Name: Metody in vitro Synteza natywnego, włóknistego kolagenu o długich odstępach i segmentowego kolagenu o długich odstępach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Poznaj metody syntezy trzech rodzajów kolagenu: natywnego, włóknistego o długich odstępach i segmentowego. Protokoły te wykorzystują mikroskopię sił atomowych do charakterystyki strukturalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować wszystkim byłym studentom studiów licencjackich, magisterskich oraz stażystom podoktorskim, którzy poświęcili swój czas i wysiłek na badanie fibrogenezy kolagenu w naszym laboratorium. Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada nieustannie zapewnia finansowanie naszych badań nad kolagenem.

UWAGA: Woda stosowana we wszystkich protokołach ma rezystywność &gt;18 MΩ.cm.
1. Rodzime włókna kolagenowe
<ol>
	<li>W probówce do mikrowirówki połączyć 6 μl wody, 20 μl 200 mM Na2HPO4 o pH 7 (skorygowanym za pomocą HCl) oraz 10 μl 400 mM KCl, a następnie wymieszać.</li>
	<li>Do probówki dodać 4 μl monomeru kolagenu (~3 mg/ml w 0,01 N HCl) i wymieszać. Roztwór powinien być klarowny i bezbarwny.</li>
	<li>Probówkę z mieszaniną reakcyjną umieścić w bloku grzewczym wstępnie podgrzanym do 37 °C i pozostawić na 3 do 4 hr. W tym momencie roztwór powinien być lekko mętny i zawierać głównie natywne fibryle kolagenu.</li>
</ol>
2. Włóknisty kolagen o dużych odstępach
<ol>
	<li>Poddać dializie 1 ml monomeru kolagenu (~3 mg/ml w 0,01 N HCl), używając membrany o MWCO 12-14 kDa przeciwko 400 ml wody, wymieniając wodę cztery razy w ciągu 24 h w temperaturze pokojowej. Dializowany monomer kolagenu, który nie zostanie wykorzystany natychmiast, można przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia.</li>
	<li>W probówce do mikrocentryfugi połączyć 20 μl wody, 20 μl α1-acid glycoprotein o stężeniu 3 mg/ml w wodzie oraz 20 μl dializowanego monomeru kolagenu. Roztwór powinien być przejrzysty i bezbarwny.</li>
	<li>Pozostawić probówkę z mieszaniną reakcyjną w temperaturze pokojowej na 30 min. W tym momencie roztwór powinien stać się mętny i zawierać głównie włókna kolagenowe FLS.</li>
</ol>
3. Kolagen z segmentowymi dużymi odstępami
<ol>
	<li>W probówce do mikrocentryfugi połączyć 67 μl wody, 60 μl 100 mM buforu glicyna-HCl o pH 3.3 oraz 40 μl ATP w stężeniu 10 mg/ml w wodzie, a następnie wymieszać.</li>
	<li>Do probówki dodać 33 μl monomeru kolagenu (~3 mg/ml w 0.01 N HCl) i wymieszać. Roztwór powinien być klarowny i bezbarwny.</li>
	<li>Probówkę z mieszaniną reakcyjną pozostawić w temperaturze pokojowej na 2 hr. Na tym etapie roztwór nadal będzie klarowny, ale powinien zawierać głównie kolagen SLS.</li>
</ol>
4. Charakterystyka AFM
<ol>
	<li>Oddziel powierzchnię kawałka miki przytwierdzonego do podłoża AFM, naklejając na powierzchnię miki kawałek taśmy klejącej, a następnie odklejając ją. Po zakończeniu sprawdź taśmę, aby potwierdzić, że oddzielono całą warstwę miki w celu zredukowania nierówności powierzchni i upewnić się, że stara próbka została usunięta w przypadku ponownego wykorzystania miki.</li>
	<li>Nanieś 20 μl roztworu włókien kolagenowych na świeżo oddzielone podłoże mikowe. Pozostaw na 5 min.</li>
	<li>Delikatnie wypłucz roztwór włókien kolagenowych wodą. Zaleca się, aby nie aplikować wody bezpośrednio na środek podłoża mikowego, lecz na jego krawędź, pozwalając jej spłynąć przez próbkę.</li>
	<li>Osusz powierzchnię pod łagodnym strumieniem gazu azotowego. Zaleca się skierowanie strumienia na krawędź, a nie na środek podłoża mikowego.</li>
	<li>Pod mikroskopem optycznym przy powiększeniu 200× próbki kolagenu natywnego i FLS powinny wykazywać skupiska włókien. Kolagen SLS nie będzie widoczny.</li>
	<li>Charakterystyczne cechy trzech różnych struktur kolagenu można obserwować za pomocą AFM. Zazwyczaj obrazujemy włókna kolagenu natywnego za pomocą AFM w trybie przerywanego kontaktu, wykorzystując krzemowe sondy AFM, natomiast włókna kolagenu FLS i SLS obrazujemy zazwyczaj w trybie kontaktu, wykorzystując sondy AFM z azotku krzemu. Wynika to z względów czasowych i kosztowych. Krzemowe sondy AFM są zazwyczaj ostrzejsze niż sondy z azotku krzemu, co czyni je szczególnie użytecznymi do obrazowania węższej struktury prążkowania włókien kolagenu natywnego. Jednak krzemowe sondy AFM są znacznie bardziej podatne na zanieczyszczenie próbkami kolagenu niż sondy z azotku krzemu i wymagają częstej wymiany. Dlatego zastrzegamy użycie krzemowych sond AFM głównie do obrazowania włókien kolagenu natywnego, gdzie wyższa rozdzielczość jest bardziej konieczna, i pracujemy w trybie przerywanego kontaktu, aby przedłużyć okres ich przydatności.</li>
</ol>
Zalecamy wykonanie wstępnego skanowania w obszarze 100 × 100 μm2, co powinno ukazać co najmniej kilka struktur kolagenowych. Następnie należy zwiększyć powiększenie, wykonując skany o rozmiarach 10 × 10 μm2, a potem 2 × 2 μm2, aby zaobserwować okresowość prążkowania kolagenu natywnego i FLS lub drobniejsze cechy kolagenu SLS. Wskazane jest również sprawdzenie co najmniej dwóch innych obszarów w próbce kolagenu, aby potwierdzić, że wstępne skany są reprezentatywne.

