Name: Technika cienkiego okienka korowego czaszki do obrazowania w optycznej tomografii koherentnej in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Poznaj technikę cienkiego okienka korowego czaszki do obrazowania OCT in vivo w modelu mysim. Ta metoda jest mniej inwazyjna niż kraniektomia, zachowując integralność biologiczną mózgu podczas badania struktury i funkcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant UC Discovery Proof of Concept oraz przez NIH (R00 EB007241). Autorzy chcieliby również podziękować Jacqueline Hubbard za jej pomoc w tym eksperymencie.

1. Przygotowanie chirurgiczne
<ol>
	<li>W naszych eksperymentach wykorzystano samice myszy CD 1 w wieku 6-8 tygodni.</li>
	<li>Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym kombinacji ketaminy i ksylazyny (80 mg/kg ketaminy/10 mg/kg ksylazyny). Umieść mysz na podkładce homeotermicznej, aby zapewnić optymalną temperaturę ciała na poziomie ~37 °C. Stale monitoruj poziom znieczulenia, testując odruchy zwierzęcia (np. szczypanie stopy kleszczami) i w razie potrzeby wstrzyknij więcej znieczulenia.</li>
	<li>Nasmaruj oba oczy maścią na sztuczne łzy. Usuń włosy ze skóry głowy za pomocą maszynki do golenia i usuń resztki włosów za pomocą płatków nasączonych 70% alkoholem. Nałóż cienką warstwę kremu do depilacji Nair na skórę głowy i odczekaj 2 minuty, aż zacznie działać. Delikatnie zetrzyj Naira i pozostałe włosy za pomocą wacików nasączonych solą fizjologiczną i wacików nasączonych alkoholem. Skóra głowy powinna być teraz całkowicie pozbawiona włosów.</li>
	<li>Zdezynfekuj skórę głowy za pomocą patyczka do wacików z betadyną i wyczyść płatkami przygotowawczymi z 70% etanolu.</li>
	<li>Ostrożnie owiń zwierzę w obłożenia chirurgiczne, aby zapewnić optymalną temperaturę ciała ~37 °C i zamontuj zwierzę na ramie stereotaktycznej, aby unieruchomić czaszkę. Lekko postukaj w czaszkę, aby zapewnić jej stabilność. Wykaz użytych materiałów znajduje się w tabeli 1.</li>
</ol>
2. Przygotowanie okna korowego z przerzedzoną czaszką
<ol>
	<li>Rozpocznij nacięcie w punkcie linii środkowej między oczami. Kontynuuj doogonowo do punktu linii środkowej między uszami. Rozchyl skórę kleszczami.</li>
	<li>Zlokalizuj obszar do przerzedzenia pod mikroskopem preparacyjnym i delikatnie usuń powięź za pomocą pęsety. Osusz czaszkę sterylnymi wacikami przed utworzeniem cienkiego okienka korowego. W naszych eksperymentach stworzyliśmy 4 × 4 mm cieńsze okno czaszki ~1 mm z tyłu i boczne do bregmy.</li>
	<li>Rozpocznij przerzedzanie czaszki za pomocą okrągłego wiertła z węglika spiekanego o rozmiarze wiertła 0,75 mm w chirurgicznej wiertarce ręcznej, używając tylko lekkich ruchów zamiatania. Nie wywieraj bezpośredniego nacisku na czaszkę. Przerywaj wiercenie co 20-30 sekund, aby usunąć pył kostny za pomocą sterylnego soli fizjologicznej i wacików bawełnianych oraz uniknąć przegrzania czaszki. Sól fizjologiczna pomoże również w rozpraszaniu ciepła w całej czaszce.</li>
	<li>Gdy zewnętrzna warstwa zwartej kości zostanie całkowicie usunięta, środkowa gąbczasta warstwa kości powinna być teraz widoczna. Może wystąpić niewielkie krwawienie, ponieważ naczynia krwionośne są bardziej widoczne w gąbczastej warstwie kości. Przełącz się na zielony wiertarz kamienny i kontynuuj wiercenie, zachowując szczególną ostrożność, ponieważ gąbczasta warstwa jest delikatniejsza. Zielony kamienny wiertło usunie mniej materiału kostnego, tworząc równość w całym oknie czaszki. Od czasu do czasu przerwij wiercenie, aby usunąć pył kostny i schłodzić czaszkę.</li>
	<li>Wreszcie, gdy czaszka stanie się bardziej przezroczysta, a unaczynienie na mózgu będzie teraz widoczne, zacznij polerować czaszkę za pomocą wiertła do polerowania. Pozwoli to na bardziej precyzyjne przerzedzenie przy jednoczesnym wygładzeniu czaszki. Sprawdź cienkość czaszki, delikatnie stukając w nią kleszczami. Przestań polerować, gdy czaszka stanie się lekko elastyczna.</li>
	<li>Cieńsze okno czaszki powinno być teraz całkowicie gładkie i odblaskowe oraz gotowe do obrazowania (ryc. 1). Ze względu na charakter silnie rozpraszających się tkanek mózgu, czaszka powinna być rozrzedzona do co najmniej 55 μm, aby uzyskać optymalną penetrację na głębokość. Wykaz użytych materiałów znajduje się w tabeli 1.</li>
</ol>
3. Obrazowanie metodą optycznej koherentnej tomografii
<ol>
	<li>Po zakończeniu operacji należy sprawdzić częstość oddechów i odruchy zwierzęcia, aby zapewnić odpowiedni poziom znieczulenia i w razie potrzeby podać dodatkowe znieczulenie. Wyjmij zwierzę z ramy stereotaktycznej, trzymaj zwierzę owinięte w serwety chirurgiczne i przetransportuj zwierzę do stacji obrazowania.</li>
	<li>Przed obrazowaniem sprawdź objawy odruchów i w razie potrzeby zastosuj dodatkowe sztuczne łzy. Zamontuj zwierzę na ramie stereotaktycznej, aby zabezpieczyć czaszkę.</li>
	<li>Umieść zwierzę pod kamerą OCT i umieść TSCW pod wiązką optyczną (rysunek 2). Można teraz zwizualizować przekrój poprzeczny czaszki i mózgu (ryc. 3).</li>
	<li>Zbieranie danych można rozpocząć po zlokalizowaniu obszaru zainteresowania. Do celów obrazowania używamy luster galvo, aby uzyskać okno obrazowania o szerokości 4,0 mm. Uzyskano głębokość obrazowania 2 mm przy mocy padającej 6 mW i ognisku znajdującym się 1 mm poniżej cieńszej czaszki. Każdy obszar przekroju składał się z 2 048 skanów osiowych z szybkością akwizycji 0,14 sekundy na obraz.</li>
	<li>Wolumetryczne skany mózgu można również uzyskać, zbierając serię obrazów przekroju poprzecznego 2D przy użyciu dwóch zestawów luster galvo do skanowania x-y, przy czym pierwsze lustro galvo skanuje wiązkę w kierunku strzałkowym, a drugie skanowanie zwierciadła galvo w kierunku koronalnym.</li>
</ol>

