Name: Modyfikacja genetyczna i rekombinacja kultur narządowych gruczołów ślinowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Poznaj technikę modyfikacji genetycznej nabłonkowych gruczołów ślinowych myszy przy użyciu wektorów adenowirusowych. Ta metoda umożliwia badanie morfogenezy rozgałęziania bez konieczności tworzenia organizmów transgenicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Deirdre Nelson za pomocne komentarze i krytyczną lekturę manuskryptu. Praca ta została sfinansowana z grantów NIH DE019244, DE019197 i DE021841 dla M.L., F32DE02098001 dla SJ i C06 RR015464 dla Uniwersytetu w Albany, SUNY.

Protokół zawiera cztery główne kroki, jak pokazano na rysunku 1. Wszystkie kroki są szczegółowo opisane. Budowa adenowirusa i oczyszczanie wirusa powinny być przeprowadzone przed pobraniem narządów w celu zastosowania w transdukcji genetycznej wypreparowanych zaczątków nabłonka. Podczas pracy z adenowirusami należy przestrzegać wszystkich standardowych środków ostrożności BSL-2.
1. Pobieranie i mikrodysekcja embrionalnego gruczołu podżuchwowego myszy (SMG)
<ol>
 <li>Eutanazja samic myszy w ciąży w czasie (szczep niekrewniaczy CD-1 lub ICR) przy użyciu narkozy CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy i pobranie ciągów zarodków myszy w 13 dniu embrionalnym (E13, 3-5 pąków nabłonkowych) zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez instytucjonalny komitet IACUC. Dzień odkrycia czopa dopochwowego jest oznaczony jako E0. Gruczoły ślinowe można również zbierać i hodować na etapie E12, kiedy występuje pojedynczy pierwotny pączek i łodyga, a szczeliny dopiero zaczynają się inicjować. Pistolety maszynowe przed tym etapem wymagają innych warunków hodowli niż te wskazane tutaj.</li>
 <li>Przenieś łańcuchy zarodków do sterylnych 10 cm naczyń do hodowli tkankowych wypełnionych 25 ml pożywki DMEM/Ham's F12 Medium (F12) bez czerwieni fenolowej (Life Technologies) i uzupełnione 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (pen-strep, Life Technologies).</li>
 <li>Za pomocą sterylnego skalpela (#11 ostrzy) i kleszczy (#5, Fine Science Tools, 11252-20) usuń zarodki z worków do osobnego 10-centymetrowego naczynia zawierającego 25 ml DMEM/F12 + paciorkowce.</li>
 <li>Odetnij główki zarodków z ukośnym nacięciem tuż pod dolną szczęką.</li>
 <li>Odizoluj dolne żuchwy od głów pod stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym z podstawą światła przechodzącego (Nikon SMZ645 lub odpowiednik), używając nacięcia poniżej górnej szczęki. Umieść chusteczki na dodatkowym kawałku szkła, a nie bezpośrednio na szklanym elemencie podstawy mikroskopu.</li>
 <li>Zebrać dolne żuchwy do 3 ml DMEM/F12 + pen-strep w sterylnym naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm.</li>
 <li>Umieść plasterek żuchwy na stoliku mikroskopu preparacyjnego tak, aby język znajdował się na dole plastra, ale był skierowany w stronę godziny 12:00.</li>
 <li>Używając jednej strony dwóch skrzyżowanych kleszczy ruchem nożycowym, usuń i wyrzuć dolną 1/3 plasterka żuchwy.</li>
 <li>Obróć plasterek o 90 ° w prawo (jeśli jesteś praworęczny) i za pomocą nożyc naciętych kleszczami odetnij górną część plastra żuchwy (bez przecinania języka) do połowy w plastrze.</li>
 <li>Oderwij nadmiar tkanki i usuń ją, aby odsłonić pistolety maszynowe znajdujące się pod spodem. Będzie po jednym z każdej strony w pobliżu podstawy języka.</li>
 <li>Używając jednej pary kleszczy do przytrzymania tkanki za język, użyj drugich kleszczy, aby odciągnąć pistolet maszynowy od języka. Powtórz dla drugiego gruczołu.</li>
 <li>Zebrać mikrowypreparowane gruczoły ślinowe do 3 ml DMEM/F12 + pen-strep do nowego sterylnego naczynia do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm. Uwaga: większe gruczoły podżuchwowe (3-5 pąków nabłonkowych) wraz z połączonym mniejszym gruczołem podjęzykowym (1 pączek) można hodować w stanie nienaruszonym, przeskakując do kroku 4 i wykonując kroki 4.1, 4.3 i 4.4, jak opisano wcześniej 2,8.</li>
</ol>
2. Separacja podstaw nabłonka SMG
<ol>
 <li>Umieść 5 (lub więcej) gruczołów ślinowych w szklanym naczyniu mikrostudzienkowym o średnicy 50 mm (MatTek Corporation, P50G-1.5-14-F) zawierającym 200 μl zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS bez Ca++lub Mg++, Life Technologies) zawierającego 0,4% (v/v) dypazy (Life Technologies, nr kat. 17105-041) i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 °C.</li>
 <li>Po inkubacji, za pomocą sterylnej końcówki pipety o pojemności 200 μl, ostrożnie odessać roztwór dypazy, nie naruszając pracy gruczołów. Natychmiast dodać 200 μl pożywki DMEM/F12 zawierającej 5% (w/v) BSA (DMEM/F12-BSA, wstępnie wysterylizowane filtrem 0,22 μm) w celu zneutralizowania dypazy.</li>
 <li>Pod mikroskopem preparacyjnym, używając kleszczy z cienkimi końcówkami (#5 Dumostar, Fine Science Tools, 11295-20), delikatnie oddziel rozluźnioną mezenchymę od okolic pąków i przewodów nabłonkowych SMG, uważając, aby nabłonek pozostał nienaruszony.</li>
 <li>Wstępnie zwilżyć sterylną końcówkę pipety o pojemności 200 μl pożywką DMEM/F12-BSA i delikatnie odpipetować zaczątki nabłonka do nowego naczynia mikrostudzienkowego o średnicy 50 mm zawierającego 200 μl DMEM/F12 + paciorkowcowiec. Używaj wysokiej jakości końcówki do pipet o pojemności 200 μl z gładką krawędzią.</li>
 <li>W naczyniu zawierającym kawałki mezenchymy wyrzuć wszelkie tkanki niemezenchymalne, w tym gruczoły podjęzykowe i wszelkie oderwane pąki gruczołów podżuchwowych.</li>
