Name: Wykrywanie palmitoylacji białek w hodowanych neuronach hipokampa poprzez immunoprecypitację i wymianę acylo-biotyny (ABE) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 33 s
Description: Poznaj metodę wykrywania palmitoylacji białek w hodowanych neuronach hipokampa przy użyciu immunoprecypitacji i wymiany acylo-biotyny. Technika ABE umożliwia precyzyjną analizę modyfikacji lipidowych białek neuronalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem MOP-81158.

1. Ekstrakcja białka docelowego z hodowanych pierwotnych neuronów hipokampa
<ol>
 <li>Przed zebraniem endogennego białka z pierwotnych komórek hipokampa należy przygotować bufor do lizy (LB; Tabela 1) z inhibitorami proteazy. Do 10 ml buforu do lizy dodać 0,1 ml roztworu fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF) do końcowego stężenia 10 mM i dodać 1 tabletkę koktajlową inhibitora proteazy.</li>
 <li>Przygotować roztwór N-etylomaleimidu (NEM) (Tabela 1) z liofilizowanego proszku. Delikatnie rozpuść w 100% EtOH w temperaturze pokojowej (RT). Zawsze przygotowuj świeży roztwór NEM na dzień eksperymentu.</li>
 <li>Następnie połączyć bufor do lizy i NEM. Dodać 0,5 ml 2M roztworu NEM do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodaj 20 ml LB na wierzch i szybko umieść LB +NEM (końcowe stężenie 50 mM) na platformie bujanej w temperaturze 4 °C, aby całkowicie wymieszać przez 5 minut. Zawsze najpierw dodawaj roztwór NEM/EtOH, a następnie LB, aby odpowiednio wymieszać te dwa.</li>
 <li>Wyjmij wyhodowane neurony z inkubatora i umieść na lodzie*. Delikatnie usuń pożywkę komórkową i delikatnie przemyj dwukrotnie zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) 1x. Dodaj 300 ml LB + 50mM NEM do pierwszej studzienki neuronów hipokampa i zeskrob komórki za pomocą jednorazowego podnośnika komórkowego. Zbierz lizat komórkowy, a następnie odprowadź lizat do następnego dołka tej grupy. Zeskrobać komórki w drugiej studzience za pomocą podnośnika komórek, zebrać i powtórzyć za pomocą trzeciego dołka, jeśli jest to konieczne, aby dalej zagęścić lizat.</li>
 <li>Zebrać lizat komórkowy do wstępnie schłodzonej (na lodzie) probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Powtórz krok 1.4, używając 100 μl LB + 50mM NEM, aby zebrać pozostały lizat komórkowy. Przepuść całkowity lizat komórkowy przez strzykawkę o rozmiarze 261/2 5-6 razy, aby wspomóc mechaniczną lizę, uważając, aby nie wdmuchiwać pęcherzyków do roztworu. Zamiast tego można sonikować przez 15 sekund na lodzie, jeśli dostępny jest sprzęt. Lizat komórek nutianowych przez ≥30 min w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Klarować lizat komórkowy przez odwirowanie w temperaturze 16 000 x g / 30 min, w celu osadzenia niezlizanych komórek i materiału nierozpuszczalnego w detergentach.</li>
 <li>Zebrać oczyszczony lizat komórkowy (supernatant) w nowej, wstępnie schłodzonej probówce o pojemności 1,5 ml na lodzie. Powtórz protokół zbioru dla wszystkich grup komórek. Zmierz stężenie białka we wszystkich próbkach lizatu za pomocą testu BCA i znormalizuj objętość wszystkich próbek lizatu z grup komórek, aby miały dokładnie równe białko całkowite, z zalecanym minimum 500 μg. Uzupełnij wszystkie próbki LB + 50mM NEM do całkowitej objętości 500 μl.</li>
 <li>Do każdej próbki lizatu dodać 1-5 μg pierwszorzędowego przeciwciała skierowanego przeciwko białku docelowemu. Nutować zmieszane próbki przeciwciała i lizatu przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
* Pierwotne neurony hipokampa szczura powinny być hodowane w gęstości około 250 000 komórek/studnię w 6-dołkowym naczyniu, w pożywce wolnej od surowicy zawierającej suplement neuronalny B27, jak wcześniej opisano5, i hodowane przez pożądany okres czasu, zazwyczaj 14-16 dni in vitro (DIV), aby osiągnąć dojrzałość. Zaleca się co najmniej 500 μg białka całkowitego, aby skutecznie immunoprecypitować i biotynylować docelowe białko neuronalne, co zwykle wymaga 2-3 dołków z 6-dołkowym naczyniem.
2. Wytrącanie białka docelowego związanego z przeciwciałem
<ol>
 <li>Przed wytrąceniem i unieruchomieniem białka docelowego przygotuj 50% zawiesinę białka A lub kulek sefarozy pokrytych białkiem G. W szczególności dodaj ≥60 μl kulek sefarozy na próbkę do probówek o pojemności 1,5 ml, upewniając się, że wszystkie próbki mają równą ilość kulek. Koraliki magnetyczne są również odpowiednie, jeśli sprzęt jest dostępny.</li>
 <li>Dodać równą objętość 50% zawiesiny do każdej próbki lizatu przeciwciał i nutować przez ≥1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Wymiana acylobiotyny: Rozszczepienie hydroksyloaminy (szynki)
<ol>
 <li>Wykonując krok 2.2, przygotuj kilka probówek z buforem do lizy (LB) o różnych pH. pH jest bardzo ważne na tych etapach i zawsze powinno być regulowane za pomocą pH-metru. Przygotować 2 ml LB pH 7,2 na próbkę i 0,5 ml rygorystycznego buforu na próbkę (Tabela 1). Przygotuj również 0,5 ml LB + 10 mM NEM na próbkę, jak w krokach 1.1-1.3. Dodaj tabletki PMSF i inhibitora proteazy do wszystkich do lizy, jak w kroku 1.1.</li>
 <li>
 <ol class="lalpha">
 <li>Hydroksyloamina (HAM) jest silnym środkiem redukującym, którego rozszczepienie palmitynianu z cystein jest wymagane do biotynylacji (ryc. 1), a pominięcie rozszczepienia HAM służy jako kontrola negatywna. Podziel każdą próbkę kulek na dwie próbki, z których jedna pomija etap rozszczepienia HAM (-HAM), a druga zawiera etap HAM (+HAM). Aby znormalizować degradację białek spowodowaną traktowaniem szynką, należy podzielić każdą próbkę na trzy części, przy czym 1/3 kulek użyto do kontroli -HAM, a pozostałe 2/3 użyto do leczenia +HAM.</li>
 <li>Przygotować dodatkowe probówki o pojemności 1,5 ml na lodzie, oznaczone jako kontrola -HAM dla każdej próbki. Po kroku 2.2 delikatnie odwirować kulki wszystkich próbek przy 0,5 x g/ 1 min w temperaturze 4 °C (wirować z tą prędkością, czasem trwania i temperaturą dla wszystkich pozostałych etapów, chyba że określono inaczej), umieścić probówki na lodzie, usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 600 μl LB + 10 mM NEM.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Po ponownym zawieszeniu kulek próbek w buforze do lizy + NEM 10 mM, natychmiast zebrać 200 μl zawiesiny lizatu z próbki i wrzucić do probówki -HAM tej próbki na lodzie. Dodać dodatkowe 300 μl LB + 10mM NEM do próbki -HAM i dodatkowe 100 μl do próbki +HAM, co daje w sumie 500 μl w każdej próbce. Inkubować probówki przez 10 minut na lodzie.</li>
