Name: Obrazowanie 4D agregacji białek w żywych komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Poznaj metodę 4D mikroskopii do obrazowania dynamiki agregacji białek w żywych komórkach. Technika ta umożliwia śledzenie procesów kontroli jakości składania białek w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Preparaty drożdżowe
<ol>
	<li>Przekształć szczepy drożdży za pomocą plazmidu przenoszącego kasetę GAL1-GFP-Y68L (UBC9ts).</li>
	<li>Drożdże hodować w pożywkach syntetycznych zawierających 2% rafinozy przez 24 godziny i ponownie rozcieńczać do 2% pożywki zawierającej galaktozę przez 16 godzin lub O/N. Inkubować komórki w temperaturze 30 °C, wstrząsając z prędkością 200 obr./min.</li>
	<li>Następnego ranka rozcieńczyć szczep zapytania do OD600 = 0,2. Wstrząsać przez 4-6 godzin w temperaturze 30 °C (200 obr./min), aż kultura osiągnie OD600 = 0,8-1,0.</li>
	<li>Aby stłumić ekspresję (tak, aby monitorować tylko już translowaną i złożoną pulę GFP-Ubc9ts), zmień pożywkę na pożywkę syntetyczną uzupełnioną 2% glukozą (SD) 30 minut przed obrazowaniem.</li>
	<li>Leczenie - Szok termiczny komórek przez 20 minut w temperaturze 37 °C w celu wywołania nieprawidłowego fałdowania lub w sposób ciągły w inkubatorze mikroskopowym w celu śledzenia agregacji białek w warunkach szoku cieplnego. Uwaga - jeśli używasz mikroskopu w dowolnej temperaturze powyżej RT, podgrzewaj go przez około 2 godziny, aby zrównoważyć temperaturę wzdłuż korpusu mikroskopu i obiektywów (patrz poniżej).</li>
</ol>
2. Płyta\Przygotowanie slajdów
<ol>
	<li>Wybierz odpowiednią płytę. Główną kwestią jest zdolność do utrzymania ostrości podczas akwizycji obrazowej. Poniższe punkty mają kluczowe znaczenie dla obrazowania 4D, a nie dla poklatków 2D lub obrazowania 3D.
	<ol>
		<li>Płyta z wieloma studniami - dno różnych studni może nie być jednorodne (tj. studnie będą znajdować się na różnych wysokościach w stosunku do celu). Utrudni to utrzymanie ostrości w punktach x y i punktach czasowych, niezależnie od zastosowanej techniki automatycznego ustawiania ostrości.</li>
		<li>Materiał prowadnicy: szkło kontra plastik. Szkiełka ze szklanym dnem są bardziej jednorodne między studzienkami, ale są droższe.</li>
		<li>Grubość dna płyty: zwykle używamy płyt nakrywkowych o indeksie 1,5, ale indeks 1 jest również dopuszczalny w zależności od obiektywu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przykryj spód płytki\szkiełka ConA (0,25 mg/ml) przez 10 minut. ConA służy do przylegania komórek do szkiełka, co umożliwia śledzenie pojedynczej komórki w czasie.</li>
	<li>Usuń ConA i inkubuj szkiełko w kapturze chemicznym, aby nadmiar ConA wyparował.</li>
	<li>Wprowadzić 200 μl próbki drożdży (OD600 = 0,5) do studzienki ConAed.</li>
	<li>Inkubować przez 15 minut, aby komórki przykleiły się do powierzchni płytki.</li>
	<li>Wyekstrahuj pożywkę i przemyj trzy razy nową pożywką, aby uzyskać jedną warstwę komórek. Uwaga: jeśli planowany jest długi upływ czasu, wysiewaj komórki rzadko, aby nowe pąki nie wypełniły i nie przerwały interesującego obszaru.</li>
</ol>
3. Preparaty mikroskopowe
<ol>
	<li>Używamy mikroskopu konfokalnego Nikon A1Rsi z kilkoma niestandardowymi modyfikacjami. Do obrazowania drożdży używamy do 4 laserów (405 nm, 50 mW CUBE laser; 457-514 nm, 65 mW laser Argon Ion; 561 nm, 50 mW laser szafirowy oraz 640 nm, 40 mW CUBE) oraz do 4 PMT wyposażonych w filtry. Większość naszych obrazowań odbywa się za pomocą zestawu zielonych filtrów dla EGFP i czerwonego zestawu filtrów dla mCherry i tdTomato. W przypadku GFP i mCherry prawie nie ma przebijania, dlatego często korzystamy ze skanowania symultanicznego. Jednak skanowanie liniowe może być również stosowane, aby zapobiec krwawieniu, gdy do niego dojdzie. Nasz konfokus jest również wyposażony w stolik PInano Piezo (MCL), który może wykonywać kroki 3 ms w z, umożliwiając 2-3 stosy z (30-50 sekcji) na sekundę. System posiada również detektor spektralny, Perfect Focus (laser offset) oraz dwa skanery - skaner galwanowy i skaner rezonansowy.</li>
	<li>Wybierz odpowiedni cel. Główne zagadnienia:
	<ol>
		<li>Obiektyw woda/olej/powietrze: głównym czynnikiem jest współczynnik załamania światła ośrodka obrazowania w porównaniu z medium próbki.