</ol>
3. Adenowirusowe zakażenie podstaw nabłonka
<ol>
 <li>Przygotować 200 μl pożywki do infekcji wirusowych, rozcieńczając adenowirusa będącego przedmiotem zainteresowania w DMEM/F12 + pen-strep w probówce do mikrowirówki, tak aby miano otrzymanego roztworu wynosiło 1x108-10 9 PFUs. Optymalna wartość miana wymagana dla różnych wirusów może się różnić. Ważne jest, aby stosować preparaty wirusowe oczyszczone chlorkiem cezu (CsCl) w celu uzyskania optymalnej wydajności wchłaniania.</li>
 <li>Usuń pożywkę z naczynia zawierającego pięć podstaw nabłonka. Szybko dodaj 200 μl pożywki infekcyjnej, utrzymując podstawy w stanie mokrym przez cały czas. Należy podjąć niezbędne środki ostrożności podczas obchodzenia się z wirusem i wyrzucania zanieczyszczonych końcówek pipet. Zdezynfekuj wszelkie powierzchnie skażone wirusami za pomocą 10% roztworu wybielacza.</li>
 <li>Odsuń podstawy nabłonka daleko od siebie za pomocą kleszczy, aby zapobiec ich sklejaniu się i pozwolić im osiąść na dnie płytki. Inkubuj rudymenty w pożywce wirusowej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji oddziel podstawy, jeśli poruszają się blisko siebie. Nadmierne kołysanie lub ruch pozwoli gruczołom się zbrylić.</li>
 <li>Po inkubacji delikatnie usuń pożywkę zawierającą wirusa i odpowiednio wyrzuć, uważając, aby nie naruszyć podstaw. Dodać 200 μl DMEM/F12 + pen-strep. Powtórz to płukanie jeszcze co najmniej dwa razy i zastąp 200 μl pożywki DMEM/F12 + pen-strep. Te płukanie ma kluczowe znaczenie dla usunięcia wirusa, który nie jest silnie przyczepiony do nabłonka i zapobieżenia infekcji mezenchymy.</li>
 <li>Inkubować podstawy nabłonka z 200 ml DMEM/F12 zawierającego 2% (v/v) Matrigel (BD Biosciences, 356231) przez 20 minut. Stwierdzamy, że ta krótka inkubacja w Matrigel minimalizuje regresję istniejących szczelin w początkowym okresie hodowli, ale z tego kroku można zrezygnować, jeśli ekspozycja na Matrigel nie jest pożądana.</li>
</ol>
4. Kultura ex vivo rekombinowanych pistoletów maszynowych
<ol>
 <li>Umieść każdy zaczątek, pojedynczo, za pomocą wstępnie zwilżonej końcówki pipety o pojemności 200 μl, na karbowanym (małym nacięciu) filtrze membranowym Nuclepore Track-Etch o średnicy 13 mm i 0,1 μm (Whatman) unoszącym się na 200 μl pożywki hodowlanej (5 rudymentów / filtr) w płytce mikrodołkowej ze szklanym dnem. Pożywką hodowlaną są: DMEM/F12 + pen-strep zawierający 50 μg/ml transferyny i 150 μg/ml kwasu askorbinowego, jak opisano wcześniej2,8. Wiadomo, że transferyna stymuluje przeżycie i rozgałęziającą się morfogenezę gruczołów ślinowych i innych eksplantatów narządowych9. Wykazano, że dodatek kwasu askorbinowego stymuluje rozgałęzianie się SMG. 10 Wiadomo, że działa jako kofaktor w wielu reakcjach hydroksylacji szlaków metabolicznych (takich jak hydroksylacja proliny podczas tworzenia włókien kolagenowych11), a także stymuluje produkcję fibronektyny i lamininy w eksplantatach innych narządów12.</li>
 <li>Usuń jak najwięcej mediów z filtra po dodaniu każdego podstawowego nabłonka. Zbyt duża ilość mediów na górze filtra może spowodować zatonięcie filtra, podczas gdy mniejsza ilość mediów znacznie ułatwia umieszczanie rudymentów i mezenchymy. Nadmiar podłoża można usunąć za pomocą końcówki do pipet lub za pomocą kleszczy do chwytania podłoża między końcówkami.</li>
 <li>Umieść kawałki mezenchymy pochodzące z trzech do czterech gruczołów na górze i/lub wokół każdego podstawowego nabłonka. Usuń wszelkie dodatkowe podłoża otaczające gruczoły, aby uniknąć przemieszczania się mezenchymy z dala od podstaw. Mezenchyma pochodząca z większej liczby gruczołów nie jest korzystna, ale mniejsza może być szkodliwa dla wzrostu podstaw nabłonka.</li>
 <li>Inkubować rekombinowane pistolety maszynowe w wilgotnym inkubatorze (95% powietrza/5% CO2) w temperaturze 37 °C przez 48 -72 godzin, zgodnie z życzeniem.</li>
 <li>Uzyskaj obrazy jasnego pola i/lub fluorescencyjne żywych gruczołów po 0 godzinach (w razie potrzeby), 2 godziny po rekombinacji, a następnie co 24 godziny na odwróconym, pionowym lub stereoskopowym mikroskopie świetlnym wyposażonym w kamerę cyfrową przy użyciu obiektywu o powiększeniu 4X lub 5X, aby uchwycić cały zrekombinowany gruczoł w jednej klatce widzenia. Obrazy gruczołu ślinowego wykazują najlepszy kontrast przy użyciu ustawienia jasnego pola lub odpowiedniego pierścienia fazowego umieszczonego w połowie ścieżki światła (co nie jest możliwe w pełni zautomatyzowanych mikroskopach). Standardowy kontrast fazowy nie jest konieczny, ponieważ gruczoł jest gruby i tworzy kontrast.</li>
 <li>W pożądanych punktach czasowych rekombinowane SMG można utrwalać przez 20 minut roztworem utrwalającym wykonanym z 2% paraformaldehydu (PFA) w 1X PBS zawierającym 5% (w/v) sacharozy (w celu lepszego zachowania wewnętrznej struktury komórkowej poprzez utrzymanie komórek w stanie izosmotycznym). W przeciwieństwie do 4% PFA, 2% PFA zachowa znaczną ilość sygnału GFP, jeśli utrwalacz zostanie całkowicie usunięty po utrwaleniu. Gruczoły mogą być przechowywane przez okres do 1 tygodnia w 1X PBS w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu wykonania całej immunocytochemii i obrazowania konfokalnego, jak opisano wcześniej3,6,13-15. Idealnie byłoby, gdyby immunocytochemia i obrazowanie były wykonywane wkrótce po utrwaleniu, aby uzyskać obrazy o najlepszej jakości. Gruczoły mogą być również poddawane lizie w buforze RIPA dla SDS-PAGE, a następnie analizie Western blot.</li>
</ol>

