurką numer jeden po prawej stronie.Załaduj komórkę przepływową i kolektor na cbot. Zakończ sprawdzanie przepływu i rozpocznij przebieg klastrowania. Po zakończeniu przebiegu sprawdź dostarczanie odczynnika na wszystkich torach.Zanotuj wszelkie nieprawidłowości. Albo natychmiast rozpocznij sekwencjonowanie, albo przechowuj komórkę przepływową w dostarczonej probówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby rozpocząć sekwencjonowanie.Rozmrozić sekwencjonowanie za pomocą odczynników do syntezy. Załaduj odczynniki w odpowiednie miejsca na tackach na odczynniki, uważając, aby nie dotknąć innych odczynników. Po dotknięciu mieszanki rozszczepiającej, za pomocą celi przepływowej bez sekwencjonowania, dwukrotnie zagruntuj linie odczynników, dokładnie wyczyść komórkę przepływu sekwencjonowania 70% etanolem i chusteczkami Kim, a następnie 70% etanolem i papierem do soczewek.Sprawdź komorę przepływową pod kątem smug i wyczyść ją ponownie, jeśli to konieczne. Załaduj komórkę przepływową do sekwencera i przeprowadź kontrolę przepływu, aby upewnić się, że uszczelnienie między kolektorami a komorą przepływową jest szczelne. Rozpocznij sekwencjonowanie.Oceń metryki jakości, gdy staną się dostępne podczas przebiegu Monitoruj intensywność przez cały przebieg. Po zakończeniu 101 cykli. Wykonaj badanie chemiczne na odwrócenie, aby zakończyć drugi odczyt.Pierwszy ojciec sparował i odczynniki, a drugi odczytał bufor inkorporacji. Następnie załaduj odczynniki, kontynuuj sekwencjonowanie, uruchom ocenę. Po drugie, odczytuj intensywność Q3 i inne wskaźniki jakości w miarę postępu biegu.Aby rozpocząć analizę danych, użyj najnowszej wersji manioku, aby przekonwertować podstawowe pliki wywołań na pliki FAST Q. Ustawienie szybkiej liczby klastrów Q na zero, aby zapewnić utworzenie pojedynczego szybkiego pliku Q. Dla każdej próbki rozpakuj szybkie pliki Q w celu dalszej analizy.Wykonuj sparowanie i wyrównanie przy użyciu najnowszej wersji cylindra, która wyrównuje odczyty RNA-Seq do genomów wielkości ssaków przy użyciu narzędzi krótkiego odczytu o ultra wysokiej przepustowości i SAM, które implementują różne narzędzia do wyrównywania po przetwarzaniu w formacie SAM. Referencyjny transkryptom człowieka można pobrać z I genomów w rundzie, w którym użyto wszystkich domyślnych ustawień parametrów, w tym opcji typu biblioteki jako fragmentu nieskręconego za pomocą części programu cuff diff pakietu oprogramowania spinki do mankietów. Porównaj komórki traktowane trombiną z komórkami kontrolnymi.Przesiać transkrypty genów o zróżnicowanej ekspresji w komórkach traktowanych trombiną w oparciu o ludzki transkryptom referencyjny. Następnie użyj arkusza kalkulacyjnego, aby zwizualizować wynik w formie tabeli. W tym przypadku użyto wszystkich domyślnych ustawień parametrów, a transkrypty genów o FPKM mniejszym niż 0,05 i p większym niż 0,05 zostały odfiltrowane w celu wykrycia nowych izoform biegnących spinkami do mankietów bez odniesienia.Transkryptom porównuje przykładowe pliki transkrypcji z genomem referencyjnym za pomocą porównania mankietowego. Przetestuj ekspresję różnicową za pomocą różnicy mankietowej, używając połączonych plików transkryptów trombiny jako genomu referencyjnego