Name: Pomiary ciśnienia skurczowego prawej komory w połączeniu z pobieraniem próbek płuc i tkanek immunologicznych u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Poznaj protokół pomiaru ciśnienia skurczowego prawej komory i pobierania próbek płuc u myszy. Ta metoda umożliwia kompleksową ocenę funkcji serca oraz odpowiedzi immunologicznej w badaniach kardiopulmonalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez National Institutes of Health 1R21HL092370-01 (GG), 1R01 HL095764-01 (GG); R01HL082694 (ŚJ); American Heart Association, założyciele stowarzyszony (0855943D, GG); Stony Will - Herbert Fund, Nowy Jork (SHP).

1. Przygotowanie
<ol>
 <li>Przygotować następujące roztwory i probówki (tabela 1) w następujący sposób:
 <ol>
 <li>Roztwór Hanksa, bez wapnia, magnezu lub wskaźnika z penicyliną (100 U/ml) / streptomycyną (100 mg/ml).</li>
 <li>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 1x, bez wapnia, bez magnezu.</li>
 <li>Etanol, 70%, zrobić 500 ml.</li>
 <li>Buforowany formaldehyd, 7-10 % z PBS, zrobić 500 ml.</li>
 <li>Roztwory anestezjologiczne:
 <ol>
 <li>Avertin. Ostrożnie dodać 5 ml 2-metylo-2-butanolu do 5 g 2,2,2-tribromoetanolu. Po rozpuszczeniu roztwór podstawowy należy przechowywać w ciemności w temperaturze pokojowej. Pobrać 0,25 ml roztworu podstawowego i rozcieńczyć go 10 ml 1xPBS w butelce ze szklanym dnem. Owinąć butelkę folią aluminiową, umieścić w temperaturze 37 °C do rozpuszczenia, a następnie rozlać do 5 ml probówek polipropylenowych i przechowywać w lodówce. Ogrzej jedną porcję rano w dniu eksperymentu.</li>
 <li>barbituran. Rozcieńczyć roztwór podstawowy PBS, aby uzyskać 2,6% roztwór barbituranów. Umieścić 3-4 ml podwielokrotności w probówkach polipropylenowych.</li>
 </ol>
 </li>
 </ol>
 </li>
 <li>Zorganizuj trzy obszary robocze (Rysunek 1).</li>
 <li>
 <ol>
 <li>Obszar A: Ułóż następujące elementy: formularz badania do zapisania numeru identyfikacyjnego badania, daty, masy ciała, masy prawego serca, lewego serca i przegrody; precyzyjna waga (0-50 g z dokładnością do 0,01 g) do określenia masy ciała; mikrowaga do określenia masy serca z dokładnością do 0,001 g; łodzie do ważenia; roztwory anestezjologiczne (wyraźnie oznaczone); mały dewar z ciekłym azotem; izolowany pojemnik z lodem; probówki i 24-dołkowa płytka do pobierania próbek krwi i tkanek (Tabela 1); narzędzia chirurgiczne (Tabela 2, Rysunek 2); i roztwory do czyszczenia narzędzi (Tabela 1).</li>
 <li>Obszar B: Ułóż następujące elementy: mikroskop preparacyjny; cewnik prawego serca podłączony do jednostki sterującej ciśnieniem, która jest podłączona do amplifier i laptop. Cewnik umieszcza się w zlewce zawierającej wodę. Ułóż narzędzia chirurgiczne (Tabela 2), kawałki szwu przycięte na optymalną długość i umieść w łodzi do ważenia; taśma (optymalna jest taśma autoklawowa) przycięta na optymalną długość i szerokość i ustawiona w linii na mikroskopie lub stole laboratoryjnym dla łatwego dostępu; waciki bawełniane i roztwór do usuwania włosów. Skalibruj cewnik na początku badania.</li>
 <li>Obszar C: Ułóż następujące elementy: soczewka powiększająca; kaniula tchawicy; strzykawki o pojemności 1 ml; szew przycięty na optymalną długość i umieszczony w łodzi wagowej; mały dewar z ciekłym azotem; izolowany pojemnik z lodem; probówki i 24-dołkowa płytka do pobrania próbek BAL i tkanek (Tabela 1); narzędzia chirurgiczne (Tabela 2); roztwory do wykonania BAL oraz do oczyszczenia kaniuli tchawicy i narzędzi (Tabela 1).</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
2. Cewnikowanie prawego serca
<ol>
 <li>Zważ mysz za pomocą precyzyjnej wagi, delikatnie umieszczając mysz w łodzi do ważenia. Upewnij się, że obchodzisz się ze zwierzęciem delikatnie i cicho. Rekordowa waga. Opisany protokół działa najlepiej w przypadku myszy o wadze 20 g lub większej, ponieważ średnica żyły szyjnej musi pomieścić cewnik ciśnieniowy; Możliwe jest cewnikowanie mniejszych myszy (17 g lub więcej), o ile żyła jest wystarczająco duża.</li>
