Name: Analiza sekwencyjna RNA transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną i kontrolnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 30 s
Description: Poznaj metodę RNA-seq do analizy transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną. Protokół obejmuje izolację RNA, budowę bibliotek i sekwencjonowanie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Stephenowi Kingsmore'owi i Centrum Medycyny Genomu Pediatrycznego w Szpitalach i Klinikach Miłosierdzia Dziecięcego za wykorzystanie ich klastrów obliczeniowych do analizy danych, zespołowi usług terenowych Illumina (Elizabeth Boyer, Scott Cook i Mark Cook) oraz zespołowi konsultantów technicznych za szybkie odpowiedzi i pomocne sugestie dotyczące działania instrumentu do sekwencjonowania DNA nowej generacji, HiScanSQ i analiza jakości danych. Praca ta była częściowo wspierana przez National Institutes of Health Grant HL080042 (dla S.Q.Y.) oraz fundusz początkowy i fundację Children's Mercy Hospitals and Clinics, University of Missouri w Kansas City (dla S.Q.Y.).

Schemat blokowy przedstawiający ten protokół jest wyświetlany na rysunku 1.
1. Leczenie komórek trombiną, izolacja RNA, ocena jakości i kwantyfikacja RNA
<ol>
	<li>Hodowla ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc (HMVEC-LBl) do 90-100% konfluencji w płytkach 6-dołkowych w pożywce EGM-2 z 5% FBS, czynnikami wzrostu i antybiotykami (Lonza, kat. # CC-3202).</li>
	<li>Zmienić pożywkę na pożywkę głodową (0% FBS) 30 minut przed leczeniem trombiną.</li>
	<li>Potraktować komórki trombiną o stężeniu 0,05 U/ml lub pozostawić bez leczenia jako kontrolę przez 6 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Wyizoluj całkowite RNA z komórek poddanych działaniu środka i kontrolnych za pomocą zestawu Ambion mirVana zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Oceń jakość RNA za pomocą chipa eukariotycznego RNA Experion StdSense zgodnie ze standardowym protokołem na automatycznej stacji elektroforezy Experion (<a href="http://www.bio-rad.com" target="_blank">www.bio-rad.com</a>).</li>
	<li>Określić ilościowo RNA przy użyciu standardowej metody spektrofotometrycznej.</li>
</ol>
2. Budowa i sekwencjonowanie bibliotek
<ol>
	<li>Jako materiał wyjściowy należy użyć 1 μg wysokiej jakości całkowitego RNA na próbkę.</li>
	<li>Aby zbudować bibliotekę, postępuj zgodnie ze standardową procedurą firmy Illumina (protokół # 15008136 Rev. A). W tym protokole wykonywane są dwie rundy selekcji poli(A) zawierającej mRNA w celu usunięcia rRNA w celu zminimalizowania sekwencjonowania rRNA.</li>
	<li>Oceń jakość bibliotek za pomocą chipa Experion DNA 1K zgodnie ze standardowym protokołem na Automatycznej Stacji Elektroforezy Experion (<a href="http://www.bio-rad.com" target="_blank">www.bio-rad.com</a>).</li>
	<li>Określ ilościowo bibliotekę za pomocą qPCR: Użyj biblioteki, która została wcześniej zsekwencjonowana jako krzywa standardowa i startery specyficzne dla ligowanych adapterów. Użyj zakresu rozcieńczeń nieznanych bibliotek (np. 1:100, 1:500 i 1:1,000). Uruchom qPCR zgodnie z protokołem SyberGreen MM i oblicz pierwotne stężenie zapasów w każdej bibliotece.</li>
	<li>Rozcieńczyć zapasy biblioteczne do 10 nM i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będą gotowe do grupowania w komórkę przepływową.</li>
	<li>Gdy będziesz gotowy do grupowania komory przepływowej, rozmrozić płytkę odczynnika cBot w łaźni wodnej. cBot to instrument firmy Illumina używany do usprawnienia procesu generowania klastrów.</li>
	<li>Umyj instrument cBot.</li>
	<li>Denaturuj biblioteki: Połącz 13 μl biblioteki 1x TE i 6 μl 10 μM, a z boku probówki dodaj 1 μl 1 N NaOH (dostarczone przez Illumina). Wirować, odwirować, inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut i umieścić zdenaturowane biblioteki na lodzie.</li>
	<li>Rozcieńczyć biblioteki: Rozcieńczyć zdenaturowane biblioteki wstępnie schłodzonym buforem hybrydyzacyjnym (HT1, dostarczonym przez Illumina) poprzez połączenie 996 μl HT1 i 4 μl zdenaturowanej biblioteki w celu uzyskania końcowego stężenia 12 pM. Umieść zdenaturowane i rozcieńczone biblioteki na lodzie.</li>
	<li>Odwróć każdy rząd probówek na płytce cBot, upewniając się, że wszystkie odczynniki są rozmrożone. Zakręć płytką, usuń/przebij uszczelki foliowe i załaduj na cBota.</li>