<ol><li>Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Salivary gland development.</a> Seminars in cell & developmental biology. 18, 237-244 (2007).</li>
<li>Sakai, T., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic organ culture.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 19, Unit 19(2008).</li>
<li>Patel, V. N., Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+gland+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Salivary gland branching morphogenesis.</a> Differentiation. 74, 349-364 (2006).</li>
<li>Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+and+growth+factors+in+salivary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+oral+biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development.</a> Frontiers of oral biology. 14, 48-77 (2010).</li>
<li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+detection+of+E1-containing+adenovirus+in+saliva+after+the+delivery+of+a+first-generation+adenoviral+vector+to+human+parotid+gland%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Transient detection of E1-containing adenovirus in saliva after the delivery of a first-generation adenoviral vector to human parotid gland.</a> J. Gene Med. 12, 3-10 (2010).</li>
<li>Larsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+PI+3-kinase+and+PIP3+in+submandibular+gland+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Role of PI 3-kinase and PIP3 in submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental biology. 255, 178-191 (2003).</li>
<li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+of+mouse+submandibular+gland+development%3A+FGFR1+regulates+branching+morphogenesis+in+vitro+through+BMP-+and+FGF-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles of mouse submandibular gland development: FGFR1 regulates branching morphogenesis in vitro through BMP- and FGF-dependent mechanisms.</a> Development. 129, 5767-5778 (2002).</li>
<li>Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECM+and+FGF-dependent+assay+of+embryonic+SMG+epithelial+morphogenesis%3A+investigating+growth+factor%2Fmatrix+regulation+of+gene+expression+during+submandibular+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">ECM and FGF-dependent assay of embryonic SMG epithelial morphogenesis: investigating growth factor/matrix regulation of gene expression during submandibular gland development.</a> Methods Mol. Biol. 522, 319-330 (2009).</li>
<li>Partanen, A. M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferrin+and+tooth+morphogenesis%3A+retention+of+transferrin+by+mouse+embryonic+teeth+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Transferrin and tooth morphogenesis: retention of transferrin by mouse embryonic teeth in organ culture.</a> Differentiation. 34, 25-31 (1987).</li>
<li>Naka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+branching+morphogenesis+of+fetal+mouse+submandibular+gland+by+sodium+ascorbate+and+epigallocatechin+gallate%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Modulation of branching morphogenesis of fetal mouse submandibular gland by sodium ascorbate and epigallocatechin gallate.</a> In Vivo. 19, 883-888 (2005).</li>
<li>Bornstein, P., Traub, W. The chemistry and biology of collagen. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBornstein%2C+P+%22The+Proteins%22">The Proteins</a>. Neurath, H., Hill, R. L. 4, 3rd, Academic Press. 412-632 (1979).</li>
<li>Zhou, L., Higginbotham, E. J., Yue, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ascorbic+acid+on+levels+of+fibronectin%2C+laminin+and+collagen+type+1+in+bovine+trabecular+meshwork+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of ascorbic acid on levels of fibronectin, laminin and collagen type 1 in bovine trabecular meshwork in organ culture.</a> Curr. Eye Res. 17, 211-217 (1998).</li>
<li>Daley, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK1-directed+basement+membrane+positioning+coordinates+epithelial+tissue+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ROCK1-directed basement membrane positioning coordinates epithelial tissue polarity.</a> Development. 139, 411-422 (2012).</li>
<li>Daley, W. P., Gulfo, K. M., Sequeira, S. J., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mechanochemical+checkpoint+and+negative+feedback+loop+regulating+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Identification of a mechanochemical checkpoint and negative feedback loop regulating branching morphogenesis.</a> Developmental biology. 336, 169-182 (2009).</li>
<li>Sequeira, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+focal+adhesion+complex+formation+and+salivary+gland+epithelial+cell+organization+by+nanofibrous+PLGA+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The regulation of focal adhesion complex formation and salivary gland epithelial cell organization by nanofibrous PLGA scaffolds.</a> Biomaterials. 33, 3175-3186 (2012).</li>
<li>Nogawa, H., Mizuno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+control+over+elongating+and+branching+morphogenesis+in+salivary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+embryology+and%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal control over elongating and branching morphogenesis in salivary gland development.</a> Journal of embryology and. 66, 209-221 (1981).</li>
<li>Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+requirement+in+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fibronectin requirement in branching morphogenesis.</a> Nature. 423, 876-881 (2003).</li>
<li>Daley, W. P., Kohn, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+focal+adhesion+protein-based+mechanochemical+checkpoint+regulates+cleft+progression+during+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">A focal adhesion protein-based mechanochemical checkpoint regulates cleft progression during branching morphogenesis.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 2069-2083 (2011).</li>
<li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasympathetic+innervation+maintains+epithelial+progenitor+cells+during+salivary+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis.</a> Science. 329, 1645-1647 (2010).</li>
<li>Larsen, M., Wei, C., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+fibronectin+dynamics+during+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell and fibronectin dynamics during branching morphogenesis.</a> J. Cell Sci. 119, 3376-3384 (2006).</li>
<li>Wei, C., Larsen, M., Hoffman, M. P., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+and+branching+morphogenesis+of+primary+salivary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Self-organization and branching morphogenesis of primary salivary epithelial cells.</a> Tissue Eng. 13, 721-735 (2007).</li>
<li>Zheng, C., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+viral+and+mammalian+promoters+for+use+in+gene+delivery+to+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Evaluation of viral and mammalian promoters for use in gene delivery to salivary glands.</a> Mol. Ther. 12, 528-536 (2005).</li>
<li>Hsu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+gene+transfer+to+developing+mouse+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dent.+Res%22%5BJournal%5D)">Viral gene transfer to developing mouse salivary glands.</a> J. Dent. Res. 91, 197-202 (2012).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Technika rekombinacji nabłonkowo-mezenchymalnej ex vivo została po raz pierwszy opublikowana dla podżuchwowych gruczołów ślinowych w 1981 roku,16. W tym protokole rozszerzamy oryginalną metodę, wykorzystując infekcję adenowirusową do manipulowania ekspresją genów komórek nabłonkowych w kontekście zrekombinowanego gruczołu. Pokazujemy, że pewien procent komórek nabłonka jest zakażony adenowirusem, podczas gdy odsetek zakażonych komórek zależy od właściwości promotora wirusa, miana wirusa i czystości w...

