Kliniczne zastosowanie śpiącej królewny i sztucznych komórek prezentujących antygen do genetycznej modyfikacji limfocytów T z krwi obwodowej i pępowinowej

Protokół ten genetycznie modyfikuje limfocyty T w celu wprowadzenia chimerycznych receptorów antygenowych specyficznych dla antygenów nowotworowych, a następnie propaguje klinicznie istotną liczbę na zaprojektowanych sztucznych komórkach prezentujących antygen. Zacznij od elektrotransferu śpiącej królewny. Transponuj i transponuj plazmidy DNA A do spoczynkowych komórek jednojądrzastych wyizolowanych z krwi obwodowej lub pępowinowej.

Następnie zmierz wydajność transfekcji za pomocą cytometrii przepływowej. Następnie kohodowla, transfekowane limfocyty T przez siedem dni na K 5 62 uzyskały sztuczny antygen prezentujący komórki z dodatkiem cytokin egzogennych w czterotygodniowej stymulacji. Cykle proliferacji przebiegają w celu analizy, kriokonserwacji i uwalniania elektroporowanych i rozmnożonych komórek T dodatnich do stosowania u ludzi.

Transpozycja Śpiącej Królewny w systemie transpozycji stanowi alternatywę dla podejść do transferu genów opartych na wirusach, polegającej na stabilnym wprowadzaniu genu do wybranej komórki. Jedną z głównych zalet systemu śpiącej królewny jest to, że można zintegrować geny przy naprawdę niższych kosztach w porównaniu z plazmidami DNA, które integrują się w wyniku nieprawowitej rekombinacji niehomologicznej. Zaletą jest więc to, że system śpiącej królewny może być używany do ekspresji genu przy niskich kosztach i wysokiej wydajności.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą początkowo musiały przezwyciężyć skuteczność komórek elektro T w selektywnej propagacji car-dodatnich komórek T na sztucznych komórkach prezentujących antygen. Oba kroki są trudne do opanowania ze względu na potrzebę wspólnej kultury. Genetycznie zmodyfikowane limfocyty T na sztucznych komórkach prezentujących antygen.

Metoda ta jest przydatna w dziedzinie immunoterapii adoptywnej, szczególnie w skutecznym dostarczaniu genów i wytwarzaniu klinicznie istotnej liczby limfocytów T. Szersze zastosowanie rozciąga się na terapię raka, ponieważ limfocyty T z układu odpornościowego mogą być modyfikowane tak, aby były specyficzne dla nowotworu. Procedurę zademonstrują Margaret Dawson i Matthew Fiola.

Technicy z mojego laboratorium najpierw rozcieńczają krew obwodową równą objętością P-B-S-E-D-T-A i krew pępowinową czterema objętościami P-B-S-E-D-T-A, powoli nakładają 25 mililitrów rozcieńczonej krwi na 12 mililitrów fialu w 50-mililitrowej probówce wirówkowej. Odwirować gradient fialalny przy 400 G przez 30 do 40 minut bez przerwy. Teraz przenieś frakcję komórek jednojądrzastych do świeżej 50-mililitrowej probówki wirówkowej z P-B-S-E-D-T-A.

Zwiększ objętość do 50 mililitrów i zbierz komórki przez odwirowanie. Delikatnie umyj komórki raz na 50 mililitrów pełnej hodowli, pożywki i odwiruj w temperaturze 400 G przez 10 minut. Następnie połącz granulki komórek w CCM, wykonaj zliczanie komórek.

Korzystanie z metody wykluczenia koloru niebieskiego triam. Ogniwa jednojądrzaste mogą być teraz wykorzystywane do elektroporacji lub kriokonserwacji do wykorzystania w przyszłości. Jeśli używasz kriokonserwowanego MNC, szybko rozmroź dwa razy od 10 do ósmych komórek, aby uzyskać elektroporację na pełną skalę, delikatnie przenieś komórki do probówki wirówkowej o odpowiedniej wielkości zawierającej wstępne podgrzanie.

Uzupełnij pożywkę hodowlaną RPMI bez fenolu i osadź komórki przez wirowanie, ponownie zawieś komórki jednojądrzaste W P-F-R-P-M-I wykonaj zliczanie komórek i przenieś komórki do naczynia do hodowli komórkowej o odpowiedniej wielkości w stężeniu 10 z sześciu komórek na mililitr. Równowaga komórek w nawilżonym inkubatorze przez dwie godziny. Zbierz MNC przez odwirowanie, a następnie delikatnie ponownie zawieś i połącz granulki komórek w P-F-R-P-M-I i policz komórki Teraz przenieś dwa razy 10 do ósmego MNC do sterylnej 50-mililitrowej probówki wirówkowej i wiruj przy 200 Gs przez 10 minut bez przerw.

Odessać supernatant tak, aby wokół osadu komórkowego nie pozostały żadne resztki pożywki. Przygotować sterylną płytkę 12-dołkową z 10 dołkami zawierającymi cztery mililitry ciepłego P-F-R-P-M-I i zrównoważyć płytkę w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnie rozpuść roztwór efektora Lonzo Nucleo z zestawu ludzkich komórek T zgodnie z instrukcjami producenta dla każdej reakcji.

