Name: Leczenie wad kostno-chrzęstnych stawu kolanowego królika poprzez implantację allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w skrzepach fibryny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Poznaj metodę implantacji allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w skrzepach fibryny do leczenia wad kostno-chrzęstnych stawu kolanowego u królika. Technika ta umożliwia standaryzowane badania regeneracji chrząstki in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt ten był finansowany przez Niemiecką Społeczność Badawczą (grant HE 4578/3-1) oraz częściowo przez projekt UE w ramach programu FP7 „GAMBA” NMP3-SL-2010-245993.

A. Przygotowanie królika dawcy do izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych (sala operacyjna)
<ol>
	<li>Komórki są izolowane od samców królików nowozelandzkich białych (NZW) w wieku 4 miesięcy i przy masie ciała około 3 kg.</li>
	<li>Indukować znieczulenie propofolem (10 mg/kg masy ciała i.v.) i uśmiercić zwierzę za pomocą pentobarbitalu sodowego (100 mg/kg masy ciała i.v.).</li>
	<li>Wygolić sierść z kończyn tylnych, grzbietu i brzucha za pomocą maszynki elektrycznej, a następnie odessać sierść odkurzaczem.</li>
	<li>Dokładnie zdezynfekować wygolony obszar 70% etanolem.</li>
	<li>Do usuwania tkanek i więzadeł używać pęsety tępodannej, ostrych nożyczek (lub skalpela) oraz kleszczy do kości.</li>
	<li>Wyonać nacięcie wzdłuż powierzchni kranialnej nogi i łydki.</li>
	<li>Odsunąć skórę i tkankę podskórną za pomocą rozdzielania ostrego lub tępego.</li>
	<li>Oddzielić mięśnie i więzadła od kości piszczelowej i udowej. Wykonywać cięcia jak najbliżej kości, aby uzyskać czystą sekcję. Na tym etapie nie oddzielać kości udowej od piszczelowej.</li>
	<li>Przeciąć staw biodrowy, aby oddzielić głowę kości udowej od panewki.</li>
	<li>Unieść kompleks piszczelowo-udowy.</li>
	<li>Użyć ostrza skalpela, aby zeskrobać pozostałą tkankę miękką z kości lub przetrzeć kości sterylnymi chusteczkami. Na tym etapie kość udowa i piszczelowa są nadal połączone.</li>
	<li>Usunąć rzepkę poprzez przecięcie, a następnie przeciąć więzadła stawu kolanowego, aby ostatecznie oddzielić kości.</li>
	<li>Spryskać oddzielone kości 70% etanolem, pozostawić do wyschnięcia, a następnie umieścić każdą kość w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml z pożywką do hodowli komórkowych (DMEM + 1% penicyliny/streptomycyny (Pen/Strep)), aby utrzymać ich wilgotność.</li>
	<li>Przenieść pracę pod sterylną dygestorową komorę z laminarnym przepływem powietrza do hodowli komórkowych.</li>
</ol>
B. Wypłukiwanie MSC królika z kości i ich namnażanie (dygestorium do hodowli komórek)
<ol>
	<li>Wyjąć kości z probówek i umieścić je w szalkach 150 mm za pomocą sterylnej pęsety.</li>
	<li>Odciąć oba końce kości sterylną piłą i przenieść fragmenty do nowych szalek 150 mm.</li>
	<li>Napełnić strzykawkę 10 ml pożywką (DMEM), przymocować igłę G18 i wprowadzić ją do otworu szpiku kostnego.</li>
	<li>Następnie wypłukać jamę szpikową pożywką, aby wypłukać szpik kostny do szalki. Potem wypłukać z drugiego końca, jeśli jest to możliwe. W razie potrzeby odciąć więcej z końców. Jeśli kość pęknie, wypłukać jedynie wnętrze kości.</li>
	<li>Zaspirować zawiesinę komórek w pożywce do strzykawki i wielokrotnie płukać szpik kostny, aż zawiesina będzie swobodnie przepływać przez jamę szpikową i nie będą pojawiać się kolejne skrzepy szpiku.</li>
	<li>Po zebraniu szpiku kostnego ze wszystkich kości, rozbić grudki szpiku, przepuszczając je przez igłę G18: napełnić strzykawkę z przymocowaną igłą i wtłoczyć zawiesinę do pożywki.</li>
	<li>Następnie przefiltrować zawiesinę przez filtr komórkowy do probówki 50 ml. Aby zapobiec utracie komórek, wypłukać szalkę hodowlaną 2x 10 ml pożywki i również przefiltrować.</li>
	<li>Wirować zawiesinę przy 500 x g przez 5 min w RT.</li>
	<li>Usunąć nadsącz i resuspendować osad komórkowy w 10 ml pożywki (DMEM + 1% Pen/Strep).</li>
	<li>Oddzielić komórki krwi od mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) i mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) przy użyciu roztworu separacyjnego Biocoll.</li>
	<li>Nalać 5 ml roztworu separacyjnego Biocoll do probówki 15 ml, ostrożnie nanieść na wierzch 5 ml zawiesiny komórkowej i wirować przy 800 x g przez 20 min w RT (bez hamowania).</li>
	<li>Możliwe wyniki przedstawiono na Rysunku 1: Ze względu na większą gęstość niż Biocoll, erytrocyty osiadają na dnie, podczas gdy PBMC i mezenchymalne komórki macierzyste pozostają na granicy faz.</li>
	<li>Ostrożnie pobrać frakcję z granicy faz do probówki 15 ml i wypłukać 5 ml PBS.</li>
	<li>Wirować zgodnie z opisem w kroku 22, resuspendować w 5 ml PBS i powtórzyć 2-3x.</li>
	<li>Następnie ponownie wirować przy 350 x g przez 10 min w RT (z hamowaniem).</li>
	<li>Resuspendować w 10 ml pożywki i policzyć komórki w hemocytometrze.</li>