 <li>Znieczulić mysz przez wstrzyknięcie Avertin w zależności od masy ciała (10 μl/g), np. dla 20 g podać 200 μl, dla 25 g dać 250 μl, dla 30 g dać 300 μl. Dokładną objętość wstrzyknięcia należy dostosować w zależności od szczepu myszy. Upewnij się, że obchodzisz się ze zwierzęciem delikatnie i cicho, ponieważ stres może zmienić reakcję na środek znieczulający.</li>
 <li>Gdy mysz zostanie uspokojona, umieść ją na podwójnie plisowanej bibułce. Zanotuj numer identyfikacyjny na papierze. Delikatnie wetrzyj balsam do depilacji w brzuszną część szyi, aby oczyścić pole operacyjne. Umieść mysz z powrotem na papierze i odczekaj 1-2 minuty.</li>
 <li>Usuń włosy z brzusznej części szyi, delikatnie głaszcząc włosy w kierunku przeciwnym do kierunku wzrostu włosów za pomocą wacików.</li>
 <li>Dokładnie określ wystarczającą głębokość znieczulenia, sprawdzając, czy nie ma odruchu u palca: mysz nie reaguje na szczypanie palców u stóp.</li>
 <li>Pracując szybko i zrelaksowany, pozostała część cewnikowania prawego serca nie powinna trwać dłużej niż 10 minut, optymalnie 3-6 minut. Ważne jest, aby tkanka nie wysychała, ponieważ cewnik musi wsunąć się do żyły i przemieszczać się wewnątrz żyły na warstwie wilgoci. Spójny czas procedury jest ważny dla generowania danych, które są porównywalne między grupami.</li>
 <li>Umieść mysz z powrotem na bibułce i przenieś bibułą na płytę styropianową. Zamocuj łapy i głowę na miejscu za pomocą taśmy autoklawu.</li>
 <li>Wykonaj nacięcie skóry od żuchwy do mostka (mostka).</li>
 <li>Ostrożnie wypreparuj tarczycę wielką w górę w kierunku żuchwy, aby odsłonić prawą żyłę szyjną i tchawicę.</li>
 <li>Umieść styropianową tablicę trzymającą mysz pod mikroskopem preparacyjnym z płaszczyzną ostrości już na miejscu i obiektywem w powiększeniu około 0.8x (całkowite powiększenie [soczewka x okular] wynosi około 8x.</li>
 <li>Ostrożnie przeprowadź mikrosekcję prawej żyły szyjnej, usuwając otaczającą tkankę łączną za pomocą kleszczy chirurgicznych.</li>
 <li>Umieść dwa kawałki szwu na prawej żyle szyjnej. Zawiąż szew najbliżej żuchwy, aby zamknąć przepływ krwi w żyle do maleńkiej strużki, umieść szew, który jest najbliżej mostka / mostka w luźnym węźle wokół żyły. Można użyć maleńkiej strużki krwi, aby później znaleźć dziurę w żyle, jeśli zajdzie taka potrzeba.</li>
 <li>Oddychaj i rozluźnij się (rozluźnij mięśnie szyi i szczęki), aby utrzymać wzrok na żyle przez okular. Dzięki temu Twoje dłonie i palce będą poruszać się bezpiecznie, płynnie i zrelaksowane. Trzymając żyłę kleszczami po stronie najbliżej żuchwy, wytnij otwór w żyle między dwoma szwami za pomocą mikronożyczek obsługiwanych drugą ręką. Odłóż mikronożyczki i trzymając rękę rozluźnioną, poczuj cewnik. Delikatnie wyjmij cewnik, trzymając go między kciukiem a pierwszym palcem (Rysunek 3). Włóż cewnik do otworu żyły.</li>
 <li>Delikatnie wsunąć cewnik do prawego serca (ryc. 3). Obserwuj oznaczenia na cewniku, które dają przybliżony wskaźnik tego, jak daleko należy wprowadzić cewnik i obserwuj monitor. Po wyświetleniu krzywych ciśnienia delikatnie zaciśnij dolny szew wokół cewnika. Ponieważ cewnik ma wytrzymałość na rozciąganie, która nadaje mu cewkę, a także dlatego, że oddech i bicie serca myszy dodają ruchu, dodatkowo przymocuj cewnik za pomocą taśmy.</li>
 <li>Rejestruj pomiary ciśnienia przez 2 minuty w celu późniejszej analizy (rysunek 4).</li>
 <li>Otwórz szew przytrzymujący cewnik, a następnie delikatnie wyjmij cewnik. Wytrzyj część za przetwornikiem ciśnienia, umieść z powrotem w zlewce z wodą. Nie dotykaj przetwornika ciśnienia.</li>
 <li>Przenieś mysz na wierzchu bibuły do obszaru A w celu eutanazji, pobrania krwi i tkanki śledziony. Czyste narzędzia chirurgiczne.</li>
 <li>Rozpocznij procedurę od następnego zwierzęcia. Gdy czas na to pozwala, wstrzyknąć środek znieczulający, czekając na zarejestrowanie krzywej ciśnienia (2.15).</li>
</ol>
3. Pobieranie próbek krwi i śledziony
<ol>
 <li>Wstrzyknąć roztwór barbituranów w ilości 400 μl na mysz i odczekać 1-2 minuty. Jest to rutynowo wykonywane w naszym laboratorium, aby uniknąć możliwości, że myszy przypadkowo dojdą do siebie po znieczuleniu avertinowym podczas krwawienia. Odpowiednią standaryzację eksperymentu osiąga się poprzez wstrzyknięcie tej samej dawki roztworu barbituranów na mysz i odczekanie tej samej ilości czasu przed pobraniem krwi. Jeśli zezwoli na to Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt i o ile zwierzęta są dokładnie monitorowane pod kątem głębokości znieczulenia przed wykrwawieniem, krok ten można pominąć.</li>