<table><tbody><tr><td>DMEM/Ham's F12 Medium bez czerwieni fenolowej</td><td>Life Technologies</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina i Streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15070-163</td><td>10X zapas</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td>Zamrażanie jednorazowych podwielokrotności w temperaturze -20C</td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td>Sigma A2934-100G</td><td>Frakcja V, niska endotoksyna</td></tr><tr><td>Adeno-X-GFP</td><td>BD Biosciences</td><td>8138-1</td><td>Powinien mieć wysokie miano (1x1010 pfu/ml). Wirusy oczyszczone CsCl są w tym teście bardziej skuteczne niż wirusy oczyszczone kolumnowo.</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710</td><td>Rozcieńczony do 2% w PBS z 5% sacharozą (w/v)</td></tr><tr><td>1X sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td>Przygotowany z 10X</td></tr><tr><td>zapasów Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td>bez wapnia, bez magnezu, bez fenolu Czerwona</td></tr><tr><td>transferyna</td><td>Sigma</td><td>T8158</td><td>25 mg/ml roztworu podstawowego w pożywce DMEM/F12. Zamrażać jednorazowe podwielokrotności w temperaturze -20C</td></tr><tr><td>kwasu L-askorbinowego (witamina C)</td><td>Sigma</td><td>A4403</td><td>75 mg/ml roztworu podstawowego w pożywce DMEM/F12. Zamroź jednorazowe podwielokrotności w temperaturze -20C</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 1. Lista odczynników wymaganych do protokołu rekombinacji SMG.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Można również użyć <td>sterylnych naczyń plastikowych o średnicy 10 cm</td><td>Corning</td><td>430167</td> Można <td>również użyć płytek niepoddanych hodowli tkankowej.</td></tr><tr><td>Stereoskopowy mikroskop preparacyjny z podstawą światła przechodzącego</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>Można użyć dowolnego stereoskopowego mikroskopu preparacyjnego, który ma podstawę światła przechodzącego.</td></tr><tr>Można również stosować <td>płytki do hodowli tkankowych 35 mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>Płytki niepoddane hodowli tkankowej.</td></tr><tr><td>Talerze mikrodołkowe o średnicy 50 mm</td><td>MatTek Corporation</td><td>P50-G-1.5-14F</td><td></td></tr><tr><td>Filtry membranowe Nuclepore Track-Etch</td><td>Whatman</td><td>110405</td><td>Średnica 13 mm, wielkość porów 0,1 mm</td></tr><tr><td>Szerokokątny mikroskop fluorescencyjny</td><td>Carl Zeiss, USA</td><td>Axio Observer Z1</td><td>Każdy mikroskop fluorescencyjny (pionowy, odwrócony lub stereoskopowy) może być używany do monitorowania ekspresji GFP przy małym powiększeniu za pomocą dołączonego aparat cyfrowy.</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td>Mikroskopia konfokalna jest niezbędna, aby zobaczyć szczegółowe struktury komórkowe. Można użyć dowolnego mikroskopu konfokalnego.</td></tr><tr><td>Samice myszy w ciąży w czasie, szczep CD-1 lub ICR</td><td>Charles River Labs</td><td></td><td>Embryos są zbierane w dniu 13 (z dniem wykrycia czopa wyznaczonym jako dzień 0).</td></tr><tr><td>Ostrze skalpela #11</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze ze stopu inox, 0,05 mm x 0,02 mm</td><td>Narzędzia do nauki o nasadzach</td><td>11252-20</td><td>Idealny do pobierania gruczołów z zarodków</td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze Dumostar ze stopu dumostar, 0,05 mm x 0,01 mm</td><td>Narzędzia do nauki</td> precyzyjnej <td>11295-20</td><td>Do usunięcia mezenchymy z nabłonka potrzebne są cienkie końcówki. Można również użyć igieł wolframowych.</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 2. Sprzęt używany w protokole rekombinacji SMG.</td></tr></tbody></table>