		<ol>
			<li>Obiektywne zalety oleju:
			<ol>
				<li>Obiektywy olejowe mogą mieć większe apertury numeryczne (olej bardziej rozbija światło niż woda, a zatem więcej fotonów wraca do obiektywu). Cele olejowe mogą mieć do 1,49 NA, w porównaniu do 1,27 dla wody. (Jednak w rzeczywistości nie jest to ogromna różnica w rozdzielczości).</li>
				<li>Współczynnik załamania światła oleju odpowiada współczynnikowi załamania światła szkła, dlatego żadne fotony nie są tracone od próbki, przez szkło, do obiektywu. (Uwaga - wybierz olejek immersyjny, który ma współczynnik załamania światła odpowiedni dla Twojego obiektywu i szkiełka nakrywkowego).</li>
				<li>Olej umożliwia bezproblemowe długie upływy czasu, ponieważ nie paruje.</li>
			</ol>
			Wady obiektywu olejowego:
			<ol>
				<li>Wyższa rozdzielczość możliwa dzięki wyższemu poziomowi azotu w obiektywach olejowych ulega szybkiej degradacji, jeśli światło musi przejść przez ośrodek wodny (taki jak komórka).</li>
				<li>Obrazy zazwyczaj mają więcej aberracji sferycznych i efekt "rozciągnięcia" w 3D.</li>
				<li>Olej jest lepki, brudny i stanowi zagrożenie dla celów.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Zalety obiektywu wodnego
			<ol>
				<li>Sama komórka jest wodnista, dlatego w z występuje mniej zniekształceń, a rozdzielczość pozostaje wysoka głęboko w próbce wodnej.</li>
				<li>Czysty i przyjazny dla użytkownika. Wady celu wodnego: szybko odparowuje, dlatego nie nadaje się do długich filmów bez specjalnych ustaleń dotyczących ciągłego pompowania wody do celu.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Obiektywne zalety powietrza: 1. Żaden materiał nie jest tracony/paruje podczas wielokrotnego pozyskiwania punktów lub długiego filmu. 2. Czysty i przyjazny dla użytkownika. Wada: niska rozdzielczość i niska czułość sygnału.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Temperatura w pomieszczeniu i inkubatorze: zmiana temperatury wpływa na właściwości materii, a w delikatnych systemach zmienia ostrość. Temperaturę należy dostosować przed wyborem punktów do akwizycji. Zmiana temperatury podczas akwizycji zakłóci obrazowanie i spowoduje utratę ostrości. Przed obrazowaniem pozwalamy, aby nasz system mikroskopowy równoważył się przez 2 godziny w żądanej temperaturze.</li>
		<li>Kołnierze korekcyjne: Wiele obiektywów jest wyposażonych w pierścień korekcyjny, który umożliwia dostosowanie obiektywu do danej grubości szkiełka nakrywkowego. Zalecamy regulację kołnierza korekcyjnego przy użyciu koralików fluorescencyjnych w celu wizualizacji funkcji punktowego rozprowadzania. Zapewni to prawidłowe ustawienia dla każdej próbki.</li>
		<li>Stabilne uchwyty na próbki: stwierdzamy, że większość dostępnych na rynku uchwytów na próbki jest najsłabszą częścią mikroskopu. Często są chwiejne i nie proste. Jest to katastrofa dla wielopunktowego obrazowania 4D o wysokiej rozdzielczości. Projektujemy własne uchwyty na próbki, które są proste i ściśle przylegają do sceny. W razie potrzeby można je również przykręcić.</li>
		<li>Akwizycja wielopunktowa: nasz system obrazowania jest wyposażony w system "Perfect focus" firmy Nikon, który jest w zasadzie laserowym mechanizmem automatycznego ustawiania ostrości. Jednak autofokus niekoniecznie jest konieczny w przypadku obrazowania 4D, zwłaszcza jeśli system nie dryfuje zbytnio.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obrazowanie
<ol>
	<li>Włącz system: lasery, scenę, kontroler, kamerę i oprogramowanie komputerowe.</li>
	<li>Umieść płytkę na uchwycie sceny, odpowiednio zabezpieczoną i ustabilizowaną.</li>
	<li>Użyj portu oka, aby określić lokalizację i orientację drożdży.</li>
	<li>Korzystając z jasnego pola, oceń zdrowie i żywotność komórek zgodnie z kształtem i teksturą.</li>
