Name: Sekwencyjne fotowybielanie w celu wyznaczenia pojedynczych komórek Schwanna w połączeniu nerwowo-mięśniowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Poznaj metodę sekwencyjnego fotowybielania do wizualizacji pojedynczych komórek Schwanna w połączeniach nerwowo-mięśniowych myszy transgenicznych. Technika ta umożliwia szczegółową analizę morfologii komórek w tkance nerwowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Manueli Budak, Ljiljanie Marinkovi i Kristinie Wullimann za doskonałą pomoc techniczną. Dziękujemy W. Macklinowi za udostępnienie myszy Plp-GFP. T.M. otrzymuje wsparcie z Instytutu Studiów Zaawansowanych (Technische Universität München), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; Sonderforschungsbereich SFB 596), Alexander-von-Humboldt-Foundation oraz z krajowej agencji finansującej („Bundesministerium für Bildung und Forschung”) w ramach ERA-Net NEURON „iPSoALS” oraz „2-photon imaging”. T.M. i M.B. są wspierani przez Center for Integrated Protein Science (Monachium). P.M. otrzymał wsparcie z Graduate School of Technische Universität München (TUM-GS).

1. Eksplant mięśnia mostkowo-obojczykowatego (Rysunek 1)
Czas trwania: 15 min.
<ol>
 <li>Przygotować instrumenty chirurgiczne: 2 pary pęset, 1 parę nożyczek, 1 parę nożyczek sprężynowych, 1 naczynie do hodowli tkanek (10 cm). Schłodzony (4 °C) roztwór Ringera uprzednio napowietrzany (minimum przez 15 min) mieszaniną 5% CO2/ 95% O2. Naczynie do hodowli tkanek o średnicy 15 cm wypełnić lodem i przykryć metalową płytką. Przygotować mikroskop sekcyjny i umieścić naczynie 15 cm z lodem pod mikroskopem, aby chłodzić eksplant podczas sekcji.</li>
 <li>Mysz poddać letalnej anestezji poprzez przedawkowanie izofluranu (lub inną zatwierdzoną metodą uśmiercania). Myszy spryskać 70% etanolem, aby zapobiec zanieczyszczeniu eksplantu sierścią. Do bielenia SC wykorzystano myszy Plp-GFP, które mogą być krzyżowane z Thy1-OFP3 lub Thy1-Membow13 w celu jednoczesnej wizualizacji aksonu.</li>
 <li>Używając dużych nożyczek, wykonać nacięcie skóry wzdłuż linii środkowej nad mostkiem oraz dwa nacięcia równoległe do dolnej krawędzi klatki piersiowej.</li>
 <li>Używając dużych nożyczek, usunąć skórę, otworzyć ścianę brzuszną i wykonać nacięcia równoległe do klatki piersiowej aż do kręgosłupa. Następnie wypreparować mięśnie piersiowe, wykonując nacięcia blisko ich przyczepu do mostka.</li>
 <li>Przeciąć przeponę tuż poniżej chrząstki miecza mostka i wypreparować ją wzdłuż przyczepów żebrowych.</li>
 <li>Trzymając klatkę piersiową za wyrostek mieczowaty za pomocą pęsety, rozpocząć odcinanie żeber od kręgosłupa, jak najbliżej ich przyczepów. Cięcia lewe i prawe powinny zbiegać się nad sercem w kierunku rękojeści mostka. Należy starać się nie przeciąć dużych naczyń krwionośnych (zwłaszcza żył podobojczykowych). Lepszą widoczność uzyskuje się poprzez delikatne uniesienie preparatu podczas trzymania wyrostka mieczowatego pęsetą.</li>
 <li>Wykonać cięcie poprzeczne tuż poniżej rękojeści mostka i przenieść eksplant do naczynia 10 cm z schłodzonym, napowietrzonym 5% CO2/ 95% O2 roztworem Ringera. Naczynie 10 cm umieścić na metalowej płytce przykrywającej naczynie 15 cm wypełnione lodem. Wszystkie kolejne kroki należy wykonywać pod mikroskopem sekcyjnym.</li>
 <li>Używając małych nożyczek sprężynowych, usunąć pozostałości grasicy, opłucnej, przepony (wewnątrz) i mięśni piersiowych (na zewnątrz; Rysunek 1B-D).</li>
 <li>Aby dopasować eksplant do naczynia 3,5 cm, wypreparować wszystkie żebra, które nie przyczepiają się do mostka. Najlepiej zrobić to za pomocą małych nożyczek sprężynowych, przecinając tkankę między żebrami (Rysunek 1E).</li>
 <li>Przytwierdzić eksplant nerwowo-mięśniowy m. triangularis sterni do naczynia do hodowli tkanek o średnicy 3,5 cm pokrytego Sylgardem, używając szpilek minutien (skróconych do &lt; 4 mm; Rysunek 1G). Dwie szpilki powinny przejść przez chrzęstne (białe) części mostka. Wbić co najmniej dwie szpilki przez żebra zarówno po lewej, jak i prawej stronie eksplantu, celując w miękkie części chrzęstne i unikając żeber znajdujących się pod lub blisko mięśnia trójkątnego. Im więcej szpilek zostanie użytych, tym lepiej (zazwyczaj stosuje się 8-10). Podczas przytwierdzania preparatu należy upewnić się, że żebra są nieco rozczłonkowane, co ustawi mięsień w lekko rozciągniętej pozycji.</li>
 <li>Opcjonalnie: Zwizualizować miejsca synaptyczne zawierające receptory acetylocholinowe, dodając bungarotoksynę sprzężoną z barwnikami Alexa (stężenie 0,8 μg/ml w napowietrzonym 5% CO2/ 95% O2 roztworze Ringera). Inkubować przytwierdzony eksplant w naczyniu pokrytym Sylgardem przez 15-20 min w temperaturze pokojowej, a następnie kilkakrotnie przemyć napowietrzonym 5% CO2/ 95% O2 roztworem Ringera.</li>
</ol>
2. Odbarwianie komórek macierzystych (SCs) i opcjonalna mikroskopia time-lapse (Rysunek 2)
Czas trwania: 30 - 45 min + opcjonalnie 1 - 5 hr dla rejestracji time-lapse.
<ol>
 <li>Przenieś naczynie 3,5-cm powlekane Sylgardem do mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser argonowy (długość fali 488 nm) i obiektywy immersyjne w wodzie (4x, 0.13 NA; 20x, 0.5 NA oraz 100x, 1.0 NA lub 60x, 0.9 NA).</li>
 <li>Opcjonalnie dla mikroskopii time-lapse: Włóż naczynie 3,5-cm powlekane Sylgardem do pierścienia grzewczego, zainstaluj system superfuzji i sondę temperatury (Ryc. 2A). Upewnij się, że żadna z tych części nie dotyka eksplantu, krawędzi naczynia ani powłoki Sylgard. Podgrzej próbkę do 33-35 °C. W przypadku wybielania SC bez obrazowania time-lapse lepiej zastosować temperaturę pokojową, ponieważ komórki wykazują mniejszą dynamikę pomiędzy etapami wybielania.</li>
 <li>Za pomocą obiektywu powietrznego 4x zaobserwuj wzorzec unerwienia mięśnia triangularis sterni i zlokalizuj pas płyt końcowych mięśnia triangularis sterni. Przełącz się na obiektyw z zanurzalnym stożkiem 20x i zacznij szukać obszarów powierzchownych w obrębie pasa płyt końcowych (dobrymi kandydatami są obszary nad żebrami). Zmień obiektyw na 100x lub 60x z zanurzalnym stożkiem, aby sprawdzić poszczególne NMJ. Idealna jest NMJ pokryta przez kilka SC i położona bardzo powierzchownie (Ryc. 2B). Jeśli planujesz obrazowanie time-lapse po wybielaniu, wybierz do 3 NMJ położonych stosunkowo blisko siebie, aby zwiększyć wydajność.</li>
