Name: Kliniczne zastosowanie śpiącej królewny i sztucznych komórek prezentujących antygen do genetycznej modyfikacji limfocytów T z krwi obwodowej i pępowinowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Poznaj metodę modyfikacji genetycznej limfocytów T przy użyciu systemu Sleeping Beauty i sztucznych komórek prezentujących antygen. Technika ta umożliwia produkcję komórek CAR do zastosowań klinicznych w immunoterapii przeciwnowotworowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Carlowi June'owi (University of Pennsylvania) za pomoc w stworzeniu i dostarczeniu klonu APC #4 oraz Dr. Perry'emu Hackettowi (University of Minnesota) za pomoc w tworzeniu systemu SB.
Wsparcie grantowe: Grant Core Center (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); ZARODNIKI (CA136411); Fundacja Alberta J. Warda; Burroughs Wellcome Fund; Fundacja Gillson Longenbaugh; Instytut Profilaktyki i Badań nad Rakiem w Teksasie; Globalna Fundacja Badawcza CLL; Departament Obrony; posiadłość Noelana L. Biblera; Harry T. Mangurian, Jr., Fundusz Immunoterapii Białaczki; Instytut Personalizowanej Terapii Nowotworów; Towarzystwo Białaczki i Chłoniaka; Fundacja Badań nad Chłoniakiem; Fundusz Sieci Instytucji Siostrzanych MDACC; Fundacja Millera; Pan Herb Simons; Pan i Pani Joe H. Scales; Pana Thomasa Scotta; Narodowa Fundacja Badań nad Rakiem; Fundacja Badań nad Rakiem Dziecięcym; Pomoc w produkcji terapii komórkowych (PACT); Fundacja Dziecięca Williama Lawrence'a i Blanche Hughes.