	<li>Podwielokrotność 120 μl rozcieńczonych, zdenaturowanych bibliotek do probówki paskowej, oznaczonej 1-8. Dodaj 1,2 μl rozcieńczonej, zdenaturowanej biblioteki kontrolnej PhiX (od Illumina) do każdej probówki jako kontrolę skokową. Wiruj i zakręć rurki w dół i załaduj je na cBot we właściwej orientacji (rura #1 po prawej).</li>
	<li>Załaduj komórkę przepływową i kolektor do cBota.</li>
	<li>Zakończ sprawdzanie przepływu i rozpocznij przebieg klastrowania.</li>
	<li>Po zakończeniu przebiegu sprawdź dostarczanie odczynnika na wszystkich torach. Zanotuj wszelkie nieprawidłowości. Albo natychmiast rozpocząć sekwencjonowanie, albo umieścić komórkę przepływową w dostarczonej probówce w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Rozmrozić odczynniki do sekwencjonowania przez syntezę (SBS, Illumina).</li>
	<li>Załaduj odczynniki w odpowiednie miejsca na tackach na odczynniki, uważając, aby nie dotknąć innych odczynników po dotknięciu mieszanki rozszczepienia.</li>
	<li>Używając komory przepływowej bez sekwencjonowania (tj. takiej, która została wcześniej zsekwencjonowana), dwukrotnie zalać linie odczynników.</li>
	<li>Dokładnie wyczyść komórkę przepływową sekwencjonowania 70% EtOH i Kimwipes, a następnie 70% EtOH i papierem do soczewek. Sprawdź komórkę przepływową pod kątem smug. W razie potrzeby wyczyść go ponownie.</li>
	<li>Załaduj komórkę przepływową do sekwencera i przeprowadź kontrolę przepływu, aby upewnić się, że uszczelnienie między kolektorami a komorą przepływową jest szczelne.</li>
	<li>Rozpocznij sekwencjonowanie.</li>
	<li>Oceń metryki jakości (np. gęstość klastrów, klastry przechodzące filtr, Q30, intensywność), gdy stają się dostępne podczas uruchamiania.</li>
	<li>Monitoruj intensywność przez cały bieg.</li>
	<li>Po zakończeniu 101 cykli wykonaj proces chemiczny, aby zakończyć drugi odczyt: Rozmrozić sparowane odczynniki końcowe i drugi odczyt bufora inkorporacji (ICB, składnik odczynników SBS, Illumina) i załaduj odczynniki.</li>
	<li>Kontynuuj sekwencjonowanie, oceniając intensywność odczytu 2.stopnia, Q30 i inne wskaźniki jakości w miarę postępu przebiegu.</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Użyj najnowszej wersji CASAVA (Illumina, obecnie 1.8.2), aby przekonwertować pliki podstawowych plików wywołań (.bcl) na pliki .fastq, ustawiając fastq-cluster-count na 0, aby zapewnić utworzenie jednego pliku fastq dla każdej próbki. Rozpakuj pliki fastq w celu dalszej analizy.</li>
	<li>Wykonaj wyrównanie sparowanych końców przy użyciu najnowszych wersji TopHat (1.4.1)5, który wyrównuje odczyty sekwencyjne RNA do genomów ssaków za pomocą ultra wysokowydajnego wyrównywacza krótkiego odczytu (Bowtie,0.12.7)6 i SAMtools (0.1.17)7. SAMtools implementuje różne narzędzia do wyrównania po przetwarzaniu w formacie SAM. Referencyjny transkryptom człowieka można pobrać ze strony iGenomes (<a href="http://www.illumina.com" target="_blank">www.illumina.com</a>). Uruchamiając TopHat, użyliśmy wszystkich domyślnych ustawień parametrów, w tym opcji typu biblioteki jako fr-unstranded (domyślnie).</li>
	<li>Korzystając z programu CuffDiff, części pakietu oprogramowania CuffLinks (1.3.0)8, porównaj komórki traktowane trombiną z komórkami kontrolnymi, aby odsiać transkrypty genów o zróżnicowanej ekspresji w tych pierwszych na podstawie ludzkiego transkryptomu referencyjnego. To porównanie wykrywa różnicową ekspresję znanych transkryptów. Użyj programu Microsoft Excel, aby zwizualizować wynik w formie tabeli. Uruchamiając program Spinki do mankietów, użyliśmy wszystkich domyślnych ustawień parametrów. Te transkrypty genów z FPKM<0,05 i p>0,05 są odfiltrowywane.</li>
	<li>Aby wykryć nowe izoformy, uruchom spinki do mankietów bez transkryptomu referencyjnego. Porównaj pliki transkrypcji próbki z genomem referencyjnym za pomocą Cuffcompare i przetestuj ekspresję różnicową za pomocą Cuffdiff, używając połączonych plików transkryptów trombiny jako genomu referencyjnego dla jednej analizy i połączonych kontrolnych plików transkryptów jako genomu referencyjnego dla drugiej analizy. Użyj programu Microsoft Excel, aby zwizualizować wynik w formacie tabelarycznym. Ponownie, te transkrypty genów z FPKM<0,05 i p>0,05 są odfiltrowywane. Po tym kroku badacze mogą zdecydować się na przesłanie listy nowo zgłoszonych transkryptów na stronę internetową UCSC Genome Browser (<a href="http://genome.ucsc.edu/" target="_blank">http://genome.ucsc.edu/</a>) w celu zweryfikowania ich ważności poprzez ręczną inspekcję.</li>