 <li>Ponownie zawiesić (przepłukać) próbki -HAM i +HAM delikatnie za pomocą 0,5 ml rygorystycznego buforu na próbkę. Wykonaj ten krok szybko, ponieważ dłuższa inkubacja SDS spowoduje usunięcie związanego przeciwciała z kulek.</li>
 <li>Delikatnie umyć wszystkie próbki trzykrotnie w 0,5 ml/próbkę o pH LB 7,2 i odwirować między praniami, jak w kroku 3.2b.</li>
 <li>Wykonując krok 3.5, przygotuj bufor HAM (Tabela 1). Dodać odpowiednią objętość roztworu hydroksyloaminy do nowej probówki, aby osiągnąć końcowe stężenie 1M w objętości 0,5 ml LB pH 7,2, na próbkę +SZYNKA. Bufor do szynki należy zawsze przygotowywać na świeżo na dzień eksperymentu. Dodać 0,5 ml/próbkę LB pH 7,2 do wszystkich próbek -HAM i 0,5 ml/próbkę buforu HAM do wszystkich próbek +HAM.</li>
 <li>Nutować wszystkie próbki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT). Nie przekraczać 1 godziny.</li>
</ol>
4. Wymiana acylo-biotyny: Etykietowanie biotyny-BMCC
<ol>
 <li>Wykonując krok 3.6, przygotuj 2 ml LB pH 6,2 na próbkę (Tabela 1), jak w kroku 3.1. Umieść LB pH 6,2 na lodzie, aż będzie potrzebny. Bezpośrednio przed użyciem należy również przygotować roztwór podstawowy Biotyny-BMCC (Tabela 1). Odważyć dokładnie 2,1 mg Biotyny-BMCC, zebrać w probówce o pojemności 1,5 ml i delikatnie rozpuścić w 0,5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO), umieszczając na platformie kołyszącej w temperaturze pokojowej, aby osiągnąć stężenie 8 mM (nie używać pipety do rozdrobnienia proszku).</li>
 <li>Po zakończeniu kroku 3.6 delikatnie umyj kulki w buforze do lizy o pH 6,2, aby usunąć resztki buforu szynki. Usunąć supernatant i umieścić próbki na lodzie.</li>
 <li>Biotyna-BMCC jest cząsteczką biotyny sprzężoną z maliemidem, która ma wysokie powinowactwo do wolnych grup tiolowych cystein (ryc. 1). Wykonując krok 4.2, przygotuj 0,5 ml buforu Biotyna-BMCC (Tabela 1) na próbkę, w stężeniu roboczym od 0,5 μM do 5 μM. Stężenia przekraczające 5 μM prawdopodobnie nasycą białko docelowe6 i zazwyczaj nie powinny być przekraczane, jednak może się to różnić w zależności od pożądanego białka docelowego. Dodać 0,5 ml buforu Biotyna-BMCC do każdej próbki i nutować dokładnie przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Nie przekraczać 1 godziny.</li>
</ol>
5. Elucja białka docelowego sprzężonego z biotyną i SDS-PAGE
<ol>
 <li>Po wykonaniu kroku 4.3 delikatnie umyj wszystkie próbki w LB pH 6.2. Przechowywać wszystkie próbki na lodzie między myciami. Usunąć 2x bufor do próbek SDS bez środków redukujących (Tabela 1) z magazynu w temperaturze -20 °C i powoli rozmrażać na lodzie.</li>
 <li>Delikatnie umyj próbki trzy razy w LB pH 7,5 + PMSF/inhibitory i trzymaj próbki na lodzie między myciami.</li>
 <li>Usunąć supernatant z trzeciego płukania, pozostawiając granulowane kulki w zawiesinie z pozostałym buforem na dnie probówki. Zanurz pipetę z końcówką o małej średnicy (wystarczy końcówka do napełniania żelem lub końcówka do pipety P2) na samym dnie probówki przez gnojowicę i szybko zbierz pozostały bufor, uważając, aby nie zebrać żadnych kulek.</li>
 <li>Uzupełnij 2x bufor próbki SDS o DL-ditiotreitol (DTT), aby osiągnąć końcowe stężenie 5 mM. Do każdej próbki dodać 40-50 μl 2x bufora próbki + 5mM DTT. W razie potrzeby należy wirować kulki, aby całkowicie wymieszać się z buforem próbki, i natychmiast odwirować z dużą prędkością, aby zebrać wszystkie kulki w osad zanurzony w buforze próbki.</li>
 <li>Gotować wszystkie próbki przez 10 minut w temperaturze 75–80 °C. Pozwól próbkom ostygnąć do temperatury pokojowej przez ≥10 minut na stole i odwiruj przy 16 000 x g / 3 minuty, aby całkowicie zagnieździć kulki.</li>
 <li>Dodać pełną objętość eluowanego białka (supernatantu) z każdej próbki do pojedynczego pasa w żelu poliakrylamidowym odpowiednim do western blotting, używając SDS-PAGE7. Uporządkuj wszystkie próbki w taki sposób, aby eluent kontrolny -HAM i eluent +HAM dla pojedynczej próbki były prowadzone bezpośrednio obok siebie podczas SDS-PAGE (rys. 2). Po SDS-PAGE przenieś do membrany PVDF lub nitrocelulozowej.</li>
</ol>
6. Western blotting i wykrywanie palmitoylacji białka docelowego
<ol>
 <li>Po wykonaniu kroku 5.6 umyj membranę dwukrotnie w soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS 1x) przez 10 minut na platformie bujanej w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przygotuj bufor blokujący, aby zablokować niespecyficzne etykietowanie, ważąc albuminę surowicy bydlęcej (BSA), aby osiągnąć 3% masy w objętości TBS 1x + Tween-20 0,05% (TBS-T), która jest wystarczająca do całkowitego zanurzenia błony. W przypadku blottingu streptawidyną należy zawsze blokować BSA, a nie mlekiem w proszku. Zablokuj membranę na 1 godzinę przy RT na bujanej platformie.</li>
 <li>Przygotować roztwór przeciwciała TBS-T + 0,3% BSA. Dodać przeciwciało Streptawidyna-HRP rozpuszczone w stężeniu 1 mg/ml w wodzie destylowanej, rozcieńczonej w stosunku 1:5 000-1:10 000. Po wykonaniu kroku 6.2 przemyć membranę raz w TBS-T przez 10 minut, a następnie inkubować błonę w roztworze przeciwciała Streptawidyny na platformie bujającej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. </li>
 <li>Umyj membranę trzykrotnie w TBS-T przez 10 minut na bujanej platformie. W celu wykrycia sygnału palmitoilacji należy naświetlić luminescencję HRP za pomocą zestawu substratów chemiluminescencyjnych.</li>
 <li>W celu znormalizowania poziomów palmitoilacji do ilości białka będącego przedmiotem zainteresowania, które zostało immunoprecypitowane, należy usunąć błonę za pomocą buforu do usuwania western blot przez 5-10 minut na platformie kołyszącej w temperaturze pokojowej. Powtórz kroki 6.1 - 6.4, używając pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania, które było pierwotnie używane do immunoprecypitacji.</li>
 <li>Określ ilościowo palmitoilację białka będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą oprogramowania do analizy obrazu i znormalizuj poziomy palmitoilacji do ilości białka immunoprecypitowanego.</li>
</ol>