Dzień 0 lub przed
1. Izolacja komórek jednojądrzastych (MNC) od PB i UCB
<ol>
 <li>Rozcieńczyć PB równą objętością, a UCB czterema objętościami PBS-EDTA.</li>
 <li>Powoli nanieść rozcieńczoną krew (25 ml) na Ficoll (12 ml) w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i wirować przy 400 x g przez 30 - 40 minut (bez hamulca).</li>
 <li>Zebrać i przenieść frakcję komórek jednojądrzastych (granicę faz) za pomocą pipety transferowej do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
 <li>Zwiększyć objętość do 50 ml za pomocą PBS-EDTA i odwirować przy 450 x g przez 10 minut.</li>
 <li>Odessać supernatant, delikatnie zawiesić osad(y) komórkowy (osady) w 50 ml kompletnej pożywki hodowlanej (CCM) i odwirować przy 400 x g przez 10 minut.</li>
 <li>Delikatnie ponownie zawiesić i zebrać granulki komórek w CCM i przeprowadzić zliczanie komórek przy użyciu metody wykluczania błękitu trypanowego (wiolometr, program PBMC).</li>
 <li>MNC może być teraz używany do elektroporacji (Nucleofection) lub kriokonserwacji do wykorzystania w przyszłości.</li>
</ol>
2. Przygotowanie limfocytów T do elektroporacji w dniu 0
<ol>
 <li>W przypadku korzystania z kriokonserwowanego MNC należy szybko rozmrozić wystarczającą ilość komórek do elektroporacji na pełną skalę (2 x 108 dodając ~ 20%, aby uwzględnić utratę komórek podczas wirowania i inkubacji trwającej 2 godziny) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Jeśli używasz świeżo odizolowanego MNC, przejdź do kroku 2.3.</li>
 <li>Delikatnie zawiesić i przenieść komórki do probówki wirówkowej o odpowiedniej wielkości zawierającej wstępnie podgrzaną pożywkę hodowlaną RPMI bez fenolu (PF-RPMI) i odwirować przy 200 x g przez 10 minut (bez hamulca), odsysać supernatant.</li>
 <li>Ponownie zawiesić MNC w PF-RPMI, przeprowadzić zliczanie komórek (celometr) i przenieść komórki do naczynia (naczyń) do hodowli komórkowej o odpowiedniej wielkości w stężeniu10-6 komórek/ml.</li>
 <li>Inkubować w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 przez 2 godziny ± 30 minut.</li>
 <li>Przenieść MNC do sterylnej probówki (probówek) wirówkowej, wirować z prędkością 200 x g przez 5 minut (bez hamulców), odessać supernatant i delikatnie ponownie zawiesić i połączyć osad(y) komórek w PF-RPMI.</li>
 <li>Wykonaj liczenie komórek (Cellometer) i oblicz wymaganą objętość zawiesiny komórek (2 x 108 MNC).</li>
 <li>Przenieść obliczoną objętość do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wirować z prędkością 200 x g przez 10 minut (bez hamulca).</li>
 <li>Odessać supernatant tak, aby nie pozostały żadne resztki pożywki i delikatnie zawiesić ponownie, stukając w bok probówki.</li>
</ol>
3. Elektroporacja (nukleofekcja) MNC (proces na pełną skalę przy użyciu 10 kuwet) w dniu 0
<ol>
 <li>Wstępnie inkubować sterylną 12-dołkową płytkę z 10 dołkami zawierającymi 4 ml ciepłego PF-RPMI w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 .</li>
 <li>Przygotuj i wstępnie podgrzej zestaw ludzkich komórek T Lonza Nucleofector Solution (odtworzony zgodnie z instrukcjami producenta, <a href="http://www.lonza.com" target="_blank">www.lonza.com</a>) do temperatury otoczenia w komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC).</li>
 <li>Przygotować roztwór Nucleofector / główną mieszankę DNA, dodając 100 μl uzupełnionego roztworu Nucleofectora, 15 μg transpozonu (superskręcony plazmid DNA oznaczony jako CD19RCD28/pSBSO) i 5 μg transpozazy (superskręcony plazmid DNA oznaczony jako pCMV-SB11) na reakcję/kuwetę.</li>
 <li>Rozproszyć osad komórkowy (od kroku 2.8), delikatnie stukając w bok probówki wirówkowej i ponownie zawiesić w roztworze Nucleofection/główna mieszanina DNA (końcowe stężenie komórek: 2 x 107 komórek/100 μl).</li>
 <li>Ostrożnie przenieś 100 μl zawiesiny komórek (z kroku 3.4) do każdej z dziesięciu (10) kuwet Lonza Nucleofection, uważając, aby uniknąć pęcherzyków.</li>
 <li>Postukaj raz w kuwetę i wykonaj elektroporację za pomocą programu U-014 (dla niestymulowanych limfocytów T).</li>
 <li>Przenieść kuwety i płytkę 12-dołkową (krok 3.1) do BSC.</li>
 <li>Pobrać elektroporowane komórki z każdej kuwety za pomocą pipety transferowej Amaxa z cienką końcówką, dodając ~500 μl wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej z odpowiedniego dołka (12-dołkowa płytka przygotowana w kroku 3.1) i umieścić płytkę z powrotem w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 na 2 godziny ± 30 minut.</li>
 <li>Po 2-godzinnej inkubacji zbierz i przenieś komórki ze wszystkich studzienek do sterylnej probówki wirówkowej.</li>
 <li>Przemywać komórki przez odwirowanie przy 140 x g przez 8 minut, w temperaturze otoczenia, bez hamulca, zassać i wyrzucić supernatant tak, aby żadne pozostałości pożywki nie pokryły osadu komórkowego.</li>
 <li>Rozproszyć osad komórkowy, delikatnie stukając w bok probówki wirówkowej i delikatnie ponownie zawiesić w CCM, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.</li>
 <li>Wykonaj zliczanie komórek i dostosuj stężenie komórek do 106 komórek/ml w CCM.</li>
 <li>Przenieść zawiesinę komórkową do kolby (kolb) do hodowli komórkowych i umieścić na noc w inkubatorze.</li>
 <li>Kroki procesu od 2.1 do 3.8 powtórzono dla kontroli: komórki transfekowane EGFP (5 x 106 komórek/kuweta z 5 μg kontrolnym plazmidem superskręconym EGFP, pmaxGFP).</li>
</ol>
Dzień 1z 1 i kolejne cykle stymulacji
4. Analiza ekspresji CAR za pomocą cytometrii przepływowej w dniu 1
<ol>
 <li>Zbierz elektroporowane ogniwa i przeprowadź liczenie komórek za pomocą metody wykluczania błękitu trypanowego (hemocytometr).</li>
 <li>Komórki barwione (1 do 2 x 106) przeciwciałem specyficznym dla CD3, CD4, CD8 i ludzkiej IgG Fcγ (jako pomiar ekspresji CAR).</li>
 <li>Pozyskaj komórki w FACS Calibur i przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania FCS Express, aby obliczyć ekspresję CAR.
 <ol>
 <li>Oblicz komórki CAR+ w hodowli według wzoru: 
 (Liczba komórek zdolnych do życia) x (% komórek CAR+) = Liczba komórek CAR+</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
5. Przygotowanie aAPC (klon #4) w dniu 1. aAPC (klon #4) pochodziły z komórek K562 (linia rodzicielska uzyskana z kolekcji kultur typu amerykańskiego) w celu koekspresji pożądanej cząsteczki kostymulującej limfocyty T
<ol>
 <li>Rozmrozić podwielokrotność zamrożonego napromieniowanego aAPC o stężeniu 100 Gy w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
 <li>Komórki przemywać się dwukrotnie przez odwirowanie w stężeniu 400 x g, przez 10 minut w CCM i zliczać za pomocą celometru (wykluczenie błękitu trypanowego).</li>
 <li>Obliczać liczbę żywotnych aAPC wymaganych do stymulacji: 
 (Liczba komórek CAR+) x 2 = wymagana liczba napromieniowanych aAPC</li>
</ol>
6. Stymulacja limfocytów T CAR+ za pośrednictwem APC w dniu 1 Początek pierwszego i kolejnych cykli stymulacji
<ol>
 <li>Wymieszaj elektroporowane ogniwa (wykazujące ekspresję CAR) i napromieniowany γ aAPC (klon #4) w sterylnym pojemniku w stosunku 1:2 (ogniwo CAR+: żywotne aAPC) w CCM.
 <ol>
 <li>Należy zauważyć, że współczynnik aAPC jest dostosowywany do ekspresji CAR na podstawie cytometrii przepływowej następnego dnia po elektroporacji.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Dodać IL-21 (30 ng/ml) do zawiesiny komórek.</li>
 <li>Podwielokrotność porcji umieścić w kolbie(-ach) T-75 cm2 i/lub workach Vue Life Culture o stężeniu 10-6 komórek/ml i ponownie umieścić w inkubatorze.</li>
</ol>
dni 3, 5
7. Kontynuacja hodowli limfocytów T CAR+
<ol>
 <li>Wykonaj zmianę półpożywki, uzupełnij IL-21 i utrzymuj limfocyty T w stężeniu10-6 komórek/ml.</li>
</ol>
Dzień 7
8. Koniec pierwszego cyklu stymulacji za pośrednictwem APC
<ol>
 <li>Zbierz komórki, policz i wybarwij pod kątem CD3, CD4, CD8 i Fcγ (CAR) i przejdź do kroku 10.1.</li>
</ol>
9. Wyczerpanie komórek CD56+ (zwykle między 7 a 14 dniem po elektroporacji)
<ol>
 <li>Wykonaj zubożenie CD56 za pomocą kulek paramagnetycznych, jeśli limfocytyneg CD56 + CD3 ≥ 10%.</li>
</ol>
Cykle stymulacji #2, #3, & #4 odpowiadające dniom 8 → 14, dniom 15 → 21 oraz dniom 22 → 28
10. Rekurencyjne dodawanie aAPC do propagacji limfocytów T do klinicznie wystarczającej liczby
<ol>
 <li>Powtórz proces stymulacji (4 razy) zgodnie z opisem w krokach 4.3-8.1.</li>
 <li>Dodaj IL-2 (50U/ml) do kultur, zaczynając w dniach 7, 14 i 21, a następnie przy każdej zmianie pożywki (trzy razy w tygodniu, według harmonogramu poniedziałek-środa-piątek).</li>
 <li>W razie potrzeby należy dokonać kriokonserwacji (archiwum) nadmiaru limfocytów T.
 <ol>
 <li>Limfocyty T zamrożone przy użyciu zamrażarki o kontrolowanej szybkości.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
Dzień 28
11. Koniec ostatniego cyklu stymulacji za pośrednictwem aAPC: Pobieranie limfocytów T
<ol>
 <li>Kriokonserwowane limfocyty T do testowania uwalniania i infuzji.</li>
</ol>