	<li>Wysiać komórki w szalkach 150 mm z początkową gęstością zasiewu około 5 x 106.</li>
	<li>Po 2-3 dniach usunąć komórki nieprzywierające. Może być konieczne uprzednie wypłukanie PBS w celu usunięcia szczątków komórkowych. Następnie dodać świeżą pełną pożywkę (DMEM + 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) + 1% Pen/Strep).</li>
	<li>Dokarmiać komórki co 3-4 dni (Rysunek 2).</li>
	<li>Po 5-10 dniach przeprowadzić pierwsze pasażowanie komórek.</li>
</ol>
C. Przygotowanie skrzepów fibrynowych in vitro
<ol>
	<li>W dniu implantacji uwolnić komórki adherentne z kolb/naczyń poprzez 3 min ekspozycji na 0,25% trypsyny-EDTA. Przerwać proces trypsynizacji poprzez dodanie pożywki kompletnej.</li>
	<li>Przenieść komórki do probówki Falcon o pojemności 50 ml i dwukrotnie przemyć je PBS.</li>
	<li>Określić żywotność i liczbę komórek za pomocą barwienia błęknitem trypanowym.</li>
	<li>Przenieść 50 000 komórek do każdej probówki do mikrocentryfugi i zebrać osad poprzez wirowanie przy 500 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Przygotować mastermix dla co najmniej jednego dodatkowego skrzepu w razie potrzeby.</li>
	<li>Resuspendować osad komórkowy w 17 μl PBS i zmieszać 25 μl komponentu fibrynogenu z zestawu TISSUCOL-Kit z tą 17 μl zawiesiną MSC.</li>
	<li>Przygotować sterylną płytkę z nawierconymi otworami (3x3,6 mm) zgodnymi z otworami wierconymi in vivo (Rysunek 3).</li>
	<li>Najpierw wprowadzić 4 μl roztworu trombiny (500 IU/ml) do jednego otworu, a następnie niezwłocznie dodać 42 μl zawiesiny fibrynogenu z komórkami i ponownie 4 μl roztworu trombiny na wierzch. Nie mieszać zawiesiny, aby uniknąć krzepnięcia w końcówce pipety. Początkowo objętość 50 μl naniesionej zawiesiny fibrynogenu z komórkami będzie wystawać ponad krawędź nawierconych otworów, nie rozlewając się dzięki napięciu powierzchniowemu. Jednak po całkowitym skrzepnięciu (po 60 min) skrzep kurczy się i dopasowuje do nawierconego otworu.</li>
	<li>Ostrożnie wyjąć skrzep za pomocą pęsety tępokrawędznej i umieścić go w probówce do mikrocentryfugi z PBS. Przygotować 2 skrzepy na zwierzę.</li>
	<li>Przenieść skrzepy do sali operacyjnej.</li>
</ol>
D. Implantacja allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w skrzepach fibrynowych
<ol>
	<li>Wprowadzić króliczka (NZW, samiec, masa ciała 3,5-4,0 kg, wiek 5-6 miesięcy) w stan znieczulenia poprzez dożylną iniekcję propofolu (10 mg/kg masy ciała).</li>
	<li>Ogolić kolano, które ma zostać poddane operacji, za pomocą trymera elektrycznego i odessać sierść. Wszystkie wyżej wymienione procedury wykonuje się w pomieszczeniu przygotowawczym do zabiegów, aby uniknąć zanieczyszczenia sterylnego środowiska sali operacyjnej.</li>
	<li>Po intubacji podtrzymać znieczulenie, podając dożylnie propofol w dawce 1,5 mg/kg/min oraz fentanyl w dawce 0,05 mg/kg/min. Monitorować znieczulenie za pomocą kapnografii, pulsoksymetrii i pomiaru tętna.</li>
	<li>Dokładnie zdezynfekować ogolone kolano i przykryć resztę ciała królika sterylnym opatrunkiem.</li>
	<li>Zbadać rzepkę palpacyjnie i wykonać nacięcie skóry po stronie przyśrodkowej rzepki.</li>
	<li>Otworzyć staw kolanowy poprzez przyśrodkową artrotomię oko rzepkową w warunkach sterylnych. Należy starać się nie przeciąć żadnych małych powierzchownych naczyń krwionośnych.</li>
	<li>Przesunąć rzepkę bocznie (Rycina 4).</li>
	<li>Po zbadaniu stawu kolanowego pod kątem współistniejących uszkodzeń chrząstki lub anomalii stawowych, utworzyć dwa defekty osteochondralne (o głębokości 3 mm, w kształcie ósemki) w bruździe kości bloczkowej za pomocą sterylnej pneumatycznej wiertarki chirurgicznej (o średnicy 3,6 mm) z ogranicznikiem głębokości (Rycina 5).</li>
	<li>Oczyścić defekty i wypłukać je sterylną solą fizjologiczną.</li>
	<li>Przed implantacją wprowadzić 20 μl kleju fibrynowego do defektów i rozprowadzić go równomiernie na dnie ubytku.</li>
	<li>Następnie zaimplantować skrzepy, dopasowując je ciasno do defektów w kształcie ósemki.</li>
	<li>Po skrzepnięciu przywrócić rzepkę do bruzdy kości bloczkowej oraz kilka razy zgjąć i wyprostować kolano.</li>
	<li>Ponownie przesunąć rzepkę bocznie i sprawdzić, czy skrzepy z fibrynogenu i komórek nadal znajdują się na miejscu.</li>
	<li>Ponownie przywrócić rzepkę i zakończyć operację poprzez warstwowe zamknięcie rany za pomocą pojedynczych szwów węzełkowych (4-0 Vicryl) oraz ciągłego szwu skórnego (4-0 Monocryl) (w obu przypadkach zastosowano wchłanialny materiał szewny).</li>
	<li>Na koniec zabezpieczyć ranę sprayem opatrunkowym przepuszczalnym dla pary wodnej.</li>
	<li>W ramach opieki pooperacyjnej ranę sprawdza się codziennie przez 7 dni. W celu przeciwbólowego leczenia pooperacyjnego króliki otrzymują Karprofen 4 mg/kg s.c. co 24 h (przez 4 dni) oraz Buprenorfinę 0,03 mg/kg s.c. co 12 h (przez 2,5 dnia). Stabilizacja kolana (np. opatrunek) nie jest konieczna.</li>
</ol>

