Name: Wykorzystanie okna czaszkowego do wizualizacji tętnicy środkowej mózgu podczas niedrożności tętnicy środkowej mózgu wywołanej endoteliną-1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Poznaj technikę okna czaszkowego do wizualizacji tętnicy środkowej mózgu u szczurów podczas niedrożności wywołanej endoteliną-1. Ta metoda umożliwia bezpośrednią obserwację zmian średnicy naczyń w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z American Heart Association Greater Southeast Affiliate (09GRNT2060421), American Medical Association oraz z University of Florida Clinical and Translational Science Institute. Adam Mecca jest stypendystą NIH/NINDS, NRSA (F30 NS-060335). Robert Regenhardt otrzymał stypendium przeddoktoranckie w ramach Multidyscyplinarnego Programu Szkoleniowego w zakresie Nadciśnienia Tętniczego Uniwersytetu Florydy (T32 HL-083810).

Ten protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Florydy i jest zgodny z "Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych" (ósme wydanie, National Academy of Sciences, 2011).
Materiały
<ol>
 <li>Zwierzęta: Ośmiotygodniowy samiec szczura Sprague Dawley (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) o wadze 250-300 g w momencie operacji. </li>
 <li>znieczulenie
 <ol class="lalpha">
 <li>System znieczulenia wziewnego (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA) </li>
 <li>Znieczulenie izofluranem (Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA) </li>
 </ol>
 </li>
 <li>System stereotaktyczny (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)
 <ol class="lalpha">
 <li>System stereotaktyczny dla małych zwierząt </li>
 <li>Niepękające nauszniki dla szczurów </li>
 <li>Uchwyt na głowicę do znieczulenia gazowego dla szczurów </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Regulacja temperatury
 <ol class="lalpha">
 <li>Termometr z mikrosondą BAT-12 (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, Floryda, USA) </li>
 <li>T/PUMP, koc termiczny TP600 (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA) </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Chirurgicznych
 <ol class="lalpha">
 <li>Nożyczki Metzenbaum, kleszczyki do tęczówki, zwijacze zaciskowe Bulldog, strzykawka 10 μl z igłą skośną o rozmiarze 26, zestaw do kauteryzacji Bovie (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA) </li>
 <li>Wiertarka mikrosilnikowa (Stoelting, Wood Dale, IL, USA) </li>
 <li>Wiertło okrągłe 0,8 mm (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA) </li>
 <li>Kleszcze do szycia STORZ Bonn (Bausch and Lomb, Inc., Rochester, NY, USA) </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Materiały chirurgiczne
 <ol class="lalpha">
 <li>Szew nylonowy 3.0 (Oasis, Mettawa, IL, USA)</li>
 <li>Waciki, maść do oczu Puralube (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA)</li>
 <li>Punkty i paski chirurgiczne (Medtronic Xomed, Inc., Jacksonville, FL, USA)</li>
 <li>Elektryczne maszynki do strzyżenia włosów (Oster, Providence, RI, USA) </li>
 </ol>
 </li>
 <li>chemikalia
 <ol class="lalpha">
 <li>Endothelin-1 (amerykański peptyd, Sunnyvale, CA, USA) </li>
 <li>Chlorheksydyna 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA) </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Sprzęt do wizualizacji
 <ol class="lalpha">
 <li>Mikroskop chirurgiczny (Seiler Instrument and Manufacturing; St. Louis, MO, USA) </li>
 <li>Sony Handycam HDR-SR12 (Sony, Minato, Tokio, Japonia) </li>
 <li>Oświetlacz światłowodowy (TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA)</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Pomiar średnicy naczynia
 <ol class="lalpha">
 <li>Odtwarzacz multimedialny VLC (Paryż, Francja) </li>
 <li>Oprogramowanie Image J (oprogramowanie ImageJ 1.42q, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA) </li>
 </ol>
 </li>
</ol>
1. Kroki przedoperacyjne
<ol>
 <li>Przed zabiegiem szczury są trzymane w cyklu światło/ciemność 12:12 ze swobodnym dostępem do wody i karmy dla gryzoni. </li>
 <li>Znieczulenie indukuje się 4% izofluranem w mieszaninie 100%O2 gazów w komorze indukcyjnej. </li>
 <li>Czubek głowy jest golony elektrycznymi maszynkami do strzyżenia włosów. </li>
 <li>Szczura umieszcza się w pozycji leżącej na podkładce chłonnej leżącej na powierzchni operacyjnej o kontrolowanej temperaturze (kocu termicznym), a głowę umieszcza się w aparacie stereotaktycznym, rozpoczynając od założenia maski znieczulającego gazem.</li>
 <li>Następnie wkładane i dokręcane są nauszniki.</li>
 <li>Podczas zabiegu znieczulenie jest utrzymywane 2% izofluranem w mieszaninie 100%O2 gazów.</li>
 <li>Okulistyczną maść nawilżającą nakłada się na oba oczy, a powieki są zamknięte, aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas zabiegu chirurgicznego. </li>
 <li>Sonda temperatury doodbytniczej jest wprowadzana w celu utrzymania stałej temperatury rdzenia zwierzęcia wynoszącej 37±0,5 °C. </li>
 <li>Gdy głowa znieczulonego szczura jest mocno trzymana w urządzeniu stereotaktycznym, obszar operacyjny jest trzykrotnie oczyszczany naprzemiennie chlorheksydyną i solą fizjologiczną. </li>
</ol>
2. Przygotowanie okna przedczaszkowego
Przed stworzeniem okna czaszkowego, szczur powinien być przygotowany do wszelkich eksperymentów poprzez wszczepienie innego wymaganego sprzętu i powinien przejść wszelkie wymagane zabiegi chirurgiczne. W tym protokole wcześniej wszczepiliśmy kaniulę prowadzącą do MCAO indukowanego endoteliną-1 (ET-1), jak pokazano w towarzyszącej publikacji zatytułowanej "Model niedrożności tętnicy środkowej mózgu indukowany endoteliną-1 dla udaru niedokrwiennego z laserową kontrolą przepływu dopplerowskiego u szczurów".
 