<ol><li>Jena, B., Dotti, G., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+T-cell+specificity+by+introducing+a+tumor-specific+chimeric+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor.</a> Blood. 116, 1035-1044 (2010).</li>
<li>Ertl, H. C., Zaia, J., Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+the+clinical+application+of+chimeric+antigen+receptor+T+cells%3A+observations+from+a+recombinant+DNA+Advisory+Committee+Symposium+held%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Considerations for the clinical application of chimeric antigen receptor T cells: observations from a recombinant DNA Advisory Committee Symposium held.</a> Cancer Res. 71, 3175-3181 (2010).</li>
<li>Kohn, D. B., Dotti, G., Brentjens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CARs+on+track+in+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">CARs on track in the clinic.</a> Mol. Ther. 19, 432-438 (2011).</li>
<li>Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sleeping+Beauty+transposon+system%3A+a+non-viral+vector+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy.</a> Hum. Mol Genet. 20, R14-R20 (2011).</li>
<li>Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon+and+transposase+system+for+human+application%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">A transposon and transposase system for human application.</a> Mol. Ther. 18, 674-683 (2010).</li>
<li>Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+Sleeping+Beauty+transposition+into+cellular+therapies%3A+victories+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges.</a> Bioessays. 32, 756-767 (2010).</li>
<li>Kebriaei, P., Huls, H., Bipulendu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusing+CD19-directed+T+cells+to+augment+disease+control+in+patients+undergoing+autologous+hematopoietic+stem-cell+transplantation+for+advanced+B-lymphoid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Infusing CD19-directed T cells to augment disease control in patients undergoing autologous hematopoietic stem-cell transplantation for advanced B-lymphoid malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 23 (5), 444-450 (2012).</li>
<li>Williams, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+beauty+vector+system+moves+toward+human+trials+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Sleeping beauty vector system moves toward human trials in the United States.</a> Mol. Ther. 16, 1515-1516 (2008).</li>
<li>Geurts, A. M., Hackett, C. S., Bell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+prediction+of+insertion-site+preferences+of+transposons+into+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structure-based prediction of insertion-site preferences of transposons into chromosomes.</a> Nucleic Acids Res. 34, 2803-2811 (2006).</li>
<li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+reconstruction+of+Sleeping+Beauty%2C+a+Tc1-like+transposon+from+fish%2C+and+its+transposition+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells.</a> Cell. 91, 501-510 (1997).</li>
<li>Izsvak, Z., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+beauty+transposition%3A+biology+and+applications+for+molecular+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Sleeping beauty transposition: biology and applications for molecular therapy.</a> Mol Ther. 9, 147-156 (2004).</li>
<li>Manuri, P. V., Wilson, M. H., Maiti, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposon%2Ftransposase+system+to+generate+CD19-specific+T+cells+for+the+treatment+of+B-lineage+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for the treatment of B-lineage malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 21, 427-437 (2010).</li>
<li>Singh, H., Figliola, M. J., Dawson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+CD19-specific+T+cells+with+IL-21+signaling+can+improve+adoptive+immunotherapy+of+B-lineage+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Reprogramming CD19-specific T cells with IL-21 signaling can improve adoptive immunotherapy of B-lineage malignancies.</a> Cancer Res. 71, 3516-3527 (2011).</li>
<li>Kowolik, C. M., Topp, M. S., Gonzalez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+costimulation+provided+through+a+CD19-specific+chimeric+antigen+receptor+enhances+in+vivo+persistence+and+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells.</a> Cancer Res. 66, 10995-11004 (2006).</li>
<li>Jin, Z., Maiti, S., Huls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+SB100X+improves+the+genetic+modification+of+T+cells+to+express+a+chimeric+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor.</a> Gene Ther. 18, 849-856 (2011).</li>
<li>Davies, J. K., Singh, H., Huls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+CD19+redirection+and+alloanergization+to+generate+tumor-specific+human+T+cells+for+allogeneic+cell+therapy+of+B-cell+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies.</a> Cancer Res. 70, 3915-3924 (2010).</li>
<li>Kebriaei, P., Kelly, S. S., Manuri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CARs%3A+driving+T-cell+specificity+to+enhance+anti-tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci.+%28Schol.+Ed%29%22%5BJournal%5D)">CARs: driving T-cell specificity to enhance anti-tumor immunity.</a> Front. Biosci. (Schol. Ed). 4, 520-531 (2012).</li>
<li>Singh, H., Manuri, P. R., Olivares, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+specificity+of+T-cell+populations+for+CD19+using+the+Sleeping+Beauty+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system.</a> Cancer Res. 68, 2961-2971 (2008).</li>
<li>Nakazawa, Y., Huye, L. E., Salsman, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac-mediated+cancer+immunotherapy+using+EBV-specific+cytotoxic+T-cells+expressing+HER2-specific+chimeric+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">PiggyBac-mediated cancer immunotherapy using EBV-specific cytotoxic T-cells expressing HER2-specific chimeric antigen receptor.</a> Mol. Ther. 19, 2133-2143 (2011).</li>
<li>Huang, G., Yu, L., Cooper, L. J., Hollomon, M., Huls, H., Kleinerman, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+T+cells+targeting+interleukin-11+receptor+alpha-chain+kill+human+osteosarcoma+cells+and+induce+the+regression+of+established+osteosarcoma+lung+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Genetically modified T cells targeting interleukin-11 receptor alpha-chain kill human osteosarcoma cells and induce the regression of established osteosarcoma lung metastases.</a> Cancer Res. 72, 271-281 (2012).</li>
<li>Huang, X., Guo, H., Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+Beauty+transposon-mediated+engineering+of+human+primary+T+cells+for+therapy+of+CD19%2B+lymphoid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Sleeping Beauty transposon-mediated engineering of human primary T cells for therapy of CD19+ lymphoid malignancies.</a> Mol. Ther. 16, 580-589 (2008).</li>
<li>Huang, X., Wilber, A., McIvor, R. S., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transposons+for+modification+of+human+primary+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA transposons for modification of human primary T lymphocytes.</a> Methods Mol. Biol. 506, 115-126 (2009).</li>
<li>Hackett, P. B. Jr, Aronovich, E. L., Hunter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+Sleeping+Beauty+transposon-mediated+gene+transfer+in+preclinical+animal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of Sleeping Beauty transposon-mediated gene transfer in preclinical animal studies.</a> Curr. Gene Ther. 11, 341-349 (2011).</li>