modyfikacja genetyczna i rekombinacja kultur narządowych gruczołów ślinowych

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Morfogeneza rozgałęzień zachodzi podczas rozwoju wielu organów, a embrionalny gruczoł podżuchwowy myszy (SMG) jest klasycznym modelem do badania rozgałęzionej morfogenezy. W rozwijającym się SMG proces ten obejmuje iteracyjne etapy tworzenia pąków i przewodów nabłonkowych, aby ostatecznie doprowadzić do powstania złożonej rozgałęzionej sieci acini i przewodów, które służą odpowiednio do produkcji i modyfikacji/transportu śliny do jamy ustnej1-3. Błona podstawna związana z nabłonkiem i aspekty przedziału mezenchymalnego, w tym komórki mezenchymiczne, czynniki wzrostu i macierz zewnątrzkomórkowa, wytwarzane przez te komórki, mają kluczowe znaczenie dla mechanizmu rozgałęziania, chociaż sposób koordynowania zdarzeń komórkowych i molekularnych pozostaje słabo poznany 4. Badanie mechanizmów molekularnych kierujących morfogenezą nabłonka pogłębia naszą wiedzę na temat mechanizmów rozwojowych i dostarcza informacji na temat możliwych podejść medycyny regeneracyjnej. Takie badania były utrudnione ze względu na brak skutecznych metod genetycznej manipulacji nabłonka śliny. Obecnie transdukcja adenowirusowa stanowi najskuteczniejszą metodę celowania w komórki nabłonkowe w dorosłych gruczołach in vivo5. Jednak w eksplantatach embrionalnych gęsta mezenchyma i błona podstawna otaczająca komórki nabłonkowe utrudniają wirusowi dostęp do komórek nabłonkowych. Jeśli mezenchyma zostanie usunięta, nabłonek może zostać transfekowany za pomocą adenowirusów, a podstawy nabłonka mogą wznowić rozgałęzioną morfogenezę w obecności Matrigelu lub lamininy-1116,7. Wzrost zaczątków nabłonka bez mezenchymów wymaga również dodatkowej suplementacji rozpuszczalnymi czynnikami wzrostu i nie podsumowuje w pełni morfogenezy rozgałęzień, ponieważ zachodzi ona w nienaruszonych gruczołach8. W tym miejscu opisano technikę, która ułatwia adenowirusową transdukcję komórek nabłonka i hodowlę transfekowanego nabłonka z towarzyszącą mezenchymą. Po mikrodysekcji embrionalnych SMG, usunięciu mezenchymy i wirusowym zakażeniu nabłonka adenowirusem zawierającym GFP, pokazujemy, że nabłonek spontanicznie rekombinuje z niezakażonym mezenchymem, rekapitulując nienaruszoną strukturę gruczołową SMG i rozgałęzioną morfogenezę. Genetycznie zmodyfikowaną populację komórek nabłonkowych można łatwo monitorować za pomocą standardowych metod mikroskopii fluorescencyjnej, jeśli stosuje się fluorescencyjnie znakowane konstrukty adenowirusowe. Opisana tutaj metoda rekombinacji tkanek jest obecnie najskuteczniejszą i najbardziej dostępną metodą transfekcji komórek nabłonkowych z wektorem typu dzikiego lub zmutowanego w złożonym konstrukcie tkankowym 3D, który nie wymaga generowania zwierząt transgenicznych.