<ol><li>Kon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+nano-composite+multilayered+biomaterial+for+osteochondral+regeneration%3A+a+pilot+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Novel nano-composite multilayered biomaterial for osteochondral regeneration: a pilot clinical trial.</a> The American Journal of Sports Medicine. 39, 1180-1190 (2011).</li>
<li>Kon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orderly+osteochondral+regeneration+in+a+sheep+model+using+a+novel+nano-composite+multilayered+biomaterial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%3A+Official+Publication+of+the+Orthopaedic+Research+Society%22%5BJournal%5D)">Orderly osteochondral regeneration in a sheep model using a novel nano-composite multilayered biomaterial.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 28, 116-124 (2010).</li>
<li>Hangody, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+osteochondral+grafting--technique+and+long-term+results%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Autologous osteochondral grafting--technique and long-term results.</a> Injury. 39, 32-39 (2008).</li>
<li>Marcacci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthroscopic+autologous+osteochondral+grafting+for+cartilage+defects+of+the+knee%3A+prospective+study+results+at+a+minimum+7-year+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Arthroscopic autologous osteochondral grafting for cartilage defects of the knee: prospective study results at a minimum 7-year follow-up.</a> The American Journal of Sports Medicine. 35, 2014-2021 (2007).</li>
<li>Ochs, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+articular+cartilage+and+subchondral+bone+after+bone+grafting+and+matrix-associated+autologous+chondrocyte+implantation+for+osteochondritis+dissecans+of+the+knee%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Remodeling of articular cartilage and subchondral bone after bone grafting and matrix-associated autologous chondrocyte implantation for osteochondritis dissecans of the knee.</a> The American Journal of Sports Medicine. 39, 764-773 (2011).</li>
<li>Aurich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+chondrocyte+transplantation+by+the+sandwich+technique.+A+salvage+procedure+for+osteochondritis+dissecans+of+the+knee%5BTitle%5D)+AND+%22Unfallchirurg%22%5BJournal%5D)">Autologous chondrocyte transplantation by the sandwich technique. A salvage procedure for osteochondritis dissecans of the knee.</a> Unfallchirurg. 110, 176-179 (2007).</li>
<li>Williams, R. J. 3rd, Ranawat, A. S., Potter, H. G., Carter, T., Warren, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fresh+stored+allografts+for+the+treatment+of+osteochondral+defects+of+the+knee%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery.+American+Volume%22%5BJournal%5D)">Fresh stored allografts for the treatment of osteochondral defects of the knee.</a> The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 89, 718-726 (2007).</li>
<li>Szerb, I., Hangody, L., Duska, Z., Kaposi, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaicplasty%3A+long-term+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Hosp.+Jt.+Dis%22%5BJournal%5D)">Mosaicplasty: long-term follow-up.</a> Bull. Hosp. Jt. Dis. 63, 54-62 (2005).</li>
<li>Brittberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+deep+cartilage+defects+in+the+knee+with+autologous+chondrocyte+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation.</a> N. Engl. J. Med. 331, 889-895 (1994).</li>
<li>Peterson, L., Vasiliadis, H. S., Brittberg, M., Lindahl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+chondrocyte+implantation%3A+a+long-term+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Autologous chondrocyte implantation: a long-term follow-up.</a> Am. J. Sports Med. 38, 1117-1124 (2010).</li>
<li>Gomoll, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subchondral+bone+in+articular+cartilage+repair%3A+current+problems+in+the+surgical+management%5BTitle%5D)+AND+%22Knee+Surg.+Sports+Traumatol.+Arthrosc%22%5BJournal%5D)">The subchondral bone in articular cartilage repair: current problems in the surgical management.</a> Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc. 18, 434-447 (2010).</li>
<li>Steinhagen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+osteochondritis+dissecans+of+the+femoral+condyle+with+autologous+bone+grafts+and+matrix-supported+autologous+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Orthop%22%5BJournal%5D)">Treatment of osteochondritis dissecans of the femoral condyle with autologous bone grafts and matrix-supported autologous chondrocytes.</a> Int. Orthop. 34, 819-825 (2010).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+large+articular+cartilage+defects+with+implants+of+autologous+mesenchymal+stem+cells+seeded+into+beta-tricalcium+phosphate+in+a+sheep+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Repair of large articular cartilage defects with implants of autologous mesenchymal stem cells seeded into beta-tricalcium phosphate in a sheep model.</a> Tissue Eng. 10, 1818-1829 (2004).</li>