<ol><li>Bizheva, K., Unterhuber, A., Hermann, B., Povazay, B., Sattmann, H., Drexler, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+ex+vivo+and+in+vitro+brain+morphology+in+animal+models+with+ultrahigh+resolution+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Imaging ex vivo and in vitro brain morphology in animal models with ultrahigh resolution optical coherence tomography.</a> Journal of Biomedical Optics. 9, 719-724 (2004).</li>
<li>Fujimoto, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+for+ultrahigh+resolution+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography for ultrahigh resolution in vivo imaging.</a> Nature Biotechnology. 21, 1361-1367 (2003).</li>
<li>Wantanabe, H., Rajagopalan, U. M., Nakamichi, Y., Igarashi, K. M., Kadono, H., Tanifuji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swept+source+optical+coherence+tomography+as+a+tool+for+real+time+visualization+and+localization+of+electrodes+used+in+electrophysiological+studies+of+brain+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Swept source optical coherence tomography as a tool for real time visualization and localization of electrodes used in electrophysiological studies of brain in vivo.</a> Biomedical Optics Express. 2, 3129-3134 (2011).</li>
<li>Huang, D., Swanson, E. A., Lin, C. P., Schuman, J. S., Stinson, W. G., Chang, W., Hee, M. R., Flottee, T., Gregory, K., Puliafito, C. A., Fujimoto, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography.</a> Science. 254, 1178-1181 (1991).</li>
<li>Mitsui, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+range+of+optical+reflectometry+with+spectral+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Dynamic range of optical reflectometry with spectral interferometry.</a> Japanese Journal of Applied Physics. 38, 6133-6137 (1999).</li>
<li>de Boer, J. F., Cense, B., Park, B. H., Pierce, M. C., Tearney, G. J., Bouma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+signal-to-noise+ratio+in+spectral-domain+compared+with+time-domain+optical+coherence+tomograhy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Improved signal-to-noise ratio in spectral-domain compared with time-domain optical coherence tomograhy.</a> Optics Letters. 28, 2067-2069 (2003).</li>
<li>de Boer, J. F. Ch. 5. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3ade+Boer%2C+JF+%22Optical+Coherence+Tomography%3A+Technology+and+Applications%22">Optical Coherence Tomography: Technology and Applications</a>. , Springer. (2008).</li>
<li>Choma, M. A., Sarunic, M. V., Yang, C., Izatt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+advantage+of+swept+source+and+fourier+domain+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Sensitivity advantage of swept source and fourier domain optical coherence tomography.</a> Optics Express. 11, 2183-2189 (2003).</li>
<li>Leitgeb, R. A., Drexler, W., Unterhuber, A., Hermann, B., Bajraszewski, T., Le, T., Stingl, A., Fercher, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh+resolution+fourier+domain+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh resolution fourier domain optical coherence tomography.</a> Optics Express. 12, 2156-2165 (2004).</li>
<li>Drew, P. J., Shih, A. Y., Driscoll, J. D., Knutsen, P. M., Blinder, P., Davalos, D., Akassoglou, K., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nature Methods. 7, 981-984 (2010).</li>
<li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Polished+and+Reinforced+Thinned-skull+Window+for+Long-term+Imaging+of+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse.</a> J. Vis. Exp. 61, e3742(2012).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protocols. 5, (2010).</li>
<li>Lu, M., Majewska, S., K, A., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Thin-skull+Window+Technique+for+Chronic+Two-photon+In+vivo+Imaging+of+Murine+Microglia+in+Models+of+Neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation.</a> J. Vis. Exp. (43), e2059(2010).</li>