<ol><li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 161-175 (2010).</li>
<li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456, 904-909 (2008).</li>
<li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36, 276-285 (2004).</li>
<li>Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylated+proteins%3A+purification+and+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Palmitoylated proteins: purification and identification.</a> Nat. Protoc. 2, 1573-1584 (2007).</li>
<li>Xie, C., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+hippocampal+and+cortical+neurons+in+a+mixture+of+MEM%2B+and+B27-supplemented+neurobasal+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Survival of hippocampal and cortical neurons in a mixture of MEM+ and B27-supplemented neurobasal medium.</a> Free Radic. Biol. Med. 28, 665-672 (2000).</li>
<li>Drisdel, R. C., Alexander, J. K., Sayeed, A., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+of+protein+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Assays of protein palmitoylation.</a> Methods. 40, 127-134 (2006).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blotting%3A+Sample+Preparation+to+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), e2359(2010).</li>
<li>Huang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+palmitoyl+acyl+transferases+exhibit+distinct+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Neuronal palmitoyl acyl transferases exhibit distinct substrate specificity.</a> FASEB J. 23, 2605-2615 (2009).</li>
<li>Noritake, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobile+DHHC+palmitoylating+enzyme+mediates+activity-sensitive+synaptic+targeting+of+PSD-95%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mobile DHHC palmitoylating enzyme mediates activity-sensitive synaptic targeting of PSD-95.</a> J. Cell Biol. 186, 147-160 (2009).</li>
<li>Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation+by+DHHC5%2F8+Targets+GRIP1+to+Dendritic+Endosomes+to+Regulate+AMPA-R+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation by DHHC5/8 Targets GRIP1 to Dendritic Endosomes to Regulate AMPA-R Trafficking.</a> Neuron. 73, 482-496 (2012).</li>
<li>Hayashi, T., Thomas, G. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+palmitoylation+of+NR2+subunits+regulates+NMDA+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dual palmitoylation of NR2 subunits regulates NMDA receptor trafficking.</a> Neuron. 64, 213-226 (2009).</li>
<li>Ho, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-Nitrosylation+and+S-Palmitoylation+Reciprocally+Regulate+Synaptic+Targeting+of+PSD-95%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">S-Nitrosylation and S-Palmitoylation Reciprocally Regulate Synaptic Targeting of PSD-95.</a> Neuron. 71, 131-141 (2011).</li>
<li>Iwanaga, T., Tsutsumi, R., Noritake, J., Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+protein+palmitoylation+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic protein palmitoylation in cellular signaling.</a> Prog. Lipid Res. 48, 117-127 (2009).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Przedstawiony tutaj test IP-ABE jest prostą i bardzo czułą metodą wykrywania białek palmitoilowanych w hodowanych pierwotnych neuronach hipokampa, przy użyciu głównie standardowych technik biochemicznych. To sprawia, że test można łatwo dostosować do laboratoriów już wyposażonych w materiały Western Blotting. Test IP-ABE łączy standardowy protokół immunoprecypitacji w celu wyizolowania i unieruchomienia białka docelowego, a następnie wcześniej opisaną chemię ABE2-4 w celu szybkiego wykrycia poziomów palmitynianu na białku substratowym. Technika ABE ma szeroki zakres zastosowań w badaniu białek palmitoilowanych w różnych tkankach i liniach komórkowych, w tym w badaniach przesiewowych na dużą skalę w kierunku palmitoilowo-proteomicznym globalnych profili palmitoilacji oraz w szybkim wykrywaniu poziomów palmitoilacji pojedynczego białka docelowego.
Poprzednie opisy chemii ABE wykorzystywały różne metody: lizę komórek i ekstrakcję detergentową białek neuronalnych2, 9, wolną blokadę tiolową10, 11, biotynylację i oczyszczanie białka docelowego4, w zależności od zastosowania eksperymentu. Dodanie palmitynianu do białek neuronalnych powoduje, że są one skierowane w kierunku błon komórkowych, a wykrycie palmitoilowanej frakcji białka docelowego będzie wymagało jego ekstrakcji z tych błon. Wcześniej opisane metodologie ABE wykorzystywały różne detergenty jonowe9 i niejonowe8 do ekstrakcji pożądanych białek docelowych, a użycie konkretnego detergentu zależy od białka docelowego i jego znanego transportu błonowego. W tym przypadku wykorzystujemy niedenaturujący i niejonowy detergent IGEPAL CA-630 do ekstrakcji białek palmitoilowanych, które zatwierdziliśmy do ekstrakcji i wykrywania palmitoilowanego białka neuronalnego δ-kateniny (ryc. 2). Struktura IGEPAL CA-630 obejmuje masywną i sztywną niepolarną grupę główną, która nie zakłóca natywnej konformacji lub interakcji białek, ale umożliwia jej asocjację z hydrofobowymi regionami białek związanych z błoną, nadając im w ten sposób mieszalność i umożliwiając ich ekstrakcję. Wiele białek neuronalnych zlokalizowanych w błonie synaptycznej lub postsynaptycznej gęstości synaps powinno być ekstrahowanych za pomocą IGEPAL CA-630, jednak niektóre mogą nie ulec całkowitej rozpuszczalności i mogą wymagać użycia innego detergentu niedenaturującego, takiego jak Triton X-100, który był wcześniej stosowany w chemii ABE2, 8.
W kilku opisach chemii ABE wykorzystano również inny odczynnik biotynylacji reagujący z tiolem od opisywanej przez nas cząsteczki, zwanej Biotyna-HPDP (Thermo Scientific), który również wymaga innego sposobu oczyszczania białek4. Biotyna-HPDP to kolejna reagująca z tiolem, sprzężona z maliemidem cząsteczka biotyny, która zawiera wiązanie dwusiarczkowe w ramieniu łącznika maliemidu, strukturalnie odróżniając go od Biotyny-BMCC, która nie zawiera tego wiązania dwusiarczkowego. Po tiolowej biotynylacji wolnej lub palmitoilowanej cysteiny białka przez Biotin-HPDP, powstałe wiązanie dwusiarczkowe między białkiem docelowym a grupą biotyny można rozszczepić przez odczynniki redukujące w celu uwolnienia grupy biotyny i regeneracji białka w jego niezmodyfikowanej postaci, dzięki czemu biotynylacja przez Biotyna-HPDP jest przejściowa i odwracalna. Dlatego stosowanie tego odczynnika do biotynylacji wymaga oczyszczenia docelowego białka za pomocą immobilizowanych odczynników awidyny, takich jak kulki pokryte streptawidyną. Jednak tiol-biotynylacja białka docelowego przez Biotin-BMCC, jak to tutaj opisujemy, jest stabilna i względnie trwała i wymaga oczyszczenia białka docelowego przez przeciwciało skierowane przeciwko celowi i unieruchomione na kulkach sefarozy. Obie techniki ABE były wcześniej wykorzystywane do badań przesiewowych na dużą skalę, a wykrywanie palmitoilacji pojedynczych białek2, 8-10, 12 i opisywany tutaj test IP-ABE są optymalne do szybkiego wykrywania palmitoilacji pojedynczych neuronalnych białek docelowych.
Zdecydowana większość palmitoilacji komórkowej polega na odwracalnym dodaniu palmitynianu do tiolowej grupy cystein (określanej jako S-palmitoilacja, którą w tym protokole uogólniamy jako "palmitoilację"), jednak bardzo ograniczona grupa białek jest poddawana nieodwracalnej palmitylacji przy resztach glicyny i cysteiny poprzez tworzenie stabilnych wiązań amidowych, zwanych N-palmitoilacją13. Jednym z ograniczeń chemii ABE jest jej niezdolność do wykrycia N-palmitoilacji ze względu na stabilność wiązania amidowego, a zatem badanie przesiewowe nowego białka docelowego pod kątem palmitoilacji powinno zostać potwierdzone za pomocą znakowania metabolicznego 3H-palmitynianu1.
Jak wspomniano wcześniej, test IP-ABE można łatwo dostosować do badania palmitoilacji w ekstraktach białkowych z wielu źródeł, w tym transfekowanych heterologicznych linii komórkowych, tkanek pierwotnych i pierwotnych kultur neuronalnych z wielu regionów mózgu. Test IP-ABE został wykorzystany do zbadania wystarczalności palmitoilacji zmutowanych białek cysteiny do seryny w celu zidentyfikowania lokalizacji cysteiny palmitoilowanej wzdłuż białka docelowego8, do zbadania dynamicznego obrotu palmitynianu na białkach synaptycznych w hodowanych neuronach w warunkach podstawowych10 oraz zmian w poziomach palmitoilacji białek neuronalnych po indukcji aktywności neuronalnej9. Czułość i zdolności adaptacyjne testu IP-ABE sprawiają, że idealnie nadaje się on do badania profili palmitoilacji białek neuronalnych i optymalnie nadaje się do wykrywania dynamicznych zmian w palmitoilacji.