3. Stworzenie okna czaszkowego
Po umieszczeniu kaniuli prowadzącej lub sprzętu wymaganego do eksperymentów, tworzone jest okno czaszkowe do bezpośredniej wizualizacji proksymalnych części tętnicy środkowej mózgu podczas procedury udaru. 
<ol>
 <li>Po pierwsze, nożyczki służą do nacinania skóry nad mięśniem skroniowym, zaczynając przyśrodkowo i pracując bocznie. </li>
 <li>Mięsień skroniowy jest przecinany na pół za pomocą elektrokoagulacji, a następnie cofany za pomocą nylonowego szwu 3,0, aby uwidocznić płaskonabłonkową część kości skroniowej. </li>
 <li>Kwadrat o boku około 3-4 mm jest rysowany na płaskonabłonkowej części kości skroniowej ogonowej do oczodołu i powyżej podstawy wyrostka jarzmowego, gdy odbija się od kości skroniowej. </li>
 <li>Wiertło służy do stopniowego wycinania zarysowanego kawałka kości z kości skroniowej. Należy zachować ostrożność, aby nie wywierać zbyt dużego nacisku na wiertło, ponieważ możliwe jest uszkodzenie opony twardej lub kory mózgowej.</li>
 <li>Częste płukanie sterylną solą fizjologiczną wykonuje się w celu poprawy wizualizacji pola operacyjnego i zapobieżenia przegrzaniu czaszki.</li>
 <li>Zaczynając od luźnego rogu, kawałek kości temoporal jest ostrożnie usuwany za pomocą cienkich kleszczy z zębami szczura, uważając, aby nie rozerwać żadnych naczyń związanych z oponą twardą. </li>
 <li>Opona twarda pozostaje nienaruszona, a zanieczyszczenia są spłukiwane za pomocą sterylnej soli fizjologicznej. </li>
</ol>
4. Rejestracja zwężenia tętnicy mózgowej
Aby zademonstrować, jak rejestrować obrazy w czasie rzeczywistym, do tego protokołu użyto szczura, który przechodzi MCAO indukowany przez ET-1.
<ol>
 <li>Przed zastosowaniem związków wazoaktywnych należy nagrać film wyjściowy przez co najmniej 1 minutę. W przypadku MCAO indukowanego przez ET-1 zapis wyjściowy jest wykonywany po opuszczeniu igły do miąższu mózgu, ale przed wstrzyknięciem ET-1. </li>
 <li>Pompa strzykawkowa jest uruchamiana do wstrzykiwania i rejestrowana przez 1 godzinę lub do pożądanego punktu końcowego. Igła pozostaje na miejscu podczas nagrywania wideo, aby zapobiec zakłóceniom płaszczyzny ogniskowej. </li>
 <li>Szczur powinien zostać głęboko znieczulony i poddany eutanazji zgodnie z zatwierdzonym protokołem po tej procedurze. </li>
</ol>
5. Analiza obrazu
Średnica naczynia może być określona dla dowolnej części wizualizowanego MCA. Jako przykład użyjemy jednej gałęzi MCA do pomiaru średnicy naczynia w punktach czasowych przed i po wstrzyknięciu ET-1. Nieruchome klatki z filmu są rejestrowane w odstępach 1-minutowych za pomocą odtwarzacza multimedialnego VLC (VideoLAN).
<ol>
 <li>Odtwarzacz VLC jest zainstalowany i otwarty. </li>
 <li>Wybierając narzędzia, a następnie preferencje, ustawienie zostanie zmienione na "Wszystkie" w sekcji "Pokaż ustawienia". </li>
 <li>"Menu wideo" jest rozwijane na lewym pasku bocznym, a następnie rozwijane są "moduły wyjściowe". Opcja "Filtry scen" jest wybierana, aby wyświetlić menu filtra wideo sceny. </li>
 <li>"Scena" jest wpisywana w polu prefiksu nazwy pliku.</li>
 <li>Zdefiniowany jest prefiks ścieżki katalogu. W tym miejscu zapisywane są nieruchome klatki.</li>
 <li>Współczynnik nagrywania jest wybierany na podstawie żądanej szybkości przechwytywania nieruchomych klatek. Jeśli film został nagrany z szybkością 29 klatek na sekundę, w polu należy wpisać "1749" (29 klatek/s x 60 sekund/min), aby zapisać jedną klatkę nieruchomą co 1 minutę. Wszystkie zmiany są następnie zapisywane.</li>
 <li>Żądane wideo jest następnie otwierane w odtwarzaczu VLC, aby automatycznie zapisywać nieruchome klatki raz na 1 minutę. </li>
 <li>Średnica naczynia jest następnie mierzona za pomocą tych obrazów. Najpierw otwierane jest oprogramowanie ImageJ (NIH). </li>
 <li>Następnie nieruchome klatki, które będą mierzone, są otwierane w ImageJ. </li>
 <li>Wybierając menu "analizuj", otwiera się "ustaw pomiary" i wszystkie pola są odznaczone. </li>
 <li>Następnie wybierane jest narzędzie Linia prosta</li>.
 <li>Skrót klawiaturowy "Ctrl +" służy do powiększania w razie potrzeby, a linia jest umieszczana prostopadle do ścieżki naczynia w celu zmierzenia średnicy naczynia. </li>
 <li>Na koniec długość naczynia uzyskuje się poprzez wybranie menu "analizuj", a następnie "zmierz" (ctrl+M), aby uzyskać długość naczynia. </li>
 <li>Proces ten powtarza się co najmniej trzy razy i uśrednia dla każdego mierzonego naczynia mierzonego w każdej nieruchomej klatce. </li>
 <li>Średnica naczynia w każdym punkcie czasowym jest znormalizowana do podstawowej średnicy naczynia, dzięki czemu można dokonać porównań przy użyciu wielu szczurów. Aby to zrobić, użyj wzoru aktualna średnica/średnica linii bazowej x 100%, aby obliczyć % średnicy linii bazowej każdego naczynia. </li>
</ol>