<li>Suhoski, M. M., Golovina, T. N., Aqui, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+artificial+antigen-presenting+cells+to+express+a+diverse+array+of+co-stimulatory+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules.</a> Mol. Ther. 15, 981-988 (2007).</li>
<li>Numbenjapon, T., Serrano, L. M., Singh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+artificial+antigen-presenting+cell+to+propagate+cytolytic+CD19-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Characterization of an artificial antigen-presenting cell to propagate cytolytic CD19-specific T cells.</a> Leukemia. 20, 1889-1892 (2006).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Transpozon i systemy transpozazy, takie jak piggyBac12,19 i SB18,20-22, są niewirusowymi podejściami do terapii genowej, które stanowią alternatywę dla transdukcji za pośrednictwem wirusa limfocytów T CAR+ klasy klinicznej. SB został wybrany jako system transferu genów na podstawie jego potencjału w terapii genowej u ludzi1,6,23. Opracowaliśmy podwójne technologie transpozycji SB (w celu wprowadzenia CAR) i rekurencyjnego dodawania napromieniowanego γ aAPC (w celu odzyskania genetycznie zmodyfikowanych limfocytów T stabilnie eksprymujących CAR), aby służyły jako technologie platformowe w produkcji limfocytów T specyficznych dla TAA zgodnie z cGMP dla badań fazy I / II (Figura 4). Po 28 dniach (cztery 7-dniowe cykle stymulacji) wspólnej hodowli na napromieniowanym γ aAPC, zazwyczaj jesteśmy w stanie wygenerować co najmniej ~10 10 genetycznie zmodyfikowanych limfocytów T nadających się do zastosowań u ludzi. W razie potrzeby można podjąć dodatkowe cykle stymulacji w celu wygenerowania większej liczby genetycznie zmodyfikowanych limfocytów T. Ponadto, jeśli potrzeba mniej limfocytów T CAR+ , podejście do elektroporacji i propagacji można ograniczyć, stosując mniej kuwet i przenosząc tylko podzbiór numerycznie rozszerzonych limfocytów T do kolejnych rund proliferacji na aAPC na początku każdego cyklu stymulacji. Większość elektroporowanych i rozmnożonych limfocytów T pobranych do infuzji stabilnie wyraża CAR. Wzrost limfocytów T CD4 + i CD8 + wyrażających nasz CAR 2. generacji obejmuje komórki o fenotypie pamięciowym / naiwnym i wykazuje trzy cechy charakterystyczne dla przekierowanej specyficzności. Po pierwsze, genetycznie zmodyfikowane limfocyty T specyficznie lizują cele CD19 + , po drugie, wytwarzają IFN-γ w odpowiedzi na komórki stymulujące CD19 + , a po trzecie, proliferują w odpowiedzi na komórki karmiące CD19 + , a wszystko to w sposób zależny od CAR13,18. Nasze podejście do integracji transgenu CAR poprzez elektrotransfer niewirusowych plazmidów DNA z systemu SB można zastosować w spoczynkowych pierwotnych limfocytach T pochodzących z PB i UCB. My i inni mamy genetycznie zmodyfikowane komórki K562, aby służyły jako aAPC do efektywnej propagacji klinicznie wystarczającej liczby limfocytów T do infuzji24,25. Środowisko aAPC i hodowli tkankowej (np. dodanie IL-21) zostały zmodyfikowane w celu wytworzenia limfocytów T CD19 specyficznych dla pacjenta i dawcy do infuzji po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych (Tabela 1)13,18. Możemy wyprodukować limfocyty T CAR + z PB po prostu uzyskane przez nakłucie żyły, co pozwala uniknąć kosztów, dyskomfortu i niedogodności związanych z uzyskaniem MNC z PB przez aferezę. Zdolność do pozyskiwania dużej liczby limfocytów T CAR+ z niewielkiej liczby MNC jest szczególnie atrakcyjna do podawania limfocytów T po allogenicznym przeszczepie UCB. Niewielki rozmiar i anonimowość dawcy noworodka wykluczają ponowny dostęp do tego osobnika w późniejszym czasie, a tylko ograniczona liczba pobranych MNC jest dostępna jako materiał wyjściowy do produkcji limfocytów T, aby uniknąć ingerencji w hematopoezę. Obecnie trwają dalsze postępy w procesie produkcyjnym, w tym wysokowydajne urządzenie do elektroporacji w połączeniu z całkowicie zamkniętym bioreaktorem WAVE, aby zminimalizować obsługę. Podsumowując, SB i aAPC są atrakcyjnymi platformami do generowania limfocytów T CAR+ specyficznych dla CD19, które można przystosować do generowania dużej liczby genetycznie zmodyfikowanych limfocytów T, które mogą rozpoznawać alternatywne TAA na powierzchni komórki zgodnie z cGMP.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reodczynniki</td></tr><tr><td>DNA plazmid eksprymujący GFP (pmaxGFP)</td><td>Lonza</td><td>VPA-1002 (zestaw)</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS PBS-EDTA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>70026</td><td></td></tr><tr><td>HyQ RPMI-1640</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30096.01</td><td></td></tr><tr><td>Bez fenolu RPMI-1640</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30605.01</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3007003HI</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Gibco</td><td>3505-061</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare Biosciences</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka IL-21</td><td>PeproTech</td><td>AF-200-21</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka IL-2 (Proleukina)</td><td>Novartis</td><td>NDC 65483-116-07</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw ludzkich limfocytów T (roztwór Nucleofectora)</td><td>Lonza</td><td>VPA-1002</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik CliniMACS CD56</td><td>Miltenyi</td><td>70206</td><td></td></tr><tr><td>FITC-sprzężony z mysim mAb specyficznym dla ludzkiego CD3</td><td>BD Biosciences</td><td>349201</td><td></td></tr><tr><td>sprzężony z mysim mAb specyficznym dla ludzkiego CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>340443</td><td></td></tr><tr><td>PerCPCy5.5 skoniugowany z mysim mAb specyficznym dla ludzkiego CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>341051</td><td></td></tr><tr><td>PE sprzężony z F(ab')2 fragmentem koziego przeciwciała specyficznego dla ludzkiego Fc&#947;</td><td>Invitrogen</td><td>H10104</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><mocne>Jednorazowe</mocna></td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>T-75 cm2</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Worki do hodowli</td><td>Vue Life</td><td>290C; 750C</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówka wirówkowa</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Amaxa Nuceleofector II</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td></td></tr><tr><td>Celometr</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Wirówka Vision</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT</td><td>Sorvall</td><td>75004377</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Calibur</td><td>BD Biosciences</td><td>342975</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka z kontrolowaną szybkością</td><td>Strugarka</td><td>Kryo 750</td><td></td></tr><tr><td>Irradiator</td><td>CIS bio International</td><td>IBL-437 C#09433</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> <table border="1"> <tbody> <tr> <td colspan="4">Ekspresja cząsteczek (endogennych i wprowadzonych)</td> </tr> <tr> <td>Cell Line</td> <td> <silny>Nazwa zwyczajowa</td> <td>Typ komórki</td> <td>Molecules Expressed</td> </tr> <tr> <td>CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19</td> <td>Klon 4</td> <td>K562</td> <td>CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP ulegające jednoczesnej ekspresji z IL-15 związanym z błoną IL-15</td> </tr> </tbody> </table> Complete Culture Medium (CCM) (przechowywane w temperaturze 4 & deg; C do 30 dni) HyQ RPMI-1640/Bez fenolu RPMI-1640 10% FBS 1% GlutaMAX Flow Cytometry Buffer (przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C do 30 dni) PBS 2% FBS 0,1% Azek sodu</td></tr></tbody></table>