	<li>Prześlij listy genów o zróżnicowanej ekspresji do Ingenuity Pathway Analysis (IPA, <a href="http://www.ingenuity.com" target="_blank">www.ingenuity.com</a>) w celu scharakteryzowania genów i szlaków, na które wpływa leczenie trombiną. Na tym etapie badacze mogą zdecydować się na użycie CummeRbund (<a href="http://compbio.mit.edu/cummeRbund/" target="_blank">http://compbio.mit.edu/cummeRbund/</a>), pakietu R, który został zaprojektowany, aby pomóc i uprościć zadanie analizy danych wyjściowych RNA spinki do mankietów, aby pomóc w zarządzaniu, wizualizacji i integracji wszystkich danych uzyskanych w wyniku analizy Cuffdiff.</li>
</ol>
4. Walidacja wyników sekwencjonowania RNA za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)
<ol>
	<li>Przeprowadzić całkowitą izolację RNA z komórek kontrolnych i HMVEC-LBl traktowanych trombiną, ocenę jakości RNA i kwantyfikację RNA opisano w krokach od 1.4 do 1.6.</li>
	<li>Wygeneruj komplementarne DNA z 1 μg całkowitego RNA każdej próbki za pomocą zestawów RT SuperScript III First-Strand Synthesis System, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (Invitrogen, 18080-051).</li>
	<li>Wykonaj analizę qRT-PCR w systemie PCR w czasie rzeczywistym Applied Biosystems ViiA 7 przy użyciu oligonukleotydów zaprojektowanych przez Taqman Assay-on-Demand do wykrywania CUGBP, członka rodziny podobnego do Elav1 (CELF1, Hs00198069_m1), fankonianemii, grupy komplementacji D2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), czynnika 1 związanego z receptorem TNF (TRAF1, Hs01090170_m1) i β-aktyny (ACTB, Hs99999903_m1). Każda próbka miała matrycę odpowiadającą 5 ng całkowitego RNA. Zmierz ilościowo za pomocą metody DDCt i znormalizuj do β-aktyny. Każdy test przeprowadzono na co najmniej trzech kontrpróbach biologicznych.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li>
<li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq%3A+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).</li>
<li>Zhang, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+Reveals+Novel+Transcriptome+of+Genes+and+Their+Isoforms+in+Human+Pulmonary+Microvascular+Endothelial+Cells+Treated+with+Thrombin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin.</a> PLoS One. 7, e31229(2012).</li>
<li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat%3A+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10, R25(2009).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).</li>
<li>Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+years+of+pathway+analysis%3A+current+approaches+and+outstanding+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002375(2012).</li>
<li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+with+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Working with RNA.</a> Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).</li>
<li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+assembly+and+analysis+of+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">De novo assembly and analysis of RNA-seq data.</a> Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).</li>
<li>Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+methods+for+transcriptome+annotation+and+quantification+using+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq.</a> Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).</li>
<li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+transcriptome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Kluczowe kroki
Postępowanie z RNA: RNazy degradują nawet RNA o najwyższej jakości, dlatego należy zachować ostrożność podczas izolacji, przechowywania i stosowania RNA10. Rękawice są zawsze noszone, aby zapobiec zanieczyszczeniu RNazami znajdującymi się na ludzkich dłoniach. Rękawiczki należy często zmieniać, szczególnie po dotknięciu skóry, klamek lub innych wspólnych powierzchni. Zestaw pipet powinien być dedykowany wyłącznie do pracy z RNA, a wszystkie końcówki i ru...