<ol><li>Kadler, K. E., Baldock, C., Bella, J., Boot-Handford, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Collagen at a glance.</a> J. Cell Sci. 120, 1955-1958 (2007).</li>
<li>Abraham, L. C., Zuena, E., Perez-Ramirez, B., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+to+Collagen+Characterization+for+Bio+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mat.+Res%22%5BJournal%5D)">Guide to Collagen Characterization for Bio Studies.</a> J. Biomed. Mat. Res. 87B, 264-285 (2008).</li>
<li>Baselt, D. R., Revel, J. -P., Baldeschwieler, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subfibrillar+Structure+of+Type+I+Collagen+Observed+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Subfibrillar Structure of Type I Collagen Observed by Atomic Force Microscopy.</a> Biophys. J. 65, 2644-2655 (1993).</li>
<li>Petruska, J. A., Hodge, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Subunit+Model+for+Tropocollagen+Macromolecule%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Subunit Model for Tropocollagen Macromolecule.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 51, 871-876 (1964).</li>
<li>Smith, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Pattern+in+Native+Collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular Pattern in Native Collagen.</a> Nature. 219, 157-158 (1968).</li>
<li>Gross, J., Highberger, J. H., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extract+of+collagen+from+connective+tissue+by+neutral+salt+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Extract of collagen from connective tissue by neutral salt solutions.</a> PNAS. 41, 1-7 (1955).</li>
<li>Gale, M., Pollanen, M. S., Markiewicz, P., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+assembly+of+collagen+revealed+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Sequential assembly of collagen revealed by atomic force microscopy.</a> Biophys. J. 68, 2124-2128 (1995).</li>
<li>Wood, G. C., Keech, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+fibrils+from+collagen+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">The formation of fibrils from collagen solutions.</a> Biochem. J. 75, 588-597 (1960).</li>
<li>Williams, B. R., Gelman, R. A., Poppke, D. C., Piez, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+Fibril+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Collagen Fibril formation.</a> J. Biol. Chem. 253, 6578-6585 (1978).</li>
<li>Holmes, D. F., Capaldi, M. J., Chapman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+collagen+fibrils+in+vitro%3B+the+assembly+process+depends+on+the+initiating+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biol.+Macromol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of collagen fibrils in vitro; the assembly process depends on the initiating procedure.</a> Int. J. Biol. Macromol. 8, 161-166 (1986).</li>
<li>Paige, M. F., Rainey, J. K., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrous+long+spacing+collagen+ultrastructure+elucidated+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fibrous long spacing collagen ultrastructure elucidated by atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 74, 3211-3216 (1998).</li>
<li>Highberger, J. H., Gross, J., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+mucoprotein+with+soluble+collagen%3B+an+electron+microscope+study%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The interaction of mucoprotein with soluble collagen; an electron microscope study.</a> PNAS. 37, 286-291 (1951).</li>
<li>Ghadially, F. N. Ultrastructural pathology of the cell and matrix. , 3rd Edition, Butterworths. London. (1988).</li>
<li>Paige, M. F., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+and+assembly+of+segmental+long+spacing+collagen+studied+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure and assembly of segmental long spacing collagen studied by atomic force microscopy.</a> Micron. 74, 355-361 (2001).</li>
<li>Schmitt, F. O., Gross, J., Highberger, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+particle+type+in+certain+connective+tissue+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A new particle type in certain connective tissue extracts.</a> PNAS. 39, 459-470 (1953).</li>
<li>Bruns, R. R., Hulmes, D. J. S., Therrien, S. F., Gross, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procollagen+segment-long-spacing+crystallites%3A+their+role+in+collagen+fibrillogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Procollagen segment-long-spacing crystallites: their role in collagen fibrillogenesis.</a> PNAS. 76, 313-317 (1979).</li>
<li>Highberger, J. H., Gross, J., Schmitt, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+observations+of+certain+fibrous+structures+obtained+from+connective+tissue+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">Electron microscope observations of certain fibrous structures obtained from connective tissue extracts.</a> JACS. 72, 3321-3322 (1950).</li>
<li>Orekhovich, V. N., Tustanovsky, A. A., Orekhovich, K. D., Plotnikova, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((O+prokollagene+kohzi%5BTitle%5D)+AND+%22Biokhimiya%22%5BJournal%5D)">O prokollagene kohzi.</a> Biokhimiya. 13, 55-60 (1948).</li>
<li>Lin, A. C., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+ultrastructure+of+fibrous+long+spacing+collagen+by+parallel+atomic+force+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Investigating the ultrastructure of fibrous long spacing collagen by parallel atomic force and transmission electron microscopy.</a> Proteins. 49, 378-384 (2002).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Oczyszczony monomer kolagenu jest stabilny przy niskim pH i temperaturze, a tworzenie natywnych włókien kolagenowych polega w zasadzie na podniesieniu pH i temperatury roztworu monomeru kolagenu. Procedury rekonstytucji prążkowanych włókien kolagenowych z monomerów istnieją od ponad 50 lat. Procedura, której nasze laboratorium używało w pierwszych badaniach nad kolagenem 15 lat temu 7, opierała się na metodach podsumowanych przez Chapmana i współpracowników w 1986 roku 10. Warunki tworzenia włókien kolagenowych w tamtych wcześniejszych badaniach obejmowały 0,18 mg/ml monomeru kolagenu w buforze Na2HPO4/KH2PO4 (I = 0,2, pH 7,4) w temperaturze 34 °C. Wadą tej oraz innych próbowanych przez nas procedur jest to, że obok pożądanych włókien prążkowanych zawsze tworzą się włókna nieprążkowane. Nasze nowe warunki to ~0,3 mg/ml monomeru kolagenu w 100 mM fosforanie i 100 mM KCl przy pH 7 i temperaturze 37 °C przez 3-4 h. Opisana tutaj procedura różni się pod każdym względem od wcześniejszej metody otrzymywania natywnych włókien kolagenowych. Co najważniejsze, podwoiliśmy siłę jonową, zwiększając stężenie buforu i dodając 100 mM KCl. Zwiększenie siły jonowej skutkuje bardziej powtarzalnym tworzeniem się wyłącznie prążkowanych włókien kolagenowych.