Przebieg głównych etapów eksperymentalnych przedstawiono na Rysunku 1. Przykład nienaruszonego SMG, wyizolowanego zalążka nabłonkowego oraz odpowiadającego mu mezenchymu pokazano na Rysunku 2. Obrazy w jasnym polu zrekonstruowanych SMG, które kontynuują morfogenezę rozgałęzioną podczas hodowli ex vivo przez wskazany czas, przedstawiono na Rysunku 3. Zrekonstruowane gruczoły hodowane przez 48 h, wykazujące ekspresję GFP w nabłonku, pokazano na Rysunku 4. ...

Opisano technikę genetycznego manipulowania komórkami nabłonkowymi w całych embrionalnych gruczołach podżuchwowych myszy (SMG) hodowanych ex vivo za pomocą transferu genów wirusowych. Metoda ta wykorzystuje wrodzoną zdolność nabłonka SMG i mezenchymy do spontanicznej rekombinacji po oddzieleniu i zakażeniu zaczątków nabłonka wektorami adenowirusowymi.

Modyfikacja genetyczna i rekombinacja kultur narządowych gruczołów ślinowych

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Ogólnym celem tej procedury jest zmiana ekspresji pożądanego białka w nabłonku myszy, embrionalnej śliny podżuchwowej myszy za pomocą konstruktów adenowirusowych. Osiąga się to poprzez pobranie zarodków w 13 dniu embrionalnym i wypreparowanie gruczołów ślinowych podżuchwowych. Następnie zalążki nabłonka są oddzielane od otaczającej mezenchymy i moczone w kulturze zawierającej wirusa.Pożywki po umyciu rudymentu inkubuje się w pożywce zawierającej matrigel, a my połączyliśmy się z trzema mezenchymami w celu wyhodowania ex vivo zmian w docelowych poziomach białek i jego wpływu na morfogenezę rozgałęzień można przeanalizować za pomocą immunochemii i standardowej mikroskopii lub zachodniej analizy krwi. Technika ta pozwala nam na genetyczną modyfikację tylko jednego przedziału tkankowego w złożonym narządzie i monitorowanie zmian w ponownie złożonym całym narządzie bez tworzenia organizmu transgenicznego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że umożliwia ekspresję białka typu dzikiego lub dominującego ujemnego w przedziale nabłonkowym.Postępując zgodnie ze standardowymi procedurami, najpierw zbierz 13 zarodków do 10-centymetrowych szalek z 25 mililitrami pożywki. Następnie za pomocą kleszczy wyjmij zarodki z worków i przenieś zarodki do 10-centymetrowego naczynia zawierającego 25 mililitrów D-M-E-M-F 12 z paciorkowcami pod stereoskopem z podstawą światła przechodzącego, umieść zarodek na czystym kawałku szkła. Teraz oddziel głowy zarodka ukośnym cięciem tuż pod dolną szczęką lub żuchwą i odizoluj dolne żuchwy za pomocą cięcia poniżej górnej szczęki.Następnie przenieś dolne żuchwy do trzech mililitrów D-M-E-M-F 12 z paciorkowca w 35-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej. Teraz przyłóż jedną żuchwę do szklanej płytki na scenie i ustaw ją tak, aby język dotykał szkła i wskazywał w kierunku pozycji godziny 12. Używając jednej strony dwóch skrzyżowanych kleszczy ruchem nożycowym, wyjmij i wyrzuć dolną trzecią część żuchwy.Następnie obróć żuchwę o 90 stopni w kierunku dominującej ręki i ruchem nożycowym przetnij górną część żuchwy. Teraz oderwij nadmiar tkanki i odsłoń pistolety maszynowe pod tkanką. Z każdej strony będzie po jednym w pobliżu podstawy języka z każdej strony.Użyj jednej pary kleszczy, aby przytrzymać tkankę obok języka, a drugiej pary, aby odciągnąć pistolet maszynowy od języka. W tym momencie większy SMG i przylegający gruczoł podjęzykowy mogą być hodowane w stanie nienaruszonym z otaczającą mezenchymą. W przeciwnym razie przejdź do następnej sekcji.Zacznij od umieszczenia co najmniej pięciu roślin gruczołów ślinowych w szklanym naczyniu z 50-milimetrową mikrostudzienką z 200 mikrolitrami HBSS plus pasta diss. Inkubuj gruczoły przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów ostrożnie wylej roztwór pasty diss, nie naruszając natychmiast gruczołów.Dodaj 200 mikrolitrów pożywki D-M-E-M-F 12 z BSA Aby zneutralizować dispa, użyj pary kleszczy numer pięć z cienkimi końcówkami, aby delikatnie oddzielić rozluźnioną tkankę mezenchymy gruczołem podjęzykowym od pąków nabłonkowych i przewodów większego gruczołu podżuchwowego. Uważaj, aby nabłonek pozostał jak najbardziej nienaruszony. Następnie wybierz wysokiej jakości końcówkę do pipet o pojemności 200 mikrolitrów z gładką krawędzią wstępną na końcówce w pożywce D-M-E-M-F 12 BSA.Następnie delikatnie odpipetować pozbawione mechów podstawy nabłonka do nowego naczynia