<table><tbody><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Fluka</td><td>93482</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche Complete Mini</td><td>11 836 153 001</td><td></td></tr><tr><td>NEM</td><td>Sigma</td><td>E3876</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór szynki </td><td>Sigma</td><td>46780-4</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Zapewnij kompatybilność z wybranym detergentem</td></tr><tr><td>Białkowe kulki sefarozy powlekane G/A </td><td>GE Healthcare</td><td>17-6002-35</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna-BMCC</td><td>Thermo Scientific</td><td>21900</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna-HRP</td><td>Thermo Scientific</td><td>21126</td><td>Rozpuścić w wodzie w stężeniu 1 mg/ml w wodzie</td></tr><tr><td>Bufor do usuwania Western Blot</td><td>Thermo Scientific</td><td>21059</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie palmitoylacji białek w hodowanych neuronach hipokampa poprzez immunoprecypitację i wymianę acylo-biotyny (abe)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylacja to potranslacyjna modyfikacja lipidów polegająca na przyłączeniu 16-węglowego nasyconego kwasu tłuszczowego, palmitynianu, do reszt cysteiny białek substratowych poprzez labilne wiązanie tioestrowe [omówione w1]. Palmitoylacja białka substratowego zwiększa jego hydrofobowość i zazwyczaj ułatwia jego transport w kierunku błon komórkowych. Ostatnie badania wykazały, że palmitoilacja jest jedną z najczęstszych modyfikacji lipidów w neuronach1, 2, co sugeruje, że obrót palmitynianu jest ważnym mechanizmem, za pomocą którego komórki te regulują kierowanie i transport białek. Identyfikacja i wykrywanie substratów palmitoilowanych może zatem lepiej zrozumieć transport białek w neuronach.
Wykrywanie palmitoilacji białek w przeszłości było technicznie utrudnione z powodu braku jednolitej sekwencji między białkami substratowymi oraz polegania na metabolicznym znakowaniu białek palmitylu za pomocą 3palmitynianu H, czasochłonnym testem biochemicznym o niskiej czułości. Opracowanie testu wymiany acylo-biotyny (ABE) umożliwia szybsze i bardziej czułe wykrywanie białek palmitoilowanych2-4 i jest optymalne do pomiaru dynamicznego obrotu palmitynianu na białkach neuronalnych. Test ABE składa się z trzech etapów biochemicznych (ryc. 1): 1) nieodwracalna blokada niezmodyfikowanych grup tiolowych cysteiny przy użyciu N-etylomalimidu (NEM), 2) specyficzne rozszczepienie i zdemaskowanie grupy tiolowej palmitoilowanej cysteiny przez hydroksyloaminę (HAM) oraz 3) selektywne znakowanie cysteiny palmitoilowanej za pomocą odczynnika biotynylacji reagującego z tiolem, biotyny-BMCC. Oczyszczanie białek tiolowo-biotynylowych zgodnie z etapami ABE różniło się w zależności od ogólnego celu eksperymentu.
Tutaj opisujemy metodę oczyszczania interesującego białka palmitoilowanego w pierwotnych neuronach hipokampa poprzez wstępny etap immunoprecypitacji (IP) przy użyciu przeciwciała skierowanego przeciwko białku, a następnie test ABE i western blot w celu bezpośredniego pomiaru poziomu palmitoilacji tego białka, który jest określany jako test IP-ABE. Hodowle o niskiej gęstości embrionalnych neuronów hipokampa szczura są szeroko stosowane do badania lokalizacji, funkcji i transportu białek neuronalnych, dzięki czemu idealnie nadają się do badania palmitoilacji białek neuronalnych za pomocą testu IP-ABE. Test IP-ABE wymaga głównie standardowych odczynników IP i western blott i jest ograniczony jedynie dostępnością przeciwciał przeciwko docelowemu substratowi. Test ten można łatwo dostosować do oczyszczania i wykrywania transfekowanych białek palmitoilowanych w heterologicznych kulturach komórkowych, pierwotnych kulturach neuronalnych pochodzących z różnych tkanek mózgowych zarówno myszy, jak i szczurów, a nawet samej pierwotnej tkance mózgowej.