<table><tbody><tr><td>Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka płuc</td><td>Lonza</td><td>CC-2815</td><td></td></tr><tr><td>Lonza, zestaw pocisków</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td>Zawiera EGM-2, FBS, czynniki wzrostu i antybiotyki</td></tr><tr><td>Trombin</td><td>Sigma</td><td>T4393</td><td></td></tr><tr><td>Ambion mirVana Kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM 1560</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Zap</td><td>Life Technologies</td><td>AM9782</td><td></td></tr><tr><td>Experion StdSens RNA</td><td>Bio-Rad</td><td>700-7103</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania RNA TruSeq</td><td>Illumina</td><td>FC-122-1001</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki AMPureXP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Indeks górny Odwrotna transkryptaza II</td><td>Life Technologies</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Experion DNA 1K</td><td>Bio-Rad</td><td>700-7107</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect SyberGreen Qiagen</td><td>204163</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do generowania klastrów PE</td> Zestaw sterujący <td>Illumina</td><td>PE-401-3001</td><td></td></tr><tr><td>PhiX</td><td>Zestaw kontrolny Illumina</td><td>FC110-301</td><td></td></tr><tr><td>200 cykli SBS</td><td>Illumina</td><td>FC-401-3001</td><td></td></tr><tr><td>HiScanSQ* </td><td>Illumina</td><td>SY-103-2001</td><td></td></tr><tr><td>cBot</td><td>Illumina</td><td>SY-301-2002</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna qPCR - Viia7</td><td>Life Technologies</td><td>Model #VIIA7 / Sprzęt #10631261</td><td>Lub równoważny </td></tr><tr><td>Experion System </td><td>Bio Rad</td><td>7007001</td><td>Bioanalyzer to alternatywny system</td></tr><tr><td>Spektrofotometr </td><td>Bio-Tek</td><td>Epoch Spektrofotometr mikropłytkowy</td><td>Lub równoważny</td></tr><tr><td>Wirówka - Sorvall Legend XTR </td><td>Thermo Scientific</td><td>75004521</td><td>Lub równoważny</td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny</td><td>Life Technologies</td><td>AM10027</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowy termocykler</td><td>Ogólny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr> laboratoryjny<td colspan="4">Tabela 3. Lista kluczowych odczynników i głównych urządzeń. *, Na filmie zademonstrowano HiSeq1000 zamiast HiScanSQ.</td></tr></tbody></table>