 <li>Wykonaj obraz konfokalny NMJ przed fotowybielaniem poszczególnych SC (Ryc. 2B). (W celu obrazowania w pełnej rozdzielczości, np. na mikroskopie Olympus FV1000, użyj obiektywu 100x, 1.0 NA i przybliżenia 2,5, co pozwala na próbkowanie ograniczone kryterium Nyquista na poziomie ~0,1 μm na piksel).</li>
 <li>„Zaparkuj” wiązkę lasera 488 nm centralnie na jądrze SC, używając maksymalnej mocy przez 5 sekund (alternatywnie można zastosować wydajny wzór skanowania w małym obszarze zainteresowania, taki jak funkcja „tornado scan” w mikroskopie Olympus; ponieważ używamy mikroskopu konfokalnego, laser jest ogniskowany w płaszczyznach sprzężonych z obrazem, zatem przy 488 nm i obiektywie 1,0 N.A. średnica wynosi &lt; 0,5 μm). Ponownie ustaw ostrość na komórkę i oceń efekt wybielania. W razie potrzeby powtórz etap wybielania, aż poziomy GFP zostaną zredukowane do wartości bliskich tłu. Wykonaj obraz po wybielaniu (Ryc. 2C). Kluczowe jest upewnienie się, że wybielany obszar znajduje się poza jakimkolwiek nakładaniem się dwóch komórek – jeśli występuje nakładanie, wybielanie w drugiej komórce będzie oczywiste.</li>
 <li>Powtarzaj powyższy krok, aż wszystkie poza jedną SC zostaną wybielone (Ryc. 2D-E). Ostatnia „niewybielona” SC nadaje się do konfokalnej mikroskopii time-lapse. Zrekonstruuj pojedyncze komórki poprzez odejmowanie obrazów, np. za pomocą oprogramowania Photoshop, aby wyznaczyć morfologię i terytorium pojedynczej SC (Ryc. 2F). Pamiętaj, że odejmowanie dwóch obrazów generuje szum (np. poprzez importowanie ich w kolejnych „warstwach” w Photoshopie, a następnie ustawienie górnego kanału na „difference” w menu rozwijanym na górze karty kanałów). Można tego uniknąć, stosując funkcję „despeckle” na kanałach przed odejmowaniem i wycinając tło, które ewidentnie nie pochodzi z wybielonej komórki. Aby zoptymalizować kontrast, konieczna może być regulacja jasności obu kanałów w oknie „levels”. Uzyskany obraz wybielonej komórki zostaje nałożony na oryginalny obraz synapsy, nadany unikalny pseudokolor i uczyniony przezroczystym, aby pokolorować terytorium wybielonej komórki na oryginalnym obrazie (wykonanie tego dla wszystkich wybielonych oraz ostatniej, niewybielonej komórki daje obraz przedstawiony na Ryc. 2F).</li>
 <li>Opcjonalnie: Rozpocznij konfokalną mikroskopię time-lapse po wybieleniu wszystkich poza jedną SC. Wykonuj obrazy w stałych odstępach czasu (na przykład co 5 do 10 min). Używaj jak najmniejszej mocy lasera. W jednej sesji można obrazować do 3 NMJ.</li>
 <li>Stwórz mapę NMJ z obrazowania time-lapse, wykonując obraz przy 100x bez przybliżenia, a następnie obrazy regionu przy użyciu obiektywów 20x i 4x (Ryc. 2G-I). Ta „mapa” jest niezbędna do odnalezienia NMJ po immunohistochemii utrwalonego mięśnia.</li>
 <li>Do przetwarzania obrazów przekształć poszczególne obrazy w projekcje maksymalnej intensywności i zapisz w formacie tiff. Połącz wszystkie punkty czasowe z projekcji z osi z w stos i wyrównaj w osiach xy, np. używając wtyczki „stackreg”10 w programie Fiji (pakiet oparty na oprogramowaniu open source ImageJ; National Institutes of Health).</li>
</ol>
3. Fixacja i immunohistochemia (Rysunek 3)
Czas trwania: przez noc.
<ol>
 <li>Przenieś eksplant do probówki reakcyjnej o pojemności 50 ml zawierającej co najmniej 15 ml 4% PFA, ostrożnie usuwając piny. Przeprowadź post-fiksację przedniej ściany klatki piersiowej z mięśniem triangularis sterni przez 1 hr w lodzie. Przepłucz utrwaloną tkankę 0,1 M glicyną w PBS (aby zneutralizować pozostałości utrwalacza i tym samym zmniejszyć tło) przez co najmniej 10 min. Na tym etapie próbki można przechowywać i przetworzyć później.</li>
 <li>Przenieś utrwalony eksplant do naczynia hodowli tkankowej o średnicy 10 cm powleczonego Sylgardem i wypełnionego 0,01 M PBS. Wytnij kształt trapezu, w którym jedna strona jest równoległa do mostka, a druga przebiega przez przejścia kość-chrząstka – w tym obszarze na powierzchni znajduje się mięsień triangularis. Usuń dolne żebra, wykonując cięcie poziome (tzn. transsternalne), tak aby uzyskać swobodny dostęp do końca ogonowego mięśnia triangularis (Ryc. 3A-D).</li>
 <li>Wprowadź igłę hipodermiczną jako pin w górną część trapezu (Ryc. 3E). Używając igły hipodermicznej przymocowanej do strzykawki 1 ml oraz pęsety, usuń znajdujący się na powierzchni mięsień triangularis, delikatnie trzymając za kąt ogonowy mięśnia i używając igły jako mikroskalpela. Upewnij się, że cięcia są wykonywane równolegle do płaszczyzny ściany klatki piersiowej. Po uwolnieniu części ogonowej mięśnia wprowadź kolejną igłę hipodermiczną jako pin pod mięsień, przez ścianę klatki piersiowej – unieruchomi to preparat i pozwoli na delikatne pociągnięcie mięśnia za pomocą pęsety (Ryc. 3F). Podczas przecinania przyczepów tkanki łącznej „odklejaj” mięsień od klatki piersiowej. Przetnij ostatni przyczep ogonowy nożyczkami sprężynowymi. Usuń pozostałości tłuszczu i naczyń krwionośnych za pomocą pęsety. Zachowaj ostrożność, aby nie zerwać nerwów. Uwaga: Do pracy z tkanką żywą i utrwaloną należy używać oddzielnych zestawów narzędzi i naczyń.</li>
 <li>Rozpocznij immunohistochemię (zgodnie ze standardowym protokołem), przenosząc próbki tkanki do roztworu blokującego na 1 hr na wytrząsarce w temperaturze pokojowej. Minimalna objętość do barwienia w płytce 96-dołkowej wynosi 200 μl.</li>
 <li>Nałóż przeciwciało pierwotne rozcieńczone w roztworze blokującym, 200 μl na dołek, przez noc w 4 °C na wytrząsarce.</li>
 <li>Przepłucz w 0,01 M PBS trzy razy po 10 min.</li>
 <li>Nałóż odpowiednie przeciwciało wtórne rozcieńczone w roztworze blokującym na 1-2 hr w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przepłucz w 0,01 M PBS trzy razy po 10 min.</li>
 <li>Zamontuj w medium antyblaknącym (np. Vectashield) i przykryj szkiełkiem cover-slip.</li>
 <li>Umieść preparat na magnetycznej płytce metalowej, połóż magnes na próbce, aby ją spłaszczyć przez kilka godzin lub przez noc w 4 °C. Uszczelnij lakierem do paznokci.</li>
</ol>