Analiza IP-ABE specyficznie wykrywa tiolopalmitoilację reszt cysteiny w białkach substratowych i może być wykorzystana do wykrywania palmitoilacji immunoprecypitowanych białek neuronalnych w sposób przedstawiony na Rysunku 1. Traktowanie immunoprecypitowanego białka neuronalnego HAM (Rysunek 1) rozrywa wiązanie tioestrowe między palmitynianem a grupą tiolową cysteiny, co umożliwia specyficzną inkorporację biotin-BMCC do nowo dostępnej grupy tiolowej, którą można następnie wykryć za pomocą western blottingu. Pominięcie etapu rozszczepiania przez HAM (minus-HAM) zapobiega inkorporacji biotin-BMCC i służy jako kontrola negatywna dla specyficznej palmitoil-biotynylacji w próbce plus-HAM, dlatego powinna być ona zawsze analizowana obok próbki plus-HAM podczas western blottingu z wykorzystaniem SDS-PAGE (Rysunek 2).
W zoptymalizowanym eksperymencie (Rysunek 2A) sygnał palmitoilacji neuronalnego białka δ-catenin2 można łatwo wykryć poprzez immunoblotting z użyciem biotyny-BMCC w stężeniu 1 μM i streptawidyny sprzężonej z HRP, w próbkach równoległych z dodatkiem oraz bez dodatku HAM. Specyficzny sygnał palmitoilacji dla δ-catenin pojawia się przy jego przewidywanej masie 160kD, wyłącznie w próbce z dodatkiem HAM. Specyficzność tego sygnału została potwierdzona poprzez ponowne wybarwienie dla δ-catenin z użyciem swoistego przeciwciała, którego początkowo użyto do immunoprecypitacji, co zaowocowało sygnałem w obu wariantach traktowania HAM przy tej samej przewidywanej masie. Optymalizacja testu IP-ABE (Rysunek 2A) pozwoli na uzyskanie profilu western blotting dla próbki bez dodatku HAM, która jest łatwo rozróżnialna od próbki z dodatkiem HAM i wykazuje minimalny lub żaden sygnał palmitoilacji.
Stężenie biotiny-BMCC stosowane do znakowania palmitoylowanych cystein wymaga dokładnej optymalizacji; jeśli podczas etapów chemii ABE (Rysunek 2B) zostanie użyte stężenie nasycające biotiny-BMCC, widoczne będzie nadmierne tło oraz sygnały nieswoiste. Wcześniej wyznaczono liniową krzywą odpowiedzi dla biotinylacji palmitoylowanego białka neuronalnego, receptornicotynowego acetylocholiny α7, z użyciem biotiny-BMCC6, która wykazuje niemal pełne nasycenie przy stężeniu 5-10 μM. Chociaż optymalne stężenie biotiny-BMCC będzie się nieznacznie różnić w zależności od docelowego białka neuronalnego, traktowanie biotiną-BMCC w stężeniu przekraczającym 5 μM prawdopodobnie doprowadzi do nasycenia białka docelowego i skutkować będzie profilem western blot z widocznym tłem i sygnałami nieswoistymi. Stężenie 0,5 μM biotiny-BMCC było wcześniej stosowane do wykrywania palmitoylowania innych białek neuronalnych, w tym SNAP-25, huntingtiny, podjednostek receptora AMPA GluA1 i GluA2 oraz paralemminy8. Wyznaczenie optymalnego stężenia dla nowego białka docelowego można przeprowadzić metodą prób i błędów w sposób liniowy, zaczynając od zakresu 0,5-5 μM, który tutaj opisujemy. Powstałe profile western blot ze streptawidyną dla próbek z i bez HAM w przypadku palmitoylowania δ-kateniny wydają się podobne po traktowaniu 4 μM biotiny-BMCC (Rysunek 2B), z dodatkowymi sygnałami tła o różnych rozmiarach, co wskazuje na wystąpienie niewłaściwej biotinylacji.
Hydroksamina jest silnym reduktorem, który powoduje ograniczoną degradację białka docelowego oprócz wydajnego rozrywania wiązań tioestrowych. W związku z tym optymalizacja chemii ABE wymaga normalizacji ilości immunoprecypitowanego białka użytego w próbkach z dodatkiem i bez dodatku HAM (kroki 3.2 - 3.3). Normalizacja wymaga zastosowania dwukrotnie większej ilości unieruchomionego białka docelowego w próbce z dodatkiem HAM w porównaniu do próbki bez HAM, co w rzeczywistości skutkuje nieodróżnialnymi profilami western blotting dla białka docelowego, co pokazano dla δ-catenin (Ryc. 2A, B). Jednakże, jeśli ilość unieruchomionego białka docelowego nie zostanie znormalizowana pomiędzy próbkami bez i z dodatkiem HAM, wynikowy sygnał western blot dla białka docelowego w próbce z dodatkiem HAM może zostać utracony, co pokazano dla δ-catenin w przypadku zastosowania równych ilości białka w obu wariantach traktowania HAM (Ryc. 2C).
Specyficzność chemii ABE w znakowaniu białek palmitylowanych jest bardzo wysoka i wymaga optymalizacji. Do powszechnych błędów napotykanych podczas analizy IP-ABE należą suboptymalne wyniki przedstawione na Rysunkach 2B i 2C oraz degradacja białka docelowego, niezależnie od traktowania HAM, co zazwyczaj jest spowodowane użyciem starych odczynników i buforów oraz nieprawidłowym pH. Aby uniknąć tych problemów i skorygować suboptymalne działanie chemii ABE, należy zawsze sprawdzać świeżość i stężenie odczynników wymaganych do przygotowania buforów wymienionych w Tabeli 1, a przed rozpoczęciem eksperymentu zawsze weryfikować korektę pH wszystkich buforów.
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td colspan="2">Bufor</td>
 <td>Stężenie robocze</td>
 <td>Komentarze</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>bufor lizujący (LB)</td>
 <td>w destylowanej H2O2O: 1% IGEPAL CA-630, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 10% glicerolu</td>
 <td>Ponieważ nie dostarczono tekstu źródłowego do przetłumaczenia, proszę o przesłanie materiałów, które wymagają przełożenia na język polski. Jestem gotowy do przygotowania profesjonalnego tłumaczenia treści naukowych JoVE zgodnie z Twoimi wytycznymi.</td>
 <td>Przygotować przed eksperymentem i przechowywać w temperaturze 4 °C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>roztwór NEM</td>
 <td>W 100% EtOH: NEM w proszku liofilizowanym</td>
 <td>2 M</td>
 <td>Przygotować na świeżo, bezpośrednio przed użyciem.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bufor o wysokiej rygorystyczności</td>
 <td>W LB: 10 mM MEM 0,1% SDS</td>
 <td>Ze względu na brak treści źródłowej, nie można wykonać tłumaczenia. Proszę o dostarczenie tekstu do przetłumaczenia.</td>
 <td>Przygotować krótko przed użyciem, przechowywać w lodu.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LB pH 7,2</td>
 <td>W pożywce LB: dostosować pH do dokładnie 7,2</td>
 <td>Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.</td>
 <td>Użyć pH-metru w celu skorygowania pH bezpośrednio przed użyciem.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bufor HAM</td>
 <td>W LB pH 7,2: Roztwór zapasowy HAM</td>
 <td>1 M (końcowe stężenie HAM)</td>
 <td>Przygotować bezpośrednio przed użyciem.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LB pH 6,2</td>
 <td>W podłożu LB: dostosować pH do dokładnie 6,2</td>
 <td>Nie dotyczy</td>
 <td>Tak samo jak w przypadku LB o pH 7,2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Roztwór zapasowy biotyny-BMCC</td>
 <td>W DMSO: roztwór 2,1 mg biotyny-BMCC</td>
 <td>8 mM</td>
 <td>Przygotować bezpośrednio przed użyciem.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bufor Biotin-BMCC</td>
 <td>W LB pH 6,2: dodać roztwór biotyny-BMCC</td>
 <td>1 - 5 μM (końcowe stężenie biotyny-BMCC)</td>
 <td>Przygotować bezpośrednio przed użyciem.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2x bufor do próbek SDS, bez czynników redukujących</td>
 <td>W destylowanej wodzie H2O2O: 5% SDS, 5% glicerol, 125 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,01% błękitu bromofenolowego</td>
 <td>Kiedy źródło tekstu nie zostanie dostarczone, nie ma treści do przetłumaczenia. Proszę o przesłanie tekstu źródłowego w języku angielskim.</td>
 <td>Przygotować przed eksperymentem i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Przed użyciem uzupełnić o 5 mM DTT.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Bufory i odczynniki wymagane do analizy IP-ABE. Wiele buforów do lizy można przygotować przed rozpoczęciem eksperymentu, jednak wartość pH należy sprawdzić i skorygować bezpośrednio przed użyciem za pomocą pH-metru, aby zapewnić prawidłowy przebieg reakcji ABE. Większość roztworów stokowych należy przygotować na świeżo dla każdego eksperymentu, bezpośrednio przed użyciem. Wiele buforów wymaga odczynników powszechnie dostępnych w większości laboratoriów biochemicznych; odczynniki specjalistyczne wraz z informacjami o dostawcy wymieniono w tabeli odczynników i sprzętu.
<img src="/files/ftp_upload/50031/50031fig1.jpg" alt="Schemat wykrywania palmitoylacji białek; immunoprecypitacja, biotinylacja grup tiolowych, analiza SDS-PAGE." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50031/50031fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Schemat analizy immunoprecypitacji i wymiany acylo-biotyny (IP-ABE) w celu oczyszczania i wykrywania palmitoylacji białek neuronalnych. Hodowane neurony hipokampa są lizowane, (1) następnie białko docelowe jest oczyszczane przy użyciu przeciwciała specyficznego dla celu i unieruchamiane na kuleczkach sefarozy powlekanych białkiem G lub A. Oczyszczone białko docelowe jest następnie (2) traktowane N-etylomaleimidem (NEM) w celu nieodwracalnego związania i zablokowania wolnych grup tiolowych (-SH) wzdłuż niemodyfikowanych cystein (C). Następnie białko docelowe jest (3) poddane działaniu hydroksaminy (HAM), co prowadzi do specyficznego rozszczepienia wiązań tioestrowych przy palmitoylowanych cysteinach i odsłonięcia wolnej, palmitoylowanej grupy tiolowej (-SH). Następnie białko docelowe jest (4) traktowane cząsteczką biotyny reaktywną wobec grup tiolowych, biotin-BMCC, co skutkuje specyficzną biotinylacją palmitoylowanej cysteiny. Na koniec (5) biotinylowane białko docelowe jest eluowane i oddzielane od przeciwciała i kuleczek. Białko docelowe z palmitoylowanymi cysteinami znakowanymi biotyną nadaje się teraz do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z SDS (SDS-PAGE) oraz do western blotingu z użyciem streptawidyny w celu wykrycia palmitoylacji oczyszczonego białka neuronalnego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50031/50031fig1large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiekszony rysunek</a>.
<img src="/files/ftp_upload/50031/50031fig2.jpg" alt="Analiza Western blot palmitoilacji δ-kateniny; detekcja streptawidyną; badanie modyfikacji białek." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50031/50031fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. Detekcja palmitoilacji neuronalnego białka δ-kateniny przy użyciu testu IP-ABE. Pierwotne neurony hipokampa szczura hodowano zgodnie z wcześniejszym opisem5, przy gęstości 130 cells/mm2 aż do osiągnięcia dojrzałości w 14DIV, a następnie poddano je lizie i testowi IP-ABE w celu wykrycia palmitoilacji niedawno zidentyfikowanego palmitoilowanego substratu neuronalnego, δ-kateniny2. Oczyszczone immunoprecypitaty (IP) δ-kateniny (białko docelowe) wyizolowano przy użyciu 5 μg przeciwciała przeciwko δ-kateninie na próbkę (BD Transduction Laboratories), a następnie poddano je elektroforezie SDS-PAGE w równoległych próbkach bez i z dodatkiem hydroksaminy (HAM). Palmitoilację wykryto metodą Western blot (WB) za pomocą streptawidyny-HRP (palmitoilacja), a następnie membranę poddano strippingowi i ponownej inkubacji w celu wykonania WB dla δ-kateniny. (A) Zoptymalizowany reprezentatywny wynik IP-ABE dla palmitoilowanej δ-kateniny (grot strzałki) traktowanej 1 μM biotin-BMCC, ilustrujący specyficzność chemii ABE w detekcji białek palmitoilowanych w pozycji tiolowej z próbek IP. (B) Suboptymalny reprezentatywny wynik IP-ABE dla δ-kateniny, w którym zastosowano nadmiarowe stężenie 4 μM biotin-BMCC, co spowodowało wystąpienie nieswoistych sygnałów i tła w próbkach zarówno bez, jak i z dodatkiem HAM (strzałki). (C) Inny suboptymalny reprezentatywny wynik WB w teście IP-ABE dla δ-kateniny, w którym zastosowano nadmierne stężenie 4 μM biotin-BMCC, a ilość białka użyta do próbki IP z dodatkiem HAM nie została znormalizowana pod kątem degradacji białek wywołanej przez HAM, co skutkowało utratą sygnału w ponownym WB dla δ-kateniny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50031/50031fig2large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.

