Wykrywanie palmitoylacji białek w hodowanych neuronach hipokampa poprzez immunoprecypitację i wymianę acylo-biotyny (ABE)

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie i wykrycie białek neuronalnych związanych z poidami z hodowanych neuronów za pomocą prostego i elastycznego testu biochemicznego. Osiąga się to poprzez ekstrakcję i unieruchomienie białka docelowego w obecności etylu lub NEM, aby zapewnić blokowanie wszystkich wolnych grup tiolowych. Drugim krokiem jest potraktowanie unieruchomionego białka docelowego średnią hydroksylową lub szynką, w celu rozszczepienia wiązania tioestrowego między pozostałością cysteiny w dłoni a cząsteczką palmitynianu.

Spowoduje to uwolnienie grupy stylów cystyny Palmated i udostępnienie jej do etykietowania w trzecim kroku. Unieruchomione białko docelowe jest inkubowane z biotyną B-M-C-C-A cząsteczką specyficzną dla pliku oznaczoną biotyną, ta biotyna unosi się i taguje, grupę Thile, która pierwotnie była pylem. Ostatnim krokiem jest wykrycie poziomu pacji białka docelowego za pomocą strony SDS i western blot dla Strp Aden.

Ostatecznie test IP A BE służy do wykazania poziomów palmitynianu lipidów odwracalnie przyłączonego do neuronalnego białka docelowego, a także może wykrywać subtelne zmiany w białkach docelowych. Poziomy pacji. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wykrywanie białka, okaleczanie dłoni za pomocą znakowania metabolicznego za pomocą cechy A palmate, jest to, że test wymiany acylu biotyny jest bardziej czuły i mniej czasochłonny.

Test A BE pozwala również na bardziej ilościowe oszacowanie okaleczania dłoni i jest optymalnie przystosowany do wykrywania niewielkich zmian w poziomach okaleczania dłoni. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w identyfikację białek palmowych i hodowanych neuronów hipokampa, może być również stosowana do innych systemów, takich jak pierwotne kultury nerwowe z innych regionów mózgu, heterologiczne linie komórkowe, a nawet tkanki pierwotne. Aby rozpocząć ekstrakcję białka docelowego z hodowanych pierwotnych neuronów hipokampa, należy przygotować bufor do lizy i roztwór NEM zgodnie z opisem w pisemnej procedurze dołączonej do tego filmu.

Następnie połącz bufor do lizy i roztwór NEM, dodając 0,5 mililitra dwumolowego roztworu NEM do świeżej 50-mililitrowej stożkowej probówki. Dodaj 20 mililitrów buforu do lizy na wierzch. Zawsze najpierw dodawaj roztwór etanolu NEM, a następnie bufor do lizy, aby prawidłowo wymieszać oba w chłodni o temperaturze czterech stopni Celsjusza, szybko umieść mieszaninę na platformie kołyszącej, aby w pełni wymieszać przez pięć minut.

Usuń wyhodowane pierwotne neurony hipokampa szczura z inkubatora, instrukcje, jak hodować. Neurony można znaleźć w tekście po umieszczeniu hodowanych neuronów na lodzie. Delikatnie wyjmij nośnik komórkowy.

Delikatnie umyj neurony dwukrotnie zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Następnie dodaj 300 mikrolitrów buforu do lizy plus 50 milimolowych NEM do pierwszej studzienki neuronów hipokampa i zeskrob komórki za pomocą jednorazowego podnośnika komórek. Zbierz lizat komórkowy, a następnie odprowadź lizat do następnego dołka tej grupy.

Zeskrob komórki w drugiej studzience za pomocą podnośnika komórek. Zbierz i powtórz za pomocą trzeciej studzienki, jeśli to konieczne. Aby jeszcze bardziej zagęścić lizat, zbierz lizat komórkowy do wstępnie schłodzonej 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej.

Dodaj 100 mikrolitrów buforu do lizy oraz 50 milimolowych NEM do pierwszej studzienki i powtórz proces skrobania spoiny, aby zebrać pozostały lizat komórkowy. Przepuść całkowity lizat komórkowy przez strzykawkę o rozmiarze 26 i pół G pięć do sześciu razy, aby wspomóc mechaniczną lizę. Uważaj, aby nie wdmuchiwać bąbelków do roztworu.

Mutować lizat komórkowy przez co najmniej 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza po odwirowaniu. Zbierz oczyszczony lizat komórkowy w nowej, wstępnie schłodzonej probówce o pojemności 1,5 mililitra na lodzie. Powtórzyć zademonstrowany protokół zbioru dla wszystkich grup komórek.

Zmierz stężenie białka we wszystkich próbkach lizatu za pomocą testu BCA. Zgodnie z instrukcjami producenta. Znormalizuj objętość wszystkich próbek lizatu z grup komórek, aby miały dokładnie takie samo białko z zalecanym minimum 500 mikrogramów.