<li>Centeno, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+knee+cartilage+volume+in+degenerative+joint+disease+using+percutaneously+implanted%2C+autologous+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pain+Physician%22%5BJournal%5D)">Increased knee cartilage volume in degenerative joint disease using percutaneously implanted, autologous mesenchymal stem cells.</a> Pain Physician. 11, 343-353 (2008).</li>
<li>Niederauer, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+multiphase+implants+for+repair+of+focal+osteochondral+defects+in+goats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Evaluation of multiphase implants for repair of focal osteochondral defects in goats.</a> Biomaterials. 21, 2561-2574 (2000).</li>
<li>Nagura, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+osteochondral+defects+with+a+new+porous+synthetic+polymer+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone.+Joint+Surg.+Br%22%5BJournal%5D)">Repair of osteochondral defects with a new porous synthetic polymer scaffold.</a> J. Bone. Joint Surg. Br. 89, 258-264 (2007).</li>
<li>Schlichting, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+scaffold+stiffness+on+subchondral+bone+and+subsequent+cartilage+regeneration+in+an+ovine+model+of+osteochondral+defect+healing%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Influence of scaffold stiffness on subchondral bone and subsequent cartilage regeneration in an ovine model of osteochondral defect healing.</a> The American Journal of Sports Medicine. 36, 2379-2391 (2008).</li>
<li>Schagemann, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-laden+and+cell-free+biopolymer+hydrogel+for+the+treatment+of+osteochondral+defects+in+a+sheep+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cell-laden and cell-free biopolymer hydrogel for the treatment of osteochondral defects in a sheep model.</a> Tissue Engineering. Part A. 15, 75-82 (2009).</li>
<li>Vogt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+the+stable+expression+of+BMP2+in+fibrin+clots+on+the+remodelling+and+repair+of+osteochondral+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of the stable expression of BMP2 in fibrin clots on the remodelling and repair of osteochondral defects.</a> Biomaterials. 30, 2385-2392 (2009).</li>
<li>Schillinger, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fibrin+glue+composition+as+carrier+for+nucleic+acid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">A fibrin glue composition as carrier for nucleic acid vectors.</a> Pharm. Res. 25, 2946-2962 (2008).</li>
<li>Ahmed, T. A., Giulivi, A., Griffith, M., Hincke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+glues+in+combination+with+mesenchymal+stem+cells+to+develop+a+tissue-engineered+cartilage+substitute%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Fibrin glues in combination with mesenchymal stem cells to develop a tissue-engineered cartilage substitute.</a> Tissue Engineering. Part A. 17, 323-335 (2011).</li>
<li>Haleem, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Clinical+Use+of+Human+Culture-Expanded+Autologous+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells+Transplanted+on+Platelet-Rich+Fibrin+Glue+in+the+Treatment+of+Articular+Cartilage+Defects%3A+A+Pilot+Study+and+Preliminary+Results%5BTitle%5D)+AND+%22Cartilage%22%5BJournal%5D)">The Clinical Use of Human Culture-Expanded Autologous Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Transplanted on Platelet-Rich Fibrin Glue in the Treatment of Articular Cartilage Defects: A Pilot Study and Preliminary Results.</a> Cartilage. 1, 253-261 (2010).</li>
<li>Pape, D., Filardo, G., Kon, E., van Dijk, C. N., Madry, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+clinical+problems+associated+with+the+subchondral+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Knee+Surg+Sports+Traumatol.+Arthrosc%22%5BJournal%5D)">Disease-specific clinical problems associated with the subchondral bone.</a> Knee Surg Sports Traumatol. Arthrosc. 18, 448-462 (2010).</li>
<li>Shirazi, R., Shirazi-Adl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+biomechanics+of+articular+cartilage+of+human+knee+joint%3A+effect+of+osteochondral+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Computational biomechanics of articular cartilage of human knee joint: effect of osteochondral defects.</a> Journal of Biomechanics. 42, 2458-2465 (2009).</li>
<li>Jorgensen, C., Gordeladze, J., Noel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Engineering+through+autologous+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Tissue Engineering through autologous mesenchymal stem cells.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 15, 406-410 (2004).</li>
<li>Chen, F. H., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+arthritic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in arthritic diseases.</a> Arthritis Res. Ther. 10, 223(2008).</li>
<li>Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+expression+and+immunologic+properties+of+differentiated+and+undifferentiated+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells.</a> Exp. Hematol. 31, 890-896 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