Odwracalne dodawanie palmitynianu do białek jest ważnym regulatorem wewnątrzkomórkowego transportu białek. Jest to szczególnie interesujące w neuronach, w których wiele białek synaptycznych jest palmitoilowanych. Wykorzystujemy prostą metodę biochemiczną do wykrywania białek palmitoilowanych w hodowanych neuronach, które można dostosować do wielu typów komórek i tkanek.

Wykrywanie palmitoylacji białek w hodowanych neuronach hipokampa poprzez immunoprecypitację i wymianę acylo-biotyny (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie i wykrycie białek neuronalnych związanych z poidami z hodowanych neuronów za pomocą prostego i elastycznego testu biochemicznego. Osiąga się to poprzez ekstrakcję i unieruchomienie białka docelowego w obecności etylu lub NEM, aby zapewnić blokowanie wszystkich wolnych grup tiolowych. Drugim krokiem jest potraktowanie unieruchomionego białka docelowego średnią hydroksylową lub szynką, w celu rozszczepienia wiązania tioestrowego między pozostałością cysteiny w dłoni a cząsteczką palmitynianu.Spowoduje to uwolnienie grupy stylów cystyny Palmated i udostępnienie jej do etykietowania w trzecim kroku. Unieruchomione białko docelowe jest inkubowane z biotyną B-M-C-C-A cząsteczką specyficzną dla pliku oznaczoną biotyną, ta biotyna unosi się i taguje, grupę Thile, która pierwotnie była pylem. Ostatnim krokiem jest wykrycie poziomu pacji białka docelowego za pomocą strony SDS i western blot dla Strp Aden.Ostatecznie test IP A BE służy do wykazania poziomów palmitynianu lipidów odwracalnie przyłączonego do neuronalnego białka docelowego, a także może wykrywać subtelne zmiany w białkach docelowych. Poziomy pacji. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wykrywanie białka, okaleczanie dłoni za pomocą znakowania metabolicznego za pomocą cechy A palmate, jest to, że test wymiany acylu biotyny jest bardziej czuły i mniej czasochłonny.Test A BE pozwala również na bardziej ilościowe oszacowanie okaleczania dłoni i jest optymalnie przystosowany do wykrywania niewielkich zmian w poziomach okaleczania dłoni. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w identyfikację białek palmowych i hodowanych neuronów hipokampa, może być również stosowana do innych systemów, takich jak pierwotne kultury nerwowe z innych regionów mózgu, heterologiczne linie komórkowe, a nawet tkanki pierwotne. Aby rozpocząć ekstrakcję białka docelowego z hodowanych pierwotnych neuronów hipokampa, należy przygotować bufor do lizy i roztwór NEM zgodnie z opisem w pisemnej procedurze dołączonej do tego filmu.Następnie połącz bufor do lizy i roztwór NEM, dodając 0,5 mililitra dwumolowego roztworu NEM do świeżej 50-mililitrowej stożkowej probówki. Dodaj 20 mililitrów buforu do lizy na wierzch. Zawsze najpierw dodawaj roztwór etanolu NEM, a następnie bufor do lizy, aby prawidłowo wymieszać oba w chłodni o temperaturze czterech stopni Celsjusza, szybko umieść mieszaninę na platformie kołyszącej, aby w pełni wymieszać przez pięć minut.Usuń wyhodowane pierwotne neurony hipokampa szczura z inkubatora, instrukcje, jak hodować. Neurony można znaleźć w tekście po umieszczeniu hodowanych neuronów na lodzie. Delikatnie wyjmij nośnik komórkowy.Delikatnie umyj neurony dwukrotnie zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Następnie dodaj 300 mikrolitrów buforu do lizy plus 50 milimolowych NEM do pierwszej studzienki neuronów hipokampa i zeskrob komórki za pomocą jednorazowego podnośnika komórek. Zbierz lizat komórkowy, a następnie odprowadź lizat do następnego dołka tej grupy.Zeskrob komórki w drugiej studzience za pomocą podnośnika komórek. Zbierz i powtórz za pomocą trzeciej studzienki, jeśli to konieczne. Aby jeszcze bardziej zagęścić lizat, zbierz lizat komórkowy do wstępnie schłodzonej 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej.Dodaj 100 mikrolitrów buforu do lizy oraz 50 milimolowych NEM do pierwszej studzienki i powtórz proces skrobania spoiny, aby zebrać pozostały lizat komórkowy. Przepuść całkowity lizat komórkowy przez strzykawkę o rozmiarze 26 i pół G pięć do sześciu razy, aby wspomóc mechaniczną lizę. Uważaj, aby nie wdmuchiwać bąbelków do roztworu.Mutować lizat komórkowy przez co najmniej 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza po odwirowaniu. Zbierz oczyszczony lizat komórkowy w nowej, wstępnie schłodzonej probówce o pojemności 1,5 mililitra na lodzie. Powtórzyć zademonstrowany protokół zbioru dla wszystkich grup komórek.Zmierz stężenie białka we wszystkich próbkach lizatu za pomocą testu BCA. Zgodnie z instrukcjami producenta. Znormalizuj objętość wszystkich próbek lizatu z grup komórek, aby miały dokładnie takie samo białko z zalecanym minimum 500 mikrogramów.Uzupełnij wszystkie próbki buforem do lizy oraz 50 milimolowym NEM do całkowitej objętości 500 mikrolitrów. Następnie dodaj od jednego do pięciu mikrogramów pierwszorzędowego przeciwciała skierowanego przeciwko białku docelowemu do każdej próbki lizatu. Zmutuj mieszane próbki przeciwciał przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed wytrąceniem i unieruchomieniem białka docelowego.Przygotuj 50% zawiesinę SRO pokrytej białkiem A lub białkiem G, zgodnie z opisem w pisemnym protokole. Na koniec dodaj równą objętość 50% zawiesiny do każdej próbki lizatu przeciwciał i mutuj przez co najmniej godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Podczas wykonywania ael należy wymienić odpowiednie pH i temperaturę wszystkich i odczynników, a także ich świeżość.Aby zapewnić udany eksperyment. Rozszczepianie szynki należy rozpocząć od przygotowania kilku probówek z buforem do lizy o różnych phs. pH jest bardzo ważne na tych etapach i zawsze powinno być dostosowywane.Używając pH-metru na próbkę, przygotuj dwa mililitry buforu do lizy o pH 7,2 i 0,5 mililitra rygorystycznego buforu przygotowanego w buforze do lizy. Przygotuj również 0,5 mililitra buforu do lizy plus 10 milimolowych NEM na próbkę. DODAJ tabletki PMSF i inhibitora proteazy do wszystkich do lizy.