mikrostudzienkowego o średnicy 50 milimetrów, zawierającego 200 mikrolitrów paciorkowca D-M-E-M-F 12 plus. Na koniec w naczyniu zawierającym kawałki mezenchymy wyrzuć wszelkie tkanki niemezenchymalne. Obejmuje to gruczoły podjęzykowe i wszelkie oderwane pąki gruczołów podżuchwowych.Odłóż na bok pozostałą mezenchymę. Najpierw przygotuj 200 mikrolitrów pożywki infekcyjnej o optymalnym stężeniu miana z oczyszczonego gradientowo preparatu wirusowego z chlorku cezu. Teraz pod mikroskopem preparacyjnym usuń pożywkę z naczynia zawierającego pięć podstaw nabłonka.Następnie szybko dodaj 200 mikrolitrów pożywki infekcyjnej, utrzymując podstawy mokre przez cały czas za pomocą kleszczy. Oddziel podstawy nabłonka daleko od siebie, aby zapobiec ich sklejaniu się i umożliwić im osiądnięcie na dnie naczynia. Następnie pozwól rudymentom inkubować się w pożywce wirusowej przez godzinę w temperaturze pokojowej przy minimalnych zakłóceniach.Sprawdzaj podstawy co 15 minut, aby upewnić się, że nie zbliżyły się do siebie. W razie potrzeby oddziel je kleszczami. Po inkubacji pod mikroskopem preparacyjnym delikatnie usunąć pożywkę wirusową i odpowiednio wyrzucić, uważając, aby nie naruszyć podstaw.Następnie dwukrotnie umyj podstawy 200 mikrolitrami świeżej pożywki. Płukanie to ma kluczowe znaczenie dla usunięcia wirusa, który jest słabo przyczepiony do nabłonka i zapobieżenia infekcji mezenchymy. Po drugim przemyciu pożywką w ilości 200 mikrolitrów pożywki, kontynuując 2% matrigel, ponownie, uważając, aby nie dopuścić do zbrylenia się podstaw.Następnie pozwól rudymentom inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej za pomocą końcówki pipety Prewitt o pojemności 200 mikrolitrów, umieść pięć rudymentów na karbowanym filtrze membranowym, który unosi się na 200 mikrolitrach pożywki hodowlanej na płytce mikrodołkowej ze szklanym dnem. Za pomocą końcówki pipety lub kleszczyków usuń nadmiar mediów z górnej części filtra, aby filtr nie zatonął, a podstawy nabłonka pozostały na swoim miejscu. Następnie umieść wszystkie kawałki meine pochodzące z trzech do czterech gruczołów wokół każdego zaczątka nabłonka, upewniając się, że są w bezpośrednim kontakcie Rekombinacja mezenchymy z trzech do czterech gruczołów z pojedynczym zaczątkiem nabłonka zakażonym wirusem ma kluczowe znaczenie dla wzrostu i rozwoju rekombinowanego podżuchwowego gruczołu ślinowego.Następnie usuń nadmiar pożywki otaczającej gruczoły, aby mezenchyma nie odsunęła się od podstaw. Teraz inkubuj zrekombinowane gruczoły w nawilżonym inkubatorze przez dwa do trzech pełnych dni, stosując opisaną procedurę. Nienaruszone embrionalne pistolety maszynowe wyizolowano, a po leczeniu DYS pace usunięto zaczątek nabłonka z otaczającej mezenchymy.Obrazowanie w jasnym polu ujawniło, że zrekombinowane pistolety maszynowe nadal ulegały rozgałęzionej morfogenezie. W przypadku hodowli ex vivo. We wskazanych czasach połączyliśmy gruczoły, które były hodowane przez 48 godzin po leczeniu za pomocą A GFP.Adenowirus wykazywał ekspresję GFP tylko w nabłonku. Łączyliśmy pistolety maszynowe, które zostały naprawione, poplamione i zobrazowane. Po 72 godzinach użyto kilku markerów.Jądra są barwione przez dpi, marker nabłonkowy eco w tym przypadku na czerwono odgranicza populację komórek nabłonkowych od otaczającej mezenchymy. Komórki nabłonkowe wykazują ekspresję adenowirusowego GFP Wykrycie białka błony podstawnej peranu w cyjanie zlokalizowanym na obrzeżach nabłonka pokazuje, że istnieje przynajmniej częściowa rekonstytucja błony podstawnej w zrekombinowanych gruczołach. Projekcje konfokalne dla DPI w kolorze niebieskim i tubuliny beta trzy w kolorze czerwonym pokazują, że zwoje przywspółczulne w mezenchymie ulegają wyrostkowi URI i unerwiają gruczoły w kulturach rekombinacyjnych.Po obejrzeniu tego filmu będziesz dobrze rozumiał techniki hodowli zarodków podżuchwowych gruczołów ślinowych. Usunięcie mezenchymy z nabłonka, jak również rekombinacja mezenchymy z nabłonkiem zakażonym wirusem mogą okazać się trudnymi krokami. Jednak procedura ta pozwala na zmianę ekspresji białka za pomocą konstruktu wirusowego, który jest nakładany na komórki nabłonka.Tylko infekcja adenowirusowa pozwala nam dodać do nabłonka konstytutywnie aktywne lub dominujące białka ujemne, aby określić, w jaki sposób manipulacja określonym białkiem zmieni wzrost i rozwój zarodkowego gruczołu ślinowego podżuchwowego.