<ol><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolipid+promoter+activity+distinguishes+two+populations+of+NG2-positive+cells+throughout+neonatal+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development.</a> J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).</li>
<li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li>
<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li>
<li>Thompson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+with+photoswitchable+GFP+in+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells.</a> Society for Neuroscience. Program 241, (2008).</li>
<li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+development+of+outer+retinal+synapses+in+the+absence+of+glial+contact%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact.</a> J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).</li>
<li>Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+imaging+of+motor+axon+dynamics+in+murine+triangularis+sterni+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants.</a> Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).</li>
<li>McArdle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+the+triangularis+sterni+muscle+of+the+mouse+for+investigations+of+synaptic+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena.</a> J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).</li>
<li>Marinkovi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).</li>
<li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li>
<li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia%2C+neurons%2C+macrophages%2C+and+dendritic+cells+for+vital+examination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj metoda wybiaszania komórek SC jest prosta, szybka i wszechstronna: (i) umożliwia ujawnienie morfologii i dynamiki pojedynczej komórki SC za pomocą mikroskopii konfokalnej w oparciu o pojedynczy transgen – co stanowi istotną zaletę przy łączeniu tego podejścia np. z modelami chorób wymagającymi dodatkowych alleli. (ii) Metoda jest szybka, ponieważ od momentu sekcji do fiksacji można ją przeprowadzić w ciągu pół dnia. (iii) Zakres zastosowań jest szeroki, gdyż można ją łączyć z innymi metodami,...