Średnia hydroksylowa lub szynka służy do rozszczepienia wiązania tioestrowego między cysteiną palmitynową a kwasem tłuszczowym palmitynianu. Jest to niezbędne, aby uwolnić grupę stylów cysteiny palmowej i udostępnić ją do oznaczania biotyną. Pominięcie rozszczepienia szynki może zatem służyć jako użyteczna kontrola negatywna.Przygotować dodatkowe 1,5 mililitrowe probówki na lodzie oznaczonym jako kontrola minus szynka dla każdej próbki po inkubacji przeciwciała z lizatem komórkowym. A następnie za pomocą kulek delikatnie odwiruj wszystkie kulki próbki w temperaturze 0,5 razy G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza z probówkami na lodzie. Usunąć supernatant i zawiesić kulki w 600 mikrolitrach buforu do lizy plus 10 milimolowych NEM.Po zawieszeniu przez Resus wszystkich kulek próbki natychmiast zbierz 200 mikrolitrów zawiesiny z kulek lizatu próbek i wylej do rurki z szynką ujemną tej próbki na lodzie, pozostawiając 400 mikrolitrów zawiesiny kulki lizatu z każdej próbki w probówce dla próbki plus szynki. Ma to na celu wyjaśnienie ograniczonej degradacji białka docelowego spowodowanej obróbką szynki. Jedna trzecia kulek jest używana do obróbki szynki minus, a pozostałe dwie trzecie są używane do obróbki szynki plus.Dodać dodatkowe 300 mikrolitrów buforu do lizy oraz 10 milimolowych NEM do próbki szynki ujemnej. Odpipetować dodatkowe 100 mikrolitrów do próbki plus szynka, co daje w sumie 500 mikrolitrów w każdej próbce. Inkubować probówki przez 10 minut na lodzie, a następnie przystąpić do mycia próbek szynki ujemnej i szynki dodatniej, zgodnie z opisem w procedurze pisemnej, po przemyciu próbki w ilości 0,5 mililitra na próbkę buforu do lizy o pH 7,2 do wszystkich próbek z pestką szynki.Dodaj 0,5 mililitra na próbkę buforu szynki do wszystkich próbek plus szynki. Następnie mutuj wszystkie próbki przez godzinę w temperaturze pokojowej. Nie należy przyjmować dłużej niż jedną godzinę po zabiegu z szynką.Przeprowadzić wymianę biotyny acylowej poprzez znakowanie biotyny BMCC, jak omówiono w procedurze pisemnej. Po zakończeniu znakowania biotyny BMCC delikatnie umyj próbki zgodnie z opisem w tekście. Usunąć supernatant z końcowego płukania, pozostawiając granulowane kulki w zawiesinie z pozostałym buforem na dnie probówki.Zanurz pipetę z końcówką o małej średnicy w samym dnie probówki przez gnojowicę i szybko zbierz pozostały bufor. Uważaj, aby nie zabrać żadnych koralików. Do każdej próbki dodać od 40 do 50 mikrolitrów dwóch x buforu do próbki oraz pięciu milimolowych DTT.w razie potrzeby. Wirować kulki, aby całkowicie wymieszać się z buforem próbki i natychmiast odwirować z dużą prędkością, aby zebrać wszystkie kulki w osadzie zanurzonym w buforze próbki. Po zagotowaniu próbek i ponownym odwirowaniu, dodać pełną objętość usuniętego białka w supernatance z każdej próbki do jednego toru w żelu poliakrylowym odpowiednim do western blot.Korzystając ze strony SDS, uporządkuj wszystkie próbki tak, aby elu kontrolne z szynką ujemną i elu z szynką dodatnią dla pojedynczej próbki były prowadzone bezpośrednio obok siebie. Podczas gdy strona SDS następuje po stronie SDS przeniesionej na membranę A-P-V-D-F lub NITROCELULOZĘ, rozpocznij western blot z myciem i blokowaniem zgodnie z opisem w pisemnej procedurze, przygotuj roztwór przeciwciała TBST plus 0,3% BSA, dodaj przeciwciało HRP streptawidyny, które zostało rozpuszczone w ilości jednego miligrama na mililitr w wodzie destylowanej. Umyj membranę raz w TBST przez 10 minut.Następnie inkubować błonę w roztworze przeciwciała STREPTAWIDYNY na platformie kołyszącej przez godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyj membranę trzy razy w TBST przez 10 minut na bujanej platformie. W celu wykrycia sygnału pation, należy naświetlić luminescencję HRP za pomocą zestawu substratów chemiluminescencyjnych w celu znormalizowania poziomów pation do ilości białka będącego przedmiotem zainteresowania, które zostało wytrącone immunologicznie.Usuń membranę za pomocą buforu do usuwania Western blot przez pięć do 10 minut na platformie kołyszącej w temperaturze pokojowej. Powtórz etapy western blott, używając pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania, które było pierwotnie używane do immunoprecypitacji. Określ ilościowo kwantację białka będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą oprogramowania do analizy obrazu i znormalizuj poziomy pation do ilości białka wytrąconego immunologicznie.Test I-P-A-B-E specyficznie wykrywa plekację reszt cystyny wzdłuż białek substratowych i może być stosowany do wykrywania pacji białek neuronalnych wytrąconych immunologicznie. Leczenie immunologicznie wytrąconego białka neuronalnego za pomocą rozszczepień szynki, tioestrowego wiązania między palmitynianem a grupą Sistine Thal, co pozwala na specyficzne włączenie biotyny BMCC do nowo dostępnej grupy plików, którą można następnie wykryć za pomocą western blotting. Pominięcie rozszczepienia szynki zapobiega wprowadzaniu biotyny BMCC i działa jako kontrola negatywna dla specyficznego uniesienia biotyny poid w próbce plus szynki.Dlatego kontrola szynki ujemnej powinna być zawsze uruchamiana w sąsiedztwie próbki szynki plus do western blot za pomocą strony SDS. W zoptymalizowanym eksperymencie sygnał pation białka neuronalnego delta kateniny można łatwo wykryć poprzez osuszanie biotyny BMCC w stężeniu jednego mikromola przy użyciu streptawidyny sprzężonej z HRP w stosunku do równoległych próbek szynki minus i plus. Specyficzny sygnał pation dla delta Kain pojawia się w przewidywanej wielkości 160 kilodaltonów tylko w próbce z dodatnią ręką.Specyficzność tego sygnału została potwierdzona przez ponowne sondowanie delta kateniny za pomocą specyficznego przeciwciała, które początkowo zastosowano do immunoprecypitacji, co dało sygnał w obu zabiegach szynkowych o tej samej przewidywanej wielkości. Optymalizacja testu I-P-A-B-E spowoduje uzyskanie profilu western blot próbki szynki ujemnej, która jest łatwo odróżnialna od próbki szynki plus i wykazuje minimalny lub żaden sygnał pation. Stężenie biotyny BMCC używane do oznaczania CYSTYN PALMOWYCH wymaga starannej optymalizacji, a jeśli na etapach chemii A BE zostanie użyte super nasycone stężenie biotyny BMCC, widoczne będzie nadmierne tło i sygnały niespecyficzne.Powstałe w ten sposób rozebrane w zachodnich profilach plam wśród próbek szynki ujemnej i dodatniej dla okaleczania kotów delta i dłoni wydają się podobne po potraktowaniu czterema mikromolowymi biotynami BMCC z dodatkowymi sygnałami tła o różnych rozmiarach, co wskazuje, że wystąpiła niewłaściwa biotyna. Ponieważ hydroksylamina jest silnym środkiem redukującym, który powoduje ograniczoną degradację białka docelowego, konieczne jest znormalizowanie ilości białka wytrąconego immunologicznie stosowanego w próbkach szynki ujemnej i dodatniej. Normalizacja wymaga użycia podwójnej ilości unieruchomionego białka docelowego w próbce z plusem w porównaniu z próbką szynki ujemnej, co skutkuje nierozróżnialnymi profilami western blot dla białka docelowego, jak pokazano dla kateniny delta.Jednakże, jeśli ilość unieruchomionego białka docelowego nie zostanie znormalizowana między próbkami szynki ujemnej i dodatniej, wynikowy sygnał western blot dla białka docelowego w próbce z plus szynka może zostać utracony, jak pokazano dla kateniny delta, gdy równe ilości białka zastosowano w obu zabiegach z szynką. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyodrębnić wybrane białko neuronalne z hodowanych neuronów hipokampa. Użyj chemii BE, aby wykryć, czy jest to podłoże do okaleczenia dłoni w jak najkrótszym czasie i być w stanie dostosować ten protokół do stosowania w innych liniach komórkowych i tkankach.