kliniczne zastosowanie śpiącej królewny i sztucznych komórek prezentujących antygen do genetycznej modyfikacji limfocytów t z krwi obwodowej i pępowinowej

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Siła działania klinicznych limfocytów T może być zwiększona poprzez połączenie terapii genowej z immunoterapią w celu opracowania produktu biologicznego, który ma potencjał do lepszego (i) rozpoznawania antygenów związanych z nowotworem (TAA), (ii) trwałości po infuzji, (iii) potencjału migracji do miejsc nowotworowych oraz (iv) zdolności do recyklingu funkcji efektorowych w mikrośrodowisku guza. Większość podejść do manipulacji genetycznej limfocytów T zmodyfikowanych do stosowania u ludzi wykorzystuje retrowirusa i lentiwirusa do stabilnej ekspresji CAR1-3. Takie podejście, choć zgodne z obecną dobrą praktyką wytwarzania (GMP), może być kosztowne, ponieważ opiera się na wytwarzaniu i uwalnianiu rekombinowanego wirusa klasy klinicznej z ograniczonej liczby zakładów produkcyjnych. Elektrotransfer plazmidów niewirusowych jest atrakcyjną alternatywą dla transdukcji, ponieważ gatunki DNA mogą być wytwarzane do klasy klinicznej przy około 1/10 kosztu rekombinowanego wirusa klasy GMP. Aby poprawić efektywność integracji, dostosowaliśmy transpozon Śpiącej Królewny (SB) i transpozazę do stosowania u ludzi4-8. Nasz system SB wykorzystuje dwa plazmidy DNA, które składają się z transpozonu kodującego dla interesującego nas genu (np. transgenu CAR specyficznego dla CD19drugiej generacji, oznaczonego CD19RCD28) i transpozazy (np. SB11), która wprowadza transgen do powtórzeń dinukleotydu TA9-11. Aby wygenerować klinicznie wystarczającą liczbę genetycznie zmodyfikowanych limfocytów T, używamy sztucznych komórek prezentujących antygen pochodzących z K562 (aAPC) (klon #4) zmodyfikowanych do ekspresji TAA (np. CD19), a także cząsteczek kostymulujących limfocyty T CD86, CD137L, związanej z błoną wersji interleukiny (IL)-15 (peptyd połączony ze zmodyfikowanym regionem IgG4 Fc) i CD64 (receptor Fc-γ 1) do ładowania przeciwciał monoklonalnych (mAb)12. W tym raporcie pokazujemy procedury, które można podjąć zgodnie z cGMP w celu wygenerowania limfocytów T CAR+ specyficznych dla CD19 odpowiednich do stosowania u ludzi. Osiągnięto to poprzez synchroniczny elektrotransfer dwóch plazmidów DNA, transpozonu SB (CD19RCD28) i transpozazy SB (SB11), a następnie pobranie stabilnych integrantów przez codzienne 7-dniowe dodatki (cykl stymulacji) napromieniowanego γ aAPC (klon #4) w obecności rozpuszczalnej rekombinowanej ludzkiej IL-2 i IL-2113. Zazwyczaj podejmowane są 4 cykle (28 dni ciągłej hodowli) w celu wygenerowania klinicznie atrakcyjnej liczby limfocytów T, które stabilnie wyrażają CAR. Ta metodologia wytwarzania limfocytów T specyficznych dla CD19 klasy klinicznej może być stosowana do limfocytów T pochodzących z krwi obwodowej (PB) lub krwi pępowinowej (UCB). Co więcej, podejście to można wykorzystać do generowania limfocytów T do różnych typów nowotworów poprzez sparowanie specyficzności wprowadzonego CAR z ekspresją TAA, rozpoznawanego przez CAR, na aAPC.

Raportujemy, że elektrotransfer plazmidów DNA oraz propagacja limfocytów T na sztucznych komórkach prezentujących antygen (aAPC) naświetlanych promieniami γ mogą być wykorzystane do generowania klinicznie istotnej liczby limfocytów T pochodzących z krwi obwodowej (PB) i krwi pępowinowej (UCB) do zastosowań u ludzi. Te genetycznie zmodyfikowane limfocyty T wykazują ekspresję wprowadzonego CAR, który rozpoznaje antygen związany z nowotworem (TAA) CD19, niezależnie od głównego kompleksu zgodności tkankowej. Pochodne od SB plazmidy DNA służące do ekspresji (i) transpozonu, 2nd generacja CAR (CD19RCD28), która sygnalizuje poprzez CD28 i CD3-ε14oraz (ii) transpozazę SB1115zostały wcześniej opisane13,16,17Plazmidy wykorzystane w niniejszym badaniu zostały dostarczone komercyjnie przez Waisman Clinical Biomanufacturing Facility (Madison, WI). aAPC (klon nr 4), pochodzące z komórek K562 (linia rodzicielska pozyskana z American Type Culture Collection), koekspresują pożądane cząsteczki kostymulujące limfocytów T (każda wprowadzona cząsteczka w poziomie 390% na powierzchni komórkowej aAPC), zgodnie z wcześniejszym opisem12W niniejszym opracowaniu wykazujemy, że CD19-specyficzne limfocyty T mogą zostać wygenerowane z mononuklearnych komórek krwi (MNC) pochodzących z krwi obwodowej (PB) lub krwi pępowinowej (UCB), wykorzystując transpozycję SB do wprowadzenia CAR, a następnie dodając aAPC w celu numerycznej ekspansji limfocytów T w sposób zależny od CAR (Ryciny 1, 4)13,18Dziesięć kuwet (2x107 MNC/kuwety) są poddawane elektroporacji dla każdego biorcy przy użyciu 15 μg plazmidu DNA (CD19RCD28/pSBSO) kodującego transpozon (CAR) oraz 5 μg plazmidu DNA (pCMV-SB11) kodującego transpozazę (SB11). Liczbę kuwet można zmniejszyć w przypadku ograniczonej dostępności MNC lub w celu dostosowania skali do pracy laboratoryjnej. Dzień elektroporacji definiuje się jako „Dzień 0” pierwszego cyklu stymulacji. Jako kontrole dla cytometrii przepływowej i warunków hodowli, autologiczne limfocyty T poddawane są elektroporacji pozornej (bez plazmidu DNA) i namnażane numerycznie na γ-naświetlonych aAPC (klon #4), które uprzednio załadowano przeciwciałem OKT3 w celu sieciowania CD3 i podtrzymania proliferacji limfocytów T. Rutynowo oceniamy wydajność elektrotransferu oraz żywotność limfocytów T dzień po elektroporacji (Rycina 2B). Ekspresja EGFP z kontrolnego plazmidu DNA (oznaczonego jako pmaxGFP) oraz CAR w tym początkowym punkcie czasowym odzwierciedla ekspresję białek z plazmidu zintegrowanego i episomalnego. Zazwyczaj dzień po elektroporacji mierzymy ekspresję EGFP na poziomie ~60% oraz ekspresję CAR na poziomie ~40% (Rysunek 2A) przy żywotności limfocytów T na poziomie 40-50%. Rekurencyjne dodawanie naświetlanych promieniami γ aAPC w obecności rozpuszczalnej rekombinowanej ludzkiej IL-2 i IL-21 pozwala na odzyskanie limfocytów T stabilnie ekspresjonujących CAR (CD19RCD28). CD3negatywnyCD56+ Komórki NK są usuwane z hodowli przy użyciu paramagnetycznych kulek specyficznych dla CD56, jeśli ich odsetek wynosi ≥10%, a w szczególności wtedy, gdy odsetek CAR ekspresyjne na komórkach T jest niski. Deplecja ta zapobiega szybkiemu przerostowi komórek NK, który utrudnia zdolność aAPC do podtrzymania proliferacji CAR.