 <li>Wykonaj nacięcie w jamie brzusznej. Otwórz żyłę ogonową (żyłę główną) i pobierz krew za pomocą pipety transferowej.</li>
 <li>Wyjmij śledzionę lub kawałek śledziony do probówki Eppendorfa i zatrzaskowo zamroź w ciekłym azocie lub do płytki 24-dołkowej do studzienki zawierającej bufor Hanksa w celu późniejszego przygotowania pojedynczych komórek.</li>
 <li>Przenieś mysz na bibułę do obszaru roboczego C w celu pobrania BAL, węzłów chłonnych drenujących płuca, płuc i tkanek serca. Czyste narzędzia chirurgiczne.</li>
</ol>
4. Pobieranie próbek płuc i serca
<ol>
 <li>Wypreparuj tchawicę z mięśni i tkanki łącznej. Umieszczając kleszcze pod tchawicą, przeciągnij szew. Delikatnie wygeneruj wystarczającą rozciągliwość, aby wyciąć otwór. Utrzymując delikatne rozciąganie, włóż kaniulę tchawicy lekko obracając się i zszyj kaniulę na miejsce. W celu wprowadzenia kaniuli tchawicy upewnij się, że tchawica jest wilgotna, w razie potrzeby dodaj kroplę roztworu Hanksa. Podczas zabiegu oddychaj, rozluźniaj mięśnie szyi i szczęki, aby ruchy dłoni były bezpieczne i płynne.</li>
 <li>Rozetnij klatkę piersiową, ostrożnie usuwając mostek, zaczynając od końca brzusznego. Nie naruszaj zawartości klatki piersiowej, ponieważ bardzo utrudni to znalezienie węzła chłonnego.</li>
 <li>Wykonać płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL) delikatnie wkładając 1 ml buforu Hanksa, delikatnie obrócić strzykawkę i pobrać płyn BAL. Powtórz 3 razy, zamknij rurkę i umieść na lodzie. Przez cały czas trwania zabiegu należy zwracać uwagę na koniec kaniuli tchawicy, która łączy się ze strzykawką. Spójrz na klatkę piersiową, aby zaobserwować napompowanie i opróżnienie płuc.</li>
 <li>Zbierz węzeł chłonny płuc, przytrzymując ścianę klatki piersiowej jednym zestawem kleszczy, znajdując i pobierając węzeł chłonny za pomocą innych kleszczy. Umieść węzeł chłonny w płytce 24-dołkowej. Ważne jest, aby wiedzieć, gdzie szukać: zaczynając od szyi, znajdź wejście do klatki piersiowej po prawej stronie myszy i spójrz powyżej kręgosłupa (ryc. 5).</li>
 <li>Zbierz serce i ułóż na bibułce. Odizoluj prawe serce, ostrożnie przeprowadzając sekcję wzdłuż przegrody. Przenieś do obszaru roboczego A w celu zważenia, zanotuj masę i umieść w probówkach eppendorfa w celu natychmiastowego zamrożenia w ciekłym azocie.</li>
 <li>Umieść szew wokół lewego płata płuca, aby zamknąć oskrzela główne. Wyciąć lewy płat płuca bez zanieczyszczeń, umieścić w probówce Eppendorfa i zatrzaskowo zamrozić w ciekłym azocie lub umieścić w studzience z 24-dołkową płytką zawierającą roztwór Hanksa w celu późniejszej izolacji zawiesin pojedynczych komórek.</li>
 <li>Wprowadzić ok. 0,5 ml buforowanego roztworu formaldehydu przez kaniulę tchawicy do pozostałych płatów płuc. Po napompowaniu wyciąć płaty płuc z klatki piersiowej i umieścić w 50 ml probówce zawierającej roztwór formaldehydu. W przypadku alternatywnego projektu badania, płuca można napompować optymalnym środkiem tnącym (OCT, rozcieńczony 1:4 PBS) i zamrożony w formie zawierającej nierozcieńczony OCT w celu późniejszego przygotowania zamrożonych skrawków. Inny projekt badania może wymagać uzyskania natychmiast zamrożonej tkanki płucnej i zawiesin pojedynczych komórek z płuc. W takim przypadku nie jest konieczne napompowanie: wypreparuj pozostałe płaty płuc; Wyjmij je z klatki piersiowej i umieść w 24-dołkowej płytce w studzience zawierającej bufor Hanksa.</li>
 <li>Usuń kaniulę tchawicy, oczyść przez spłukanie buforem Hanksa, wyczyść narzędzia chirurgiczne.</li>
</ol>
5. Analiza krzywych ciśnienia generowanych przez prawy cewnik serca
Zarejestrowane dane dotyczące ciśnienia w prawej komorze są analizowane za pomocą oprogramowania LabChart 7 bez wiedzy o tożsamości grupowej każdego zapisu. Losowo wybieranych jest ponad 20 krzywych, a różnica między maksymalnym i minimalnym ciśnieniem komorowym dla każdej krzywej jest mierzona (ΔP). Średni ΔP oblicza się, aby uzyskać ciśnienie skurczowe prawej komory.