<li>Wang, Y., Oh, C. M., Oliveira, M. C., Islam, M. S., Ortega, A., Park, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPU+accelerated+real-time+multi-functional+spectral-domain+optical+coherence+tomography+system+at+1300nm%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">GPU accelerated real-time multi-functional spectral-domain optical coherence tomography system at 1300nm.</a> Optics Express. 20, 14797-14813 (2012).</li>
<li>Aguirre, A. D., Chen, Y., Fujimoto, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depth-resolved+imaging+of+functional+activation+in+the+rat+cerebral+cortex+using+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Depth-resolved imaging of functional activation in the rat cerebral cortex using optical coherence tomography.</a> Opt. Lett. 31, 3459-3461 (2006).</li>
<li>Chen, Y., Aguirre, A. D., Ruvinskaya, L., Devor, A., Boas, D. A., Fujimoto, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+%28OCT%29+reveals+depth-resolved+dynamics+during+functional+brain+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography (OCT) reveals depth-resolved dynamics during functional brain activation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 178, 162-173 (2009).</li>
<li>Liang, C., Wierwille, J., Moreira, T., Schwartzbauer, G., Jafri, M. S., Tang, C., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+forward-imaging+needle-type+OCT+probe+for+image+guided+stereotactic+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">A forward-imaging needle-type OCT probe for image guided stereotactic procedures.</a> Opt Express. 19, 26283-26294 (2011).</li>
<li>Srinivasan, V. J., Sakadzic, S., Gorczynska, I., Ruvinskaya, S., Wu, W., Fugimoto, J. G., Boas, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+cerebral+blood+flow+with+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Quantitative cerebral blood flow with optical coherence tomography.</a> Optics Express. 18, 2477-2494 (2010).</li>
<li>Galetta, K. M., Calabresi, P. A., Frohman, E. M., Balcer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Coherence+Tomography+%28OCT%29%3A+imaging+the+visual+pathway+as+a+model+for+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Society+for+Experimental+NeuroTherapeutics%22%5BJournal%5D)">Optical Coherence Tomography (OCT): imaging the visual pathway as a model for neurodegeneration.</a> The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 8, 117-132 (2011).</li>
<li>Seigo, M. A., Sotirchos, E. S., Newsome, S., Babiarz, A., Eckstein, C., Ford, E., Oakley, J. D., Syc, S. B., Frohman, T. C., Ratchford, J. N., Balcer, L. J., Frohman, E. M., Calabresi, P. A., Saidha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assessment+of+retinal+neuronal+layers+in+multiple+sclerosis+with+maual+and+automated+optical+coherence+tomography+segementation+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol%22%5BJournal%5D)">In vivo assessment of retinal neuronal layers in multiple sclerosis with maual and automated optical coherence tomography segementation techniques.</a> J. Neurol. , (2012).</li>
<li>Frohman, E. M., Fujimoto, J. G., Frohman, T. C., Calabresi, P. A., Cutter, G., Balcer, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography%3A+a+window+into+the+mechanisms+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography: a window into the mechanisms of multiple sclerosis.</a> Nature Clinical Practice. 4, 664-675 (2008).</li>
<li>Gill, A. S., Rajneesh, K. F., Owen, C. M., Yeh, J., Hsu, M., Binder, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+optical+detection+of+cerebral+edema+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Early optical detection of cerebral edema in vivo.</a> J. Neurosurg. 114, 470-477 (2011).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Obrazowanie za pomocą OCT i rozrzedzonej czaszki jest nowatorską techniką neuroobrazowania, która została zbadana dopiero niedawno15, 16. W naszych eksperymentach wykazaliśmy wykonalność obrazowania SD-OCT za pomocą TSCW w modelu mysim in vivo. Z naszych wyników wynika, że czaszka jest przerzedzona do około 55 μm, a głębokość penetracji uzyskuje się na poziomie około 1 mm przy rozdzielczości obrazu 8 μm i 20 μm odpowiednio w kierunku osiowym i bocznym. W profilu intensywności sygnału, obrazowanie OCT ...