Uzupełnij wszystkie próbki buforem do lizy oraz 50 milimolowym NEM do całkowitej objętości 500 mikrolitrów. Następnie dodaj od jednego do pięciu mikrogramów pierwszorzędowego przeciwciała skierowanego przeciwko białku docelowemu do każdej próbki lizatu. Zmutuj mieszane próbki przeciwciał przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed wytrąceniem i unieruchomieniem białka docelowego.

Przygotuj 50% zawiesinę SRO pokrytej białkiem A lub białkiem G, zgodnie z opisem w pisemnym protokole. Na koniec dodaj równą objętość 50% zawiesiny do każdej próbki lizatu przeciwciał i mutuj przez co najmniej godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Podczas wykonywania ael należy wymienić odpowiednie pH i temperaturę wszystkich i odczynników, a także ich świeżość.

Aby zapewnić udany eksperyment. Rozszczepianie szynki należy rozpocząć od przygotowania kilku probówek z buforem do lizy o różnych phs. pH jest bardzo ważne na tych etapach i zawsze powinno być dostosowywane.

Używając pH-metru na próbkę, przygotuj dwa mililitry buforu do lizy o pH 7,2 i 0,5 mililitra rygorystycznego buforu przygotowanego w buforze do lizy. Przygotuj również 0,5 mililitra buforu do lizy plus 10 milimolowych NEM na próbkę. DODAJ tabletki PMSF i inhibitora proteazy do wszystkich do lizy.

Średnia hydroksylowa lub szynka służy do rozszczepienia wiązania tioestrowego między cysteiną palmitynową a kwasem tłuszczowym palmitynianu. Jest to niezbędne, aby uwolnić grupę stylów cysteiny palmowej i udostępnić ją do oznaczania biotyną. Pominięcie rozszczepienia szynki może zatem służyć jako użyteczna kontrola negatywna.

Przygotować dodatkowe 1,5 mililitrowe probówki na lodzie oznaczonym jako kontrola minus szynka dla każdej próbki po inkubacji przeciwciała z lizatem komórkowym. A następnie za pomocą kulek delikatnie odwiruj wszystkie kulki próbki w temperaturze 0,5 razy G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza z probówkami na lodzie. Usunąć supernatant i zawiesić kulki w 600 mikrolitrach buforu do lizy plus 10 milimolowych NEM.

Po zawieszeniu przez Resus wszystkich kulek próbki natychmiast zbierz 200 mikrolitrów zawiesiny z kulek lizatu próbek i wylej do rurki z szynką ujemną tej próbki na lodzie, pozostawiając 400 mikrolitrów zawiesiny kulki lizatu z każdej próbki w probówce dla próbki plus szynki. Ma to na celu wyjaśnienie ograniczonej degradacji białka docelowego spowodowanej obróbką szynki. Jedna trzecia kulek jest używana do obróbki szynki minus, a pozostałe dwie trzecie są używane do obróbki szynki plus.

Dodać dodatkowe 300 mikrolitrów buforu do lizy oraz 10 milimolowych NEM do próbki szynki ujemnej. Odpipetować dodatkowe 100 mikrolitrów do próbki plus szynka, co daje w sumie 500 mikrolitrów w każdej próbce. Inkubować probówki przez 10 minut na lodzie, a następnie przystąpić do mycia próbek szynki ujemnej i szynki dodatniej, zgodnie z opisem w procedurze pisemnej, po przemyciu próbki w ilości 0,5 mililitra na próbkę buforu do lizy o pH 7,2 do wszystkich próbek z pestką szynki.

Dodaj 0,5 mililitra na próbkę buforu szynki do wszystkich próbek plus szynki. Następnie mutuj wszystkie próbki przez godzinę w temperaturze pokojowej. Nie należy przyjmować dłużej niż jedną godzinę po zabiegu z szynką.

Przeprowadzić wymianę biotyny acylowej poprzez znakowanie biotyny BMCC, jak omówiono w procedurze pisemnej. Po zakończeniu znakowania biotyny BMCC delikatnie umyj próbki zgodnie z opisem w tekście. Usunąć supernatant z końcowego płukania, pozostawiając granulowane kulki w zawiesinie z pozostałym buforem na dnie probówki.

Zanurz pipetę z końcówką o małej średnicy w samym dnie probówki przez gnojowicę i szybko zbierz pozostały bufor. Uważaj, aby nie zabrać żadnych koralików. Do każdej próbki dodać od 40 do 50 mikrolitrów dwóch x buforu do próbki oraz pięciu milimolowych DTT.

w razie potrzeby. Wirować kulki, aby całkowicie wymieszać się z buforem próbki i natychmiast odwirować z dużą prędkością, aby zebrać wszystkie kulki w osadzie zanurzonym w buforze próbki. Po zagotowaniu próbek i ponownym odwirowaniu, dodać pełną objętość usuniętego białka w supernatance z każdej próbki do jednego toru w żelu poliakrylowym odpowiednim do western blot.