<table><tbody><tr><td>70% (obj./obj.) roztwór etanolu </td><td>Roth</td><td>T913.1</td><td>w butelce z atomizerem</td></tr><tr><td>izofluran</td><td>Forene, Abbott</td><td></td><td>można zastosować jakikolwiek inny zatwierdzony środek znieczulający do przeprowadzenia eutanazji przez znieczulenie</td></tr><tr><td>myszy transgeniczne (&lt;em&gt;Plp&lt;/em&gt;-GFP) </td><td></td><td></td><td>należy pozyskać z cytowanych źródeł</td></tr><tr><td>mikroskop stereoskopowy z oświetleniem zimnym </td><td>Olympus SZ51</td><td></td><td>wyposażony w Schott KL 1500 LCD</td></tr><tr><td>pinceta nr 2</td><td>Fine Science Tools</td><td>11233-20</td><td></td></tr><tr><td>pinceta nr 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-00</td><td></td></tr><tr><td>nożyczki medyczne, duże</td><td>Fine Science Tools</td><td>14108-09</td><td></td></tr><tr><td>nożyczki, małe zakrzywione sprężynowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>15033-09</td><td></td></tr><tr><td>podgrzewacz przepływowy</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-28</td><td></td></tr><tr><td>pierścień grzejny do naczyń o średnicy 3,5 cm </td><td>Warner Instruments</td><td>64-0110 DH-35</td><td></td></tr><tr><td>dwukanałowy system kontroli temperatury</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>system pompy do superfuzyjnej perfuzji </td><td></td><td></td><td>wykonany na zamówienie</td></tr><tr><td>szalka hodowlana o średnicy 15 cm </td><td>Sarstedt</td><td>83.1803.003</td><td>wypełnione lodem i przykryte metalową płytką</td></tr><tr><td>szalka do hodowli tkankowej o średnicy 10 cm </td><td>Sarstedt</td><td>83.1802.003</td><td>z natlenionym roztworem Ringera</td></tr><tr><td>szalka hodowlana o średnicy 3,5 cm </td><td>Sarstedt</td><td>83.1800.003</td><td>wypełnione polimerem Sylgard</td></tr><tr><td>polimer Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>Zestaw do przygotowania elastomeru silikonowego Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop konfokalny </td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td>z laserem argonowym</td></tr><tr><td>probówka reakcyjna o pojemności 50 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254 PP</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA w PBS</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>kaniula 0,5 mm x 25 mm</td><td>Neolab</td><td>E-1510</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 1 ml</td><td>Neolab</td><td>E-1496</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało przeciwko synaptofizynie</td><td>Invitrogen</td><td>18-0130</td><td>królik</td></tr><tr><td>przeciwciało wtórne</td><td>Invitrogen</td><td>A-11012</td><td>Alexa 594</td></tr><tr><td>płytka 24-dołkowa</td><td>Sarstedt</td><td>83.1836</td><td></td></tr><tr><td>0,01 M PBS</td><td>Sygma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>0,1 M glicyna w PBS</td><td>Roth</td><td>3790.1</td><td></td></tr><tr><td>szkiełka coverglass</td><td>Neolab</td><td>E-4132</td><td></td></tr><tr><td>preparaty</td><td>Neolab</td><td>E-4121</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>piny do mikro manipulacji &amp;#215;10</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>skrócone do &amp;< 4 mm</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Bungarotoksyna sprzężona z Alexa 594</td><td>Invitrogen (Molecular Probes)</td><td>B-13423</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;Roztwór blokujący&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>0,01 M PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2% Triton-X100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>10% normalne serum kozie</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td></td></tr><tr><td> 1% albuminy surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;roztwór Ringera&lt;Sekwencyjne fotowybielanie stanowi nieinwazyjną metodę znakowania poszczególnych komórek Schwanna (SC) w obrębie złącza nerwowo-mięśniowego (NMJ). NMJ jest największą synapsą w układzie nerwowym ssaków i służy jako wiodący model badania struktury oraz funkcji synaptycznej. W NMJ myszy zakończenia aksonów ruchowych tworzą z włóknami mięśniowymi miejsca kontaktu przypominające precel. Akson ruchowy i jego zakończenie są otoczone przez komórki Schwanna. W ciągu ostatnich dziesięcioleci stworzono kilka linii myszy transgenicznych umożliwiających wizualizację neuronów ruchowych oraz komórek Schwanna, na przykład odpowiednio myszy Thy1-XFP1 i Plp-GFP. Wzdłuż aksonów ruchowych mielinizujące komórki Schwanna są rozmieszczone w formie niezachodzących na siebie internodów, oddzielonych węzłami Ranviere’a, co umożliwia skokowe przewodzenie potencjału czynnościowego. Z kolei terminalne komórki Schwanna w synapsie są wyspecjalizowanymi komórkami glejowymi, które monitorują i wspomagają neurotransmisję, usuwają szczątki komórkowe i prowadzą regenerujące się aksony. Złącza NMJ są ściśle pokryte przez do sześciu niemielinizujących terminalnych komórek Schwanna – nie można ich jednak rozdzielić indywidualnie za pomocą mikroskopii świetlnej, ponieważ pozostają one w bezpośrednim kontakcie błonowym. Istnieje kilka metod umożliwiających indywidualną wizualizację terminalnych komórek Schwanna, jednak żadna z nich nie jest pozbawiona wad. Przykładowo, wypełnianie barwnikiem, w którym pojedyncze komórki są nakłuwane mikroelektrodą wypełnioną barwnikiem, wymaga zniszczenia znakowanej komórki przed wypełnieniem kolejnej. Jest to niekompatybilne z późniejszymi pomiarami w trybie time-lapse. Wielospektralne znakowanie komórek Schwanna metodą „Brainbow” osiągnięto poprzez kombinatoryjną ekspresję białek fluorescencyjnych. Technika ta wymaga jednak połączenia kilku transgenów i jest ograniczona przez wzorzec ekspresji stosowanych promotorów. W przyszłości alternatywą może stać się ekspresja białek „fotoprzełączalnych” w komórkach Schwanna. Przedstawiamy tutaj metodę sekwencyjnego fotowybielania, w której pojedyncze komórki są wybielane, a ich obraz uzyskuje się poprzez odejmowanie. Uważamy, że podejście to – ze względu na prostotę i wszechstronność – stanowi trwałe uzupełnienie instrumentarium technologicznego neurobiologa, zwłaszcza że może być stosowane in vivo i przeniesione na inne typy komórek, miejsca anatomiczne lub gatunki. W poniższym protokole szczegółowo opisujemy zastosowanie sekwencyjnego wybielania i następującej po nim konfokalnej mikroskopii time-lapse w odniesieniu do terminalnych komórek Schwanna w eksplantach mięśnia triangularis sterni. Ten cienki, powierzchowny i łatwy do wypreparowania preparat nerwowo-mięśniowy okazał się użyteczny w badaniach rozwoju, fizjologii i patologii NMJ. Na koniec wyjaśniamy, w jaki sposób przygotowuje się mięsień triangularis sterni po utrwaleniu, aby przeprowadzić skorelowane obrazowanie konfokalne o wysokiej rozdzielczości, immunohistochemię lub badania ultrastrukturalne.