analiza sekwencyjna rna transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną i kontrolnych

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

Charakterystyka ekspresji genów w komórkach poprzez pomiar poziomu mRNA jest użytecznym narzędziem do określenia, jak na maszynerię transkrypcyjną komórki wpływają sygnały zewnętrzne (np. leczenie farmakologiczne), lub jak komórki różnią się między stanem zdrowym a chorym. Wraz z pojawieniem się i ciągłym udoskonalaniem technologii sekwencjonowania DNA nowej generacji, sekwencjonowanie RNA (sekwencjonowanie RNA) staje się coraz bardziej popularną metodą analizy transkryptomu w celu skatalogowania wszystkich gatunków transkryptów, określenia struktury transkrypcyjnej wszystkich wyrażonych genów oraz ilościowego określenia zmieniających się poziomów ekspresji całkowitego zestawu transkryptów w danej komórce, tkance lub organizmie1,2 . RNA-seq stopniowo zastępuje mikromacierze DNA jako preferowaną metodę analizy transkryptomu, ponieważ ma zalety profilowania całego transkryptomu, zapewniając dane typu cyfrowego (numer kopii dowolnego transkryptu) i nie opierając się na żadnej znanej sekwencji genomu3.
Tutaj prezentujemy kompletny i szczegółowy protokół zastosowania sekwencyjnego RNA do profilowania transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc z leczeniem trombiną lub bez niej. Protokół ten opiera się na naszym niedawno opublikowanym badaniu zatytułowanym "RNA-seq ujawnia nowy transkryptom genów i ich izoform w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną", w którym z powodzeniem przeprowadziliśmy pierwszą pełną analizę transkryptomu ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną przy użyciu sekwencji RNA. Dostarczyło to bezprecedensowych zasobów do dalszych eksperymentów w celu uzyskania wglądu w mechanizmy molekularne leżące u podstaw dysfunkcji śródbłonka za pośrednictwem trombiny w patogenezie stanów zapalnych, raka, cukrzycy i choroby niedokrwiennej serca, a także dostarcza potencjalnych nowych wskazówek dla celów terapeutycznych dla tych chorób.
Opisowy tekst tego protokołu jest podzielony na cztery części. W pierwszej części opisano leczenie ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc za pomocą izolacji trombiny i RNA, analizy jakości i kwantyfikacji. Druga część opisuje budowę i sekwencjonowanie biblioteki. Trzecia część opisuje analizę danych. Czwarta część opisuje test walidacyjny RT-PCR. Wyświetlane są reprezentatywne wyniki kilku kluczowych kroków. Przydatne wskazówki lub środki ostrożności, które pomogą Ci osiągnąć sukces w kluczowych krokach, znajdują się w sekcji Dyskusja. Chociaż protokół ten wykorzystuje ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczone trombiną, można go uogólnić w celu profilowania transkryptomów zarówno w komórkach ssaków, jak i innych ssaków oraz w tkankach traktowanych różnymi bodźcami lub inhibitorami, lub w celu porównania transkryptomów w komórkach lub tkankach między stanem zdrowym a stanem chorobowym.