<ol><li>Price, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+pulmonary+arterial+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Inflammation in pulmonary arterial hypertension.</a> Chest. 141, 210-221 (2012).</li>
<li>Olschewski, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+pathophysiology+and+therapy+of+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular pathophysiology and therapy of pulmonary hypertension.</a> J. Lab. Clin. Med. 138, 367-377 (2001).</li>
<li>Hassoun, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation%2C+growth+factors%2C+and+pulmonary+vascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Inflammation, growth factors, and pulmonary vascular remodeling.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 54, S10-S19 (2009).</li>
<li>Rabinovitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathogenesis+of+pulmonary+arterial+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension.</a> J. Clin. Invest. 118, 2372-2379 (2008).</li>
<li>Steudel, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+pulmonary+hypertension+and+right+ventricular+hypertrophy+after+chronic+hypoxia+in+mice+with+congenital+deficiency+of+nitric+oxide+synthase+3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Sustained pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy after chronic hypoxia in mice with congenital deficiency of nitric oxide synthase 3.</a> J. Clin. Invest. 101, 2468-2477 (1998).</li>
<li>Zaidi, S. H., You, X. M., Ciura, S., Husain, M., Rabinovitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+serine+elastase+inhibitor+elafin+protects+transgenic+mice+from+hypoxic+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the serine elastase inhibitor elafin protects transgenic mice from hypoxic pulmonary hypertension.</a> Circulation. 105, 516-521 (2002).</li>
<li>Guignabert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie2-mediated+loss+of+peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+in+mice+causes+PDGF+receptor-beta-dependent+pulmonary+arterial+muscularization%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tie2-mediated loss of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in mice causes PDGF receptor-beta-dependent pulmonary arterial muscularization.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 297, L1082-L1090 (2009).</li>
<li>West, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+hypertension+in+transgenic+mice+expressing+a+dominant-negative+BMPRII+gene+in+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Pulmonary hypertension in transgenic mice expressing a dominant-negative BMPRII gene in smooth muscle.</a> Circ. Res. 94, 1109-1114 (2004).</li>
<li>Cook, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+eNO+and+pulmonary+iNOS+expression+in+eNOS+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Respir.+J%22%5BJournal%5D)">Increased eNO and pulmonary iNOS expression in eNOS null mice.</a> Eur. Respir. J. 21, 770-773 (2003).</li>
<li>West, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+expressing+BMPR2R899X+transgene+in+smooth+muscle+develop+pulmonary+vascular+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mice expressing BMPR2R899X transgene in smooth muscle develop pulmonary vascular lesions.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295, L744-L755 (2008).</li>
<li>Tu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+fibroblast+growth+factor-2+signaling+contributes+to+altered+endothelial+phenotype+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Autocrine fibroblast growth factor-2 signaling contributes to altered endothelial phenotype in pulmonary hypertension.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 311-322 (2011).</li>
<li>Daley, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+arterial+remodeling+induced+by+a+Th2+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Pulmonary arterial remodeling induced by a Th2 immune response.</a> J. Exp. Med. 205, 361-372 (2008).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation%2C+endothelial+injury%2C+and+persistent+pulmonary+hypertension+in+heterozygous+BMPR2-mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Inflammation, endothelial injury, and persistent pulmonary hypertension in heterozygous BMPR2-mutant mice.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, 677-690 (2008).</li>
<li>Thibault, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+assessment+of+murine+pulmonary+arterial+pressure%3A+validation+and+application+to+models+of+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation.+Cardiovascular+imaging%22%5BJournal%5D)">Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension.</a> Circulation. Cardiovascular imaging. 3, 157-163 (2010).</li>
<li>Otto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+hypertension+and+right+heart+failure+in+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+type+I+receptor-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pulmonary hypertension and right heart failure in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor-deficient mice.</a> Circulation. 110, 3245-3251 (2004).</li>