dla jednej analizy i połączonych plików transkrypcji kontrolnych jako genomu referencyjnego dla drugiej analizy, ponownie użyj arkusza kalkulacyjnego, aby zwizualizować wynik w formacie tabelarycznym. Tak jak poprzednio, transkrypty genów o FPKM mniejszym niż 0,05 i p większym niż 0,05 zostały odfiltrowane.Po tym kroku badacze mogą zdecydować się na przesłanie listy nowo zgłoszonych transkryptów na stronę internetową przeglądarki genomu uc SC w celu zweryfikowania ich ważności poprzez ręczną inspekcję. Listy genów o zróżnicowanej ekspresji można również przesłać do analizy szlaku pomysłowości w celu scharakteryzowania genów i szlaków, na które wpływa leczenie trombiną. Na tym etapie badacze mogą zdecydować się na użycie cummerbund pakietu R, który ma na celu pomoc i uproszczenie zadania analizy spinki do mankietów RN aeq output, aby pomóc w zarządzaniu, wizualizacji i integracji wszystkich danych uzyskanych przez analizę różnicową mankietów.Walidacja wyników RN aeq jest następnie przeprowadzana przez Q-R-T-P-C-R, najpierw przeprowadza się całkowitą izolację RNA z kontroli i trombiny ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc, ocenę jakości RNA i kwantyfikację RNA, jak pokazano wcześniej w filmie. Następnie wygeneruj komplementarne DNA z jednego mikrograma całkowitego RNA każdej próbki z indeksem górnym systemu syntezy trzech pierwszych nici rt zgodnie z instrukcjami producenta. Na koniec przeprowadź analizę Q-R-T-P-C-R w systemie VI a seven do PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu testu TAC MAN zaprojektowanego na żądanie nukleotydów wymienionych w pisemnym protokole dołączonym do tego filmu i zmierz ilościowo zgodnie z opisem.Stosunek 28 s do 18 S jest tradycyjnie używany jako wskaźnik degradacji RNA Aby dokładniej określić ilościowo degradację, system doświadczeń oblicza wskaźnik jakości RNA lub liczbę RQI. Algorytm RQI porównuje elektroferogram próbek RNA z danymi z serii standaryzowanych zdegradowanych próbek RNA i automatycznie zwraca liczbę z zakresu od 10 do jednego. Próbka RNA powinna mieć RQI co najmniej siedem, a najlepiej większą niż osiem.Wyniki Experian wskazują na wysokiej jakości próbkę RNA o RQI 8,4. Biblioteki powinny mieć łącze szerokopasmowe na poziomie około 250 do 300 par podstaw, jak pokazano na rysunku wyników Experian dla biblioteki wysokiej jakości. Tutaj pokazane są wyniki Q-R-T-P-C-R próbek krzywej wzorcowej i jednej nieznanej próbki.Postęp i jakość sekwencjonowania powinny być stale obserwowane przez cały czas trwania cyklu. Na tym rysunku przedstawiono odpowiednią gęstość klastrów na etapie obrazowania w pierwszym cyklu. Jest to pierwsza wskazówka dotycząca biegu.Klastry wysokiej jakości powinny być jasne i skoncentrowane. Pokazano przykład pierwszego raportu bazowego wygenerowanego po zakończeniu pierwszego cyklu. Ważne jest, aby w tym momencie ocenić szacowane poziomy gęstości skupienia i jakość ostrości.Następny punkt kontroli jakości po czwartym cyklu jest pokazany tutaj. Pokazuje bezwzględne zagęszczenie klastrów dla każdego pasa ruchu. Gęstość klastra nie powinna przekraczać 850 K na milimetr kwadratowy po cyklu 13.Obliczane są statystyki fazowania i wstępnego etapowania. Typowe liczby