<ol><li>Levasseur, J. E., Wei, E. P., Raper, A. J., Kontos, A. A., Patterson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+description+of+a+cranial+window+technique+for+acute+and+chronic+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Detailed description of a cranial window technique for acute and chronic experiments.</a> Stroke. 6, 308-317 (1975).</li>
<li>Baumbach, G. L., Dobrin, P. B., Hart, M. N., Heistad, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+cerebral+arterioles+in+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanics of cerebral arterioles in hypertensive rats.</a> Circ. Res. 62, 56-64 (1988).</li>
<li>Regrigny, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+melatonin+on+rat+pial+arteriolar+diameter+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effects of melatonin on rat pial arteriolar diameter in vivo.</a> Br. J. Pharmacol. 127, 1666-1670 (1999).</li>
<li>Mecca, A. P., O'Connor, T. E., Katovich, M. J., Sumners, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candesartan+pretreatment+is+cerebroprotective+in+a+rat+model+of+endothelin-1-induced+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Candesartan pretreatment is cerebroprotective in a rat model of endothelin-1-induced middle cerebral artery occlusion.</a> Exp. Physiol. 94, 937-946 (2009).</li>
<li>Mecca, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebroprotection+by+angiotensin-%281-7%29+in+endothelin-1-induced+ischaemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cerebroprotection by angiotensin-(1-7) in endothelin-1-induced ischaemic stroke.</a> Exp. Physiol. 96, 1084-1096 (2011).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podsumowując, ta technika przygotowania okna czaszkowego jest bardzo wszechstronna, ponieważ można ją zmieniać, aby sprostać potrzebom wielu eksperymentów z niewielkimi modyfikacjami4, 5. Na przykład z powodzeniem monitorowaliśmy przepływ krwi w mózgu w określonych gałęziach MCA za pomocą laserowej przepływowej dopplerowskiej metrii dopplerowskiej, aby skupić się bezpośrednio na tętnicy mózgowej uwidocznionej przez okno czaszki (Mecca AP 2009 i 2011). Ponadto podobny preparat z naciętą oponą twardą może być st...