	<li>Włącz światło epifluorescencyjne zgodnie z odpowiednim fluoroforem (np. filtrem FITC dla GFP) i skup się na komórkach wykazujących fenotyp, który jest przedmiotem Twoich badań. Komórki, które są wysoce fluorescencyjne na więcej niż jednej długości fali, mogą być martwe, a zatem autofluorescencyjne. Wizualizujemy jądro za pomocą fluoroforu tdTomato połączonego z sygnałem SV40 NLS (NLS-TFP). TFP jest dwa razy większy od GFP, a zatem znajduje się powyżej granicy dyfuzji jądra, dlatego bardzo dobrze sprawdza się jako marker jądrowy. Możemy również wzbudzić TFP za pomocą zielonego (488 nm) lasera jednocześnie jako GFP, ale zebrać zielone i czerwone emisje do dwóch oddzielnych PMT w celu uzyskania rozdzielczości spektralnej.</li>
	<li>Dostosuj następujące ustawienia, aby zminimalizować szumy i przesycenie:
	<ol>
		<li>Należy wziąć pod uwagę moc lasera - fotowybielanie i fototoksyczność w porównaniu z jasnością obrazu.</li>
		<li>Wzmocnienie: wpływa na czułość kamery, a tym samym na stosunek sygnału do szumu.</li>
		<li>Średnica otworka - powinna być dostosowana do lasera o krótszej długości fali. Średnica otworu określa grubość (wysokość) obrazowanego przekroju optycznego. Tak więc otwarcie otworu zbierze więcej światła (wpuści więcej fotonów), ale zmniejszy rozdzielczość w z (mniejsza konfokaliczność).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przydatne wskazówki:
	<ol>
		<li>Jeśli różne fluorofory emitują zbieżne długości fali, użyj funkcji detektora spektralnego, która umożliwia wybór wirtualnych filtrów. Należy pamiętać, że detektory spektralne są mniej czułe niż zwykłe PMT.</li>
		<li>Jeśli różne fluorofory są wzbudzane przez ten sam laser, użyj funkcji skanowania linii.</li>
		<li>Skaner Galvano zapewnia większą czułość, ale wiąże się z większym ryzykiem fotowybielania. Skaner rezonansowy umożliwia szybszą akwizycję, zmniejszając w ten sposób ryzyko fotowybielania, ale jest mniej czuły.</li>
		<li>Uzyskując średnio od 2 do 16 obrazów, poprawia stosunek sygnału do szumu, ale spowalnia akwizycję i oczywiście wiąże się z większą ekspozycją próbki na działanie lasera.</li>
		<li>Czas akwizycji - zależy od kwestii biologicznej (np. tworzenie JUNQ i IPOD trwa ~2 godziny). Obrazowaliśmy drożdże za pomocą skanera rezonansowego przez okres do 30 godzin w filmie poklatkowym 3D.</li>
		<li>Interwały poklatkowe- Mniejsze interwały stworzą bardziej spójny film, ale mogą spowodować wybielanie zdjęć, a tym samym utratę sygnału.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gershenson, A., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+in+the+cell%3A+challenges+and+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Protein folding in the cell: challenges and progress.</a> Current opinion in structural biology. 21, 32-41 (2011).</li>
<li>Aguzzi, A., Calella, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions%3A+protein+aggregation+and+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Prions: protein aggregation and infectious diseases.</a> Physiological reviews. 89, 1105-1152 (2009).</li>
<li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteotoxic+stress+and+inducible+chaperone+networks+in+neurodegenerative+disease+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging.</a> Genes & development. 22, 1427-14 (2008).</li>
<li>Cohen, E., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulin+paradox%3A+aging%2C+proteotoxicity+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The insulin paradox: aging, proteotoxicity and neurodegeneration.</a> Nature reviews. Neuroscience. , (2008).</li>
<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system.</a> Annual review of biochemistry. 67, (1998).</li>