mieszczą się w przedziale od 0,1 do 0,25. Główna ocena jakości jest możliwa po cyklu 24, kiedy obliczanych jest kilka wskaźników jakości.Procent odczytów powyżej Q3 jest miarą zaufania do bazy. Wywołanie odczytu z wynikiem Q równym trzy oznacza, że istnieje szansa jeden na 1000, że podstawowe wywołanie jest nieprawidłowe. Wyniki Q będą się zmniejszać wraz z postępem biegu, ale powinny zaczynać się od więcej niż 95% readów spełniających lub przekraczających Q3. Klastry przechodzące przez filtr lub pf to klastry, z których zostaną pobrane rzeczywiste dane sekwencji.Idealnie byłoby, gdyby było to powyżej 85%Klaster pf opiera się na wielu czynnikach, w tym na fazowaniu, intensywności wstępnej fazy, a Q3.It nie zmieni się wraz z postępem biegu. Procent wyrównania jest miarą odczytów, które dostosowują czas rzeczywisty do genomu FI x. Ponieważ około 1% biblioteki FI x zostało wzbogacone do bibliotek przykładowych, procent wyrównania powinien wynosić od 0,5 do jednego.Ta statystyka pokazuje, że zawartość biblioteki jest dobrze reprezentowana przez klastry i nie było błędu systematycznego generowania klastrów, wymienione tutaj są ekspresja genów i izoform zarówno w kontrolnych, jak i trombinach ludzkich mikronaczyniowych komórek śródbłonka płuc. Warto zauważyć, że wykryto około 26 000 nowych izoform, co ilustruje siłę aeq RN. Może identyfikować nieznane RNA.Alternatywnie, spliced transcripts i alternatywne użycie promotora, które nie są wykrywalne przez techniki mikromacierzy. RNA-Seq może również mierzyć mniej obfite transkrypty, które są niedokładne, określone ilościowo lub nie są wykrywane przez mikromacierze w celu walidacji wyników RNA-Seq przy użyciu alternatywnego podejścia. Eksperyment A-Q-R-T-P-C-R przeprowadzono w celu oznaczenia trzech różnych genów w danych RNA-Seq TR, z których jeden był regulowany w górę 7,96-krotnie.Jeden został obniżony o 1,16 razy, a dzięki dwóm został obniżony o 1,70 razy w danych Q-R-T-P-C-R, te odpowiadające im liczby to odpowiednio plus 7,25 razy minus 1,15 razy i minus 2,07 razy. Wyniki tych trzech genów testowanych za pomocą RNA-Seq i Q-R-T-P-C-R są zgodne, co potwierdza wyniki RNA-Seq. Protokół ten jest specyficzny dla IC w jednym punkcie czasowym ludzkiego mikrokrążenia płucnego leczonego trobiną w komórkach senioralnych, ale można go łatwo dostosować do badania wielopunktowego lub badań w tkankach innych komórek traktowanych różnymi bodźcami lub inhibitorami lub porównania transkryptomów w komórkach lub tkankach między stanem zdrowym a stanem chorobowym.Chociaż jest specyficzny dla wysokiego SQ 1000, protokół ten ma zastosowanie do każdej rodziny HighSeq lub analizatora genomu. Dwa instrumenty z niewielkimi modyfikacjami etapów generowania klastra i odczynników sekwencjonowania. Inne platformy sekwencjonowania DNA nowej generacji, takie jak seria stała.Systemy GS, jak również niektóre pojawiające się nowsze systemy, są również wykorzystywane do celów sekwencjonowania RNA. Chociaż ich budowa biblioteki i procedury sekwencjonowania mogą się nieco różnić, wskazówki dotyczące obsługi RNA, fragmenty analizy danych i walidacja przez R-T-P-C-R przedstawione w tym protokole mogą mieć wartość referencyjną dla ich aplikacji RNA-Seq.

