Analiza sekwencyjna RNA transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną i kontrolnych

Ogólnym celem tej procedury jest przedstawienie kompletnego i szczegółowego procesu zastosowania RNA-Seq, potężnej technologii sekwencjonowania DNA nowej generacji, do profilowania transkryptomów. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie całkowitego RNA z ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc z leczeniem trombiną lub bez niej i sprawdzenie jakości RNA. Drugim krokiem jest skonstruowanie bibliotek DNA z tych próbek RNA.

Usprawnij generowanie klastrów za pomocą instrumentu cbot i wykonaj zadanie sekwencjonowania DNA na HighSeq 1000. Następnie przeprowadzana jest analiza danych, aby ostatecznie zidentyfikować i wyświetlić transkrypty genów o zróżnicowanej ekspresji. Ostatnim krokiem jest walidacja wyników RN aeq przez RT TP CR. Główną zaletą IC w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikromacierz DNA do analizy transkryptomu, jest to, że IC może profilować cały transkryptom, dostarczać dane cyfrowe i nie polegać na żadnej znanej genomizacji ekspresji genów w komórkach.

Pomiar poziomu MRA jest użytecznym narzędziem w określaniu, w jaki sposób sygnały zewnętrzne wpływają na transkrypcję maszynerii komórki lub jak komórki różnią się między stanem zdrowia a stanem chorobowym. W tym protokole zademonstrujemy analizę IC transkryptomów w komórkach Indo syn leczonych trobiną i kontrolnych ludzkich mikronaczyniowych komórkach Indo. Protokół ten opiera się na naszym niedawno opublikowanym badaniu, w którym z powodzeniem przeprowadziliśmy pierwszą pełną analizę transkryptomu ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc traktowanych trombiną przy użyciu RNA-Seq na High SEQ 1000, popularnej platformie sekwencjonowania DNA nowej generacji.Pani

Suman Shaha zademonstruje sekwencjonowanie DNA na instrumencie o wysokim SEQ 1000, a także eksperyment walidacyjny R-T-P-C-R. Korzystając z systemu VS seven R-T-P-C-R, dr Denova zademonstruje leczenie trombiną ludzkich komórek płucnych, mikronaczyniowych komórek śródbłonka i izolację całkowitego komórkowego RNA. Pani Margaret Gibson zademonstruje system Experian do sprawdzania jakości RNA i biblioteki DNA, a także generowania klastrów na cbocie.

A dr Dimitri Gregor zademonstruje analizę danych, aby rozpocząć tę kulturę protokołu. Ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego płuc do zbiegu od 90 do 100% w sześciu płytkach dołkowych w pożywce EGM dwie z 5% czynnikami wzrostu FBS i antybiotykami. Zmienić pożywkę na pożywkę głodową 30 minut przed leczeniem trombiną.

Po 30 minutach potraktuj komórki 0,05 jednostki na mililitr, trombiną lub pozostaw bez leczenia jako kontrolę. Inkubuj komórki przez sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po sześciogodzinnej kuracji.

Wyizoluj całkowite RNA z leczonych i kontrolnych komórek za pomocą zestawu Nirvana zgodnie z instrukcjami producenta. Oceń jakość RNA za pomocą eukariotycznego chipa RNA Experian o standardowym wyczuwalnym wymyśle, zgodnie ze standardowym protokołem na automatycznej stacji elektroforezy Experian. Na koniec określ ilościowo RNA przy użyciu standardowej metody spektrofotometrycznej do budowy biblioteki.

Użyj jednego mikrograma wysokiej jakości całkowitego RNA na próbkę jako materiału wyjściowego do budowy biblioteki. Postępuj zgodnie ze standardowym protokołem producenta. W tym protokole przeprowadzane są dwie rundy selekcji poli zawierających Mr.mRNA.

Aby usunąć nasze RNA, aby zminimalizować sekwencjonowanie RNA, oceń jakość bibliotek za pomocą chipa Experian DNA one K. Zgodnie ze standardowym protokołem na zautomatyzowanej stacji elektroforezy Experian. Określ ilościowo bibliotekę za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym.