Od czasu jego wprowadzenia na początku lat 90-tych, OCT jest szeroko stosowany do biologicznego obrazowania struktury i funkcji tkanek2. OCT generuje obrazy przekroju poprzecznego, mierząc opóźnienie czasowe echa światła wstecznie rozproszonego4, wdrażając źródło światła o niskiej koherencji ze światłowodowym interferometrem Michelsona2,4. SD-OCT, znany również jako OCT W DOMENIE FOURIERA (FD-OCT), został po raz pierwszy wprowadzony w 1995 roku5 i oferuje lepszą modalność obrazowania w porównaniu z tradycyjnym OCT W DZIEDZINIE CZASU (TD-OCT). W SD-OCT ramię referencyjne jest utrzymywane nieruchomo, co skutkuje szybką akwizycją obrazu o ultrawysokiej rozdzielczości6-9.
Obecnie, modele TSCW są głównie używane do obrazowania mózgu in vivo w mikroskopii dwufotonowej zamiast tradycyjnej kraniotomii. Te TSCW były używane jednocześnie z niestandardową płytką czaszki lub szklanym szkiełkiem nakrywkowym10-13, aby zapewnić dodatkową stabilność obrazowania. W naszych badaniach zaobserwowaliśmy, że akcesoria takie jak te nie są konieczne do obrazowania OCT, gdy używany jest TSCW. W związku z tym brak płytki czaszki lub szklanych szkiełek nakrywkowych pozwala na szerszy zakres rozmiarów okien obrazowania, ponieważ mogą one zakłócać wiązkę optyczną i zmieniać obrazy OCT.
Preparat z rozrzedzoną czaszką okazał się korzystny w badaniach obrazowych mózgu przy użyciu mikroskopii dwufotonowej10-13. W naszych eksperymentach wykorzystujemy system SD-OCT do obrazowania kory mózgowej in vivo za pomocą TSCW. Nasz niestandardowy zestaw do obrazowania SD-OCT zawiera szerokopasmowe, niskokoherentne źródło światła składające się z dwóch diod superluminescencyjnych (SLD) wyśrodkowanych pod kątem 1295 nm i szerokości pasma 97 nm, co daje rozdzielczość osiową i poprzeczną odpowiednio 8 μm i 20 μm,14. Dzięki naszemu urządzeniu do obrazowania optycznego wyobrażamy sobie, że obrazowanie za pomocą TSCW ma ogromny potencjał w identyfikacji i wizualizacji struktur i funkcji w optycznie gęstej tkance mózgowej.