Dla kroku 1: Stosunek 28s:18s jest tradycyjnie używany jako wskaźnik degradacji RNA. Idealnie byłoby, gdyby szczyt 28s miał około dwa razy większą powierzchnię niż pasmo 18s (stosunek 2), jednak ten idealny stosunek często nie jest spotykany w praktyce. Co więcej, proporcje 28s:18s uzyskane metodami spektrofotometrycznymi mogą zaniżać stopień degradacji RNA. Aby dokładniej określić ilościowo degradację, a tym samym jakość próbki RNA, system Experion oblicza liczbę wskaźnika jakości RNA (RQI). Algorytm RQ...

Ten protokół przedstawia kompletną i szczegółową procedurę zastosowania sekwencjonowania RNA, potężnej technologii sekwencjonowania DNA nowej generacji, do profilowania transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc z leczeniem trombiną lub bez. Protokół ten można uogólnić na różne komórki lub tkanki dotknięte różnymi odczynnikami lub stanami chorobowymi.

Analiza sekwencyjna RNA transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną i kontrolnych

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Ogólnym celem tej procedury jest przedstawienie kompletnego i szczegółowego procesu zastosowania RNA-Seq, potężnej technologii sekwencjonowania DNA nowej generacji, do profilowania transkryptomów. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie całkowitego RNA z ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc z leczeniem trombiną lub bez niej i sprawdzenie jakości RNA. Drugim krokiem jest skonstruowanie bibliotek DNA z tych próbek RNA.Usprawnij generowanie klastrów za pomocą instrumentu cbot i wykonaj zadanie sekwencjonowania DNA na HighSeq 1000. Następnie przeprowadzana jest analiza danych, aby ostatecznie zidentyfikować i wyświetlić transkrypty genów o zróżnicowanej ekspresji. Ostatnim krokiem jest walidacja wyników RN aeq przez RT TP CR. Główną zaletą IC w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikromacierz DNA do analizy transkryptomu, jest to, że IC może profilować cały transkryptom, dostarczać dane cyfrowe i nie polegać na żadnej znanej genomizacji ekspresji genów w komórkach.Pomiar poziomu MRA jest użytecznym narzędziem w określaniu, w jaki sposób sygnały zewnętrzne wpływają na transkrypcję maszynerii komórki lub jak komórki różnią się między stanem zdrowia a stanem c

rna-seq-analysis-transcriptomes-thrombin-treated-control-human

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza RNA-seq transkryptomów w komórkach śródbłonka naczyń włosowatych płucnych człowieka, traktowanych torembiną i kontrolnych

Sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne zostały wykorzystane do identyfikacji znacząco i różnicowo wyrażonych czynników transkrypcyjnych w subpopulacjach Lin-CD34+ i Lin-CD34- mysich komórek EML. Te czynniki transkrypcyjne mogą odgrywać ważną rolę w określaniu przełączania między samoodnawiającymi się komórkami Lin-CD34 + a częściowo zróżnicowanymi komórkami Lin-CD34.

Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA

Śródbłonek naczyniowy ściśle kontroluje rekrutację leukocytów. Niewystarczające wynaczynienie leukocytów przyczynia się do chorób zapalnych u ludzi. Dlatego poszukiwanie nowych elementów regulacyjnych aktywacji śródbłonka jest niezbędne do projektowania ulepszonych terapii zaburzeń zapalnych. W tym miejscu opisujemy kompleksową metodologię charakteryzującą nowe regulatory śródbłonka, które mogą modyfikować transport leukocytów podczas stanu zapalnego.

Testy przesiewowe w celu scharakteryzowania nowych regulatorów śródbłonka zaangażowanych w odpowiedź zapalną

Opisano protokół indukcji in vitro przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego (EndMT), który jest przydatny do badania szlaków sygnalizacji komórkowej związanych z EndMT. W tym modelu eksperymentalnym EndMT jest indukowany przez leczenie TGF-β w komórkach śródbłonka MS-1.