W naszym doświadczeniu jedynymi sytuacjami, w których ta procedura nie doprowadziła do powstania kolagenu typu natywnego, były przypadki, gdy termin przydatności roztworu monomeru kolagenu zalecany przez producenta już upłynął. W takich sytuacjach obserwowane zjawiska obejmowały zarówno mniejszą liczbę fibryli, z których wszystkie były pozbawione prążkowania, jak i liczne fibrylle, które jednak pozostawały w przeważającej mierze nieprążkowane. Należy zauważyć, że przeterminowany monomer kolagenu często wciąż może być z sukcesem wykorzystany do otrzymania kolagenu natywnego, jednak w przypadku niepowodzenia należy bezwzględnie zakupić nowy monomer kolagenu.
FLS zostały po raz pierwszy zidentyfikowane przez Highberger et al. 17 w preparatach kolagenowych opracowanych przez Orekhovich et al. 18. Dalsze badania doprowadziły Highbergera i Schmitta do wniosku, że to glikoproteina kwasowa α1 promuje tworzenie się FLS 12. Później udało nam się powtórzyć procedurę otrzymywania kolagenu FLS poprzez połączenie dostępnego komercyjnie monomeru kolagenu i glikoproteiny kwasowej α1 przy niskim pH, a następnie powolne zwiększanie pH poprzez dializowanie mieszaniny przeciwko wodzie przez 24 hr 11. Przedstawiamy obecnie modyfikację tej procedury, polegającą na uprzednim dializowaniu monomeru kolagenu przeciwko wodzie, a następnie prostym połączeniu go z glikoproteina kwasową α1 w wodzie w celu utworzenia kolagenu FLS. Warunki montażu kolagenu FLS opisane w niniejszym tekście są znacznie mniej czasochłonne. Monomer kolagenu nadal musi być wstępnie dializowany przeciwko wodzie, ale można to wykonać masowo, a następnie przechowywać go stabilnie w 4 °C do momentu użycia. Ta nowa procedura pozwala na otrzymanie przeważnie prążkowanych fibryli kolagenowych FLS.
Z naszego doświadczenia wynika, że α1-kwasowa glikoproteina o niższej łącznej zawartości białka i wody, a w konsekwencji wyższej zawartości cukrów, ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego wytwarzania fibryli FLS. Zazwyczaj weryfikujemy u producenta, czy partia α1-kwasowej glikoproteiny, której używamy, ma łączną zawartość białka i wody równą 82% lub mniej. Podobnie jak w procedurze syntezy kolagenu natywnego, zbyt stary monomer kolagenu może również doprowadzić do niepowodzenia w produkcji kolagenu FLS. Dodatkowo, w tej procedurze krytyczna jest czystość wody używanej do dializy. Na przykład dializa monomeru kolagenu przeciwko wodzie o oporności nawet ~8 MΩ.cm zamiast &gt;18 MΩ.cm skutkuje otrzymaniem roztworu kolagenu, który nie uformuje kolagenu FLS.
Spośród trzech typów włókien kolagenowych najłatwiejszym do przygotowania jest kolagen SLS. Pierwszą metodę otrzymywania SLS opisali Schmitt i współpracownicy 15. Przed 12 laty opublikowaliśmy adaptację tej procedury pozwalającą na otrzymanie kolagenu SLS z wykorzystaniem kolagenu dostępnego w handlu 14. Procedura ta polegała po prostu na połączeniu 2 mg/ml ATP oraz 0,5 mg/ml monomeru kolagenu w 0,05% (v/v) kwasie octowym o pH 3,5 i pozostawieniu mieszaniny w temperaturze pokojowej przez noc.
W naszym doświadczeniu krytycznym aspektem montażu SLS, który musi być kontrolowany, jest pH roztworu reakcyjnego. SLS montowany w warunkach bardziej zasadowych (~pH 3,6-3,9) prowadzi do powstania zagregowanych skupisk krystalitów. Warunki bardziej kwasowe (~pH 2,9-3,2) skutkują powstaniem cieńszych i bardziej rozdzielonych krystalitów niż te montowane w idealnych warunkach pH 3,3-3,5. Wartości pH reakcji poza tym zakresem (&lt; 2,8 oraz &gt; 4) nie dają żadnego kolagenu SLS. W przeszłości korygowaliśmy pH mieszaniny reakcyjnej poprzez dodanie kwasu octowego. Aby jeszcze bardziej uprościć procedurę, w niniejszym artykule wprowadziliśmy bufor glicyna-HCl w celu kontroli pH.
Trzy różne struktury kolagenu utworzone zgodnie z opisanymi powyżej protokołami posiadają charakterystyczne cechy, które można rozpoznać jedynie za pomocą instrumentów o rozdzielczości nanometrowej. Kolagen natywny oraz kolagen FLS charakteryzują się okresowością prążkowania wynoszącą odpowiednio ~67 nm i ~270 nm. Największy wymiar kolagenu SLS wynosi zaledwie ~360 nm. Opisaliśmy szczegółowo sposób wykorzystania AFM do charakteryzacji tych trzech różnych struktur kolagenu. Niemniej jednak, każdy AFM pracujący w trybie kontaktowym lub przerywanym kontakcie z dowolną sondą AFM o promieniu &lt;10 nm powinien być w stanie obrazować te struktury kolagenu. Dodatkowo do charakteryzacji tych struktur kolagenu można wykorzystać i wykorzystywano mikroskopię elektronową 19.
Główną zaletą tych procedur jest to, że prowadzą one do powstania przede wszystkim pożądanego konstruktu kolagenowego. Jedyną inną formą kolagenu występującą w tych reakcjach jest monomer wyjściowy, który często jest widoczny w tle obrazów AFM. W przypadku kolagenu natywnego oraz FLS, można go łatwo oddzielić od większości nieprzereagowanego monomeru poprzez wielokrotne odwirowywanie i przemywanie otrzymanego granulatu kolagenu natywnego lub FLS wodą.
Przedstawiliśmy proste i niezawodne procedury otrzymywania kolagenu natywnego, FLS oraz SLS z wykorzystaniem zaawansowanych, dostępnych komercyjnie materiałów wyjściowych. Monomer kolagenu użyty we wszystkich tych procedurach jest dostępny komercyjnie w formie oczyszczonej. α1-glikoproteina kwaśna oraz ATP są również dostępne w sprzedaży.