W ostatnich latach coraz bardziej atrakcyjna staje się możliwość leczenia złożonych stawowych ubytków chrzęstno-kostnych – takich jak te powstałe w wyniku osteochondritis dissecans, osteonekrozy i urazów – z wykorzystaniem metod inżynierii tkankowej. W wymienionych jednostkach chorobowych uszkodzenie tkanek obejmuje kość podchrzęstną i angażuje dwie tkanki charakteryzujące się różnymi wewnętrznymi zdolnościami gojenia 1. Rośnie zainteresowanie rolą kości podchrzęstnej w procesach patogennych stawowych uszkodze...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom AG</td><td>F 0415</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAN Biotech GmbH</td><td>0401</td><td></td></tr><tr><td>Propofol</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Biochrom AG</td><td>A 2210</td><td>1 000 jednostek/10 &amp;mu;g/&amp;mu;l w 0,9% NaCl</td></tr><tr><td>PBS Dulbecco (1X)</td><td>Biochrom AG</td><td>L1815</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (70%)</td><td>Merck KGaA</td><td>410230</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanu (0,4%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór separacyjny Biocoll</td><td>Biochrom AG</td><td>L6115</td><td>Roztwór izotoniczny Gęstość: 1,077 g/ml</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA 0,05%</td><td>Invitrogen GmbH</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>DeltaSelectGmBH</td><td>1819340</td><td></td></tr><tr><td>roztwór NaCl (0,9%)</td><td>BBraun</td><td>8333A193</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki (Injekt)</td><td>BBraun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>Igły (Sterican)</td><td>BBraun</td><td>4657519</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta (tępe/ostre)</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skalpele</td><td>Feather Safety Razor Co</td><td>02.001.30.022</td><td></td></tr><tr><td>Badania nad pipetami</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przecinarka do kości</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli tkanek 100 mm/150 mm</td><td>TPP AG</td><td>93100/93150</td><td>Powierzchnia wzrostu 60,1 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;/147,8 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Kolby do hodowli tkankowych 25/75 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>TPP AG</td><td>90025/90075</td><td>25 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, 75 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Probówki do wirowania (50 ml)</td><td>TPP AG</td><td>91050</td><td>Sterylizowane promieniami gamma</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Inkubator</td><td>Forma Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dygestorium z laminarnym przepływem powietrza do hodowli komórkowych Hera Safe</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylna piła</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Megafuge 2.0 R</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora countingowa (hemocytometr)</td><td>Brand GmbH+Co KG</td><td>717810</td><td>Neubauer</td></tr><tr><td>Wiertarka pneumatyczna</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw TISSUCOL-Kit 1,0 ml Immuno</td><td>Baxter</td><td>2546648</td><td></td></tr><tr><td>Nici chirurgiczne (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl)</td><td>Ethicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opatrunek w sprayu (OpSite)</td><td>Smith&amp;siostrzeniec/bratanek</td><td>66004978</td><td>Przepuszczalny dla pary wodnej</td></tr></tbody></table>