Analiza molekularna przejścia śródbłonkowo-mezenchymalnego wywołanego sygnalizacją transformacji czynnika wzrostu β

terapia miRNA ma znaczący potencjał w regulowaniu progresji raka. Zademonstrowano tu podejścia analityczne stosowane do identyfikacji aktywności kombinatorycznego leczenia miRNA w zatrzymywaniu cyklu komórkowego i angiogenezie.

Analiza skojarzonych zabiegów miRNA w celu regulacji cyklu komórkowego i angiogenezy

Prezentujemy podejście do oczyszczania mRNA związanego z rybosomami z komórek śródbłonka naczyń krwionośnych (EC) bezpośrednio w tkankach mózgu, płuc i serca myszy za pomocą specyficznego dla EC znacznika genetycznego wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) w rybosomach w połączeniu z oczyszczaniem RNA.

Translacja oczyszczania powinowactwa rybosomów (TRAP) do izolacji RNA z komórek śródbłonka in vivo

Prezentujemy model choroby naczyniowej in vitro do zbadania interakcji krwi pełnej ze śródbłonkiem pochodzącym od pacjenta. System ten pozwala na badanie właściwości trombogennych pierwotnych komórek śródbłonka w różnych okolicznościach. Metoda ta jest szczególnie przydatna do oceny trombogenności in situ i terapii przeciwzakrzepowej w różnych fazach krzepnięcia.

Model choroby mikroprzepływowej in vitro do badania interakcji krew pełna - śródbłonek i dynamiki zakrzepów krwi w czasie rzeczywistym

Protokół opisuje izolację, hodowlę i profilowanie komórek śródbłonka z ludzkiej tętnicy krezkowej. Dodatkowo opracowano metodę przygotowania tętnicy człowieka do transkryptomiki przestrzennej. Proteomika, transkryptomika i testy funkcjonalne mogą być wykonywane na izolowanych komórkach. Protokół ten można zastosować do każdej tętnicy średniej lub dużej wielkości.

Izolacja i profilowanie ludzkich pierwotnych komórek śródbłonka tętnic krezkowych na poziomie transkryptomu

Ten protokół opisuje proces od hodowli komórkowych ex vivo lub in vitro do wstępnego przetwarzania danych transkryptomicznych w celu opłacalnego badania przesiewowego leków opartego na transkryptomie.

Ekonomiczne badania przesiewowe leków oparte na transkryptomii

Protokół ten obejmuje krok po kroku workflow dla zwapniałych próbek naczyniowych: obsługę tkanek, odwapnianie, walidację RNA, wykrywanie poziomu zwapnienia oraz strategie wyboru regionów zainteresowania na Nanostring GeoMx Digital Spatial Profilere (DSP). Celem jest przedstawienie kompleksowej metody zachowania morfologii tkanek naczyniowych oraz RNA do wiarygodnej analizy transkryptomii przestrzennej.

Przygotowanie i przetwarzanie zwapnionych tętnic z zachowaną morfologią i RNA do cyfrowego profilowania przestrzennego

Praca ta opisuje test mikrofluidyczny, który wykorzystuje naprężenie ścinające do wywołania powstawania zakrzepów we krwi i charakteryzuje zakrzep za pomocą wielu wymiarów odczytu. Test pozwala mierzyć tendencję protrombotyczną próbek krwi, dzięki czemu jest przydatny w diagnozowaniu chorób, odkrywaniu leków oraz podstawowych badaniach mechanistycznych związanych z zakrzepicą.

Testy profilowania zakrzepów: platforma oparta na mikrofluidyce do kompleksowej charakterystyki trombogenezy biomechanicznej

Poznaj metodę RNA-seq do analizy transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną. Protokół obejmuje izolację RNA, budowę bibliotek i sekwencjonowanie.

Analiza sekwencyjna RNA transkryptomów w ludzkich komórkach śródbłonka mikronaczyniowego płuc leczonych trombiną i kontrolnych

Przeglądaj więcej filmów