<table><tbody><tr><td>Ketamina</td><td>Phoenix Pharmaceuticals</td><td>57319-542-02</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Akorn, Inc.</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>Maść na sztuczne łzy</td><td>Rugby</td><td>0536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>Nair</td><td>Church Dwight Co., Inc.</td><td></td><td></td>4010130</tr><tr><td>Sterylna podkładka nasączona alkoholem</td><td>Kendall Healthcare</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-115</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór betadyny Swabstick</td><td>Purdue Products</td><td>67618-153-01</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór soli fizjologicznej, .9%</td> <td>Phoenix Pharmaceuticals</td><td>57319-555-08</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktyczne przechowywanie ramek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szybkobieżna chirurgiczna wiertarka ręczna</td><td>Foredom</td><td></td><td>38 000 obr./min</td></tr><tr><td>Okrągłe wiertło z węglika spiekanego</td><td>Stoelting</td><td></td><td>0,75 mm</td></tr><tr><td>Dura-Green Stones</td><td>Trzpień Shofu</td><td></td><td>: HP Kształt: BA1</td></tr><tr><td>CompoMaster Coarse & Polerka CompoMaster</td> Kształt <td>Shofu</td><td></td><td>: Mini-Pt.</td></tr><tr><td>SpaceDrapes</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