<li>Burton, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+leukocyte+recruitment+via+CXCR1%2F2+inhibition+stops+the+progression+of+PAH+in+mice+with+genetic+ablation+of+endothelial+BMPR-II%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Attenuation of leukocyte recruitment via CXCR1/2 inhibition stops the progression of PAH in mice with genetic ablation of endothelial BMPR-II.</a> Blood. 118, 4750-4758 (2011).</li>
<li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+hypertension+in+TNF-alpha-overexpressing+mice+is+associated+with+decreased+VEGF+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pulmonary hypertension in TNF-alpha-overexpressing mice is associated with decreased VEGF gene expression.</a> J. Appl. Physiol. 93, 2162-2170 (2002).</li>
<li>Motley, H. L., Cournand, A., Werko, L., Himmelstein, A., Dresdale, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Influence+of+Short+Periods+of+Induced+Acute+Anoxia+Upon+Pulmonary+Artery+Pressures+in+Man%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Influence of Short Periods of Induced Acute Anoxia Upon Pulmonary Artery Pressures in Man.</a> Am. J. Physiol. 150, 315-320 (1947).</li>
<li>Liljestrand, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Pulmonary+Arterial+Blood+Pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Intern.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of Pulmonary Arterial Blood Pressure.</a> Arch. Intern. Med. 81, 162-172 (1948).</li>
<li>Euler, U. S. V., Liljestrand, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+pulmonary+arterial+blood+pressure+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol.+Scand%22%5BJournal%5D)">Observations on the pulmonary arterial blood pressure in the cat.</a> Acta Physiol. Scand. 12, 301-320 (1946).</li>
<li>Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes%3A+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB%2FcAnNCrl+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> Journal of immunological. 312, 12-19 (2006).</li>
<li>Rabinovitch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+prevents+hypoxic+pulmonary+hypertension+and+vascular+changes+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II prevents hypoxic pulmonary hypertension and vascular changes in rat.</a> Am. J. Physiol. 254, 500-508 (1988).</li>
<li>Rabinovitch, M., Gamble, W., Nadas, A. S., Miettinen, O. S., Reid, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+pulmonary+circulation+after+chronic+hypoxia%3A+hemodynamic+and+structural+features%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rat pulmonary circulation after chronic hypoxia: hemodynamic and structural features.</a> Am. J. Physiol. 236, 818-827 (1979).</li>
<li>Rabinovitch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+pulmonary+blood+flow+affect+vascular+response+to+chronic+hypoxia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Changes in pulmonary blood flow affect vascular response to chronic hypoxia in rats.</a> Circ. Res. 52, 432-441 (1983).</li>
<li>Kugathasan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+angiopietin-1-Tie2+pathway+prevents+rather+than+promotes+pulmonary+arterial+hypertension+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The angiopietin-1-Tie2 pathway prevents rather than promotes pulmonary arterial hypertension in transgenic mice.</a> J. Exp. Med. 206, 2221-2234 (2009).</li>
<li>Bearer, C., Emerson, R. K., ORiordan, M. A., Roitman, E., Shackleton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+tobacco+smoke+exposure+and+persistent+pulmonary+hypertension+of+the+newborn%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Persp%22%5BJournal%5D)">Maternal tobacco smoke exposure and persistent pulmonary hypertension of the newborn.</a> Environ. Health Persp. , 105-202 (1997).</li>
<li>Graham, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis-induced+experimental+pulmonary+hypertension%3A+role+of+interleukin-13+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis-induced experimental pulmonary hypertension: role of interleukin-13 signaling.</a> Am. J. Pathol. 177, 1549-1561 (2010).</li>
<li>Butrous, G., Ghofrani, H. A., Grimminger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+vascular+disease+in+the+developing+world%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pulmonary vascular disease in the developing world.</a> Circulation. 118, 1758-1766 (2008).</li>
<li>Crosby, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Praziquantel+reverses+pulmonary+hypertension+and+vascular+remodeling+in+murine+schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Praziquantel reverses pulmonary hypertension and vascular remodeling in murine schistosomiasis.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 184, 467-473 (2011).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Opisany tutaj przepływ eksperymentalny pozwala na szybki i jednoczesny pomiar ciśnienia skurczowego prawej komory i pobieranie próbek do analizy odpowiedzi w płucach, sercu i układzie odpornościowym u myszy. Procedura łączy pomiary fizjologii serca, mikropreparację i późniejsze pobranie tkanek do badań żywych komórek, analizy histologicznej lub analizy omicznej tkanek. Cała procedura zajmuje mniej niż 20 minut na mysz. Ze względu na przepływ pracy zorganizowany w obszarze roboczym, 2-3 zwierzęta mogą być badane jednocześ...