<table><tbody><tr><td>Wziewny system anestezjologiczny</td><td>VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Znieczulenie izofluranem</td><td>Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>System stereotaktyczny dla małych zwierząt </td><td>David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>Niepękające nauszniki, szczur</td><td>David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA</td><td>957</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na głowę do znieczulenia gazem dla szczurów </td><td>David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA</td><td>1929</td><td></td></tr><tr><td>Termometr mikrosondowy BAT-12</td><td>World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA</td><td>BAT-12</td><td></td></tr><tr><td>T / PUMP, koc termiczny</td><td>Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA</td><td>T/PUMP, TP600</td><td></td></tr><tr><td>Metzenbaum Scissors</td><td>World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA</td><td>501254</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do tęczówki</td><td>World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA</td><td>15915</td><td></td></tr><tr><td>Zwijacze zaciskowe Bulldog</td><td>World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA</td><td>14119-G</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; l strzykawka 26-gaugue</td><td>World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA</td><td>SGE010RNS</td><td></td></tr><tr><td>Bovie, zestaw do kauteryzacji wysokotemperaturowej</td><td>World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA</td><td>500392</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do zębów szczurów 0,12</td><td>Stotz</td><td>E1811</td><td></td></tr><tr><td>Wiertarka mikrosilnikowa</td><td>Stoelting, Wood Dale, IL, USA</td><td>51449</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło</td> <td>okrągłe 0,8 mmRoboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA</td><td>RS-6280C-1</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do szycia STORZ Bonn</td><td>Bausch and Lomb, Inc., Rochester, NY, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szew nylonowy, rozmiar 3.0</td><td>Oasis, Mettawa, IL, USA</td><td>MV-663</td><td></td></tr><tr><td>Waciki bawełniane</td><td>Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA</td><td>22-029-488</td><td></td></tr><tr><td>Maść do oczu Puralube</td><td>Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA</td><td>NC0138063</td><td></td></tr><tr><td>Elektryczne maszynki do strzyżenia włosów </td><td>Oster, Providence, RI, USA</td><td>78005-301</td><td></td></tr><tr><td>ET-1 rozcieńczone do 80 &mu; Stężenie M w amerykańskim </td><td>peptydzie PBS, Sunnyvale, CA, USA</td><td>88-1-10A</td><td></td></tr><tr><td>Chlorheksydyna, 2% </td><td>Agrilabs, St. Joseph, MO, USA</td><td>1040, Rev. 6-06, Nr NAC: 10580322</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop chirurgiczny </td><td>Seiler Instrument i produkcja, St. Louis, MO, USA</td><td>Evolution xR6</td><td></td></tr><tr><td>Sony Handycam</td><td>Sony, Minato, Tokio, Japonia</td> Włókno <td>HDR-SR12</td><td></td></tr><tr><td> oświetlacz optyczny </td><td>TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA</td><td>FO1&#8211; Odtwarzacz multimedialny 150</td><td></td></tr><tr><td>VLC</td> <td>(Paryż, Francja)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Image J</td><td>U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie okna czaszkowego do wizualizacji tętnicy środkowej mózgu podczas niedrożności tętnicy środkowej mózgu wywołanej endoteliną-1