W skrócie Q-R-T-P-C-R zgodnie z opisem w pisemnym protokole. Dołączając ten film, uruchom Q-R-T-P-C-R zgodnie z protokołem cyber green MM i oblicz pierwotne stężenie zapasów każdej biblioteki. Rozcieńczyć zapasy biblioteczne do 10 nanomolowych i przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Gdy komora przepływowa będzie gotowa do zgrupowania, rozmrozić płytkę odczynnika cbot w łaźni wodnej. CBOT jest instrumentem służącym do usprawnienia procesu generowania klastrów. Po umyciu instrumentu cbot należy zdenaturować biblioteki, najpierw łącząc 13 mikrolitrów jednego XTE i sześć mikrolitrów 10 nanomolowych.

Biblioteka następnie z boku każdej probówki, dodaj jeden mikrolitr jednego normalnego wodorotlenku sodu, wiruj probówki w dół i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie umieść zdenaturowane biblioteki na lodzie. Następnie rozcieńczyć zdenaturowane biblioteki wstępnie schłodzonym buforem hybrydyzacyjnym, łącząc 996 mikrolitrów buforu i 4,0 mikrolitrów zdenaturowanej biblioteki, aby uzyskać końcowe stężenie 12 pikomolowców.

Umieść zdenaturowane, rozcieńczone biblioteki na. Następnie odwróć każdy rząd probówek na płytce cbot, upewniając się, że wszystkie odczynniki są rozmrożone. Po odwirowaniu płyty zdejmij uszczelkę foliową z rzędu rurek z wodorotlenkiem sodu i załaduj na podwielokrotność cbot.

120 mikrolitrów rozcieńczonych, zdenaturowanych bibliotek do probówki paskowej oznaczonej od jednego do ośmiu. Dodaj 1,2 mikrolitra rozcieńczonej, zdenaturowanej biblioteki kontrolnej PHI X do każdej probówki jako skok kontroli. Po wirowaniu i obracaniu rurek, załaduj je na cbot we właściwej orientacji z rurką numer jeden po prawej stronie.

Załaduj komórkę przepływową i kolektor na cbot. Zakończ sprawdzanie przepływu i rozpocznij przebieg klastrowania. Po zakończeniu przebiegu sprawdź dostarczanie odczynnika na wszystkich torach.

Zanotuj wszelkie nieprawidłowości. Albo natychmiast rozpocznij sekwencjonowanie, albo przechowuj komórkę przepływową w dostarczonej probówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby rozpocząć sekwencjonowanie.

Rozmrozić sekwencjonowanie za pomocą odczynników do syntezy. Załaduj odczynniki w odpowiednie miejsca na tackach na odczynniki, uważając, aby nie dotknąć innych odczynników. Po dotknięciu mieszanki rozszczepiającej, za pomocą celi przepływowej bez sekwencjonowania, dwukrotnie zagruntuj linie odczynników, dokładnie wyczyść komórkę przepływu sekwencjonowania 70% etanolem i chusteczkami Kim, a następnie 70% etanolem i papierem do soczewek.

Sprawdź komorę przepływową pod kątem smug i wyczyść ją ponownie, jeśli to konieczne. Załaduj komórkę przepływową do sekwencera i przeprowadź kontrolę przepływu, aby upewnić się, że uszczelnienie między kolektorami a komorą przepływową jest szczelne. Rozpocznij sekwencjonowanie.

Oceń metryki jakości, gdy staną się dostępne podczas przebiegu Monitoruj intensywność przez cały przebieg. Po zakończeniu 101 cykli. Wykonaj badanie chemiczne na odwrócenie, aby zakończyć drugi odczyt.

Pierwszy ojciec sparował i odczynniki, a drugi odczytał bufor inkorporacji. Następnie załaduj odczynniki, kontynuuj sekwencjonowanie, uruchom ocenę. Po drugie, odczytuj intensywność Q3 i inne wskaźniki jakości w miarę postępu biegu.

Aby rozpocząć analizę danych, użyj najnowszej wersji manioku, aby przekonwertować podstawowe pliki wywołań na pliki FAST Q. Ustawienie szybkiej liczby klastrów Q na zero, aby zapewnić utworzenie pojedynczego szybkiego pliku Q. Dla każdej próbki rozpakuj szybkie pliki Q w celu dalszej analizy.

Wykonuj sparowanie i wyrównanie przy użyciu najnowszej wersji cylindra, która wyrównuje odczyty RNA-Seq do genomów wielkości ssaków przy użyciu narzędzi krótkiego odczytu o ultra wysokiej przepustowości i SAM, które implementują różne narzędzia do wyrównywania po przetwarzaniu w formacie SAM. Referencyjny transkryptom człowieka można pobrać z I genomów w rundzie, w którym użyto wszystkich domyślnych ustawień parametrów, w tym opcji typu biblioteki jako fragmentu nieskręconego za pomocą części programu cuff diff pakietu oprogramowania spinki do mankietów. Porównaj komórki traktowane trombiną z komórkami kontrolnymi.