Kolagen to klasa białek strukturalnych o potrójnej strukturze helikalnej, utworzonej z trzech łańcuchów polipeptydowych. Monomery te łączą się w sposób hierarchiczny, tworząc sukcesywnie większe struktury. Zidentyfikowano co najmniej 28 genetycznie różnych typów kolagenu 1. Łącznie kolageny stanowią 30% całkowitej zawartości białek w organizmach zwierzęcych, przy czym typ I jest formą dominującą, stanowiąc do 90% wszystkich białek kolagenowych 2. Kolagen typu I występuje w postaci struktur włókienstych w skórze, więzadłach, ścięgnach i kościach. Obrazy natywnych włókien kolagenu typu I uzyskane za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM) i mikroskopu elektronowego (EM) zazwyczaj wykazują prążkowanie o charakterystycznym okresie ~67 nm (często określane jako prążkowanie D) 3-5.
Monomer kolagenu typu I jest heterotrimerem o strukturze potrójnej helisy, składającym się z dwóch identycznych łańcuchów α1(I) i jednego łańcucha α2(I), z których każdy ma długość ponad tysiąca aminokwasów. Jest on długi i cienki, o wymiarach 300 nm długości i 1,4 nm średnicy. Monomer kolagenu typu I można łatwo uzyskać poprzez rozkład naturalnie tworzących się struktur wyższego rzędu 6. My 7 oraz wielu innych autorów 8-10 wykazaliśmy, że te rozpuszczalne monomeryczne bloki budulcowe mogą następnie zostać wykorzystane do rekonstrukcji fibryli z prążkami D in vitro (Rycina 1).
Oprócz natywnych włókien kolagenowych, stwierdzono, że przy użyciu tego samego monomeru budulcowego in vitro tworzą się dwie inne kolagenowe struktury wyższego rzędu. Są to kolagen o włóknistym długim odstępie (FLS) oraz kolagen o segmentowym długim odstępie (SLS) (Rysunek 1). Kolagen FLS jest konstrukcją włóknistą, podobnie jak kolagen natywny, lecz charakteryzuje się większą periodycznością prążkowania niż kolagen natywny 11. In vitro kolagen FLS powstaje, gdy monomer kolagenu zostanie połączony z α1-glikoproteiną kwasową 12. Kolagen FLS obserwowano również in vivo, choć rzadko 13. Kolagen SLS opisuje się jako krystality, ponieważ monomery są w nich uporządkowane w rejestrach, podobnie jak w sieci krystalicznej 14. Kolagen SLS powstaje, gdy monomer kolagenu zostanie połączony z adenozynotrifosforanem (ATP) 15. Naturalnie występujący kolagen SLS zaobserwowano w pożywce hodowlanej fibroblastów, ale nie w ekstraktach z próbek tkanek, co prawdopodobnie wynika z jego niewielkiego rozmiaru i braku rozróżnialnych cech topograficznych 16.
Celem niniejszej publikacji jest przedstawienie szczegółowych procedur wytwarzania natywnych włókien kolagenowych, a także kolagenu FLS i SLS, które mogą zostać odtworzone nawet przez najmniej doświadczonego badacza. Wykorzystując dostępne komercyjnie zaawansowane materiały wyjściowe, dążyliśmy do maksymalnego uproszczenia protokołów przy jednoczesnym zachowaniu ich niezawodności. Szczegółowo opisujemy również sposób wykorzystania AFM do charakteryzacji otrzymanych różnych struktur kolagenowych. Praca ta będzie pomocna dla badaczy chcących analizować jedną lub więcej z tych struktur kolagenowych wyższego rzędu i/lub wykorzystywać je jako prekursory w innych zastosowaniach, a którzy obecnie nie posiadają odpowiedniej wiedzy specjalistycznej lub po prostu nie chcą pracować z próbkami tkanek.