Utilizing a Cranial Window to Visualize the Middle Cerebral Artery During Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion

Tworzenie okna czaszkowego to metoda, która pozwala na bezpośrednią wizualizację struktur na powierzchni kory mózgowej1-3. Technika ta może być wykonywana w wielu miejscach pokrywających mózg szczura, ale najłatwiej jest ją przeprowadzić, wykonując kraniektomię nad łatwo dostępnymi kośćmi czołowymi lub ciemieniowymi. Najczęściej stosowaliśmy tę technikę w połączeniu z modelem niedrożności środkowej tętnicy mózgowej endothelin-1 udaru niedokrwiennego w celu ilościowego określenia zmian średnicy naczynia tętnicy środkowej mózgu, które zachodzą po wstrzyknięciu endoteliny-1 do miąższu mózgu przylegającego do bliższego MCA4, 5. Aby uwidocznić proksymalną część MCA podczas MCAO indukowanego endoteliną -1, używamy techniki tworzenia okna czaszkowego przez kość skroniową po bocznej stronie czaszki szczura (ryc. 1). Tętnice mózgowe można uwidocznić albo z nienaruszoną oponą twardą, albo z oponą twardą naciętą i cofniętą. Najczęściej pozostawiamy oponę twardą nienaruszoną podczas wizualizacji, ponieważ MCAO indukowane endoteliną-1 polega na dostarczeniu peptydu zwężającego naczynia krwionośne do miąższu mózgu. Omija to konieczność nacinania opony twardej bezpośrednio nad wizualizowanymi naczyniami w celu dostarczenia leku. Protokół ten opisuje, jak stworzyć okno czaszkowe do wizualizacji tętnic mózgowych w sposób krokowy, a także jak uniknąć wielu potencjalnych pułapek związanych z tą metodą.

Klatki obrazu pobrane z nagranego wideo pokazują, że zmianę średnicy tętnic mózgowych po wstrzyknięciu ET-1 można łatwo zaobserwować, stosując tę technikę okna czaszkowego (Rysunek 2). W ciągu kilku minut od podania ET-1 naczynia zaczną się zwężać. Z czasem naczynia staną się trudne do wizualizacji, a tkanka mózgowa stanie się blada. Po około 20 min działanie ET-1 osłabnie, a naczynia zaczną się rozszerzać, stopniowo wracając do średnicy wyjściowej po około 45 min. Oprócz bardziej oczywistego skurczu nac...

Ten artykuł opisuje metodę wizualizacji tętnic mózgowych szczurów przez okno czaszki za pomocą kraniektomii skroniowej w celu obejrzenia proksymalnych części środkowej tętnicy mózgowej (Rysunek 1). Ta wszechstronna metoda może być łączona z różnymi technikami dostarczania leków w celu pomiaru reaktywności tętnic mózgowych in vivo.

Wykorzystanie okna czaszkowego do wizualizacji tętnicy środkowej mózgu podczas niedrożności tętnicy środkowej mózgu wywołanej endoteliną-1

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be ...