<li>Tyedmers, J., Mogk, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+strategies+for+controlling+protein+aggregation.+Nature+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Cellular strategies for controlling protein aggregation. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 11, 777-788 (2010).</li>
<li>Treusch, S., Cyr, D. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+deposits%3A+Protection+against+toxic+protein+species%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle+%28Georgetown%2C+Tex.%29%22%5BJournal%5D)">Amyloid deposits: Protection against toxic protein species?</a> Cell cycle (Georgetown, Tex.). 8, 1668-1674 (2009).</li>
<li>Spokoini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confinement+to+Organelle-Associated+Inclusion+Structures+Mediates+Asymmetric+Inheritance+of+Aggregated+Protein+in+Budding+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Confinement to Organelle-Associated Inclusion Structures Mediates Asymmetric Inheritance of Aggregated Protein in Budding Yeast.</a> Cell Rep. , (2012).</li>
<li>Weisberg, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+superoxide+dismutase+1+%28SOD1G93A%29+aggregates+determines+their+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of superoxide dismutase 1 (SOD1G93A) aggregates determines their toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15811-15816 (2012).</li>
<li>Kaganovich, D., Kopito, R., Frydman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Misfolded+proteins+partition+between+two+distinct+quality+control+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Misfolded proteins partition between two distinct quality control compartments.</a> Nature. 454, 1088(2008).</li>
<li>Betting, J., Seufert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+Ubc9+mutant+protein+with+temperature-sensitive+in+vivo+function+is+subject+to+conditional+proteolysis+by+a+ubiquitin-+and+proteasome-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">A yeast Ubc9 mutant protein with temperature-sensitive in vivo function is subject to conditional proteolysis by a ubiquitin- and proteasome-dependent pathway.</a> The Journal of biological chemistry. 271, 25790(1996).</li>
<li>Tongaonkar, P., Beck, K., Shinde, U. P., Madura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+temperature-sensitive+mutant+of+a+ubiquitin-conjugating+enzyme+and+its+use+as+a+heat-inducible+degradation+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of a temperature-sensitive mutant of a ubiquitin-conjugating enzyme and its use as a heat-inducible degradation signal.</a> Analytical biochemistry. 272, 263(1999).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Nasze intuicje dotyczące procesów biochemicznych wywodzą się z eksperymentów laboratoryjnych, w których dobrze wymieszany roztwór reagentów i produktów może osiągnąć równowagę w zlewce. W takim ustawieniu stężenie danego związku chemicznego może być wyrażone jako pojedyncza liczba, która jest stosunkiem ilości molowej cząsteczek do objętości makroskopowej. Wiele z tego, co wiemy o strukturze i funkcji białek, pochodzi z użycia metod, które odzwierciedlają klasyczny, masowy obraz reakcji: zachodnie plamy, wirówki i pomiary spektrofotometryczne przeprowadzane na ekstraktach z homogenatów całych populacji komórek.
W miarę jak technologia, której używamy do oglądania komórek w powiększeniu, poprawia się w zawrotnym tempie, staje się coraz bardziej jasne, że warunki, w których większość reakcji biochemicznych zachodzi in vivo , tylko w najmniejszym stopniu przypominają te z klasycznego scenariusza laboratoryjnego. Wnętrze komórki jest nie tylko gęsto upakowanym środowiskiem, w którym efekty stłoczenia znacznie zmieniają aktywność różnych reagentów, ale jest również przeciwieństwem dobrze wymieszanych. Tłumaczy to częste rozbieżności między skutecznością in vitro i in vivo w szerokim zakresie złożonych reakcji makromolekularnych.