genetic-modification-recombination-salivary-gland-organ

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Modyfikacja genetyczna i rekombinacja kultur narządów gruczołów ślinowych

Opisano zoptymalizowany protokół izolacji komórek macierzystych z gruczołu ślinowego myszy. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne i mechaniczne oraz umożliwia izolację salisfer zawierających komórki o charakterystyce komórek macierzystych.

Izolacja komórek macierzystych gruczołów ślinowych myszy

Ten film przedstawia protokół hodowli salisfer, trójwymiarowych sferoid pochodzących z gruczołów ślinowych. Ślikule mogą być dalej wykorzystywane do oceny wpływu raka głowy i szyi na produkcję śliny z gruczołów ślinowych dotkniętych chorobą pacjentów.

Hodowla salisfer z tkanki gruczołów ślinowych: metoda rozwoju salisfer z komórek nabłonka pochodzących z ludzkich gruczołów ślinowych

Gruczoł łzowy (LG) to rozgałęziony organ, który wytwarza wodne składniki łez, niezbędne do utrzymania wzroku i zdrowia oczu. Tutaj opisujemy mysie techniki preparacji LG i hodowli ex vivo w celu rozszyfrowania szlaków sygnałowych zaangażowanych w rozwój LG.

Manipulowanie mysim gruczołem łzowym

Przedstawiamy szczegółowe podejście do pobierania śliny, w tym mysią tracheostomię i izolację trzech głównych gruczołów ślinowych.

Ocena funkcjonalna śliny myszy za pomocą stymulacji pilokarpiną po frakcjonowanym promieniowaniu

Wykorzystanie trójwymiarowych kultur organotypowych do wizualizacji morfologii i funkcjonalnych markerów gruczołów ślinowych może dostarczyć nowych informacji na temat mechanizmów uszkodzenia tkanek po promieniowaniu. Opisano tutaj protokół cięcia, hodowli, napromieniania, barwienia i obrazowania skrawków gruczołów ślinowych o grubości 50–90 μm przed i po ekspozycji na promieniowanie jonizujące.

Radioterapia kultur organotypowych z modeli gruczołów ślinowych podżuchwowych i przyusznych Kluczowe cechy in vivo

Prezentujemy metodę izolowania i hodowli pierwotnych komórek nabłonkowych pochodzących z ludzkich gruczołów ślinowych. Komórki te wykazują wzorce ekspresji genów zgodne z tym, że pochodzą z nabłonka śliny i mogą być hodowane jako salisfery na matrycach błony podstawnej pochodzących z komórek nowotworowych Engelbreth-Holm-Swarm lub jako monowarstwy na traktowanych szalkach hodowlanych.

Izolacja komórek nabłonka śliny z ludzkich gruczołów ślinowych do wzrostu in vitro w postaci ślikul lub monowarstw

Gruczoły ślinowe zostały zaproponowane jako miejsce docelowe dla terapii genowej, szczególnie w obszarze szczepienia przez transfer genów. Pokazujemy dostarczanie genów w modelu naczelnych innym niż człowiek, wykorzystując infuzję ślinianki przyusznej wstecznej.

Wsteczny wlew gruczołu przyusznego przez przewód Stensena u naczelnych innych niż człowiek w celu wektorowego dostarczania genów

Obrazowanie immunofluorescencyjne jest ograniczone przez możliwość obserwacji złożonych, zależnych od czasu procesów biologicznych w zaledwie jednej migawce w czasie. Badanie to przedstawia podejście do obrazowania na żywo przeprowadzone na precyzyjnie wyciętych wycinkach gruczołu podżuchwowego myszy. Takie podejście pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym interakcji komórka-komórka podczas homeostazy oraz procesów regeneracji i naprawy.

Badanie interakcji komórka-komórka w gruczole ślinowym za pomocą obrazowania żywych komórek ex vivo

Środkowy jelito oraz gruczoły ślinowe komara stanowią kluczowe punkty wejścia i wyjścia dla patogenów przenoszonych przez wektory, takich jak Plasmodium falciparum i wirus dengi. Niniejsze wideo prezentuje techniki sekcji służące do usuwania jelita środkowego i gruczołów ślinowych z komarów Aedes aegypti.

Disekcja jelita środkowego i gruczołów ślinowych komarów Ae. aegypti

Wytwarzanie urządzeń z PDMS oraz modyfikacja powierzchni

Poznaj technikę modyfikacji genetycznej nabłonkowych gruczołów ślinowych myszy przy użyciu wektorów adenowirusowych. Ta metoda umożliwia badanie morfogenezy rozgałęziania bez konieczności tworzenia organizmów transgenicznych.

Modyfikacja genetyczna i rekombinacja kultur narządowych gruczołów ślinowych

Przeglądaj więcej filmów