technika cienkiego okienka korowego czaszki do obrazowania w optycznej tomografii koherentnej in vivo

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optyczna tomografia koherentna (OCT) to technika obrazowania biomedycznego o wysokiej rozdzielczości przestrzenno-czasowej. Dzięki minimalnie inwazyjnemu podejściu OCT jest szeroko stosowany w okulistyce, dermatologii i gastroenterologii1-3. Korzystając z okienka korowego z cieńszą czaszką (TSCW), wykorzystujemy modalność OCT w domenie spektralnej (SD-OCT) jako narzędzie do obrazowania kory mózgowej in vivo. Powszechnie otwarta czaszka jest używana do obrazowania neurologicznego, ponieważ zapewnia większą wszechstronność, jednak podejście TSCW jest mniej inwazyjne i jest skutecznym środkiem do długoterminowego obrazowania w badaniach neuropatologicznych. W niniejszej pracy przedstawiono metodę tworzenia TSCW w modelu mysim do obrazowania OCT in vivo kory mózgowej.

Po wykonaniu cieńszego okna nad korą mózgu naczynia krwionośne powinny stać się bardziej widoczne (Rysunek 1), co pozwoli na uzyskanie większej głębokości obrazowania (do 1 mm). Prawa kora zostaje ścieniona do około 55 μm w porównaniu do normalnej czaszki mierzącej 140 μm (Rysunek 1), co zapewnia większą przejrzystość optyczną. Dalsze ścienienie do 10-15 μm jest możliwe11, jednak nie jest konieczne, ponieważ w naszych eksperymentach nie zastosowano szkiełek nakrywkowych ani pł...

Prezentujemy metodę tworzenia okna korowego z cieńszą czaszką (TSCW) w modelu mysim do obrazowania in vivo OCT kory mózgowej.