&gt; &lt;/em&gt;napowietrzony 95% O2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; /5% CO2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td> 125 mM NaCl </td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>2,5 mM KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>1,25 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;Sekwencyjne fotowybielanie stanowi nieinwazyjny sposób znakowania poszczególnych komórek Schwanna (SC) w obrębie połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ). NMJ jest największą synapsą w układzie nerwowym ssaków i służy jako model wiodący do badania struktury i funkcji synaptycznych. W NMJ myszy zakończenia aksonów ruchowych tworzą z włóknami mięśniowymi miejsca kontaktu przypominające precla. Akson ruchowy i jego zakończenie są otoczone przez komórki SC. W ciągu ostatnich dekad stworzono kilka linii myszy transgenicznych umożliwiających wizualizację neuronów ruchowych i komórek SC, na przykład odpowiednio myszy Thy1-XFP1 i Plp-GFP. Wzdłuż aksonów ruchowych mielinizujące komórki SC są rozmieszczone w niezachodzących na siebie internodach, oddzielonych węzłami Ranviere’a, co umożliwia skokowe przewodzenie potencjału czynnościowego. Z kolei terminalne komórki SC w synapsie są wyspecjalizowanymi komórkami glejowymi, które monitorują i wspomagają neurotransmisję, usuwają resztki komórkowe i prowadzą regenerujące się aksony. NMJ są ściśle pokryte przez do sześciu niemielinizujących terminalnych komórek SC – nie można ich jednak rozróżnić pojedynczo za pomocą mikroskopii świetlnej, ponieważ pozostają one w bezpośrednim kontakcie błonowym. Istnieje kilka metod pozwalających na indywidualną wizualizację terminalnych komórek SC, jednak żadna z nich nie jest doskonała. Na przykład wypełnianie barwnikiem, w którym pojedyncze komórki są nakłuwane mikroelektrodą wypełnioną barwnikiem, wymaga zniszczenia znakowanej komórki przed wypełnieniem kolejnej. Jest to niezgodne z późniejszymi rejestracjami time-lapse. Wielospektralne znakowanie komórek SC metodą „Brainbow” osiągnięto poprzez kombinacyjną ekspresję białek fluorescencyjnych. Technika ta wymaga jednak połączenia kilku transgenów i jest ograniczona wzorcem ekspresji użytych promotorów. W przyszłości alternatywą może stać się ekspresja białek „fotoprzełączalnych” w komórkach SC. Przedstawiamy tutaj metodę sekwencyjnego fotowybielania, w której pojedyncze komórki są wybielane, a ich obraz uzyskuje się poprzez odejmowanie. Uważamy, że podejście to – ze względu na prostotę i wszechstronność – stanowi trwały dodatek do instrumentarium technologicznego neurobiologa, zwłaszcza że może być stosowane in vivo i przeniesione na inne typy komórek, obszary anatomiczne lub gatunki. W poniższym protokole szczegółowo opisujemy zastosowanie sekwencyjnego wybielania i następującej po nim konfokalnej mikroskopii time-lapse w odniesieniu do terminalnych komórek SC w eksplantach mięśnia trójkątnego piersiowego (m. triangularis sterni). Ten cienki, powierzchowny i łatwy do wypreparowania preparat nerwowo-mięśniowy okazał się użyteczny w badaniach rozwoju, fizjologii i patologii NMJ. Na koniec wyjaśniamy, w jaki sposób przygotowuje się mięsień trójkątny piersiowy po utrwaleniu, aby przeprowadzić skorelowane obrazowanie konfokalne o wysokiej rozdzielczości, immunohistochemię lub badania ultrastrukturalne.&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>26 mM NaHCO3&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>2 mM CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>21114</td><td></td></tr><tr><td>1 mM MgCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>63020</td><td></td></tr><tr><td>20 mM glukozy</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Następne fotowybielanie stanowi nieinwazyjną metodę znakowania poszczególnych komórek Schwanna (SC) w obrębie złącza neuromięśniowego (NMJ). NMJ jest największą synapsą w układzie nerwowym ssaków i służy jako wiodący model badania struktury oraz funkcji synaptycznych. W NMJ myszy zakończenia aksonów ruchowych tworzą przypominające precel miejsca kontaktu z włóknami mięśniowymi. Akson ruchowy i jego zakończenie są otoczone przez komórki Schwanna. W ciągu ostatnich dekad stworzono kilka linii myszy transgenicznych umożliwiających wizualizację neuronów ruchowych i komórek Schwanna, na przykład odpowiednio myszy Thy1-XFP1 i Plp-GFP. Wzdłuż aksonów ruchowych mielinizujące komórki Schwanna są rozmieszczone w niezachodzących na siebie internodach, oddzielonych węzłami Ranviéra, co umożliwia skokowe przewodzenie potencjału czynnościowego. Z kolei terminalne komórki Schwanna w synapsie są wyspecjalizowanymi komórkami glejowymi, które monitorują i wspomagają neurotransmisję, usuwają szczątki komórkowe oraz prowadzą regenerujące się aksony. NMJ są ściśle pokryte przez do sześciu niemielinizujących terminalnych komórek Schwanna – nie można ich jednak rozróżnić pojedynczo w mikroskopii świetlnej, ponieważ znajdują się one w bezpośrednim kontakcie błonowym. Istnieje kilka metod umożliwiających indywidualną wizualizację terminalnych komórek Schwanna, jednak żadna z nich nie jest wolna od wad. Na przykład wypełnianie barwnikiem, w którym pojedyncze komórki są nakłuwane mikroelektrodą wypełnioną barwnikiem, wymaga zniszczenia znakowanej komórki przed wypełnieniem kolejnej. Jest to niezgodne z późniejszymi rejestracjami time-lapse. Wielospektralne znakowanie komórek Schwanna metodą „Brainbow” osiągnięto poprzez kombinatoryjną ekspresję białek fluorescencyjnych. Technika ta wymaga jednak połączenia kilku transgenów i jest ograniczona wzorcem ekspresji wykorzystanych promotorów. W przyszłości alternatywą może okazać się ekspresja białek „fotoprzełączalnych” w komórkach Schwanna. Przedstawiamy tutaj metodę następnego fotowybielania, w której pojedyncze komórki są wybielane, a ich obraz uzyskuje się poprzez odejmowanie. Uważamy, że podejście to – ze względu na swoją łatwość i wszechstronność – stanowi trwały dodatek do zestawu narzędzi neurobiologa, zwłaszcza że może być stosowane in vivo oraz przeniesione na inne typy komórek, obszary anatomiczne lub gatunki. W poniższym protokole szczegółowo opisujemy zastosowanie następnego wybielania i późniejszej konfokalnej mikroskopii time-lapse w odniesieniu do terminalnych komórek Schwanna w eksplantach mięśnia triangularis sterni. Ta cienka, powierzchowna i łatwa do wypreparowania preparat nerwowo-mięśniowy okazał się przydatny w badaniach nad rozwojem, fizjologią i patologią NMJ. Na koniec wyjaśniamy, w jaki sposób przygotowuje się mięsień triangularis sterni po utrwaleniu, aby przeprowadzić skorelowane obrazowanie konfokalne o wysokiej rozdzielczości, immunohistochemię lub badania ultrastrukturalne.&quot;&gt;&lt;strong&gt;Tabela 1.&lt;/strong&gt; Specyficzne odczynniki i sprzęt.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