rna-seq-analysis-transcriptomes-thrombin-treated-control-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza RNA-seq transkryptomów w komórkach śródbłonka naczyń włosowatych płucnych człowieka, traktowanych torembiną i kontrolnych

Sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne zostały wykorzystane do identyfikacji znacząco i różnicowo wyrażonych czynników transkrypcyjnych w subpopulacjach Lin-CD34+ i Lin-CD34- mysich komórek EML. Te czynniki transkrypcyjne mogą odgrywać ważną rolę w określaniu przełączania między samoodnawiającymi się komórkami Lin-CD34 + a częściowo zróżnicowanymi komórkami Lin-CD34.

Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA

Śródbłonek naczyniowy ściśle kontroluje rekrutację leukocytów. Niewystarczające wynaczynienie leukocytów przyczynia się do chorób zapalnych u ludzi. Dlatego poszukiwanie nowych elementów regulacyjnych aktywacji śródbłonka jest niezbędne do projektowania ulepszonych terapii zaburzeń zapalnych. W tym miejscu opisujemy kompleksową metodologię charakteryzującą nowe regulatory śródbłonka, które mogą modyfikować transport leukocytów podczas stanu zapalnego.

Testy przesiewowe w celu scharakteryzowania nowych regulatorów śródbłonka zaangażowanych w odpowiedź zapalną

Opisano protokół indukcji in vitro przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego (EndMT), który jest przydatny do badania szlaków sygnalizacji komórkowej związanych z EndMT. W tym modelu eksperymentalnym EndMT jest indukowany przez leczenie TGF-β w komórkach śródbłonka MS-1.

Analiza molekularna przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego wywołanego sygnalizacją transformacji czynnika wzrostu β

terapia miRNA ma znaczący potencjał w regulowaniu progresji raka. Zademonstrowano tu podejścia analityczne stosowane do identyfikacji aktywności kombinatorycznego leczenia miRNA w zatrzymywaniu cyklu komórkowego i angiogenezie.

Analiza skojarzonych zabiegów miRNA w celu regulacji cyklu komórkowego i angiogenezy

Prezentujemy podejście do oczyszczania mRNA związanego z rybosomami z komórek śródbłonka naczyń krwionośnych (EC) bezpośrednio w tkankach mózgu, płuc i serca myszy za pomocą specyficznego dla EC znacznika genetycznego wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) w rybosomach w połączeniu z oczyszczaniem RNA.

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) do izolacji RNA z komórek śródbłonka in vivo

Prezentujemy model choroby naczyniowej in vitro do zbadania interakcji krwi pełnej ze śródbłonkiem pochodzącym od pacjenta. System ten pozwala na badanie właściwości trombogennych pierwotnych komórek śródbłonka w różnych okolicznościach. Metoda ta jest szczególnie przydatna do oceny trombogenności in situ i terapii przeciwzakrzepowej w różnych fazach krzepnięcia.

Model choroby mikroprzepływowej in vitro do badania interakcji krew pełna - śródbłonek i dynamiki zakrzepów krwi w czasie rzeczywistym

Protokół opisuje izolację, hodowlę i profilowanie komórek śródbłonka z ludzkiej tętnicy krezkowej. Dodatkowo opracowano metodę przygotowania tętnicy człowieka do transkryptomiki przestrzennej. Proteomika, transkryptomika i testy funkcjonalne mogą być wykonywane na izolowanych komórkach. Protokół ten można zastosować do każdej tętnicy średniej lub dużej wielkości.

Izolacja i profilowanie ludzkich pierwotnych komórek śródbłonka tętnic krezkowych na poziomie transkryptomu

Ten protokół opisuje proces od hodowli komórkowych ex vivo lub in vitro do wstępnego przetwarzania danych transkryptomicznych w celu opłacalnego badania przesiewowego leków opartego na transkryptomie.

Ekonomiczne badania przesiewowe leków oparte na transkryptomii

Protokół ten obejmuje krok po kroku workflow dla zwapniałych próbek naczyniowych: obsługę tkanek, odwapnianie, walidację RNA, wykrywanie poziomu zwapnienia oraz strategie wyboru regionów zainteresowania na Nanostring GeoMx Digital Spatial Profilere (DSP). Celem jest przedstawienie kompleksowej metody zachowania morfologii tkanek naczyniowych oraz RNA do wiarygodnej analizy transkryptomii przestrzennej.

Przygotowanie i przetwarzanie zwapnionych tętnic z zachowaną morfologią i RNA do cyfrowego profilowania przestrzennego

Praca ta opisuje test mikrofluidyczny, który wykorzystuje naprężenie ścinające do wywołania powstawania zakrzepów we krwi i charakteryzuje zakrzep za pomocą wielu wymiarów odczytu. Test pozwala mierzyć tendencję protrombotyczną próbek krwi, dzięki czemu jest przydatny w diagnozowaniu chorób, odkrywaniu leków oraz podstawowych badaniach mechanistycznych związanych z zakrzepicą.

Testy profilowania zakrzepów: platforma oparta na mikrofluidyce do kompleksowej charakterystyki trombogenezy biomechanicznej

Poznaj metodę RNA-seq do analizy transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną. Protokół obejmuje izolację RNA, budowę bibliotek i sekwencjonowanie.

Analiza sekwencyjna RNA transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną i kontrolnych

Przeglądaj więcej filmów