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reodczynniki</td></tr><tr><td>2-Methyl-2-butanol </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-Tribrom&#8211; tanol </td> Mydło dezynfekujące <td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>(Coverage Spray TB plus Steris)</td><td>Fisher Scientific</td><td>1629-08</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy, 200 Proof, absolutny, bezwodny klasy ACS/USP </td><td>PHARMCO-APER</td><td>111000200</td><td>Rozcieńczyć do 70 % wodą destylowaną</td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635-500ML</td><td>Rozcieńczyć do 7-10 % stężenia formaldehydu przy stężeniu PBS 1x przy użyciu roztworu podstawowego PBS i wodnego</td></tr><tr><td>roztworu Hanksa, bez wapnia, magnezu </td><td>Fisher Scientific</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina (10 000 U/ml) / Streptomycyna (10 000 mg / ml) roztwór</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), bez wapnia, bez magnezu, roztwory 1x i 10x </td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodu 26% </td><td>Fort Dodge Zdrowie zwierząt</td><td>NDC 0856-0471-01</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Labware </td></tr><tr><td>Płytki 12, 24, 96 dołków </td><td>Pipet</td> transferowy Falcon <td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9BM</td><td></td></tr><tr><td>Probówka z powłoką EDTA </td><td>Sarstedt</td><td>2013-08</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 0,65 ml i 1,7 ml mikrowirówki </td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki 12 x 75 mm polipropylen </td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-1D</td><td></td></tr><tr><td>Probówki, różne rozmiary, polipropylen</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Instruments </td></tr><tr><td>Kleszcze, Dumon #5 Fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze, bardzo drobne końcówki -0,5 mm zakrzywione</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze, bardzo cienkie końcówki -0,5 mm proste</td><td>Fine Science Tools</td><td>11150-10</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula 18 ga, 19 ga</td><td>BD</td><td>Precyzyjne igły ślizgowe</td><td>Przycięte na optymalną długość, stępione i zewnętrznie tarte, aby stworzyć szorstką powierzchnię zewnętrzną.</td></tr><tr><td>Nożyczki, Nożyczki do dyparacji-cienkie ostrza 9 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14081-09</td><td></td></tr><tr><td>Szew do BAL, pleciony szew jedwabny, 4-0 </td><td>Fine Science Tools</td><td>SP116</td><td></td></tr><tr><td>Szew do cewnikowania prawego serca, jedwabny szew pleciony, 6-0</td><td>Teleflex medical</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka, 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</ mocny> </td></tr><tr><td>Wzmacniacz, PowerLab 4/30</td><td>ADInstrument</td><td>Model ML866</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik, ciśnienie F1.4</td><td>Millar Instruments, Inc</td><td>840-6719</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Kleszcze variskopowe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, nożyczki sprężynowe Vannas - ostrza 2 mm </td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Podświetlana halogenowo lupa biurkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-990-56</td><td></td></tr><tr><td>Laptop</td><td>Asus</td><td>Numer modelu procesora A52F i5; 15-calowe</td><td></td></tr><tr><td>źródło światła </td><td>Amscope</td><td>HL-250-A</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka kontroli ciśnienia </td><td>Millar Instruments, Inc</td> Oprogramowanie <td>PCU-2000</td><td></td></tr><tr><td>, Labchart-Pro V.7</td><td>AD Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