W niniejszym protokole wideo zademonstrujemy wykorzystanie okna czaszkowego do wizualizacji tętnicy środkowej mózgu podczas indukowanego endoteliną 1 zamknięcia tętnicy środkowej mózgu. W celu przygotowania tego okna czaszkowego wykonuje się kraniektomię skroniową, aby umożliwić obserwację proksymalnych odcinków tętnicy środkowej mózgu. Tworzenie okna czaszkowego jest metodą pozwalającą na bezpośrednią wizualizację struktur znajdujących się na powierzchni korowej mózgu.Tę technikę można przeprowadzić w wielu miejscach nad mózowiem szczura, lecz najłatwiej jest ją wykonać, wykonując kraniektomię w obszarze łatwo dostępnych kości czołowych lub ciemieniowych. Najczęściej stosowaliśmy tę technikę w połączeniu z modelem niedokrwiennego udaru wywołanego przez zator tlenku etylenu (ET one induced MCAO) lub modelu MCAO wywołanego przez śródbłonek. Procedurę okna czaszkowego przeprowadza się w celu ilościowego określenia zmian w średnicy naczyń, które następują po wstrzyknięciu ET one do miąższu mózgu w sąsiedztwie proksymalnego odcinka tętnicy środkowej mózgu (MCA).W szczególności stosujemy technikę tworzenia okna czaszkowego w kości skroniowej na bocznej stronie czaszki szczura. Tętnice mózgowe mogą być następnie wizualizowane zarówno przy nienaruszonej oponie twardej, jak i po jej nacięciu i odsunięciu. Najczęściej podczas wizualizacji pozostawiamy oponę twardą nienaruszoną.Ponieważ indukcja MCAO za pomocą ET one polega na wprowadzeniu peptydu obkurczającego naczynia do miąższu mózgu, pozwala to uniknąć konieczności nacinania opony twardej bezpośrednio nad widocznymi naczyniami w celu podania leku. W tym filmie pokażemy krok po kroku, jak stworzyć okno czaszkowe w celu wizualizacji tętnic mózgowych, a także jak uniknąć wielu powszechnych potencjalnych błędów związanych z tą metodą. Po umieszczeniu kaniuli prowadzącej, zgodnie z opisem, można stworzyć okno czaszkowe, aby bezpośrednio obserwować proksymalne odcinki tętnicy środkowej mózgu podczas procedury udarowej; najpierw, wykonując nacięcie w skórze głowy za pomocą nożyczek, jak pokazano, odsunąć skórę, aby odsłonić mięsień skroniowy.Przetnij mięsień skroniowy za pomocą elektrokoagulacji, a następnie odsun go, aby uwidocznić część łuskowatą kości skroniowej. Uzyskanie odpowiedniej ekspozycji kości skroniowej jest kluczowe w tej procedurze. Podczas koagulacji należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić oczodołu.Aby poprawić widoczność, należy użyć szwu do odsunięcia przeciętego mięśnia skroniowego. Wyznaczyć kwadrat o boku od trzech do czterech milimetrów na części łuskowej kości skroniowej, w pobliżu oczodołu i powyżej podstawy wyrostka jarzmowego w miejscu, gdzie oddziela się on od kości skroniowej. Za pomocą wiertła wyciąć ten fragment kości.Należy uważać, aby nie wywierać zbyt dużego nacisku, ponieważ istnieje ryzyko przewiercenia mózgu. Należy pamiętać o częstym płukaniu sterylną solą fizjologiczną w celu poprawy widoczności pola operacyjnego i zapobiegania przegrzaniu czaszki. Zaczynając od luźnego narożnika, ostrożnie usuń fragment kości skroniowej za pomocą precyzyjnych kleszczyków typu „rat tooth”, dbając o to, aby nie przerwać naczyń krwionośnych związanych z oponą twardą.Tutaj można zobrazować odgałęźnię tętnicy środkowej mózgu w stanie wyjściowym, przed podaniem preparatu endothelial.One. W ciągu kilku minut od wstrzyknięcia endothelial.One tętnica środkowa mózgu zacznie się zwężać. W efekcie odgałęźnię stanie się trudne do zobrazowania, a tkanka mózgowa stanie się blada.Po około 20 minutach działanie endoteliny ulegnie osłabieniu, a naczynia zaczną stopniowo ulegać rozszerzeniu. Powrót do średnicy wyjściowej następuje po około 45 minutach. Aby zmierzyć średnicę naczynia w różnych punktach czasowych przed i po wstrzyknięciu endoteliny, należy pobrać klatki z nagrania wideo w odstępach jednominutowych. W programie VLC media player należy przejść do menu narzędzia, preferencje, a następnie zmienić ustawienie na wszystkie w sekcji pokaż ustawienia.Rozwiń menu wideo na lewym pasku bocznym i rozwiń moduły wyjściowe. W polu prefiksu nazwy pliku wybierz typ filtru sceny: „scene”. Następnie dodaj ścieżkę do katalogu.Następnie ustaw stosunek rejestracji dla przechwytywania klatek statycznych w zależności od częstotliwości klatek nagrania wideo, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Na koniec kliknij „save open”. Wybrane wideo i odtwarzacz VLC będą automatycznie zapisywać klatki statyczne co jedną minutę w celu pomiaru średnicy naczynia.Korzystając z tych obrazów, najpierw uruchom program Image J, a następnie otwórz klatki obrazu, które będą mierzone. Przejdź do sekcji Analyze, wybierz Set Measurements i odznacz wszystkie pola. Wybierz narzędzie linii prostej i w razie potrzeby powiększ obraz.Należy poprowadzić linię prostopadłą do przebiegu naczynia, aby zmierzyć jego średnicę. Przejdź do zakładki analyze, a następnie kliknij measure, aby uzyskać średnicę naczynia. Powtórz tę czynność dla wszystkich wybranych obrazów.Średnicę naczynia w każdym punkcie czasowym należy znormalizować do bazowej średnicy naczynia, aby umożliwić porównania z wykorzystaniem wielu szczurów. W tym celu należy zastosować przedstawiony tutaj wzór. Podsumowując, ta technika przygotowania okna czaszkowego jest bardzo wszechstronna, ponieważ można ją dostosować do potrzeb wielu eksperymentów za pomocą niewielkich modyfikacji.Na przykład z powodzeniem monitorowaliśmy przepływ krwi mózgowej w konkretnych odgałęzieniach tętnicy środkowej mózgu (MCA), wykorzystując obrazowanie laserowej dopplerowskiej przepływności w celu bezpośredniego skupienia się na tętnicy mózgowej uwidocznionej przez okno czaszkowe. Ponadto podobny preparat z zachowaną oponą twardą może być stosowany przy miejscowym podawaniu związków naczynioruchowych, aby stworzyć kąpiel reaktywności naczyniowej in vivo. Podczas przygotowywania okna czaszkowego należy wziąć pod uwagę kilka czynników, aby zmniejszyć odsetek niepowodzeń w tej technice.Wiele z tych czynników wiąże się z uzyskaniem dobrej wizualizacji tętnic mózgowych. Na przykład, podczas wykonywania kraniektomii w obszarze C należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić opon twardych lub przebiegających nad nimi naczyń krwionośnych wiertłem. Najlepiej osiągnąć to poprzez częste przemywanie sterylną solą fizjologiczną w celu usunięcia resztek tkanki i schłodzenia czaszki.Mamy nadzieję, że ten film pomoże Państwu w projektowaniu eksperymentów z wykorzystaniem okna czaszkowego oraz pozwoli uniknąć powszechnych błędów, które mogą wystąpić podczas tej procedury.