+ limfocyty T. Okazyjnie, eliminacja komórek NK z CAR+ izolację limfocytów T przeprowadza się podczas dwóch ostatnich cykli stymulacji, jednak powoduje to utratę pożądanych komórek ze względu na koekspresję CD56 na niektórych CAR+ Limfocyty T. Limfocyty T były hodowane w funkcjonalnie zamkniętym systemie z wykorzystaniem worków hodowlanych Vue Life po 14. dniu. Podzbiór genetycznie zmodyfikowanych i propagowanych limfocytów T jest zazwyczaj krio konserwowany w 14. lub 21. dniu (koniec 2. lub 3. cyklu stymulacji) kokultury na aAPC, aby służyć jako archiwizowane materiały do przyszłych analiz oraz w celu rozmrożenia w przypadku wystąpienia nieprzewidzianych problemów podczas procesu wytwarzania. Limfocyty T są zazwyczaj zbierane w 28. dniu hodowli lub w okolicy tego terminu (Rysunek 3), które rutynowo wykazują ekspresję &gt;90% CAR i są &gt;80% żywotności (Rysunek 2C, D). Wykazaliśmy wcześniej, że po czterech tygodniach kokultury na aAPC średni stopień ekspansji limfocytów T CD3+ wynosi 19 800 ± 11 313 w przypadku CAR+ ekspresja wynosząca 90%±7,5 13Limfocyty T te są kriokonserwowane i poddawane badaniom w trakcie procesu oraz badaniom zwolnieniowym, które dostarczają informacji o bezpieczeństwie i potencjale terapeutycznym wytworzonego produktu. Badania zwolnieniowe są przeprowadzane zgodnie z poprawkami dotyczącymi ulepszenia laboratoriów klinicznych (CLIA) w celu wygenerowania certyfikatu analizy przed infuzją do biorców w ramach badań klinicznych.
<img alt="Proces produkcji komórek CAR T, schemat blokowy; aktywacja transpozonem CD3/CD28, dodawanie cytokin." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Kroki opisujące proces elektroporacji i propagacji komórek CAR+ T z PB i UCB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig1large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.
<img alt="Schemat analizy cytometrii przepływowej; wykresy GFP, FSC-H; wykres danych ekspresji CAR, wyniki dla CD3, CD4, CD8." fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Charakterystyka genetycznie zmodyfikowanych limfocytów T z krwi obwodowej (PB). (A) Ekspresja EGFP w dniu 0 pierwszego cyklu stymulacji w celu oceny wydajności transferu genów. Ekspresja swoistego dla CD19 CAR (CD19RCD28) oceniana metodą cytometrii przepływowej w limfocytach T CD3+, CD8+ i CD4+ (B) około 24 h po elektroporacji oraz (C) 28 dni po kokulturze z aAPC. Podobną ekspresję CAR zaobserwowano w limfocytach T pochodzących z krwi pępowinowej (UCB). (D) Kinetyka ekspresji CAR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig2large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.
<img alt="Wykres wzrostu komórek; wnioskowana liczba komórek w funkcji dni współhodowli; analiza stymulacji CD3, CAR." fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Propagacja komórek CAR+ T pochodzących z PB. Szybkość ekspansji liczbowej komórek CD3+ i CAR+ T pochodzących z PB poprzez powtarzającą się współhodowlę na aAPC naświetlonych promieniami γ w obecności rekombinowanych ludzkich rozpuszczalnych IL-2 i IL-21. Strzałki skierowane w górę wskazują momenty dodawania naświetlonych promieniami γ aAPC, które wyznaczają początek każdego cyklu stymulacji. Komórki CAR+ T pochodzące z UCB wykazują podobną szybkość ekspansji liczbowej.
<img alt="Schemat produkcji komórek CAR T: elektroporacja, ko-kultura z K562, krio konserwacja, proces infuzji." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
 Rycina 4. Schemat procesu wytwarzania z wykorzystaniem systemów SB i aAPC do modyfikacji genetycznej i propagacji komórek CAR+ T pochodzących z PB i UCB. Komórki CAR+ T specyficzne dla CD19 zostały wygenerowane poprzez elektrotransfer superzwiniętych plazmidów DNA pochodzących z SB i późniejszą ko-kulturę na aAPC pochodzących z K562 (klon #4) w obecności rekombinowanych ludzkich rozpuszczalnych IL-2 i IL-21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig4large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinię</a>.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody >
 <tr >
 <td >Źródło limfocytów T</td>
 <td >Transpozon*</td>
 <td >Transpozaza</td>
 <td >Infuzja limfocytów T</td>
 <td >Nr IRB</td>
 <td >Nr NIH-OBA</td>
 <td >Nr IND</td>
 </tr>
 <tr >
 <td >Autologiczne (pochodzące od pacjenta)**</td>
 <td >CD19RCD28</td>
 <td >SB11</td>
 <td >Po autologicznym przeszczepieniu komórek macierzystych krwiotwórczych</td>
 <td >2007-0635</td>
 <td >0804-922</td>
 <td >14193</td>
 </tr>
 <tr >
 <td >Allogeniczne (pochodzące od dawcy)</td>
 <td >CD19RCD28</td>
 <td >SB11</td>
 <td >Po allogenicznym przeszczepieniu komórek macierzystych krwiotwórczych</td>
 <td >2009-0525</td>
 <td >0910-1003</td>
 <td >14577</td>
 </tr>
 <tr >
 <td >Allogeniczne (pochodzące od dawcy)</td>
 <td >CD19RCD28</td>
 <td >SB11</td>
 <td >Po allogenicznym przeszczepieniu krwi pępowinowej</td>
 <td >2010-0835</td>
 <td >1001-1022</td>
 <td >14739</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Badania kliniczne pod auspicjami FDA w MDACC dotyczące infuzji CD19-specyficznych komórek CAR+ T namnażanych na aAPC. *Komórki T zostają uczynione specyficznymi dla CD19 poprzez wymuszoną ekspresję transpozonu SB kodującego CAR 2nd generacji, oznaczonego jako CD19RCD28, który sygnalizuje poprzez CD28 i CD3-z. **Badanie opisane w referencji nr 7