<table><tbody><tr><td>Monomer kolagenu typu I&lt;br/&gt;(~3 mg/ml w 0,01 N HCl)</td><td>Inamed&lt;br/&gt; Advanced Biomatrix</td><td>5409&lt;br/&gt; 5005-B</td><td>Partia 1261443 (2,9 mg/ml, pH 2,1)&lt;br/&gt; Partia 1629346 (3,2 mg/ml, pH 2,1)&lt;br/&gt; Partia 6006 (3,2 mg/ml, pH 2,1)</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Research Biochemicals International</td><td>A-141</td><td>Partia FBJ-1194A</td></tr><tr><td>&amp;alpha;1-glikoproteina kwasowa z osocza bydlęcego </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3643</td><td>Partia 051K7440 (89,8%)&lt;br/&gt; Partia 011K7410 (82%)&lt;br/&gt; Partia 065K7405 (71,2%)&lt;br/&gt; Partia 063K7495 (71,9%)&lt;br/&gt; Partia 117K7535 (75,9%)&lt;br/&gt; (zawartość białka + wody)</td></tr><tr><td>a1-glikoproteina kwasowa z osocza ludzkiego </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9885</td><td>Partia 128H7606 (70,9%)&lt;br/&gt; Partia 049K7565V (68%)&lt;br/&gt;(zawartość białka + wody)</td></tr><tr><td>mika</td><td>Ted Pella</td><td>53</td><td></td></tr><tr><td>Pointprobe – krzemowy sensor SPM</td><td>Nanoworld</td><td>NHC</td><td>Krzemowa sonda AFM stosowana w trybie przerywanego kontaktu</td></tr><tr><td>Grotki Veeco Nanoprobe</td><td>Veeco&lt;br/&gt;(obecnie sondy Bruker AFM)</td><td>NP-S</td><td>Sonda AFM z azotku krzemu stosowana w trybie kontaktowym</td></tr></tbody></table>

in vitro synteza natywnego, włóknistego kolagenu o długim odstępie oraz kolagenu segmentowego o długim odstępie