Korzystając ze strony SDS, uporządkuj wszystkie próbki tak, aby elu kontrolne z szynką ujemną i elu z szynką dodatnią dla pojedynczej próbki były prowadzone bezpośrednio obok siebie. Podczas gdy strona SDS następuje po stronie SDS przeniesionej na membranę A-P-V-D-F lub NITROCELULOZĘ, rozpocznij western blot z myciem i blokowaniem zgodnie z opisem w pisemnej procedurze, przygotuj roztwór przeciwciała TBST plus 0,3% BSA, dodaj przeciwciało HRP streptawidyny, które zostało rozpuszczone w ilości jednego miligrama na mililitr w wodzie destylowanej. Umyj membranę raz w TBST przez 10 minut.

Następnie inkubować błonę w roztworze przeciwciała STREPTAWIDYNY na platformie kołyszącej przez godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyj membranę trzy razy w TBST przez 10 minut na bujanej platformie. W celu wykrycia sygnału pation, należy naświetlić luminescencję HRP za pomocą zestawu substratów chemiluminescencyjnych w celu znormalizowania poziomów pation do ilości białka będącego przedmiotem zainteresowania, które zostało wytrącone immunologicznie.

Usuń membranę za pomocą buforu do usuwania Western blot przez pięć do 10 minut na platformie kołyszącej w temperaturze pokojowej. Powtórz etapy western blott, używając pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania, które było pierwotnie używane do immunoprecypitacji. Określ ilościowo kwantację białka będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą oprogramowania do analizy obrazu i znormalizuj poziomy pation do ilości białka wytrąconego immunologicznie.

Test I-P-A-B-E specyficznie wykrywa plekację reszt cystyny wzdłuż białek substratowych i może być stosowany do wykrywania pacji białek neuronalnych wytrąconych immunologicznie. Leczenie immunologicznie wytrąconego białka neuronalnego za pomocą rozszczepień szynki, tioestrowego wiązania między palmitynianem a grupą Sistine Thal, co pozwala na specyficzne włączenie biotyny BMCC do nowo dostępnej grupy plików, którą można następnie wykryć za pomocą western blotting. Pominięcie rozszczepienia szynki zapobiega wprowadzaniu biotyny BMCC i działa jako kontrola negatywna dla specyficznego uniesienia biotyny poid w próbce plus szynki.

Dlatego kontrola szynki ujemnej powinna być zawsze uruchamiana w sąsiedztwie próbki szynki plus do western blot za pomocą strony SDS. W zoptymalizowanym eksperymencie sygnał pation białka neuronalnego delta kateniny można łatwo wykryć poprzez osuszanie biotyny BMCC w stężeniu jednego mikromola przy użyciu streptawidyny sprzężonej z HRP w stosunku do równoległych próbek szynki minus i plus. Specyficzny sygnał pation dla delta Kain pojawia się w przewidywanej wielkości 160 kilodaltonów tylko w próbce z dodatnią ręką.

Specyficzność tego sygnału została potwierdzona przez ponowne sondowanie delta kateniny za pomocą specyficznego przeciwciała, które początkowo zastosowano do immunoprecypitacji, co dało sygnał w obu zabiegach szynkowych o tej samej przewidywanej wielkości. Optymalizacja testu I-P-A-B-E spowoduje uzyskanie profilu western blot próbki szynki ujemnej, która jest łatwo odróżnialna od próbki szynki plus i wykazuje minimalny lub żaden sygnał pation. Stężenie biotyny BMCC używane do oznaczania CYSTYN PALMOWYCH wymaga starannej optymalizacji, a jeśli na etapach chemii A BE zostanie użyte super nasycone stężenie biotyny BMCC, widoczne będzie nadmierne tło i sygnały niespecyficzne.

Powstałe w ten sposób rozebrane w zachodnich profilach plam wśród próbek szynki ujemnej i dodatniej dla okaleczania kotów delta i dłoni wydają się podobne po potraktowaniu czterema mikromolowymi biotynami BMCC z dodatkowymi sygnałami tła o różnych rozmiarach, co wskazuje, że wystąpiła niewłaściwa biotyna. Ponieważ hydroksylamina jest silnym środkiem redukującym, który powoduje ograniczoną degradację białka docelowego, konieczne jest znormalizowanie ilości białka wytrąconego immunologicznie stosowanego w próbkach szynki ujemnej i dodatniej. Normalizacja wymaga użycia podwójnej ilości unieruchomionego białka docelowego w próbce z plusem w porównaniu z próbką szynki ujemnej, co skutkuje nierozróżnialnymi profilami western blot dla białka docelowego, jak pokazano dla kateniny delta.

Jednakże, jeśli ilość unieruchomionego białka docelowego nie zostanie znormalizowana między próbkami szynki ujemnej i dodatniej, wynikowy sygnał western blot dla białka docelowego w próbce z plus szynka może zostać utracony, jak pokazano dla kateniny delta, gdy równe ilości białka zastosowano w obu zabiegach z szynką. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyodrębnić wybrane białko neuronalne z hodowanych neuronów hipokampa. Użyj chemii BE, aby wykryć, czy jest to podłoże do okaleczenia dłoni w jak najkrótszym czasie i być w stanie dostosować ten protokół do stosowania w innych liniach komórkowych i tkankach.