sekwencyjne fotoblaknięcie w celu wyznaczenia pojedynczych komórek schwanna w złączu neuromięśniowym

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sekwencyjne fotowybielanie stanowi nieinwazyjną metodę znakowania poszczególnych komórek Schwanna (SC) w obrębie złącza neuromięśniowego (NMJ). NMJ jest największą synapsą w układzie nerwowym ssaków i służy jako model prowadzący w badaniach nad strukturą i funkcją synaptyczną. W NMJ myszy zakończenia aksonów ruchowych tworzą przypominające precla miejsca kontaktu z włóknami mięśniowymi. Akson ruchowy i jego zakończenie są otoczone przez SC. W ciągu ostatnich dekad stworzono kilka linii myszy transgenicznych w celu wizualizacji neuronów ruchowych i SC, na przykład odpowiednio myszy Thy1-XFP1 oraz Plp-GFP2.
Wzdłuż aksonów ruchowych mielinizujące komórki Schwanna (SC) są rozmieszczone w postaci niepokrywających się segmentów (internodów), oddzielonych węzłami Ranviera, co umożliwia skokowe przewodzenie potencjału czynnościowego. Z kolei terminalne komórki Schwanna w synapsie są wyspecjalizowanymi komórkami glejowymi, które monitorują i wspomagają neurotransmisję, usuwają resztki komórkowe oraz prowadzą regenerujące się aksony. Złącza neuromięśniowe (NMJ) są ściśle pokryte przez do sześciu niemielinizujących terminalnych komórek Schwanna – nie można ich jednak rozdzielić w mikroskopii świetlnej, ponieważ znajdują się one w bezpośrednim kontakcie błonowym3.
Istnieje kilka podejść do indywidualnej wizualizacji terminalnych komórek SC. Żadne z nich nie jest jednak pozbawione wad. Na przykład wypełnianie barwnikiem, polegające na nakłuciu pojedynczych komórek mikroelektrodą wypełnioną barwnikiem, wymaga zniszczenia znakowanej komórki przed wypełnieniem kolejnej. Jest to niezgodne z późniejszymi zapisami w trybie poklatkowym3. Wielospektralne znakowanie komórek SC metodą „Brainbow” osiągnięto dzięki kombinatoryjnej ekspresji białek fluorescencyjnych4. Technika ta wymaga jednak połączenia kilku transgenów i jest ograniczona przez wzorce ekspresji stosowanych promotorów. W przyszłości alternatywą może okazać się ekspresja białek „fotoprzełączalnych” w komórkach SC5. Przedstawiamy tutaj sekwencyjne fotowybielanie, w którym pojedyncze komórki są wybielane, a ich obraz uzyskuje się metodą subtrakcji. Uważamy, że podejście to – ze względu na swoją łatwość i wszechstronność – stanowi trwały dodatek do instrumentarium technologicznego neurobiologa, zwłaszcza że może być stosowane in vivo i przenoszone na inne typy komórek, obszary anatomiczne lub gatunki6.
W poniższym protokole szczegółowo opisujemy zastosowanie sekwencyjnego wybielania i następującej po nim konfokalnej mikroskopii poklatkowej w odniesieniu do terminalnych SC w eksplantach mięśnia triangularis sterni. Ta cienka, powierzchowna i łatwa do wypreparowania preparacja nerwowo-mięśniowa7,8 okazała się użyteczna w badaniach nad rozwojem, fizjologią i patologią NMJ9. Na koniec wyjaśniamy, w jaki sposób przygotowuje się mięsień triangularis sterni po fiksacji w celu przeprowadzenia skorelowanego obrazowania konfokalnego o wysokiej rozdzielczości, immunohistochemii lub badań ultrastrukturalnych.