leczenie ubytków chrzęstno-kostnych w stawie kolanowym królika poprzez implantację allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w skrzepach fibrynowych

Treatment of Osteochondral Defects in the Rabbit's Knee Joint by Implantation of Allogeneic Mesenchymal Stem Cells in Fibrin Clots

Leczenie ubytków kostno-chrzęstnych w stawach stanowi od wielu lat wyzwanie dla lekarzy. Lepsze zrozumienie interakcji między chrząstką stawową a kością podchrzęstną w ostatnich latach doprowadziło do zwiększenia uwagi poświęcanej regeneracji całej jednostki kostno-chrzęstnej. W porównaniu z uszkodzeniami chrzęstnymi, regeneracja ubytków kostno-chrzęstnych jest znacznie bardziej złożona i stanowi znacznie większe wyzwanie chirurgiczne i terapeutyczne. Uszkodzona tkanka obejmuje nie tylko powierzchowną warstwę chrząstki, ale również kość podchrzęstną. W przypadku głębokich uszkodzeń kostno-chrzęstnych, takich jak np. w przebiegu osteochondrosis dissecans, konieczna jest rekonstrukcja pełnej grubości ubytku w celu przywrócenia powierzchni stawowej 1. Odpowiednie procedury terapeutyczne muszą uwzględniać te dwie różne tkanki o odmiennym wewnętrznym potencjale gojenia 2. W ostatnich dekadach pojawiło się kilka opcji chirurgicznego leczenia, które zostały już wprowadzone do praktyki klinicznej 3-6.
Autologiczne lub allogeniczne przeszczepy kostno-chrzęstne składają się z chrząstki stawowej i kości podchrzęstnej, umożliwiając zastąpienie całej jednostki kostno-chrzęstnej. Ubytki wypełnia się cylindrycznymi graftami kostno-chrzęstnymi, których celem jest zapewnienie powierzchni pokrytej zgodną chrząstką szklistą 3,7,8. Do wad tej metody należą: ograniczona ilość dostępnych graftów, zachorowalność w miejscu pobrania (w przypadku przeszczepów autologicznych) oraz niezgodność powierzchni; w związku z czym zastosowanie tej metody jest szczególnie ograniczone w przypadku dużych ubytków.
Nowe podejścia w dziedzinie inżynierii tkankowej otworzyły obiecujące możliwości dla regeneracyjnej terapii osteochondralnej. Implantacja autologicznych chondrocytów stanowiła pierwsze biologiczne podejście oparte na komórkach w leczeniu pełnowarstwowych uszkodzeń chrząstki i jest obecnie stosowane na całym świecie, przynosząc dobre wyniki kliniczne nawet 10 do 20 lat po implantacji 9,10. Jednak do dziś technika ta nie nadaje się do leczenia wszystkich rodzajów uszkodzeń, takich jak głębokie defekty obejmujące kość podchrzęstną 11.
technika kanapkowa (sandwich-technique) łączy przeszczepianie kości z aktualnymi podejściami w inżynierii tkankowej 5,6. Kombinacja ta wydaje się pozwalać na przezwyciężenie ograniczeń obserwowanych w przypadku samych przeszczepów kostno-chrzęstnych. Po autologicznym przeszczepieniu kości w obszar ubytku podchrzęstnego, powyżej przyszywa się membranę zasiedloną autologicznymi chondrocytami, co ułatwia dopasowanie topografii przeszczepu do miejsca uszkodzenia. Oczywiście, wcześniejsza rekonstrukcja kostna wymaga dodatkowego czasu operacyjnego, a często nawet dodatkowego zabiegu chirurgicznego. Ponadto do chwili obec stanu brakuje danych długoterminowych 12.
Inżynieria tkankowa bez dodatowego przeszczepu kostnego ma na celu przywrócenie złożonej struktury i właściwości natywnej chrząstki stawowej poprzez potencjał chondrogenny i osteogenny przeszczepionych komórek. Jednakże, ponownie, zazwyczaj regeneracji ulega w większym lub mniejszym stopniu jedynie tkanka chrzęstna. Dodatkowe uszkodzenia kostno-chrzęstne wymagają specyficznego, dalszego leczenia. Aby osiągnąć regenerację wielowarstwowej struktury ubytków kostno-chrzęstnych, trójwymiarowe produkty inżynierii tkankowej zasiane komórkami autologicznymi/allogenicznymi mogą zapewnić dobrą zdolność regeneracyjną 11.
Oprócz autologicznych chondrocytów, mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) wydają się być atrakcyjną alternatywą dla rozwoju pełnowarstwowej tkanki chrzęstnej. W licznych badaniach przedklinicznych in vitro i in vivo mezenchymalne komórki macierzyste wykazały doskonały potencjał regeneracji tkanek 13,14. Istotną zaletą mezenchymalnych komórek macierzystych, szczególnie w leczeniu ubytków kostno-chrzęstnych, jest ich zdolność do różnicowania się zarówno w osteocyty, jak i chondrocyty. Dzięki temu potencjalnie umożliwiają one wielowarstwową regenerację ubytku.
W ostatnich latach opracowano i oceniono zatem kilka rusztowań o potencjale regeneracyjnym w obszarze osteochondralnym, uzyskując obiecujące wstępne wyniki 1,15-18. Ponadto klej fibrynowy jako nośnik komórek stał się jedną z preferowanych technik w eksperymentalnej naprawie chrząstki i został już z sukcesem zastosowany w kilku badaniach na zwierzętach 19-21, a nawet w pierwszych próbach klinicznych u ludzi 22.
Poniższy protokół zaprezentuje technikę eksperymentalną izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych z szpiku kostnego królika, w celu ich późniejszej proliferacji w hodowli komórkowej oraz przygotowania standaryzowanego modelu in vitro skrzepów fibrynowo-komórkowych. Na koniec opisana zostanie technika implantacji wcześniej przygotowanych skrzepów fibrynowo-komórkowych do sztucznych ubytków osteochondralnych w stawie kolanowym królika.