Przesiać transkrypty genów o zróżnicowanej ekspresji w komórkach traktowanych trombiną w oparciu o ludzki transkryptom referencyjny. Następnie użyj arkusza kalkulacyjnego, aby zwizualizować wynik w formie tabeli. W tym przypadku użyto wszystkich domyślnych ustawień parametrów, a transkrypty genów o FPKM mniejszym niż 0,05 i p większym niż 0,05 zostały odfiltrowane w celu wykrycia nowych izoform biegnących spinkami do mankietów bez odniesienia.

Transkryptom porównuje przykładowe pliki transkrypcji z genomem referencyjnym za pomocą porównania mankietowego. Przetestuj ekspresję różnicową za pomocą różnicy mankietowej, używając połączonych plików transkryptów trombiny jako genomu referencyjnego dla jednej analizy i połączonych plików transkrypcji kontrolnych jako genomu referencyjnego dla drugiej analizy, ponownie użyj arkusza kalkulacyjnego, aby zwizualizować wynik w formacie tabelarycznym. Tak jak poprzednio, transkrypty genów o FPKM mniejszym niż 0,05 i p większym niż 0,05 zostały odfiltrowane.

Po tym kroku badacze mogą zdecydować się na przesłanie listy nowo zgłoszonych transkryptów na stronę internetową przeglądarki genomu uc SC w celu zweryfikowania ich ważności poprzez ręczną inspekcję. Listy genów o zróżnicowanej ekspresji można również przesłać do analizy szlaku pomysłowości w celu scharakteryzowania genów i szlaków, na które wpływa leczenie trombiną. Na tym etapie badacze mogą zdecydować się na użycie cummerbund pakietu R, który ma na celu pomoc i uproszczenie zadania analizy spinki do mankietów RN aeq output, aby pomóc w zarządzaniu, wizualizacji i integracji wszystkich danych uzyskanych przez analizę różnicową mankietów.

Walidacja wyników RN aeq jest następnie przeprowadzana przez Q-R-T-P-C-R, najpierw przeprowadza się całkowitą izolację RNA z kontroli i trombiny ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc, ocenę jakości RNA i kwantyfikację RNA, jak pokazano wcześniej w filmie. Następnie wygeneruj komplementarne DNA z jednego mikrograma całkowitego RNA każdej próbki z indeksem górnym systemu syntezy trzech pierwszych nici rt zgodnie z instrukcjami producenta. Na koniec przeprowadź analizę Q-R-T-P-C-R w systemie VI a seven do PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu testu TAC MAN zaprojektowanego na żądanie nukleotydów wymienionych w pisemnym protokole dołączonym do tego filmu i zmierz ilościowo zgodnie z opisem.

Stosunek 28 s do 18 S jest tradycyjnie używany jako wskaźnik degradacji RNA Aby dokładniej określić ilościowo degradację, system doświadczeń oblicza wskaźnik jakości RNA lub liczbę RQI. Algorytm RQI porównuje elektroferogram próbek RNA z danymi z serii standaryzowanych zdegradowanych próbek RNA i automatycznie zwraca liczbę z zakresu od 10 do jednego. Próbka RNA powinna mieć RQI co najmniej siedem, a najlepiej większą niż osiem.

Wyniki Experian wskazują na wysokiej jakości próbkę RNA o RQI 8,4. Biblioteki powinny mieć łącze szerokopasmowe na poziomie około 250 do 300 par podstaw, jak pokazano na rysunku wyników Experian dla biblioteki wysokiej jakości. Tutaj pokazane są wyniki Q-R-T-P-C-R próbek krzywej wzorcowej i jednej nieznanej próbki.

Postęp i jakość sekwencjonowania powinny być stale obserwowane przez cały czas trwania cyklu. Na tym rysunku przedstawiono odpowiednią gęstość klastrów na etapie obrazowania w pierwszym cyklu. Jest to pierwsza wskazówka dotycząca biegu.