wyrażające specyficzny dla CD19 receptor antygenu chimerycznego (CAR) są podawane jako eksperymentalne leczenie nowotworów złośliwych komórek B w naszych pierwszych badaniach klinicznych terapii genowej u ludzi. Opisujemy modyfikację genetyczną limfocytów T przy użyciu systemu Śpiącej Królewny (SB) w celu wprowadzenia specyficznego dla CD19 CAR i selektywnej propagacji na zaprojektowanych sztucznych komórkach prezentujących antygen CD19 +.

Kliniczne zastosowanie śpiącej królewny i sztucznych komórek prezentujących antygen do genetycznej modyfikacji limfocytów T z krwi obwodowej i pępowinowej

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Protokół ten genetycznie modyfikuje limfocyty T w celu wprowadzenia chimerycznych receptorów antygenowych specyficznych dla antygenów nowotworowych, a następnie propaguje klinicznie istotną liczbę na zaprojektowanych sztucznych komórkach prezentujących antygen. Zacznij od elektrotransferu śpiącej królewny. Transponuj i transponuj plazmidy DNA A do spoczynkowych komórek jednojądrzastych wyizolowanych z krwi obwodowej lub pępowinowej.Następnie zmierz wydajność transfekcji za pomocą cytometrii przepływowej. Następnie kohodowla, transfekowane limfocyty T przez siedem dni na K 5 62 uzyskały sztuczny antygen prezentujący komórki z dodatkiem cytokin egzogennych w czterotygodniowej stymulacji. Cykle proliferacji przebiegają w celu analizy, kriokonserwacji i uwalniania elektroporowanych i rozmnożonych komórek T dodatnich do stosowania u ludzi.Transpozycja Śpiącej Królewny w systemie transpozycji stanowi alternatywę dla podejść do transferu genów opartych na wirusach, polegającej na stabilnym wprowadzaniu genu do wybranej komórki. Jedną z głównych zalet systemu śpiącej królewny jest to, że można zintegrować geny przy naprawdę niższych kosztach w porównaniu z plazmidami DNA, które integrują się w wyniku nieprawowitej rekombinacji niehomologicznej. Zaletą jest więc to, że system śpiącej królewny może być używany do ekspresji genu przy niskich kosztach i wysokiej wydajności.Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą początkowo musiały przezwyciężyć skuteczność komórek elektro T w selektywnej propagacji car-dodatnich komórek T na sztucznych komórkach prezentujących antygen. Oba kroki są trudne do opanowania ze względu na potrzebę wspólnej kultury. Genetycznie zmodyfikowane limfocyty T na sztucznych komórkach prezentujących antygen.Metoda ta jest przydatna w dziedzinie immunoterapii adoptywnej, szczególnie w skutecznym dostarczaniu genów i wytwarzaniu klinicznie istotnej liczby limfocytów T. Szersze zastosowanie rozciąga się na terapię raka, ponieważ limfocyty T z układu odpornościowego mogą być modyfikowane tak, aby były specyficzne dla nowotworu. Procedurę zademonstrują Margaret Dawson i Matthew Fiola.Technicy z mojego laboratorium najpierw rozcieńczają krew obwodową równą objętością P-B-S-E-D-T-A i krew pępowinową czterema objętościami P-B-S-E-D-T-A, powoli nakładają 25 mililitrów rozcieńczonej krwi na 12 mililitrów fialu w 50-mililitrowej probówce wirówkowej. Odwirować gradient fialalny przy 400 G przez 30 do 40 minut bez przerwy. Teraz przenieś frakcję komórek jednojądrzastych do świeżej 50-mililitrowej probówki wirówkowej z P-B-S-E-D-T-A.Zwiększ objętość do 50 mililitrów i zbierz komórki przez odwirowanie. Delikatnie umyj komórki raz na 50 mililitrów pełnej hodowli, pożywki i odwiruj w temperaturze 400 G przez 10 minut. Następnie połącz granulki komórek w CCM, wykonaj zliczanie komórek.Korzystanie z metody wykluczenia koloru niebieskiego triam. Ogniwa jednojądrzaste mogą być teraz wykorzystywane do elektroporacji lub kriokonserwacji do wykorzystania w przyszłości. Jeśli używasz kriokonserwowanego MNC, szybko rozmroź dwa razy od 10 do ósmych komórek, aby uzyskać elektroporację na pełną skalę, delikatnie przenieś komórki do probówki wirówkowej o odpowiedniej wielkości zawierającej wstępne podgrzanie.Uzupełnij pożywkę hodowlaną RPMI bez fenolu i osadź komórki przez wirowanie, ponownie zawieś komórki jednojądrzaste W P-F-R-P-M-I wykonaj zliczanie komórek i przenieś komórki do naczynia do hodowli komórkowej o odpowiedniej wielkości w stężeniu 10 z sześciu komórek na mililitr. Równowaga komórek w nawilżonym inkubatorze przez dwie godziny. Zbierz MNC przez odwirowanie, a następnie delikatnie ponownie zawieś i połącz granulki komórek w P-F-R-P-M-I i policz komórki Teraz przenieś dwa razy 10 do ósmego MNC do sterylnej 50-mililitrowej probówki wirówkowej i wiruj przy 200 Gs przez 10 minut bez przerw.Odessać supernatant tak, aby wokół osadu komórkowego nie pozostały żadne resztki pożywki. Przygotować sterylną płytkę 12-dołkową z 10 dołkami zawierającymi cztery mililitry ciepłego P-F-R-P-M-I i zrównoważyć płytkę w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnie rozpuść roztwór efektora Lonzo Nucleo z zestawu ludzkich komórek T zgodnie z instrukcjami producenta dla każdej reakcji.Q: Vet przygotować 100 mikrolitrów głównej mieszanki DNA zawierającej uzupełniony roztwór efektora jądrowego NU. 15 mikrogramów transpozycji plazmidu i pięć mikrogramów transpozycyjnego plazmidu. Następnie rozproszyć osad limfocytów T i ponownie zawiesić główną mieszankę DNA roztworu uczucia jądrowego NU przy końcowym stężeniu komórek dwa razy 10 siódmych komórek na 100 mikrolitrów.Ostrożnie przenieś 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej z 10 kuwet lonza nucleo affection, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Teraz dotknij raz qve i elektro za pomocą programu U 0 1 4 dla niestymulowanych limfocytów T. Przenieść kuwety i 12-dołkową płytkę Equilibrating do okapu hodowlanego za pomocą pipety do przenoszenia z cienką końcówką o objętości 500 mikrolitrów wstępnie ogrzanej pożywki hodowlanej z odpowiedniego dołka do każdego wete.Przenieś elektroporowane komórki na płytkę i pozwól komórkom zregenerować się w inkubatorze do hodowli komórkowych przez dwie godziny. Następnie przenieś komórki ze wszystkich studzienek do sterylnej probówki wirówkowej i po jednym płukaniu zagnieźdź komórki, delikatnie rozproszyj osad komórkowy i zawiesij go w CCM, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Po wykonaniu zliczania komórek dostosuj stężenie komórek, aby dążyć do sześciu komórek na mililitr w CCM.Następnie przenieś zawiesinę komórkową do kolby hodowlanej i umieść na noc w inkubatorze w celu wytworzenia komórek transfekowanych EGFP. Powtórzyć protokół elektroporacji, używając pięć razy 10 z sześciu komórek na weterynarz z pięcioma mikrogramami plazmidu EGFP kontroli amox. Zbierz elektroporowane ogniwa, a następnie przeprowadź liczenie komórek przy użyciu metody wykluczenia trien blue.Następnie wybarwić od jednej do dwóch razy 10 z sześciu komórek przeciwciałem specyficznym dla CD 3, CD 4, CD 8 i ludzkiej IgG FC gamma jako miary ekspresji CAR. Uzyskaj komórki w kalibrze faksu. Analizuj dane za pomocą oprogramowania FCS express, aby określić ekspresję samochodu.Następnie oblicz dodatnie komórki samochodu w hodowli. Klon A PC numer cztery pochodziłby z komórek K 5 62 do koekspresji pożądanych cząsteczek kostymulujących limfocyty T Rozmrażaj podwielokrotność zamrożonego napromieniowanego A A PC w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie umyj komórki, a CCM zlicz żywe komórki przez wyłączenie niebieskiego wyzwolenia i oblicz liczbę żywotnych A A PC wymaganych do stymulacji.Wymieszać elektroporowane ogniwa wykazujące ekspresję samochodu i napromieniowany promieniami gamma A A A PC w sterylnym pojemniku w stosunku jeden do dwóch. Dostosuj stosunek A PC do ekspresji samochodu na podstawie cytometrii przepływowej dzień po elektroporacji Dodaj 30 nanogramów na mililitr IL 21 do zawiesiny komórki. Następnie Eloqua opiekował się sześcioma komórkami na mililitr w kolbach T 75 lub przeglądał torby z kulturami życia i wracał do inkubatora hodowli, elektrotransferu plazmidów DNA i rozmnażania limfocytów T na napromieniowanych promieniami gamma.A PC może być używany do generowania klinicznie atrakcyjnej liczby limfocytów T pochodzących z krwi obwodowej i krwi pępowinowej do zastosowań u ludzi. W tej charakterystyce genetycznie zmodyfikowanych limfocytów T z ekspresji EGFP we krwi obwodowej w dniu zero pierwszego cyklu stymulacji, kontrole skuteczności transferu genów, ekspresję specyficznego dla CD 19 samochodu ocenia się za pomocą cytometrii przepływowej na CD trzech dodatnich, CD ośmiu dodatnich i CD czterech dodatnich i CD czterech dodatnich po około 24 godzinach po elektroporacji. A następnie 28 dni po wspólnej hodowli na A kinetyka PC ekspresji samochodu na limfocytach T hodowanych w funkcjonalnie zamkniętym systemie.Namnażanie się limfocytów T dodatnich w krwi obwodowej może z czasem generować klinicznie atrakcyjną liczbę limfocytów T, które stabilnie wyrażają samochód. Po czterech tygodniach kohodowli na komputerze AA, średnia krotna ekspansja trzech dodatnich limfocytów T CD wynosi około 19 800 z 90% ekspresją car. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wybrać paradę i rozmnażać limfocyty T, które wyrażają pożądany samochód.Pamiętaj, aby monitorować przerost komórek NK. Elektroporacja i propagacja limfocytów T odbywa się zwykle w ciągu czterech siedmiodniowych cykli stymulacji. Dalsze badania, takie jak uwalnianie cytokin i testy cytotoksyczności, mogą być prowadzone w celu oceny przekierowanej specyficzności genetycznie zmodyfikowanych limfocytów T w dziedzinie immunoterapii adoptywnej.Ta technika pomaga nam zrozumieć potencjał terapeutyczny limfocytów T, które są podawane ludziom.