Technika cienkiego okienka korowego czaszki do obrazowania w optycznej tomografii koherentnej in vivo

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie cienkiego okna czaszki czaszki w modelu mysim do obrazowania mózgu metodą optycznej koherentnej tomografii in vivo. Osiąga się to poprzez uprzednie znieczulenie zwierzęcia i przygotowanie go do operacji. Następnie rozrzedzić czaszkę za pomocą różnych zadziorów dentystycznych.Ostatnim krokiem jest uzyskanie obrazów OCT mózgu in vivo przez cienkie okienko czaszki czaszki. Ostatecznie, informacje strukturalne i funkcjonalne mózgu można uzyskać z uzyskanych obrazów OCT. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak kraniektomia lub okienka nakrywkowe, jest to, że okienko końcowe jest mniej inwazyjne i z większym prawdopodobieństwem utrzymuje biologiczną integralność i żywotność mózgu.Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozy zaburzeń neurologicznych, ponieważ OCT zapewnia wysoką rozdzielczość przestrzenną i czasową oraz zapewnia lepszą penetrację głębokości w porównaniu z mikroskopią konfokalną i dwufotonową. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, będą miały trudności z utworzeniem jednolicie cienkiej powierzchni czaszki bez wprowadzania złamań czaszki lub krwawienia podtwardówkowego. Aby rozpocząć tę procedurę, znieczulij jedną mysz CD w wieku od sześciu do ośmiu tygodni za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia kombinacji ketaminy i ksylazyny.Następnie umieść mysz na podkładce lub kocu homeotematycznym, aby zapewnić optymalną temperaturę ciała na poziomie około 37 stopni Celsjusza podczas przygotowania chirurgicznego, stale monitoruj poziom znieczulenia, badając odruchy zwierzęcia i w razie potrzeby wstrzyknij więcej znieczulenia. Następnie nasmaruj oba oczy maścią na sztuczne łzy. Usuń włosy ze skóry głowy za pomocą maszynki do strzyżenia.Następnie usuń resztki obciętych włosów za pomocą podkładki lub wacika. Następnie nałóż cienką warstwę kremu do depilacji na skórę głowy. Po dwóch minutach delikatnie zetrzyj krem i pozostałe włosy za pomocą soli fizjologicznej, zwilżonych wacików i wacików nasączonych alkoholem.Teraz zdezynfekuj skórę głowy za pomocą patyczka do wacików Betadine i wyczyść płatkami przygotowawczymi z 70% etanolu. Następnie zamontuj zwierzę na stereotaktycznej ramie, aby unieruchomić czaszkę. Lekko postukaj w czaszkę, aby zapewnić jej stabilność.W tej procedurze rozpocznij nacięcie skóry głowy w punkcie linii środkowej między oczami. Kontynuuj pieczołowicie do punktu linii środkowej między częścią uszu, płaty skóry z kleszczami. Następnie zlokalizuj obszar, który ma zostać przerzedzony pod mikroskopem preparacyjnym.Użyj kleszczy, aby zeskrobać czaszkę, aby usunąć resztki powięzi. Następnie osusz czaszkę sterylnymi wacikami bawełnianymi przed utworzeniem cienkiego okna korowego o wymiarach cztery na cztery milimetry, około jednego milimetra tylnego i bocznego torema. Użyj chirurgicznej wiertarki ręcznej z okrągłym zadziorem z węglika spiekanego lekkim ruchem zamiatającym, aby rozrzedzić czaszkę.Nie wywieraj bezpośredniego nacisku na czaszkę. Przerwij wiercenie co 20 do 30 sekund, aby usunąć pył kostny za pomocą sterylnej soli fizjologicznej i wacików bawełnianych oraz uniknąć przegrzania czaszki. Sól fizjologiczna pomoże również w rozpraszaniu ciepła w całej czaszce.Gdy zewnętrzna warstwa zwartej kości zostanie całkowicie usunięta, środkowa gąbczasta warstwa kości powinna być widoczna. Może wystąpić niewielkie krwawienie, ponieważ naczynia krwionośne są bardziej widoczne w gąbczastej warstwie kości. Przełącz się na zielony zadzior kamienny i kontynuuj wiercenie, zachowując szczególną ostrożność.Ponieważ gąbczasta warstwa jest bardziej delikatna, zielony kamienny zadzior usunie mniej materiału kostnego, zapewniając jednocześnie równość w całym oknie czaszki. Od czasu do czasu przerwij wiercenie, aby usunąć pył kostny i schłodzić czaszkę. Wreszcie, gdy czaszka stanie się bardziej przezroczysta, a unaczynienie na mózgu będzie widoczne, zacznij polerować czaszkę za pomocą wiertła do polerowania, sprawdź grubość czaszki, delikatnie stukając w nią kleszczami, przestań polerować.Kiedy czaszka staje się lekko elastyczna, przerzedzone okno czaszki powinno być teraz całkowicie gładkie i odblaskowe oraz gotowe do obrazowania. Ze względu na charakter silnie rozpraszających się tkanek mózgu, czaszka powinna być rozrzedzona do co najmniej 55 mikronów, aby uzyskać optymalną penetrację na głębokość. Po zakończeniu operacji sprawdź częstość oddechów zwierzęcia poprzez oględziny i odruchy, aby zapewnić odpowiedni poziom znieczulenia i podać dodatkowe znieczulenie W razie potrzeby umieść zwierzę pod kamerą OCT, a następnie umieść cienkie okno czaszki czaszki pod wiązką optyczną.Można teraz wizualizować przekrój poprzeczny czaszki i mózgu. Można rozpocząć gromadzenie danych. Po zlokalizowaniu obszaru zainteresowania do celów obrazowania, zeskanowaliśmy wiązkę OCT nad obrazowym oknem korowym o szerokości 4,0 milimetrów i uzyskaliśmy głębokość obrazowania wynoszącą dwa milimetry z sześcioma miliwatami mocy padania i ogniskową 0,1 milimetra poniżej cienkiej czaszki.Każdy obszar przekroju poprzecznego składał się z 2048 skanów osiowych z szybkością akwizycji 0,14 sekundy na obraz. Ta konkretna metoda pozwoliła nam zidentyfikować konkretne struktury na naszych obrazach przekrojowych OCT. Ten rysunek przedstawia parastrzałkowy obraz OCT kory pod normalną czaszką, a tutaj pokazuje parastrzałkowy obraz OCT pod cienką czaszką.Struktury mózgu są bardziej widoczne wizualnie pod cienkim oknem czaszki w przeciwieństwie do normalnej czaszki. Dodatkowo uzyskuje się również koronalny obraz przekroju poprzecznego OCT, który ułatwia identyfikację struktur linii środkowej. Wolumetryczne skany mózgu można również uzyskać, zbierając serię obrazów przekroju poprzecznego 2D przy użyciu dwóch zestawów luster gal O do skanowania XY, przy czym pierwsze lustro gal O skanuje wiązkę w kierunku strzałkowym, a drugie zwierciadło gal skanuje kierunek koronalny.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 10 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby równomiernie rozrzedzić czaszkę, aby zapewnić odpowiednią penetrację sygnału podczas obrazowania OCT, Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować cienkie okno korowe czaszki do celów obrazowania OCT.