pomiary ciśnienia skurczowego prawej komory w połączeniu z pobieraniem próbek płuc i tkanek immunologicznych u myszy

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

Funkcją prawego serca jest pompowanie krwi przez płuca, łącząc w ten sposób fizjologię prawego serca z fizjologią naczyń płucnych. Stan zapalny jest częstym modyfikatorem funkcji serca i płuc, poprzez opracowanie infiltracji komórkowej, produkcję cytokin i czynników wzrostu oraz zainicjowanie procesów przebudowy 1.
W porównaniu do lewej komory, prawa komora jest pompą niskociśnieniową, która działa w stosunkowo wąskiej strefie zmian ciśnienia. Zwiększone ciśnienie w tętnicy płucnej wiąże się ze zwiększonym ciśnieniem w łożysku naczyniowym płuc i nadciśnieniem płucnym 2. Nadciśnienie płucne jest często związane z chorobami zapalnymi płuc, na przykład przewlekłą obturacyjną chorobą płuc lub chorobami autoimmunologicznymi 3. Ponieważ nadciśnienie płucne wiąże się ze złymi rokowaniami dotyczącymi jakości życia i oczekiwanej długości życia, wiele badań jest ukierunkowanych na zrozumienie mechanizmów, które mogą być celem interwencji farmaceutycznej 4. Głównym wyzwaniem dla opracowania skutecznych narzędzi leczenia nadciśnienia płucnego pozostaje złożoność jednoczesnego zrozumienia zmian molekularnych i komórkowych w prawym sercu, płucach i układzie odpornościowym.
Tutaj prezentujemy proceduralny proces szybkiego i precyzyjnego pomiaru zmian ciśnienia w prawym sercu myszy oraz jednoczesnego pobierania próbek z serca, płuc i tkanek odpornościowych. Metoda opiera się na bezpośrednim cewnikowaniu prawej komory przez żyłę szyjną u myszy z krótką piersiową, po raz pierwszy opracowanym pod koniec lat 90. jako zastępczy pomiar ciśnienia w tętnicy płucnej5-13. Zorganizowane podejście zespołowe ułatwia bardzo szybką technikę cewnikowania prawego serca. Dzięki temu możliwe jest przeprowadzenie pomiarów u myszy, które spontanicznie oddychają powietrzem w pomieszczeniu. Organizacja przepływu pracy w odrębnych obszarach roboczych zmniejsza opóźnienia czasowe i otwiera możliwość jednoczesnego przeprowadzania eksperymentów fizjologicznych i pobierania tkanek immunologicznych, serca i płuc.
Opisany tutaj przepływ pracy proceduralnej może być dostosowany do szerokiej gamy warunków laboratoryjnych i projektów badań, od małych, ukierunkowanych eksperymentów, po duże testy przesiewowe leków. Jednoczesne pozyskiwanie danych z zakresu fizjologii serca, które mogą być rozszerzone o echokardiografię5,14-17 oraz pobieranie tkanek serca, płuc i układu odpornościowego, zmniejsza liczbę zwierząt potrzebnych do uzyskania danych, które naprzód podstawy wiedzy naukowej. Przedstawiony tutaj przebieg procedur stanowi również idealną podstawę do zdobycia wiedzy na temat sieci łączących funkcje układu odpornościowego, płuc i serca. Te same zasady, które zostały tutaj przedstawione, można w razie potrzeby zaadaptować do badania innych lub dodatkowych narządów.

Głównym celem w celu uzyskania krzywych ciśnienia w prawej części serca jest prawidłowe rozmieszczenie cewnika w prawym sercu. Kształt krzywych ciśnienia w funkcji czasu ma krytyczne znaczenie, ponieważ prawidłowe umieszczenie cewnika wewnątrz prawej komory skutkuje plateau ciśnienia (Ryc. 4). Natomiast krzywe z gwałtownymi skokami wskazują na cewnik, który pod wpływem oddechu lub skurczów serca przemieszcza się i uderza o ścianę prawej komory. Aby wykryć potencjalne problemy z przeżywalnością zwierząt, ...

Specyficzny i szybki protokół do jednoczesnego badania funkcji prawego serca, zapalenia płuc i odpowiedzi immunologicznej jest opisany jako narzędzie do nauki. Filmy i rysunki opisują fizjologię i techniki mikrodysekcji w zorganizowanym podejściu zespołowym, które można dostosować do stosowania w małych i dużych badaniach.

Pomiary ciśnienia skurczowego prawej komory w połączeniu z pobieraniem próbek płuc i tkanek immunologicznych u myszy

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

right-ventricular-systolic-pressure-measurements-combination-with

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Pomiary ciśnienia skurczowego w prawej komorze serca w połączeniu z pobieraniem próbek płuc i tkanek układu odpornościowego u myszy

Poniższy protokół opisuje proces izolacji, wentylacji i instrumentacji płuc myszy w celu pomiaru stacjonarnych lub pulsacyjnych zależności między ciśnieniem a przepływem w naczyniach płucnych, aby określić wpływ przepływu krwi, przepływu powietrza, zmian w drogach oddechowych i zmian naczyniowych na obciążenie następcze prawej komory.

Charakterystyka izolowanego, wentylowanego i opomiarowanego płuca mysiego poddanego perfuzji przepływem pulsacyjnym

Opisano metodę pomiaru ciśnienia w lewej komorze (LV) u myszy w okresie embrionalnym i neonatalnym. Ciśnienie mierzy się poprzez wprowadzenie igły połączonej z przetwornikiem wypełnionym cieczą do LV pod kontrolą ultradźwięków. Podczas realizacji protokołu eksperymentalnego należy zadbać o utrzymanie prawidłowej funkcji serca.