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Włókna kolagenowe występują w macierzy pozakomórkowej tkanek zwierzęcych, zapewniając rusztowanie strukturalne i wytrzymałość mechaniczną. Naturalne włókna kolagenowe charakteryzują się specyficzną prążkowaną periodycznością wynoszącą ~67 nm i powstają in vivo poprzez hierarchiczną samoorganizację monomerów kolagenu typu I, które mają długość 300 nm i średnicę 1.4 nm. In vitro, poprzez zmianę warunków, jakim poddawane są monomery budulcowe, można tworzyć unikalne struktury o długościach sięgających 50 mikronów, w tym nie tylko włókna typu naturalnego, ale także kolagen o włóknistej długiej przestrzeni (fibrous long spacing) oraz kolagen o segmentowej długiej przestrzeni (segmental long spacing). W niniejszym opracowaniu przedstawiamy procedury formowania trzech różnych struktur kolagenowych z powszechnie dostępnego komercyjnie monomeru kolagenu. Stosowanie protokołów opublikowanych wcześniej przez nas i innych autorów w celu wytworzenia tych trzech typów zazwyczaj prowadzi do powstawania mieszanin struktur. W szczególności, podczas wytwarzania kolagenu naturalnego często stwierdzano obecność włókien bezprążkowych, a podczas tworzenia kolagenu o włóknistej długiej przestrzeni często występowały włókna naturalne. Nowe procedury mają tę zaletę, że pozwalają na otrzymanie niemal wyłącznie pożądanego typu włókien kolagenowych. Formowanie pożądanych struktur jest weryfikowane za pomocą obrazowania z wykorzystaniem mikroskopu sił atomowych.

Kolagen natywny
Mieszanina reakcyjna zawierająca ~0,3 mg/ml monomeru kolagenu w 100 mM fosforanie i 100 mM KCl przy pH 7, inkubowana w temperaturze 37 °C przez 3-4 godziny, pozwoli na otrzymanie roztworu zawierającego natywne fibryle kolagenu z wyraźnym prążkowaniem D o szerokości ~67 nm, bez obecności fibryli nieprążkowanych.
Pod mikroskopem optycznym przy powiększeniu 200× na podłożu z miki zazwyczaj widoczne są skupiska kilku fibryl, szczególnie w mikroskopii kontrastu interferencyjnego (DIC) (Rycina 2). W typowej próbce podczas skanowania AFM przypadkowego obszaru o wymiarach 100 × 100 μm2 zwykle widocznych jest co najmniej kilka fibryl o długości od 5 do 50 mikronów (Ryciny 3a-c). Na tym etapie można łatwo zidentyfikować pojedyncze, odseparowane fibryle kolagenu. Przy skanowaniu obrazu o rozdzielczości 512 × 512 pikseli2 powiększenie obszaru skanowania do 10 × 10 μm2 pokazuje, że wszystkie fibryle są prążkowane (Ryciny 3d-f). Aby dokładnie zmierzyć okresowość prążkowania, najlepiej powiększyć obraz do obszaru skanowania 2 × 2 μm2 (Ryciny 3g-i).
Okresowość prążkowania można wyznaczyć, mierząc i uśredniając odległość wzdłużną między kilkoma szczytami lub dolinami. Alternatywnie, jeżeli oprogramowanie AFM na to pozwala, można również zastosować jednowymiarową transformatę Fouriera wzdłuż przekroju podłużnego. Rysunek 4 przedstawia obraz wysokości fibry wykonany za pomocą AFM oraz odpowiadający mu przekrój podłużny.
Kolagen FLS
Mieszanina reakcyjna zawierająca 1 mg/ml glikoproteiny kwasowej μ1 oraz ~1 mg/ml monomeru kolagenu w wodzie, pozostawiona w temperaturze pokojowej na 30 min, utworzy roztwór włókienek kolagenowych FLS.
Kępki fibryli, podobne do tych obserwowanych w przypadku kolagenu natywnego, są łatwo widoczne na podłożu z miki pod mikroskopem optycznym przy powiększeniu 200×. W typowej próbce losowy skan AFM o rozmiarze 100 × 100 μm2 zazwyczaj wykazuje co najmniej kilka fibryli. Przy rozmiarze skanu obrazu 512 × 512 pikseli2, okresowość prążkowania można zmierzyć poprzez powiększenie skanu do 10 × 10 μm2 (Rycina 5a) lub bardziej precyzyjnie za pomocą skanu 2 × 2 μm2 (Rycina 5b). Rycina 5c przedstawia podłużny przekrój poprzeczny fibryli FLS.
Kollagen SLS
Mieszanina reakcyjna zawierająca 2 mg/ml ATP oraz ~0,5 mg/ml monomeru kolagenu w 100 mM buforze glicyna-HCl o pH 3,3, pozostawiona w temperaturze pokojowej na 2 h, pozwoli na otrzymanie roztworu kolagenu SLS.
Zazwyczaj krystality SLS nie są widoczne pod mikroskopem optycznym. Do potwierdzenia obecności krystalitów SLS wymagany jest AFM. W typowej próbce losowe skanowanie AFM obszaru 100 × 100 μm2 zwykle wykazuje obecność wielu punktów. Powiększenie skanu do obszaru 10 × 10 μm2 zazwyczaj ujawnia kilka krystalitów SLS (Rysunek 6a). Z kolei skan obszaru 2 × 2 μm2 (Rysunek 6b) pokazuje drobniejszą strukturę krystalitu SLS.
<img alt="Transformacja strukturalna białka; monomer do stanu natywnego, FLS, SLS pokazane na obrazach z mikroskopii." src="/files/ftp_upload/4417/4417fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Trzy strukturalnie różne formy fibryli kolagenowych, które mogą zostać utworzone in vitro z monomeru kolagenu. Obrazy AFM przedstawiające monomer kolagenu oraz trzy struktury kolagenowe wyższego rzędu, wszystkie w tej samej skali (2 × 2 μm2).
<img alt="Obraz mikroskopowy struktur włóknistych; analiza porównawcza dwóch warunków próbek w skali 100μm." src="/files/ftp_upload/4417/4417fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Cyfrowy obraz przy powiększeniu ~200× wykonany za pomocą optycznej mikroskopii DIC natywnych włókien kolagenowych na miki (a) w stanie nienaruszonym oraz (b) po zastosowaniu progowania i wyostrzenia w celu uwidocznienia włókien.
<img alt="Analiza struktury nanorurek; obrazy z mikroskopu elektronowego przedstawiają różne skale od 20μm do 400nm, szczegółowo opisując morfologię." src="/files/ftp_upload/4417/4417fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
 Rysunek 3. Obrazy AFM natywnych włókien kolagenowych na mice. Przedstawiono obrazy amplitudy AFM w trybie przerywanego kontaktu.
<img alt="Analiza okresowości nanostruktury; obraz mikroskopowy i wykres; pomiar odległości dla okresowości 67 nm." src="/files/ftp_upload/4417/4417fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
 Rysunek 4. (a) Obraz wysokości AFM w trybie przerywanego kontaktu o obszarze 0,5 × 1 μm2 (skala pionowa = 100 nm) oraz (b) podłużny przekrój natywnego włókna kolagenowego.
<img alt="Analiza wzoru powierzchni polimeru; obrazy SEM, skala mikrometrów, nanometrowe zmarszczki, dane z wykresu." src="/files/ftp_upload/4417/4417fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
 Rysunek 5. Obrazy AFM włókien kolagenowych FLS na miki. (a) obraz ugięcia AFM w trybie kontaktowym o rozmiarze 10 × 10 μm2, (b) obraz ugięcia AFM w trybie kontaktowym o rozmiarze 2 × 2 μm2 oraz (c) przekrój podłużny włókna kolagenowego FLS.
<img alt="Obrazy AFM nanostruktur; paski skali wskazują 2µm i 400nm, pokazując morfologię powierzchni." src="/files/ftp_upload/4417/4417fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
 Rysunek 6. Obrazy AFM kolagenu SLS na miki. Przedstawiono obrazy amplitudy AFM w trybie przerywanego kontaktu.