Intuicje wywodzące się z klasycznych eksperymentów biochemicznych in vitro nigdzie nie są bardziej podatne na wprowadzanie w błąd, jak w pytaniach dotyczących fałdowania, nieprawidłowego fałdowania i agregacji białek in vivo . Podczas gdy badania nad chemią białek w reakcjach masowych mogą traktować kwestię fałdowania danego białka jako proste pytanie "tak" lub "nie", każda próba śledzenia dynamiki całych populacji makrocząsteczek w żywej komórce musi być wrażliwa na cały rozkład możliwych wyników konformacyjnych dostępnych dla łańcucha polipeptydowego, , a w szczególności do ryzyka nieprawidłowego fałdowania i agregacji. Na przykład, możemy zbadać lizat komórkowy białka agregującego za pomocą western blotting i ustalić, że białko jest w większości nierozpuszczalne i nie jest ubikwitynowane. Jednak w żywej komórce dyskretna subpopulacja białka, trudna do wykrycia podczas uśredniania na wielu komórkach, może być rozpuszczalna i ubikwitynowana w określonym kompartmencie, w którym lokalne stężenie gatunku jest bardzo wysokie. Ten drugi scenariusz może mieć ważniejsze konsekwencje dla żywotności komórki niż większa subpopulacja masowa. Co więcej, podczas gdy białka opiekuńcze wykazują różnorodne zachowania i funkcje plejotropowe in vitro, staje się oczywiste, że w komórce ich dyskretne funkcje są ograniczone przestrzennie i czasowo.
W nowo powstającym paradygmacie rozumienia biochemii koncentracja staje się zmienną właściwością każdego konkretnego nanośrodowiska w komórce, a zdarzenia molekularne, które leżą u podstaw procesów biologicznych, muszą być badane nie tylko w czasie, ale także w przestrzeni. Przedstawione tutaj podejście do obrazowania 4D umożliwia czułe modelowanie nieprawidłowego fałdowania białek w żywych komórkach, choć może być wykorzystane do badania dowolnej liczby innych procesów biologicznych i tego, jak są one regulowane w przestrzeni, czasie i po zmianach warunków środowiskowych. W tym artykule wykorzystano czujnik składania Ubc9ts , który skutecznie demonstruje etapy i opcje radzenia sobie z początkiem agregacji białek w cytozolu. Oprócz zilustrowania biologii komórki w kontroli jakości agregacji, podejście to może służyć jako potężne narzędzie do rozszyfrowywania wpływu określonych zaburzeń lub mutacji genetycznych na proteostazę (na przykład Ubc9ts można wykorzystać do pomiaru stresu związanego z fałdowaniem białek w odpowiedzi na utlenianie, ekspresję toksycznego agregatu lub mutacje w szlaku kontroli jakości).
Obrazowanie 4D jest również niezbędne do dokładnego określenia lokalizacji lub kolokalizacji białek między dwoma różnymi białkami oraz do wykrywania zjawisk, które mogą być przejściowe, ale ważne. Na przykład, szczególnie w małych kulistych organizmach, takich jak drożdże, może się wydawać, że struktura lub agregat ma lokalizację międzyjądrową, podczas gdy obrazowanie 4D może ujawnić, że jest to po prostu artefakt kąta badania.
W przykładowym eksperymencie, który tutaj prezentujemy, demonstrujemy użycie modelowego nieprawidłowo sfałdowanego białka, Ubc9ts, do śledzenia kontroli jakości agregacji w czasie i przestrzeni w cytozolu. W temperaturze dopuszczalnej Ubc9ts jest fałdowany i dyfundowany w jądrze i cytozolu. W przypadku nieprawidłowego fałdowania wywołanego ciepłem początkowo tworzy szybko dyfundujące małe zagregowane ogniska naprężeń, które są przetwarzane w celu degradacji proteasomalnej. Kiedy proteasom jest częściowo zahamowany, te ogniska stresu są przekształcane w inkluzje JUNQ i IPOD w ciągu około 2 godzin. Jeśli degradacja za pośrednictwem ubikwityny nie jest dostępna jako opcja kontroli jakości, Ubc9ts jest natychmiast przekierowywany do inkluzji IPOD w celu agregacji ochronnej. Narzędzia te oferują niesamowite możliwości odkrywania nowych czynników genetycznych zaangażowanych w kontrolę jakości agregacji oraz badania ich przestrzennej i czasowej regulacji w komórce.