Opisana technika chirurgiczna umożliwia skuteczną izolację i implantację allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w sztuczny ubytek osteochondralny. Układ eksperymentalny doprowadził do pomyślnej integracji implantu z otaczającą chrząstką.
Defekt został wypełniony tkanką naprawczą o właściwościach biomechanicznych i trwałości zbliżonej do otaczającej chrząstki. Skrzep fibrynowo-komórkowy przygotowano in vitro na sterylnej płytce z nawierconymi otworami o rozmiarach odpowia...

Opisano eksperymentalną technikę leczenia ubytków chrzęstno-kostnych w stawie kolanowym królika. Implantacja allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w ubytki chrzęstno-kostne stanowi obiecujący kierunek rozwoju w dziedzinie inżynierii tkankowej. Przygotowanie skrzepów fibrynowo-komórkowych in vitro oferuje zestandaryzowaną metodę implantacji.

Leczenie ubytków chrzęstno-kostnych w stawie kolanowym królika poprzez implantację allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w skrzepach fibrynowych

Leczenie ubytków chrzęstno-kostnych w stawach od wielu lat stanowi wyzwanie dla lekarzy. Lepsze zrozumienie oddziaływań stawowych...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie standaryzowanej metody prowadzenia eksperymentalnych badań nad komórkami macierzystymi w dziedzinie regeneracji kostno-chrzęstnej. Cel ten jest realizowany poprzez wstępną izolację mezenchymalnych komórek macierzystych ze szpiku kostnego królika. W drugim kroku izolowane komórki macierzyste są hodowane w celu umożliwienia ich proliferacji.Następnie w warunkach in vitro przygotowuje się skrzepy komórkowe z fibryny. W kolejnym kroku wcześniej przygotowane skrzepy komórkowe z fibryny implantuje się w sztuczne defekty osteochondralne w stawie kolanowym królika. Ostatecznie, po 12 tygodniach in vivo, można przeprowadzić analizę makroskopową kolana, w której tkanka naprawcza wykazuje jednorodną i nienaruszoną powierzchnię o zwartej strukturze.Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapię uszkodzeń chrząstki w warunkach eksperymentalnych na zwierzętach, ponieważ umożliwia ona analizę in vivo zdolności do integracji i regeneracji allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w leczeniu uszkodzeń chrząstki. W sali zabiegowej należy użyć elektrycznej maszynki do strzyżenia, aby ogolić sierść z tylnych kończyn, pleców i brzuch

treatment-osteochondral-defects-rabbit-s-knee-joint-implantation

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Leczenie wad osteochondralnych w stawie kolanowym królika poprzez implantację allogennych komórek macierzystych mezenchymalnych w skrzepach fibryny

Celem prezentacji jest zademonstrowanie wysoce powtarzalnej metody generowania implantów komórek macierzystych związanych z macierzą w ubytkach chrząstki, które można wizualizować za pomocą obrazowania MR. Komórki macierzyste są znakowane zatwierdzonymi przez FDA ferumoksydami, mieszane z agarozą, implantowane w ubytkach chrząstki i obrazowane za pomocą skanera MR 7T.

Implantacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych ferumoksydami w ubytkach chrząstki

Ludzkie okołonaczyniowe komórki macierzyste (PSCs) stanowią nową klasę komórek macierzystych do regeneracji tkanek szkieletowych, podobnie jak mezenchymalne komórki macierzyste (MSCs). PSCs można wyizolować za pomocą FACS (sortowania komórek aktywowanego fluorescencją) z tkanki tłuszczowej pobranej podczas standardowych procedur liposukcji, a następnie połączyć z rusztowaniem osteoindukcyjnym w celu uzyskania formowania kości in vivo.