Opisano proste i powtarzalne procedury wytwarzania trzech strukturalnie odmiennych skupisk kolagenu z powszechnie dostępnego komercyjnie monomeru kolagenu typu I. Kolagen typu natywnego, włóknisty o długim rozstawie lub segmentowy o długim rozstawie może być otrzymywany poprzez zmianę warunków, na jakie narażony jest monomer budulcowy o długości 300 nm i średnicy 1,4 nm.

In vitro synteza natywnego, włóknistego kolagenu o długim odstępie oraz kolagenu segmentowego o długim odstępie

Włókna kolagenowe występują w macierzy zewnątrzkomórkowej tkanek zwierzęcych, zapewniając rusztowanie strukturalne oraz wytrzymałość mechaniczną. Te natywne...

Ogólnym celem tych procedur jest pokazanie, w jaki sposób monomer kolagenu może zostać wykorzystany do powtarzalnego wytwarzania trzech różnych rodzajów struktur kolagenowych wyższego rzędu. Kolagen natywny otrzymuje się poprzez podniesienie pH roztworu monomeru kolagenu, kolagen włóknisty o długim rozstawie (long spacing) powstaje poprzez połączenie monomeru kolagenu z glikoproteiną kwasową alfa 1, a kolagen o segmentowym długim rozstawie (segmental long spacing) powstaje w wyniku analogicznego procesu.Kolagen powstaje poprzez mieszanie monomeru kolagenu z TP. Ostatecznie, do charakterystyki trzech różnych typów utworzonych struktur kolagenowych wykorzystywana jest mikroskopia sił atomowych. Główną zaletą tych protokołów w porównaniu do wcześniej opublikowanych procedur jest ich prostota oraz bardzo wysoka powtarzalność w tworzeniu pożądanych struktur kolagenowych. Protokoły te zostały opracowane w naszym laboratorium w ciągu ostatnich 10 lat, dzięki wykorzystaniu niezawodnego komercyjnego źródła monomeru kolagenu jako materiału wyjściowego; procedurę zaprezentuje Calvin Chang, doktorant z mojego laboratorium, w celu wytworzenia natywnych włókien kolagenowych z wyraźnym prążkowaniem D o szerokości 67 nanometrów.Zacznij od wstępnego podgrzania bloku grzewczego do 37 °C. Następnie przygotuj roztwór buforowy w probówce do mikrocentryfugi, dodając 4 µL roztworu monomeru kolagenu o stężeniu 3 mg/mL i dokładnie wymieszaj. Otrzymany roztwór powinien być klarowny i bezbarwny.Umieść mieszaninę na bloku grzewczym wstępnie podgrzanym do 37 °C przez trzy do czterech godzin, aby utworzyły się natywne włókna kolagenowe. Końcowy roztwór powinien być lekko mętny i zawierać głównie natywne włókna kolagenowe, co pozwoli na przygotowanie kolagenu o włóknistej strukturze z długim rozmieszczeniem (long spacing collagen). Najpierw umieść 1 mL roztworu monomeru kolagenu o stężeniu 3 mg/mL w membranie z progiem odcięcia masy cząsteczkowej od 12 do 14 kDa.Następnie przeprowadź dializę przeciwko 400 mililitrów wody, wymieniając wodę cztery razy w ciągu 24 godzin. Następnie połącz 20 mikrolitrów zdializowanego monomeru kolagenu z 20 mikrolitrów ultra czystej wody oraz 20 mikrolitrów roztworu glikoproteiny kwasowej alfa-1 o stężeniu trzech miligramów na mililitr w wodzie w probówce do mikrocentryfugi i wymieszaj.Pozostaw kolagen do formowania włókien w temperaturze pokojowej przez 30 minut. W tym czasie roztwór zmieni przejrzystość i stanie się mętny, tworząc włóknisty kolagen. Najpierw przygotuj bufor kwasowy w probówce do mikrocentryfugi.Dodaj 40 µL TP w wodzie o stężeniu 10 mg/mL do roztworu buforowego i wymieszaj. Na koniec dodaj 33 µL roztworu monomeru kolagenu o stężeniu 3 mg/mL w 0,01 N kwasie solnym i wymieszaj do połączenia.Pozostaw kolagen o segmentowej długiej przestrzeni w temperaturze pokojowej przez dwie godziny w celu jego złożenia. W przypadku tego preparatu końcowy roztwór będzie klarowny, w przeciwieństwie do dwóch pozostałych opisanych form kolagenu. Aby uzyskać czystą, płaską powierzchnię do mikroskopii sił atomowych lub FM, przyczep kawałek taśmy klejącej do podłoża AFM wykonanego z miki i odklej co najmniej jedną warstwę.Sprawdź taśmę, aby potwierdzić usunięcie całej warstwy. Po uzyskaniu odpowiedniej powierzchni nanieś 20 µL roztworu kolagenu FI na podłoże mikowe i pozostaw na pięć minut. Po upływie pięciu minut wypłucz nadmiar fibryli, dodając wodę na krawędź podłoża MICA i pozwalając jej przepłynąć przez próbkę przez 10 do 15 sekund.Nie dodawać wody bezpośrednio do obszaru próbki. Następnie osuszyć powierzchnię, kierując łagodny strumień azotu z jednej krawędzi podłoża, dbając o to, aby strumień nie był skierowany na środek próbki.Próbkę należy zbadać pod mikroskopem optycznym przy powiększeniu 200 x w celu oceny natywnego i włóknistego odstępu długiego. Próbki kolagenu wykazują skupiska włókien, podczas gdy kolagen o segmentowym odstępie długim nie jest widoczny. Pozwala to na najlepszą obserwację unikalnych właściwości różnych rodzajów kolagenu.Używając AFM, wykonaj wstępne skanowanie obszaru o wymiarach 100 na 100 mikrometrów, a następnie powiększ obraz, aby zeskanować obszary o wielkości 10 na 10 mikrometrów kwadratowych i ostatecznie 2 na 2 mikrometry kwadratowe. Pozwoli to na obserwację okresowości prążkowania w naturalnych i włóknistych przestrzeniach płuca. Kolagen stanowił drobniejsze struktury kolagenu w odcinkowych przestrzeniach płuca.W przypadku natywnych włókien kolagenowych należy uruchomić mikroskop sił atomowych w trybie przerywanego kontaktu, używając krzemowej sondy AFM do obrazowania długich odstępów włóknistych oraz segmentowych. W przypadku włókien kolagenowych należy uruchomić mikroskop sił atomowych w trybie kontaktowym i użyć sond AFM wykonanych z azotku krzemu dla uzyskania najlepszych wyników. Należy sprawdzić co najmniej dwa inne obszary na próbce kolagenu, aby zweryfikować, czy wstępne skany są reprezentatywne.Wysoka rozdzielczość przestrzenna AFM jest idealna do charakteryzacji różnych preparatów kolagenu opisanych w tym filmie. Pozwala ona z łatwością odróżnić natywne włókna kolagenowe, kolagen o włóknistej długiej przestrzeni oraz kolagen o segmentowej długiej przestrzeni. Techniki mikroskopii optycznej, takie jak mikroskopia z kontrastem interferencyjnym, pokazują włókna, ale nie są w stanie ukazać cech w skali nanometrowej, które różnicują trzy rodzaje kolagenu przygotowanych tymi metodami. W typowej próbce, losowy skan AFM o wymiarach 100 na 100 mikrometrów ukazuje co najmniej kilka oddzielnych fibryli o długości od 5 do 50 mikronów.Włókna kolagenowe można łatwo zidentyfikować na tym etapie; przybliżenie do rozmiaru skanu 10 µm x 10 µm wykazuje, że wszystkie włókna są prążkowane. Aby dokładnie zmierzyć periodyczność prążkowania, najlepiej przybliżyć obraz do rozmiaru skanu 2 µm x 2 µm. Przybliżenie do rozmiaru skanu 10 µm x 10 µm pokazuje, że wszystkie fibrille są prążkowane.Aby dokładnie zmierzyć okresowość prążkowania, najlepiej powiększyć obraz do rozmiaru skanu 2 na 2 mikrometry. Okres prążkowania zwiększa się, gdy kolagen jest przygotowywany zgodnie z procedurą kolagenu o długim odstępie, co daje powtórzenia co 270 nanometrów wzdłuż długości włókna. W typowej próbce losowy skan o rozmiarze 100 na 100 mikrometrów wykonany za pomocą FM pokazuje co najmniej kilka fibryli.Periodyczność prążkowania można zaobserwować, powiększając skan obszaru o wymiarach 10 na 10 mikrometrów, a łatwo ją zmierzyć przy skanie obszaru o wymiarach 2 na 2 mikrometry. Wreszcie, kolagen o długim odstępie segmentowym nie tworzy w ogóle włókien, lecz pojedyncze segmenty. W typowej próbce, losowy skan obszaru o wymiarach 100 na 100 mikrometrów wykonany za pomocą FM wykazuje wiele pojedynczych punktów.Dokładniejsze skanowanie w kwadracie o wymiarach 10 na 10 mikrometrów ukazuje kilka krystalitów SLS, a skanowanie w kwadracie o wymiarach 2 na 2 mikrometry pokazuje drobniejszą strukturę pojedynczego krystalitu SLS. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiąść wiedzę na temat sposobu wytwarzania jednorodnych, dojrzałych natywnych konstruktów kolagenowych FLS i SLS z komercyjnie dostępnego monomeru kolagenu. Kolagen jest materiałem biokompatybilnym, który znajduje zastosowanie jako podłoże lub rusztowanie do hodowli komórek i tkanek.Niniejsza procedura pozwoli na otrzymanie pożądanych struktur kolagenu do tych i innych zastosowań.