utilizing-cranial-window-to-visualize-middle-cerebral-artery-during

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Zastosowanie okna czaszkowego w celu wizualizowania tętnicy mózgowej środkowej podczas okluzji tętnicy mózgowej środkowej wywołanej endoteliną-1

Chirurgiczne wywołanie niedokrwiennego uszkodzenia mózgu u szczura jest powszechnie stosowanym modelem w badaniach nad udarem. W niniejszej pracy demonstrujemy indukcję ogniskowego niedokrwienia mózgu poprzez zamknięcie tętnicy środkowej mózgu. Przedstawiono również wizualizację powstałego zawału za pomocą barwienia histologicznego oraz obrazowania rezonansem magnetycznym.

Model ogniskowego niedokrwienia mózgu poprzez endowaskularną okluzję tętnicy środkowej mózgu u szczura za pomocą szwu

W materiale wideo demonstrujemy metodę wywołania zatoru w środkowej tętnicy mózgowej u dorosłych myszy z wykorzystaniem wewnątrzluminalnego monofilamentu. Pokazujemy również, jak oceniać zakres zawału mózgu za pomocą barwienia chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC).

Myszy model udaru niedokrwiennego wywołanego zamknięciem tętnicy środkowej mózgu

Ten film przedstawia procedurę wykonywania trwałej dystalnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu lub MCAO z tętnicą szyjną wspólną lub podwiązaniem CCA u starszych szczurów w celu modelowania udaru niedokrwiennego. Blokuje to przepływ krwi do mózgu, prowadząc do śmierci neuronów i generowania modelu do badania mechanizmów udaru i potencjalnych metod leczenia.

Wywoływanie niedokrwienia poprzez niedrożność środkowej części mózgu i tętnicy szyjnej wspólnej w modelu szczurzym

Kilka zwierzęcych modeli niedokrwienia mózgu zostało opracowanych w celu symulacji ludzkiego stanu udaru. Protokół ten opisuje model niedrożności środkowej tętnicy mózgowej indukowanej endoteliną-1 (ET-1) (MCAO) dla udaru niedokrwiennego u szczurów.  Ponadto omówiono ważne względy, zalety i wady tego modelu.