Zastosowanie ludzkich peryvaskularnych komórek macierzystych w regeneracji kości

Opisano eksperymentalną technikę leczenia uszkodzeń chrzęstnych w stawie kolanowym królika. Implantacja autologicznych chondrocytów osadzonych na macierzy jest powszechnie akceptowaną metodą przebudowy i naprawy uszkodzeń chrząstki stawowej, zapewniającą satysfakcjonujące długoterminowe wyniki. Transplantacja autologicznych chondrocytów wspomagana macierzą (MACT) oferuje zstandaryzowaną i klinicznie uznaną metodę implantacji.

Przeszczep chrząstki autologicznej wspomagany macierzą w celu przebudowy i naprawy ubytków chrzęstnych w modelu królika

Modele zwierzęce są ważnymi narzędziami do oceny przeszczepów wytwarzanych metodą inżynierii tkankowej. W pracy przedstawiono protokół przygotowania elektroprzędzonego biodegradowalnego przeszczepu polimerowego do zastosowania w inżynierii tkankowej więzadła krzyżowego przedniego, a także protokół chirurgiczny implantacji w modelu szczurzym.

Atymiczny model szczura do oceny zmodyfikowanych przeszczepów więzadła krzyżowego przedniego

Celem tego badania jest przedstawienie protokołu artroskopowego leczenia uszkodzeń kostno-chrzęstnych kości skokowej przy użyciu mikrozłamanych i oczyszczonych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej.

Autologiczna mikropęknięta i oczyszczona tkanka tłuszczowa do artroskopowego leczenia zmian kostno-chrzęstnych kości skokowej

Ten artykuł opisuje przygotowanie i ocenę sferoidów mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z macierzy pępowiny z obustronnym modelem ubytku ścięgna rzepki u szczura. Model ten był związany z akceptowalną chorobowością i stwierdzono, że wykrywa różnice między nieleczonymi i leczonymi ścięgnami oraz między dwoma testowanymi terapiami.

Ocena terapii komórkami macierzystymi w obustronnym modelu uszkodzenia ścięgna rzepki u szczurów

Ten artykuł przedstawia prosty i ekonomiczny protokół prostej izolacji i oczyszczania mezenchymalnych komórek macierzystych z płynu maziowego białego królika z Nowej Zelandii.

Strategie sortowania komórek aktywowanych magnetycznie w celu izolacji i oczyszczenia mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z płynu maziowego z modelu królika

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania frakcji zrębowej pochodzącej z tkanki tłuszczowej i jej zastosowanie do poprawy funkcji kolana poprzez regenerację tkanki chrzęstnej u pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów.

Protokół kliniczny wytwarzania frakcji zrębowej naczyniowej pochodzącej z tkanki tłuszczowej w celu potencjalnej regeneracji chrząstki

Terapia kości poprzez kostnienie śródchrzęstne poprzez wszczepienie sztucznej tkanki chrzęstnej wyprodukowanej z mezenchymalnych komórek macierzystych ma potencjał do obejścia wad konwencjonalnych terapii. Hydrożele kwasu hialuronowego są skuteczne w zwiększaniu skali jednolicie zróżnicowanych przeszczepów chrząstki, a także w tworzeniu zintegrowanej kości z unaczynieniem między zrośniętymi przeszczepami in vivo.

Zintegrowane tworzenie kości poprzez kostnienie endochrzęstne in vivo przy użyciu mezenchymalnych komórek macierzystych

Proponowany protokół zakłada globalne podejście do oceny procesu tworzenia się kości w kontekście regeneracji kości za pomocą analiz multimodalnych. Ma on na celu dostarczenie jakościowych i ilościowych informacji na temat tworzenia się nowych kości, zwiększenie rygoru i trafności badań podstawowych i przedklinicznych.

Kompleksowa charakterystyka mineralizacji tkanek w modelu ex vivo

Przedstawiamy tutaj zintegrowany protokół generowania kontrolowanych zmian kostnych-chondralnych u kolan owiec, aby ustanowić eksperymentalny model odpowiedni do badań regeneracji tkanek kości i chrząstki. Protokół określa metodę wywołania pełnogrubego ubytku kości kostnodzielnej w kłykciu udowym, wykorzystując techniki minimalizujące wpływ na dobrostan zwierząt oraz zmienność wyników.

Ustanowienie i ocena modelu owiec o pełnej grubości ubytku kości kościowego

Poznaj metodę implantacji allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w skrzepach fibryny do leczenia wad kostno-chrzęstnych stawu kolanowego u królika. Technika ta umożliwia standaryzowane badania regeneracji chrząstki in vivo.

Leczenie wad kostno-chrzęstnych stawu kolanowego królika poprzez implantację allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w skrzepach fibryny (Wideo) | JoVE Journal

Leczenie ubytków chrzęstno-kostnych w stawie kolanowym królika poprzez implantację allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w skrzepach fibrynowych

Przeglądaj więcej filmów