in-vitro-synthesis-native-fibrous-long-spacing-segmental-long-spacing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

In vitro Synteza natywnej, włóknistej kolageny długiego rozstawu i segmentalnej kolageny długiego rozstawu

Opisano metodę przygotowania trójwymiarowej macierzy składającej się z kolagenu typu I oraz pierwotnych ludzkich fibroblastów. Ten żel organotypowy służy jako przydatny substrat do oceny inwazyjnej migracji komórek, ponieważ naśladuje podstawowe cechy stromy tkanki i nadaje się do wielu form mikroskopii.

Organotypowy test z kolagenem typu I: elastyczna platforma do oceny zachowania komórek w kontekście trójwymiarowym

Ten artykuł przedstawia metodę fluorescencyjnego znakowania kolagenu, która może być dalej wykorzystywana zarówno do obrazowania na żywo, jak i do obrazowania na żywo kultur komórkowych 3D. Zapewniamy również zoptymalizowany protokół wizualizacji endogennych białek cytoszkieletu komórek hodowanych w środowiskach 3D.

Odkrywanie organizacji cytoszkieletu inwazyjnych komórek nowotworowych w 3D

Ten system modelowy zaczyna się od wypełnionego miofibroblastami żelu fibrynowego, który może być używany do badania endogennej kolagenu (re)organizacji w czasie rzeczywistym w sposób nieniszczący. System modelowy jest bardzo przestrajalny, ponieważ może być używany z różnymi źródłami komórek, dodatkami do pożywek i może być łatwo dostosowany do konkretnych potrzeb.

Inżynieria konstruktów tkankowych na bazie fibryny z miofibroblastów oraz zastosowanie ograniczeń i szczepów do indukowania reorganizacji komórek i kolagenu

Tradycyjne procedury izolacji rozpuszczalnego kolagenu typu 1 (COL1) wymagają około 10 dni od początku do końca ze względu na długie inkubacje buforowe i pracochłonne zawieszanie włókienek. Tutaj opisujemy sposób oczyszczania COL1 z małych biopsji skóry w mniej niż 3 godziny.

Ulepszona metoda przygotowania kolagenu typu I ze skóry

Ta procedura demonstruje in vivo obrazowanie w bliskiej podczerwieni fluorescencji działań remodelujących kolagen u myszy, jak również barwienie ex vivo kolagenu w skrawkach tkanek za pomocą klatkowych peptydów mimetycznych kolagenu, które mogą być fotowyzwalane do hybrydyzacji ze zdenaturowanymi pasmami kolagenu.

Obrazowanie zdenaturowanych pasm kolagenu in vivo i ex vivo poprzez fotowyzwalaną hybrydyzację peptydów mimetycznych kolagenu w klatce

Kolagen jest kluczowym składnikiem ECM i dostarcza niezbędnych wskazówek dla kilku procesów komórkowych, począwszy od migracji, a skończywszy na różnicowaniu i proliferacji. Poniżej przedstawiono protokół osadzania komórek w hydrożelach kolagenowych 3D oraz bardziej zaawansowaną technikę generowania losowych lub wyrównanych matryc kolagenowych przy użyciu mikrokanałów PDMS.

Przygotowanie żeli kolagenowych 3D i mikrokanalików do badania oddziaływań 3D in vivo

Ten protokół opisuje, jak przygotować mieszaną matrycę 2D, składającą się z żelatyny i kolagenu I, oraz wtyczkę 3D kolagenu I do badania liniowych inwadosomów. Protokoły te pozwalają na badanie liniowego tworzenia inwadosomu, aktywności degradacji macierzy oraz zdolności inwazji komórek pierwotnych i linii komórek rakowych.

Macierze 2D i 3D do badania liniowego powstawania i aktywności inwadosomów

Ten artykuł przedstawia strategię budowania modeli elementów skończonych z włóknistych materiałów przewodzących wystawionych na działanie pola elektrycznego (EF). Modele te można wykorzystać do oszacowania wkładu elektrycznego, jaki otrzymują komórki zasiane w takich materiałach, oraz do oceny wpływu zmiany właściwości, struktury lub orientacji materiału składowego rusztowania.

Modelowanie metodą elementów skończonych w komórkowym mikrośrodowisku elektrycznym

Ten protokół demonstruje użycie kanału mikroprzepływowego o zmieniającej się geometrii wzdłuż kierunku przepływu płynu do generowania naprężeń rozciągających (rozciągających) w celu wyrównania włókien w hydrożelu kolagenowym 3D (&lt;250 μm grubości). Wynikowe wyrównanie rozciąga się na kilka milimetrów i ma na nie wpływ szybkość odkształcania rozciągającego.

Mikroinżynieryjne hydrożele kolagenowe 3D z wyrównaniem włókien dalekiego zasięgu

Poniższy protokół przedstawia metodę wytłaczania opartą na ścinaniu do produkcji hydrożeli kolagenowych z nanoskalowymi wzorzystymi włókienkami, które mogą być stosowane w szerokim zakresie zastosowań inżynierii tkankowej.

Produkcja kolagenu o wzorzystym kształcie nanofibrylarnym dla inżynierii tkankowej

Poznaj metody syntezy trzech rodzajów kolagenu: natywnego, włóknistego o długich odstępach i segmentowego. Protokoły te wykorzystują mikroskopię sił atomowych do charakterystyki strukturalnej.

In vitro synteza natywnego, włóknistego kolagenu o długim odstępie oraz kolagenu segmentowego o długim odstępie

Przeglądaj więcej filmów