Pomiar ciśnienia w lewej komorze u myszy w późnym okresie embrionalnym i neonatalnym

Ten artykuł zawiera protokół do echokardiograficznej oceny wielkości prawej komory i nadciśnienia płucnego u myszy.  Zastosowania obejmują określanie fenotypu i seryjną ocenę w transgenicznych i indukowanych toksynami mysich modelach kardiomiopatii i chorób naczyń płucnych.

Echokardiograficzna ocena prawego serca u myszy

Dysfunkcja prawej komory (RV) jest kluczowa dla patogenezy chorób sercowo-naczyniowych, jednak dostępne są ograniczone metodologie jej oceny. Ostatnie postępy w obrazowaniu ultrasonograficznym zapewniają nieinwazyjną i dokładną opcję podłużnego badania RV. W tym artykule szczegółowo opisujemy krok po kroku metodę echokardiograficzną wykorzystującą mysi model przeciążenia ciśnienia RV.

Ocena struktury i funkcji prawej komory serca w mysim modelu zwężenia tętnicy płucnej za pomocą echokardiografii przezklatkowej

Ten rękopis opisuje szczegółowy protokół zbierania danych o ciśnieniu i objętości z myszy.

Pomiar pętli głośności ciśnienia w myszy

Tutaj opisujemy i porównujemy dwie pozycje do uzyskania wierzchołkowego widoku czterokomorowego u myszy. Pozycje te umożliwiają ilościowe określenie funkcji prawej komory, zapewniają porównywalne wyniki i mogą być stosowane zamiennie.

Echokardiograficzny pomiar parametrów rozkurczowych prawej komory serca u myszy

Ten protokół opisuje indukcję nadciśnienia płucnego (PH) u myszy na podstawie ekspozycji na niedotlenienie i wstrzyknięcia antagonisty receptora VEGF. U zwierząt rozwija się PH i przerost prawej komory (RV) 3 tygodnie po rozpoczęciu protokołu. Przedstawiono również charakterystykę funkcjonalną i morfometryczną modelu.

Indukcja i charakterystyka nadciśnienia płucnego u myszy przy użyciu modelu hipoksji/SU5416

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia inwazyjnej oceny hemodynamicznej prawej komory i tętnicy płucnej u myszy przy użyciu metody chirurgicznej na otwartej klatce piersiowej.

Inwazyjna ocena hemodynamiczna układu prawej komory i tętniczego nadciśnienia płucnego wywołanego niedotlenieniem u myszy

Prezentowany tutaj jest protokół oceny dwukomorowej funkcji serca u myszy poprzez generowanie pętli ciśnienie-objętość (PV) z prawej i lewej komory u tego samego zwierzęcia za pomocą zamkniętego cewnikowania klatki piersiowej. Nacisk kładziony jest na techniczny aspekt chirurgii i pozyskiwania danych.

Dwukomorowa ocena czynności serca i pętli ciśnienie-objętość za pomocą cewnikowania w zamkniętej klatce piersiowej u myszy

Tutaj opisujemy analizę pętli ciśnienia i objętości serca pod wpływem rosnących dawek dożylnie podawanego izoproterenolu w celu określenia wewnętrznej funkcji serca i rezerwy β-adrenergicznej u myszy. Do pomiarów pętli ciśnienie-objętość stosujemy zmodyfikowane podejście z otwartą klatką piersiową, w którym uwzględniamy wentylację z dodatnim ciśnieniem końcowo-wydechowym.

Odpowiedź serca na stymulację β-adrenergiczną określona na podstawie analizy pętli ciśnienie-objętość

Opisujemy mysi model przeciążenia ciśnienia w prawej komorze wywołanego przez opaski na pniu płucnym. Szczegółowe protokoły intubacji, chirurgii i fenotypowania za pomocą echokardiografii znajdują się w artykule. Do intubacji i chirurgii wykorzystywane są instrumenty wykonane na zamówienie, co pozwala na szybkie i niedrogie odtworzenie modelu.

Mysi model przerostu prawej komory serca wywołanego przeciążeniem ciśnieniowym i niewydolności przez opaski pnia płucnego

Poznaj protokół pomiaru ciśnienia skurczowego prawej komory i pobierania próbek płuc u myszy. Ta metoda umożliwia kompleksową ocenę funkcji serca oraz odpowiedzi immunologicznej w badaniach kardiopulmonalnych.

Pomiary ciśnienia skurczowego prawej komory w połączeniu z pobieraniem próbek płuc i tkanek immunologicznych u myszy

Przeglądaj więcej filmów