Model niedrożności tętnicy środkowej mózgu indukowany endoteliną-1 dla udaru niedokrwiennego z laserową kontrolą przepływu dopplerowskiego u szczura

Wykazano, że monitorowanie perfuzji mózgowej poprawia dokładność modeli udaru niedokrwiennego. Trudności techniczne często ograniczają wykorzystanie tego niezbędnego narzędzia do badań naczyń mózgowych. W tym filmie pokazano zoptymalizowany system do uzyskania jedno- lub wielomiejscowego monitorowania hemodynamicznego podczas śródświetlnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu u szczurów.

Zoptymalizowany system do monitorowania perfuzji mózgowej w modelu udaru szczura wewnątrzświetlnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu

Opisujemy wysoce powtarzalną metodę trwałego zamknięcia głównego naczynia krwionośnego mózgu gryzoni.  Technikę tę można osiągnąć przy bardzo niewielkim uszkodzeniu obwodowym, minimalnej utracie krwi, wysokim wskaźniku długoterminowego przeżycia i stałej objętości zawału współmiernej do populacji klinicznej ludzi.

Stała niedrożność naczynia mózgowego poprzez podwójne podwiązanie i przecięcie

Aby zrozumieć patofizjologię udaru, ważne jest korzystanie z wiarygodnych modeli. W artykule opisano jeden z najczęściej stosowanych modeli udaru u myszy, określany jako model niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAo) (określany również jako model włókna śródświetlnego lub szewu) z reperfuzją.

Podejście chirurgiczne do niedrożności tętnicy środkowej mózgu i udaru wywołanego reperfuzją u myszy

Chirurgiczne zamknięcie dystalnej gałęzi środkowej tętnicy mózgowej (MCAo) jest często używanym modelem w eksperymentalnych badaniach nad udarem. Manuskrypt ten opisuje podstawową technikę stałego MCAo, połączoną z wstawieniem bocznego okna czaszki, które daje możliwość podłużnej mikroskopii przyżyciowej u myszy.

Przygotowanie bocznego przewlekłego okna czaszki umożliwia obserwację in vivo po niedrożności dystalnej tętnicy środkowej mózgu u myszy

Ten protokół demonstruje unikalny model udaru myszy ze średniej wielkości zawałem i doskonałym wskaźnikiem przeżycia. Model ten pozwala przedklinicznym badaczom zajmującym się udarem mózgu wydłużyć czas trwania niedokrwienia, wykorzystać starzejące się myszy i ocenić długoterminowe wyniki funkcjonalne.

Zmodyfikowany przezczaszkowy model niedrożności tętnicy środkowej mózgu do badania wyników udaru u starszych myszy

Ten protokół opisuje model przejściowego ogniskowego niedokrwienia mózgu u myszy poprzez śródświetlne zamknięcie środkowej tętnicy mózgowej. Dodatkowo przedstawiono przykłady oceny wyników z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego i testów behawioralnych.

Przejściowy model niedrożności tętnicy środkowej mózgu

Celem niniejszej pracy było ustalenie reprodukowalnej metody wykonywania kraniektomii z późniejszym trwałym, selektywnym zamknięciem tętnicy mózgowej środkowej u szczurów dla zastosowania w badaniach eksperymentalnych nad deficytami ruchowymi i przestrzenną pamięcią.

Selektywne i trwałe zatorowanie środkowej tętnicy mózgowej u szczurów: eksperymentalne podejście do badania niedoborów motorycznych i przestrzennej pamięci

Poznaj technikę okna czaszkowego do wizualizacji tętnicy środkowej mózgu u szczurów podczas niedrożności wywołanej endoteliną-1. Ta metoda umożliwia bezpośrednią obserwację zmian średnicy naczyń w czasie rzeczywistym.

Wykorzystanie okna czaszkowego do wizualizacji tętnicy środkowej mózgu podczas niedrożności tętnicy środkowej mózgu wywołanej endoteliną-1 (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie okna czaszkowego do wizualizacji tętnicy środkowej mózgu podczas niedrożności tętnicy środkowej mózgu wywołanej endoteliną-1

Przeglądaj więcej filmów