detection-protein-palmitoylation-cultured-hippocampal-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wykrywanie palmitoylacji białek w hodowanych neuronach hipokampu metodą immunoprecypitacji i wymiany acyl-biotyny (ABE)

Ubikwitynacja jest kluczową modyfikacją potranslacyjną przeprowadzaną przez zestaw trzech enzymów. Mutacje genów zaangażowanych w tę modyfikację są powiązane z wieloma różnymi chorobami ludzi. W niniejszej pracy opisujemy protokoły wykrywania ubikwitynacji białek w hodowlach komórkowych in vivo oraz w probówkach in vitro.

Wykrywanie ubikwitynacji białek

Film przedstawia analizę stanu palmitoilacji białek błony komórkowej wyizolowanych z tkanki mózgowej myszy. Proces ten polega na wystawieniu niepalmitoilowanych cystein i zablokowaniu ich, a następnie użyciu polimeru, który wiąże się z cysteinami palmitoilowanymi, pomagając w ocenie stanu palmitoilacji wyizolowanych białek.

Ocena stanu palmitoylacji białek błony komórkowej z tkanki mózgowej myszy

Ruch błony neuronalnej dynamicznie kontroluje dostępność białek błony plazmatycznej i znacząco wpływa na neuroprzekaźnictwo. Do tej pory trudno było zmierzyć neuronalny transport endocytarny w dorosłych neuronach. W tym miejscu opisujemy wysoce skuteczną, ilościową metodę pomiaru szybkich zmian ekspresji białek powierzchniowych ex vivo w ostrych wycinkach mózgu.

Biotynylacja wycinków mózgu: podejście ex vivo do pomiaru specyficznego dla regionu transportu białek błony plazmatycznej w dorosłych neuronach

W tym raporcie przedstawiono dwie metody oparte na biotynylacji, przeznaczone do określania ekspresji na powierzchni komórki i szybkości endocytarnej białek wyrażanych na błonie plazmatycznej.

Określanie ekspresji białek na powierzchni komórki i szybkości endocytów w pierwotnych kulturach astrocytów za pomocą biotynylacji

Badanie wielu, endogennych modyfikacji potranslacyjnych dla docelowego białka może być niezwykle trudne. Opisane tutaj techniki wykorzystują zoptymalizowany bufor do lizy i system filtrów opracowany ze specyficznymi matrycami powinowactwa do kierowania PTM, do wykrywania modyfikacji acetylacji, ubikwitynacji, SUMOylacji 2/3 i fosforylacji tyrozyny dla białka docelowego przy użyciu jednego, usprawnionego systemu.

Wykorzystanie kompleksowego systemu wzbogacania immunoprecypitacji w celu zidentyfikowania endogennego profilu modyfikacji potranslacyjnej dla białek docelowych

Acyl-RAC (Acyl-Resin Assisted Capture) to wysoce czuła, niezawodna i łatwa do wykonania metoda wykrywania odwracalnej modyfikacji lipidów reszt cysteiny (S-acylacji) w różnych próbkach biologicznych.

Wykrywanie S-acylacji białek za pomocą wychwytywania wspomaganego żywicą acylową

Palmitoylacja polega na włączeniu 16-węglowego ugrupowania palmitynianowego do reszt cysteinowych docelowych białek w odwracalny sposób. W tym miejscu opisujemy podejście biochemiczne, test przesunięcia żelu acylo-pegylowego (APEGS), w celu zbadania stanu palmitoilacji dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania w lizatach mózgu myszy.

Test przesunięcia żelu acylo-pegylowego do ilościowego oznaczania palmitoylacji białek błony mózgowej

Badanie acylacji tłuszczów ma ważne implikacje w interakcjach i chorobach białek komórkowych. Przedstawiono tutaj zmodyfikowany protokół mający na celu poprawę wykrywania chemicznego acylowanych białek tłuszczowych, który może być stosowany w różnych typach komórek i łączony z innymi testami, w tym pościgiem impulsowym i spektrometrią mas.

Zoptymalizowane wprowadzanie analogów alkinylowych kwasów tłuszczowych do wykrywania acylowanych białek tłuszczowych za pomocą chemii Click

Protokół proteomiki znakowania bliskości lizosomów neuronalnych jest tutaj opisany w celu scharakteryzowania dynamicznego mikrośrodowiska lizosomów w ludzkich neuronach pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Lizosomalne białka błonowe i białka, które oddziałują z lizosomami (stabilnie lub przejściowo), można dokładnie określić ilościowo w tej metodzie z doskonałą wewnątrzkomórkową rozdzielczością przestrzenną w żywych ludzkich neuronach.

Charakterystyka interaktomu lizosomu neuronalnego z proteomiką znakowania zbliżeniowego

W protokole przedstawiono metodę kowalencyjnego przyłączania biotyny do białek in vivo w oparciu o ich bliskość do ligazy biotyny połączonej z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Modyfikacja ta pozwala na selektywne wzbogacanie białek za pomocą kulek streptawidyny, zgodnie z potrzebami w badaniach interakcji białkowych.

In vivo (in vivo ) Biotynylacja zbliżeniowa w badaniach interakcji białkowych w Pantofelku czworobocznym

Poznaj metodę wykrywania palmitoylacji białek w hodowanych neuronach hipokampa przy użyciu immunoprecypitacji i wymiany acylo-biotyny. Technika ABE umożliwia precyzyjną analizę modyfikacji lipidowych białek neuronalnych.

Wykrywanie palmitoylacji białek w hodowanych neuronach hipokampa poprzez immunoprecypitację i wymianę acylo-biotyny (ABE)

Przeglądaj więcej filmów