clinical-application-sleeping-beauty-artificial-antigen-presenting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zastosowanie kliniczne Śpiącej Królewny i sztucznych komórek prezentujących antygeny do genetycznej modyfikacji limfocytów T z krwi obwodowej i pępowinowej

Szybki, prosty i kosztowo efektywny protokół generowania pochodzących od dawcy wielowirusowych specyficznych limfocytów T cytotoksycznych (rCTL) do infuzji dla biorców allogenicznych przeszczepów komórek macierzystych krwi tworzącej (HSCT) będących w grupie ryzyka zakażeń CMV, Adv lub EBV. Ten proces wytwarzania jest zgodny z zasadami GMP i powinien zapewnić szersze wdrożenie immunoterapii limfocytami T poza wyspecjalizowanymi ośrodkami.

Generowanie wielowirusowych swoistych limfocytów T w celu zapobiegania i leczenia infekcji wirusowych po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych

Opisano nową metodę indukcji i ekspansji antygenowo swoistych limfocytów T, niezależną od komórek dendrytycznych (DC). Sztuczne komórki prezentujące antygen (aAPC) oparte na HLA A2-Ig są ładowane peptydami ograniczonymi przez HLA-A2 w celu efektywnej ekspansji CTL o różnej swoistości antygenowej. Technologia ta wykazuje duży potencjał w zastosowaniu w immunoterapii adoptywnej opartej na CTL.

Sztuczne komórki prezentujące antygen oparte na HLA-Ig dla efektywnej ekspansji ludzkich CTL ex vivo

W niniejszej pracy opisujemy pierwszą zgodną z dobrą praktyką wytwarzania (GMP) metodę produkcji wirusowo-specyficznych cytotoksycznych limfocytów T (CTL) z krwi pępowinowej, która jest źródłem głównie naiwnych limfocytów T.

Ekspansja cytotoksycznych limfocytów T z krwi pępowinowej nakierowanych na cytomegalowirus, wirusa Epstein-Barr i adenowirusa

Generowanie limfocytów T z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) stanowi alternatywne podejście do wykorzystania embrionalnych komórek macierzystych w immunoterapii opartej na limfocytach T. Metoda ta wykazuje, że dzięki zastosowaniu systemu indukcji in vitro lub in vivo, komórki iPS są zdolne do różnicowania się zarówno w konwencjonalne, jak i antygenowo swoiste limfocyty T.

Kierunkowe różnicowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych w kierunku limfocytów T

Prezentujemy tutaj metodę rozwoju funkcjonalnych limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu (Ag) (Treg) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do immunoterapii autoimmunologicznego zapalenia stawów w modelu mysim.

Rozwój limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu macierzystego przeciwko autoimmunizacji

Limfocyty T specyficzne dla antygenu są trudne do scharakteryzowania lub wykorzystania w terapiach ze względu na ich ekstremalnie niską częstotliwość. W tym miejscu przedstawiamy protokół rozwoju cząsteczki magnetycznej, która może wiązać się z limfocytami T specyficznymi dla antygenu, aby wzbogacić te komórki, a następnie rozszerzyć je kilkaset razy zarówno w celu charakteryzacji, jak i terapii.

Wzbogacanie i rozszerzanie rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu za pomocą nanocząstek magnetycznych

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę generowania indukowanych indukowanych pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z komórek macierzystych (iTE) za pomocą trójwymiarowego (3D) systemu hodowli grasicy. iTE to jednorodny podzbiór limfocytów T blisko spokrewniony z naiwnymi limfocytami T ze zdolnością do proliferacji, tworzenia pamięci i supresji guza.

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek CD34+ naczelnych innych niż człowiek z przygotowanego szpiku kostnego, modyfikowanie genów tych komórek za pomocą wektorów lentiwirusowych oraz przygotowanie produktu do infuzji do autologicznego gospodarza. Łączna długość protokołu wynosi około 48 godzin.

Przygotowanie i modyfikacja genów hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych naczelnych

Prezentowany tutaj jest protokół skutecznego tłumienia replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) u myszy poprzez wykorzystanie adoptywnego transferu komórek (ACT) limfocytów T specyficznych dla antygenu wirusowego (Ag) pochodzących z komórek macierzystych. Procedura ta może być dostosowana do potencjalnej immunoterapii zakażenia HBV opartej na ACT.

Limfocyty T specyficzne dla wirusa Ag pochodzące z komórek macierzystych hamują replikację HBV u myszy

Obecny protokół opisuje zoptymalizowaną procedurę hodowli hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) w celu solidnego wszczepienia komórek z edytowanymi genami in vivo.

Edycja genów CRISPR/Cas9 hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych do zastosowań w terapii genowej

Ten protokół zapewnia usprawniony przepływ pracy do generowania i testowania ludzkich limfocytów regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (Treg CAR).

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego

Poznaj metodę modyfikacji genetycznej limfocytów T przy użyciu systemu Sleeping Beauty i sztucznych komórek prezentujących antygen. Technika ta umożliwia produkcję komórek CAR do zastosowań klinicznych w immunoterapii przeciwnowotworowej.

Kliniczne zastosowanie śpiącej królewny i sztucznych komórek prezentujących antygen do genetycznej modyfikacji limfocytów T z krwi obwodowej i pępowinowej (Wideo) | JoVE Journal

Kliniczne zastosowanie śpiącej królewny i sztucznych komórek prezentujących antygen do genetycznej modyfikacji limfocytów T z krwi obwodowej i pępowinowej

Przeglądaj więcej filmów