Przykład eksplantu mięśnia triangularis sterni przygotowanego do obrazowania w szalce pokazano na Rysunku 1G. Eksplant ten jest szczególnie odpowiedni do obrazowania złącza neuromięśniowego (NMJ) ex vivo, ponieważ mięsień triangularis składa się tylko z kilku warstw włókien mięśniowych. Pozwala to na uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości z eksplantów pochodzących z transgenicznych linii myszy, które podkreślają komórki Schwanna (SCs) (Plp-GFP2) i/lub aksony (Thy1</e...

Wizualizacja pojedynczych komórek w gęsto upakowanych tkankach, takich jak terminalne komórki Schwanna (SCs) w złączach nerwowo-mięśniowych (NMJs), jest trudna. „Sekwencyjne fotoblaknięcie” pozwala na wyodrębnienie pojedynczych terminalnych SCs, na przykład w eksplantacie mięśnia triangularis sterni — wygodnej preparacji nerwowo-mięśniowej, w której sekwencyjne blaknięcie można połączyć z obrazowaniem poklatkowym i post-hoc immunobarwieniem.

Sekwencyjne fotoblaknięcie w celu wyznaczenia pojedynczych komórek Schwanna w złączu neuromięśniowym

Sekwencyjne fotowybielanie stanowi nieinwazyjną metodę znakowania poszczególnych komórek satelitarnych (SC) w obrębie złącza neuromięśniowego (NMJ). NMJ jest największą synapsą w układzie nerwowym ssaków ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wyodrębnienie pojedynczych komórek Schwanna w złącze nerwowo-mięśniowym przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Protokół ten wykorzystuje myszy transgeniczne wykazujące ekspresję GFP w terminalnych i aksonalnych komórkach Schwanna. Pierwszym krokiem jest wypreparowanie preparatu nerwowo-mięśniowego.Następnie wykonuje się sekwencyjne wybielanie wszystkich komórek Schwanna z wyjątkiem jednej w danej złączce nerwowo-mięśniowej, co pozwala na ujawnienie morfologii pojedynczej komórki. Na koniec tworzona jest mapa przy małym powiększeniu. Tkanka zostaje utrwalona i wykorzystana do immunohistochemii w celu wizualizacji dowolnego wybranego markera w odniesieniu do pozostałej, niewybielonej komórki Schwanna.Wyniki obrazują morfologię pojedynczych komórek, a w razie potrzeby – mikroskopię poklatkową lub immunohistochemiczną analizę kolokalizacji w utrwalonej tkance z wykorzystaniem obrazowania konfokalnego. Chociaż metoda ta pozwala na uzyskanie informacji o morfologii i obszarze rozmieszczenia pojedynczych komórek typu swan w złącze neuromięśniowym, może być ona również zastosowana w innych systemach, takich jak linie komórkowe, żywe skrawki mózgu, a nawet inne gatunki, np. zebrafish.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ zidentyfikowanie wystarczająco powierzchownego złącza nerwowo-mięśniowego oraz unikanie struktur, których analiza nie jest warta poświęconego czasu, wymaga pewnego doświadczenia. Przed rozpoczęciem zabiegu należy natlenić i schłodzić roztwór Ringera przez co najmniej 15 minut. Pod mikroskopem należy umieścić 15 centymetrową szalkę do hodowli tkankowych z lodem. Przykryć ją metalową płytką.Umieść 10 centymetrową szalkę do hodowli tkanek wypełnioną roztworem Ringera na metalowej płycie. Włóż kamień napowietrzający do roztworu. Kolejnym krokiem jest wybranie myszy, której komórki łabędzie i aksony są znakowane koloramiPo uśmierceniu myszy spryskaj ją etanolem. Aby zapobiec zanieczyszczeniu futrem, użyj dużych nożyczek, aby wykonać nacięcie w linii środkowej nad mostkiem oraz dwa nacięcia równoległe do dolnej krawędzi klatki piersiowej. Usuń skórę, otwórz jamę brzuszną i odetnij mięśnie piersiowe, wykonując nacięcia blisko miejsca przyczepu mięśnia do mostka. Używając pęsety, uchwyć wyrostek mieczykowaty i rozetnij przeponę tuż poniżej wyrostka mieczykowatego.Wypreparuj przeponę wzdłuż jej przyczepów żebrowych. Okazyjnie zwilżaj tkankę roztworem Ringera, aby zapobiec jej wysychaniu, trzymając klatkę piersiową za wyrostek mieczykowaty za pomocą pęsety. Rozpocznij odcinanie żeber od kręgosłupa tak blisko ich przyczepów, jak to możliwe.Nacięcia lewe i prawe powinny zbiegać się powyżej serca w kierunku rękojeści mostka. Należy starać się nie przeciąć dużych naczyń krwionośnych, w szczególności żył podobojczykowych, aby zapewnić lepszą widoczność.Delikatnie unieś preparat, trzymając wyrostek mieczowaty pęsetą. Następnie wykonaj cięcie poprzeczne tuż poniżej manubrium sterni, aby usunąć klatkę piersiową i przenieść preparat X do naczynia o średnicy 10 centymetrów z przygotowanym roztworem Ringera. Umieść naczynie na metalowej płytce i w wypełnionym lodem pojemniku pod mikroskopem.Za pomocą małych nożyczek sprężynowych usuń pozostałości grasicy, opłucnej, przepony oraz mięśni piersiowych. Za pomocą małych nożyczek sprężynowych odetnij wszystkie żebra, które nie przyczepiają się do mostka. Przetnij tkankę znajdującą się między żebrami.Pozwala to na umieszczenie eksplantu X w naczyniu z powłoką SIL o średnicy 3,5 centymetra. Następnie, używając od ośmiu do 10 skróconych szpilek Minuchina, przymocuj eksplant X, unikając trójkątnego mięśnia oka mostkowego wskazanego w tym miejscu. Dwie szpilki powinny przejść przez części chrzęstne mostka, a dwie szpilki powinny przejść przez miększe części chrzęstne między żebrami.Należy unikać przebijania żeber pod mięśniem trójgraniastym lub w jego bezpośrednim sąsiedztwie. Kontynuuj przypinanie, aż żebra zostaną nieco rozsunięte, utrwalając mięsień w lekko rozciągniętej pozycji.Przenieś naczynie z powłoką sill guard o średnicy 3,5 centymetra do mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser Argonne oraz obiektywy imersyjne wodne. W przypadku mikroskopii poklatkowej umieść naczynie z powłoką sill guard o średnicy 3,5 centymetra w pierścieniu grzewczym. Zainstaluj system superfuzji oraz sondę temperatury.Upewnij się, że nic nie dotyka preparatu, krawędzi naczynia ani powłoki cygarowej. W przypadku mikroskopii poklatkowej podgrzej preparat X, natomiast w celu wybielania komórek Schwanna lepsza będzie temperatura pokojowa. Teraz, używając obiektywu powietrznego Forex, zaobserwuj wzorzec unerwienia trójkątnego mięśnia sternalnego oka i zlokalizuj prążkowaną płytkę końcową trójkątnego mięśnia sternalnego oka.Przełącz na obiektyw zanurzany 20 x i zacznij poszukiwać obszarów powierzchownych w obrębie pasm nplate. Dobrymi obszarami do wyboru są te znajdujące się nad żebrami oraz w pobliżu nerwów międzyżebrowych. Przełącz na obiektyw zanurzany 100 x lub 60 x, aby sprawdzić poszczególne elementy oraz mjs.W idealnym przypadku należy zlokalizować NMJ pokrytą kilkoma komórkami Schwanna, która znajduje się bardzo powierzchownie. Kluczowe dla sukcesu tego protokołu jest znalezienie powierzchownego i płaskiego złącza nerwowo-mięśniowego. Ponieważ złącze nerwowo-mięśniowe unerwia cylindryczne włókna mięśniowe, ma ono tendencję do owijania się wokół włókna, co często uniemożliwia uzyskanie idealnego kąta obrazowania. Należy wybierać wyłącznie te złącza nerwowo-mięśniowe, które są powierzchowne, płaskie i znajdują się na powierzchni, a następnie użyć obiektywu 100 x o aperturze numerycznej 1,0.Przy powiększeniu 2,5 należy uzyskać obraz konfokalny złącza nerwowo-mięśniowego (NMJ). Takie ustawienia zapewniają rozmiar piksela około 0,1 µm, co gwarantuje odpowiednie próbkowanie przestrzenne zgodnie z kryterium Nyquista. Następnie należy przeprowadzić fotowybielanie komórki Schwanna, kierując wiązkę lasera o długości fali 488 nm centralnie na jądro komórkowe przy maksymalnej mocy przez pięć sekund.Następnie ponownie ustaw ostrość na komórce i oceń wynik wybiórczego wybielania. Jeśli jest to konieczne, powtórz etap wybielania aż do momentu, gdy poziom GFP zostanie zredukowany niemal do poziomu tła, a następnie wykonaj kolejne zdjęcie. Kluczowe jest upewnienie się, że wybielony obszar znajduje się poza jakimkolwiek nakładaniem się dwóch komórek.W przypadku wystąpienia nakładania się obszarów, wybielenie drugiej komórki będzie oczywiste. Prawidłowo wykonana metoda pozwala na wyraźne uwidocznienie końcowych komórek, które często wykazują zaskakującą morfologię, której nie można było przewidzieć przed rozpoczęciem procedury. Powtarzaj proces wybielania aż do momentu, gdy wybielone zostaną wszystkie komórki Schwanna z wyjątkiem jednej.Ostatnia niewybielona komórka Schwanna nadaje się do konfokalnej mikroskopii poklatkowej. Po zakończeniu obrazowania poklatkowego stwórz mapę tych njs, wykonując zdjęcie przy powiększeniu 100 x bez zoomu, następnie zdjęcia obszaru z użyciem obiektywu 20 x i powtórz ten proces, korzystając z obiektywu 4 x. Mapa ta jest niezbędna do zlokalizowania njs po przeprowadzeniu immunohistochemii utrwalonego mięśnia.Po obrazowaniu i wybielaniu odczep preparat i przenieś go do probówki o pojemności 50 ml zawierającej co najmniej 15 ml 4% PFA. Następnie umieść probówkę na lodzie na godzinę. Po schłodzeniu tkanki przez godzinę, przemyj ją 0,1 M glicyną w PBS przez co najmniej 10 minut. Następnie przenieś utrwalony preparat do naczynia hodowlanego o średnicy 5 cm powleczonego silk guard, wypełnionego 0,01 M PBS, i przygotuj się do dalszej dyssekcji preparatu.Najpierw wycina się kształt trapezu, z jedną stroną równoległą do mostka, a drugą przebiegającą przez przejścia kość-chrząstka. Na jego powierzchni znajduje się mięsień trójgraniasty. Następnie usuwa się dolne żebra za pomocą cięcia poziomego lub transsternalnego, tak aby uzyskać swobodny dostęp do końca ogonowego mięśnia trójgraniastego.Teraz wprowadź igłę hipodermiczną jako pinezkę w górną część mięśnia czworobocznego. Następnie usuń mięsień trójgraniasty. Najpierw, używając pęsety, delikatnie uchwyć narożny róg mięśnia.Po drugie, użyj strzykawki z igłą jako mikroskalpela, aby wykonać cięcie równolegle do płaszczyzny ściany klatki piersiowej. Po zwolnieniu części przyczepu mięśnia, wprowadź drugą igłę pod mięsień przez ścianę klatki piersiowej, aby unieruchomić preparat. Podczas przecinania przyczepów tkanki łącznej, oddziel mięsień od klatki piersiowej, delikatnie pociągając go pęsetą.Na koniec usuń pozostałości tłuszczu i naczyń krwionośnych za pomocą pęsety. Należy uważać, aby nie przerwać nerwów. Mięsień trójgraniasty jest teraz gotowy do immunohistochemii.Przygotowano preparat gałki ocznej myszy wykazującej ekspresję GFP pod promotorem PLP w celu wizualizacji komórek Schwanna ex vivo. Aksony można było wizualizować jednocześnie poprzez skrzyżowanie P-L-P-G-F-P z myszami OFP trzech linii. Stosując opisany protokół, dzięki wybieleniu sąsiednich dwóch terminalnych komórek oraz pierwszej aksonalnej komórki Schwanna in vivo, udało się ujawnić morfologię pojedynczych terminalnych komórek Schwanna z zaskakująco wysoką szczegółowością.Obrazowane złącza nerwowo-mięśniowe zostały odnalezione przy użyciu wcześniej stworzonej mapy i przeskanowane z wysoką rozdzielczością w utrwalonej tkance po wykonaniu konfokalnej mikroskopii żywych komórek; trójkątny odcinek sternum został utrwalony i poddany barwieniu. Przedstawiono tutaj receptory acetylocholiny znakowane bungarotoksyną sprzężoną z Alexa 647 w kolorze czerwonym oraz pęcherzyki synaptyczne znakowane przeciwciałem anty-synaptofizyną w kolorze białym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wizualizować morfologię pojedynczych komórek, które początkowo były wszystkie znakowane tym samym białkiem fluorescencyjnym i rozmieszczone zbyt gęsto, aby można było je rozdzielić indywidualnie.Nasz przykład przedstawia złącze nerwowo-mięśniowe, ale istnieje wiele innych potencjalnych zastosowań.