thinned-skull-cortical-window-technique-for-vivo-optical-coherence

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Technika okna kortykalnego o przerzedzonym czaszki do in vivo obrazowania tomografią koherencji optycznej

Opisujemy metodę wielokrotnej wizualizacji mikrogleju mysiego oraz monocytów krążących in vivo w czasie liczonym w godzinach, dniach lub tygodniach, z wykorzystaniem transkranialnej mikroskopii dwufotonowej. Demonstrujemy sposób przygotowania okna z cienkiej czaszki, które umożliwia przerywaną obserwację spoczywającego mikrogleju, który może zostać aktywowany poprzez sąsiednią stereotaktyczną iniekcję białka regulatorowego Tat wirusa HIV-1.

Technika cienkiej okienkowej czaszki do przewlekłego obrazowania dwufotonowego in vivo mikrogleju mysiego w modelach neurozapalenia

W tym filmie i materiałach uzupełniających przedstawiamy protokół przewlekłego obrazowania in vivo nienaruszonego mózgu z wykorzystaniem preparacji z cienkiej czaszki.

Przewlekłe obrazowanie kory wzrokowej myszy z wykorzystaniem preparatu z pocienioną czaszką

Przedstawiamy metodę tworzenia okna obrazującego w czaszce myszy, które obejmuje obszar o wielkości kilku milimetrów i pozostaje stabilne przez wiele miesięcy bez wywoływania stanu zapalnego mózgu. Metoda ta jest odpowiednia do podłużnych badań przepływu krwi, dynamiki komórkowej oraz struktury komórkowej i naczyniowej z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej.

Polerowane i wzmocnione okno z cienkiej czaszki do długoterminowego obrazowania mózgu myszy

Łącząc zastosowanie polerowanego i wzmocnionego cienkiego okna czaszkowego (PoRTS) z wstrzykiwaniem komórek glejaka wielopostaciowego (GBM), możemy w sposób podłużny obserwować inicjację i wzrost glejaka z wstrzykniętych komórek GBM w mózgu żywej myszy.

Obrazowanie inicjacji glejaka in vivo poprzez wypolerowane i wzmocnione cienkie okno czaszkowe

Obrazowanie poklatkowe u żywego zwierzęcia dostarcza cennych informacji na temat reorganizacji strukturalnej w nienaruszonym mózgu. Tutaj wprowadzamy preparat z rozcieńczoną czaszką, który umożliwia przezczaszkowe obrazowanie znakowanych fluorescencyjnie struktur synaptycznych w żywej korze myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Dwufotonowe obrazowanie in vivo kolców dendrytycznych w korze myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką

Tutaj opisujemy półinwazyjną metodę mikroskopii optycznej do indukcji skrzepu fotozakrzepowego Rose Bengal w korze somatosensorycznej myszy in vivo.  Opisano techniczne aspekty procedury obrazowania, począwszy od indukcji zdarzenia fotozakrzepowego, a skończywszy na zastosowaniu i gromadzeniu danych.

Fotozakrzepica różana bengalska za pomocą konfokalnego obrazowania optycznego in vivo: model udaru pojedynczego naczynia

Ten manuskrypt opisuje procedurę śledzenia przebudowy układu naczyniowo-mózgowego podczas gromadzenia się blaszek amyloidowych in vivo za pomocą podłużnej mikroskopii dwufotonowej. Preparat z rozcieńczoną czaszką umożliwia wizualizację barwników fluorescencyjnych w celu oceny postępu uszkodzenia naczyń mózgowych w mysim modelu choroby Alzheimera.

Podłużne obrazowanie in vivo naczyń mózgowych: znaczenie dla chorób OUN

Opisujemy eksperymentalną procedurę pomiaru aktywności neuronalnej za pomocą podwójnych okien optycznych nad obustronnymi głównymi korami somatosensorycznymi (S1) u transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s przy użyciu mikroskopii 2-fotonowej (2P) in vivo.

Obrazowanie aktywności neuronalnej w pierwotnej korze somatosensorycznej przy użyciu transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s

Prezentowany tutaj jest protokół wszczepienia przewlekłego okna czaszkowego do podłużnego obrazowania komórek mózgowych u obudzonych, skrępowanych głową myszy.

Implantacja okna czaszkowego w celu powtórzenia obrazowania in vivo u obudzonych myszy

Wprowadziliśmy nowatorską technikę obrazowania zwaną Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), która umożliwia bezstronne obrazowanie wszystkich komórek w próbkach mózgu na mezoskali i może być płynnie zintegrowana z procesem obrazowania taśmowej szeregowej skaningowej mikroskopii elektronowej na tej samej próbce.

Metoda optycznego obrazowania zgodna z mikroskopią skaningową do mezoskopowego mapowania mózgu w całych komórkach

Poznaj technikę cienkiego okienka korowego czaszki do obrazowania OCT in vivo w modelu mysim. Ta metoda jest mniej inwazyjna niż kraniektomia, zachowując integralność biologiczną mózgu podczas badania struktury i funkcji.

Technika cienkiego okienka korowego czaszki do obrazowania w optycznej tomografii koherentnej in vivo

Przeglądaj więcej filmów