Q: Vet przygotować 100 mikrolitrów głównej mieszanki DNA zawierającej uzupełniony roztwór efektora jądrowego NU. 15 mikrogramów transpozycji plazmidu i pięć mikrogramów transpozycyjnego plazmidu. Następnie rozproszyć osad limfocytów T i ponownie zawiesić główną mieszankę DNA roztworu uczucia jądrowego NU przy końcowym stężeniu komórek dwa razy 10 siódmych komórek na 100 mikrolitrów.

Ostrożnie przenieś 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej z 10 kuwet lonza nucleo affection, uważając, aby uniknąć pęcherzyków. Teraz dotknij raz qve i elektro za pomocą programu U 0 1 4 dla niestymulowanych limfocytów T. Przenieść kuwety i 12-dołkową płytkę Equilibrating do okapu hodowlanego za pomocą pipety do przenoszenia z cienką końcówką o objętości 500 mikrolitrów wstępnie ogrzanej pożywki hodowlanej z odpowiedniego dołka do każdego wete.

Przenieś elektroporowane komórki na płytkę i pozwól komórkom zregenerować się w inkubatorze do hodowli komórkowych przez dwie godziny. Następnie przenieś komórki ze wszystkich studzienek do sterylnej probówki wirówkowej i po jednym płukaniu zagnieźdź komórki, delikatnie rozproszyj osad komórkowy i zawiesij go w CCM, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Po wykonaniu zliczania komórek dostosuj stężenie komórek, aby dążyć do sześciu komórek na mililitr w CCM.

Następnie przenieś zawiesinę komórkową do kolby hodowlanej i umieść na noc w inkubatorze w celu wytworzenia komórek transfekowanych EGFP. Powtórzyć protokół elektroporacji, używając pięć razy 10 z sześciu komórek na weterynarz z pięcioma mikrogramami plazmidu EGFP kontroli amox. Zbierz elektroporowane ogniwa, a następnie przeprowadź liczenie komórek przy użyciu metody wykluczenia trien blue.

Następnie wybarwić od jednej do dwóch razy 10 z sześciu komórek przeciwciałem specyficznym dla CD 3, CD 4, CD 8 i ludzkiej IgG FC gamma jako miary ekspresji CAR. Uzyskaj komórki w kalibrze faksu. Analizuj dane za pomocą oprogramowania FCS express, aby określić ekspresję samochodu.

Następnie oblicz dodatnie komórki samochodu w hodowli. Klon A PC numer cztery pochodziłby z komórek K 5 62 do koekspresji pożądanych cząsteczek kostymulujących limfocyty T Rozmrażaj podwielokrotność zamrożonego napromieniowanego A A PC w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie umyj komórki, a CCM zlicz żywe komórki przez wyłączenie niebieskiego wyzwolenia i oblicz liczbę żywotnych A A PC wymaganych do stymulacji.

Wymieszać elektroporowane ogniwa wykazujące ekspresję samochodu i napromieniowany promieniami gamma A A A PC w sterylnym pojemniku w stosunku jeden do dwóch. Dostosuj stosunek A PC do ekspresji samochodu na podstawie cytometrii przepływowej dzień po elektroporacji Dodaj 30 nanogramów na mililitr IL 21 do zawiesiny komórki. Następnie Eloqua opiekował się sześcioma komórkami na mililitr w kolbach T 75 lub przeglądał torby z kulturami życia i wracał do inkubatora hodowli, elektrotransferu plazmidów DNA i rozmnażania limfocytów T na napromieniowanych promieniami gamma.

A PC może być używany do generowania klinicznie atrakcyjnej liczby limfocytów T pochodzących z krwi obwodowej i krwi pępowinowej do zastosowań u ludzi. W tej charakterystyce genetycznie zmodyfikowanych limfocytów T z ekspresji EGFP we krwi obwodowej w dniu zero pierwszego cyklu stymulacji, kontrole skuteczności transferu genów, ekspresję specyficznego dla CD 19 samochodu ocenia się za pomocą cytometrii przepływowej na CD trzech dodatnich, CD ośmiu dodatnich i CD czterech dodatnich i CD czterech dodatnich po około 24 godzinach po elektroporacji. A następnie 28 dni po wspólnej hodowli na A kinetyka PC ekspresji samochodu na limfocytach T hodowanych w funkcjonalnie zamkniętym systemie.

Namnażanie się limfocytów T dodatnich w krwi obwodowej może z czasem generować klinicznie atrakcyjną liczbę limfocytów T, które stabilnie wyrażają samochód. Po czterech tygodniach kohodowli na komputerze AA, średnia krotna ekspansja trzech dodatnich limfocytów T CD wynosi około 19 800 z 90% ekspresją car. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wybrać paradę i rozmnażać limfocyty T, które wyrażają pożądany samochód.

Pamiętaj, aby monitorować przerost komórek NK. Elektroporacja i propagacja limfocytów T odbywa się zwykle w ciągu czterech siedmiodniowych cykli stymulacji. Dalsze badania, takie jak uwalnianie cytokin i testy cytotoksyczności, mogą być prowadzone w celu oceny przekierowanej specyficzności genetycznie zmodyfikowanych limfocytów T w dziedzinie immunoterapii adoptywnej.

Ta technika pomaga nam zrozumieć potencjał terapeutyczny limfocytów T, które są podawane ludziom.