sequential-photo-bleaching-to-delineate-single-schwann-cells-at

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Sekwencyjne fotobleachowanie do wyznaczenia pojedynczych komórek Schwanna w złączu nerwowo-mięśniowym

Zastosowanie elektrofizjologii w badaniach dostępnych synaps umożliwia ilościowe pomiary aktywności synaptycznej, co jest przydatne w analizie mutantów synaptycznych. Niniejszy artykuł opisuje metodę dysekcji służącą do odsłonięcia złączy neuromięśniowych (NMJ) u Caenorhabditis elegans (C. elegans) i krótko omawia możliwe zastosowania tak przygotowanego preparatu.

Disekcja i rejestracja z połączenia nerwowo-mięśniowego C. elegans

Złącze neuromięśniowe (NMJ) Drosophila melanogaster stanowi istotny system modelowy do badania prawidłowej funkcji synaptycznej, jak i zaburzeń tej funkcji występujących w niektórych chorobach neurologicznych. Przedstawiamy protokół sekcji układu ruchowego larw Drosophila oraz immunobarwienia białek strefy aktywnej w obrębie NMJ.

Disekcja i obrazowanie stref aktywnych w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila

Źródło: Marinello, M., et al. Charakterystyka połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej. J. Vis. Exp. (2021)Ten film przedstawia przygotowanie, barwienie immunologiczne i obrazowanie połączeń nerwowo-mięśniowych w tkance mięśniowej szczura przy użyciu mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej do wizualizacji i analizy struktur presynaptycznych i postsynaptycznych.

Charakterystyka połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej

Czterowymiarowe (4D) obrazowanie jest wykorzystywane do badania zachowania i interakcji między dwoma typami endosomów w zakończonych nerwach żywych kręgowców.  Ruch tych małych struktur jest scharakteryzowany w trzech wymiarach, co pozwala na potwierdzenie zdarzeń takich jak fuzja endosomów i egzocytoza.

Wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest zmienione w różnych stanach, które czasami mogą prowadzić do niewydolności synaptycznej. W niniejszym raporcie opisano metody oparte na mikroskopie fluorescencyjnym do ilościowego określania takich zmian strukturalnych.

Połączenie nerwowo-mięśniowe: pomiar wielkości synaps, fragmentacji i zmian gęstości białek synaptycznych za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej

Tutaj opisujemy prostą i powszechnie dostępną metodę uszkadzania nerwów segmentowych u larw Drosophila, aby uwidocznić i określić ilościowo neurodegenerację neuronów ruchowych w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) larw trzeciego stadium rozwojowego.

Prosta metodologia mechanicznego urazu, metoda neuronów do badania zwyrodnienia neuronów ruchowych Drosophila

Protokół opisany w tym artykule wykorzystuje mięsień levator auris longus (LAL) myszy do rejestrowania spontanicznych i wywołanych przez nerwy potencjałów postsynaptycznych (zacisk prądowy) i prądów (zacisk napięcia) w złączu nerwowo-mięśniowym. Zastosowanie tej techniki może dostarczyć kluczowych informacji na temat mechanizmów transmisji synaptycznej w warunkach normalnych i chorobowych.

Dźwigacz Auris Longus Przygotowanie do badania przewodnictwa nerwowo-mięśniowego ssaków w warunkach cęgowania napięciowego

Zdolność do dokładnego wykrywania komponentów połączenia nerwowo-mięśniowego jest kluczowa w ocenie zmian w jego architekturze spowodowanych procesami patologicznymi lub rozwojowymi. Poniżej przedstawiamy pełny opis prostej metody uzyskiwania wysokiej jakości obrazów całych połączeń nerwowo-mięśniowych, które można wykorzystać do wykonywania pomiarów ilościowych.

Rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości

Ten protokół opisuje metodę analizy morfometrycznej połączeń nerwowo-mięśniowych za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i STED, która jest używana do ilościowego określania zmian patologicznych w mysich modelach SMA i CMS związanych z ColQ.

Protokół pokazuje metodę badania korelacji przestrzennej między zakończeniami presynaptycznymi, receptorami postsynaptycznymi i okołosynaptycznymi komórkami Schwanna w mięśniu brzuchatym łydki szczura przy użyciu immunohistochemii fluorescencyjnej z różnymi biomarkerami, a mianowicie: neurofilamentem 200, pęcherzykowym transporterem acetylocholiny, alfa-bungarotoksyną i S100.

Wizualizacja cech morfologicznych połączenia nerwowo-mięśniowego w mięśniu brzuchatym łydki przyśrodkowym szczura

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wizualizacji sieci mikrotubul w połączeniach nerwowo-mięśniowych i komórkach mięśniowych. W połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi Drosophila melanogaster, protokół ten znacznie ułatwia genetyczne badania przesiewowe i analizę dynamiki mikrotubul pod kątem roli białek regulatorowych sieci mikrotubul w układzie nerwowym.

Wykorzystanie połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila i komórek mięśniowych do wizualizacji sieci mikrotubul

Poznaj metodę sekwencyjnego fotowybielania do wizualizacji pojedynczych komórek Schwanna w połączeniach nerwowo-mięśniowych myszy transgenicznych. Technika ta umożliwia szczegółową analizę morfologii komórek w tkance nerwowej.

Sekwencyjne fotoblaknięcie w celu wyznaczenia pojedynczych komórek Schwanna w złączu neuromięśniowym

Przeglądaj więcej filmów