Klastry wysokiej jakości powinny być jasne i skoncentrowane. Pokazano przykład pierwszego raportu bazowego wygenerowanego po zakończeniu pierwszego cyklu. Ważne jest, aby w tym momencie ocenić szacowane poziomy gęstości skupienia i jakość ostrości.

Następny punkt kontroli jakości po czwartym cyklu jest pokazany tutaj. Pokazuje bezwzględne zagęszczenie klastrów dla każdego pasa ruchu. Gęstość klastra nie powinna przekraczać 850 K na milimetr kwadratowy po cyklu 13.

Obliczane są statystyki fazowania i wstępnego etapowania. Typowe liczby mieszczą się w przedziale od 0,1 do 0,25. Główna ocena jakości jest możliwa po cyklu 24, kiedy obliczanych jest kilka wskaźników jakości.

Procent odczytów powyżej Q3 jest miarą zaufania do bazy. Wywołanie odczytu z wynikiem Q równym trzy oznacza, że istnieje szansa jeden na 1000, że podstawowe wywołanie jest nieprawidłowe. Wyniki Q będą się zmniejszać wraz z postępem biegu, ale powinny zaczynać się od więcej niż 95% readów spełniających lub przekraczających Q3. Klastry przechodzące przez filtr lub pf to klastry, z których zostaną pobrane rzeczywiste dane sekwencji.

Idealnie byłoby, gdyby było to powyżej 85%Klaster pf opiera się na wielu czynnikach, w tym na fazowaniu, intensywności wstępnej fazy, a Q3.It nie zmieni się wraz z postępem biegu. Procent wyrównania jest miarą odczytów, które dostosowują czas rzeczywisty do genomu FI x. Ponieważ około 1% biblioteki FI x zostało wzbogacone do bibliotek przykładowych, procent wyrównania powinien wynosić od 0,5 do jednego.

Ta statystyka pokazuje, że zawartość biblioteki jest dobrze reprezentowana przez klastry i nie było błędu systematycznego generowania klastrów, wymienione tutaj są ekspresja genów i izoform zarówno w kontrolnych, jak i trombinach ludzkich mikronaczyniowych komórek śródbłonka płuc. Warto zauważyć, że wykryto około 26 000 nowych izoform, co ilustruje siłę aeq RN. Może identyfikować nieznane RNA.

Alternatywnie, spliced transcripts i alternatywne użycie promotora, które nie są wykrywalne przez techniki mikromacierzy. RNA-Seq może również mierzyć mniej obfite transkrypty, które są niedokładne, określone ilościowo lub nie są wykrywane przez mikromacierze w celu walidacji wyników RNA-Seq przy użyciu alternatywnego podejścia. Eksperyment A-Q-R-T-P-C-R przeprowadzono w celu oznaczenia trzech różnych genów w danych RNA-Seq TR, z których jeden był regulowany w górę 7,96-krotnie.

Jeden został obniżony o 1,16 razy, a dzięki dwóm został obniżony o 1,70 razy w danych Q-R-T-P-C-R, te odpowiadające im liczby to odpowiednio plus 7,25 razy minus 1,15 razy i minus 2,07 razy. Wyniki tych trzech genów testowanych za pomocą RNA-Seq i Q-R-T-P-C-R są zgodne, co potwierdza wyniki RNA-Seq. Protokół ten jest specyficzny dla IC w jednym punkcie czasowym ludzkiego mikrokrążenia płucnego leczonego trobiną w komórkach senioralnych, ale można go łatwo dostosować do badania wielopunktowego lub badań w tkankach innych komórek traktowanych różnymi bodźcami lub inhibitorami lub porównania transkryptomów w komórkach lub tkankach między stanem zdrowym a stanem chorobowym.

Chociaż jest specyficzny dla wysokiego SQ 1000, protokół ten ma zastosowanie do każdej rodziny HighSeq lub analizatora genomu. Dwa instrumenty z niewielkimi modyfikacjami etapów generowania klastra i odczynników sekwencjonowania. Inne platformy sekwencjonowania DNA nowej generacji, takie jak seria stała.

Systemy GS, jak również niektóre pojawiające się nowsze systemy, są również wykorzystywane do celów sekwencjonowania RNA. Chociaż ich budowa biblioteki i procedury sekwencjonowania mogą się nieco różnić, wskazówki dotyczące obsługi RNA, fragmenty analizy danych i walidacja przez R-T-P-C-R przedstawione w tym protokole mogą mieć wartość referencyjną dla ich aplikacji RNA-Seq.