<table><tbody><tr><td>MG132</td><td>Mercury</td><td>mbs474790</td><td></td></tr><tr><td>con A</td><td>Sigma</td><td>C2010</td><td></td></tr><tr><td>Szklane płyty dolne</td><td>ibidi</td><td>ibd81158</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4D Obrazowanie fluorescencyjne agregacji białek Konfokalne filmy 3D zostały uzyskane za pomocą mikroskopu Nikon A1R-si wyposażonego w stolik PInano Piezo (MCL), przy użyciu 60-krotnego obiektywu wodnego NA 1,27, plastry 0,3 mikrona, 0,5% mocy lasera (od 65 mW lasera 488 i 50 mW lasera 561). Ładunki z były zdobywane co 5 minut przez 90 minut. Każda seria z została uzyskana z krokiem o wielkości 0,5 mikrona i łącznie 30 krokami. Przetwarzanie obrazu odbyło się za pomocą oprogramowania NIS-Elements.</td></tr></tbody></table>

obrazowanie 4d agregacji białek w żywych komórkach

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

Jednym z kluczowych zadań każdej żywej komórki jest utrzymanie prawidłowego fałdowania nowo zsyntetyzowanych białek w obliczu ciągle zmieniających się warunków środowiskowych i środowiska wewnątrzkomórkowego, które jest ciasno upakowane, lepkie i niebezpieczne dla stabilności białka1. Zdolność do dynamicznego równoważenia produkcji, fałdowania i degradacji białek wymaga wysoce wyspecjalizowanych maszyn kontroli jakości, których absolutna konieczność jest najlepiej obserwowana w przypadku awarii. Choroby takie jak ALS, choroba Alzheimera, Parkinsona i niektóre formy mukowiscydozy mają bezpośredni związek ze składnikami kontroli jakości fałdowania białek2, a zatem przyszły rozwój terapeutyczny wymaga podstawowej wiedzy na temat procesów leżących u ich podstaw. Naszym eksperymentalnym wyzwaniem jest zrozumienie, w jaki sposób komórki integrują sygnały uszkodzeń i montują odpowiedzi, które są dostosowane do różnych okoliczności.
Głównym powodem, dla którego nieprawidłowe fałdowanie białek stanowi egzystencjalne zagrożenie dla komórki, jest skłonność nieprawidłowo pofałdowanych białek do agregacji, powodując w ten sposób globalne zakłócenia w zatłoczonym i delikatnym środowisku fałdowania wewnątrzkomórkowego1. Fałdowane zdrowie lub "proteostaza" proteomu komórkowego jest utrzymywane, nawet pod presją starzenia się, stresu i uszkodzeń oksydacyjnych, dzięki skoordynowanemu działaniu różnych jednostek mechanistycznych w skomplikowanym systemie kontroli jakości3,4. Wyspecjalizowana maszyneria molekularnych białek opiekuńczych może wiązać nienatywne polipeptydy i promować ich fałdowanie do stanu natywnego1, kierować je do degradacji przez układ ubikwityna-proteasom5 lub kierować je do ochronnych inkluzjiagregacji 6-9.
U eukariontów ładunek kontroli jakości agregacji cytozolowej jest podzielony między dwa przedziały8-10: przedział kontroli jakości juxtanuclear (JUNQ) i nierozpuszczalny depozyt białkowy (IPOD) (Rysunek 1 - model). Białka, które są ubikwitynowane przez maszynerię kontroli jakości fałdowania białek, są dostarczane do JUNQ, gdzie są przetwarzane w celu degradacji przez proteasom. Nieprawidłowo sfałdowane białka, które nie są ubikwitynowane, są kierowane do IPOD, gdzie są aktywnie agregowane w komorze ochronnej.
Do tego momentu, metodologiczny paradygmat mikroskopii fluorescencyjnej żywych komórek polegał głównie na oznaczaniu białek i śledzeniu ich lokalizacji w komórce w określonych punktach czasowych i zazwyczaj w dwóch wymiarach. Ponieważ nowe technologie zaczęły zapewniać eksperymentatorom bezprecedensowy dostęp do skali submikronowej w żywych komórkach, dynamiczna architektura cytozolu stała się postrzegana jako nowa, wymagająca granica dla charakterystyki eksperymentalnej. Przedstawiamy metodę szybkiego monitorowania rozkładów przestrzennych 3D wielu białek znakowanych fluorescencyjnie w cytozolu drożdży w czasie. Timelapse 3D (obrazowanie 4D) to nie tylko wyzwanie techniczne; Przeciwnie, ułatwia również radykalną zmianę w ramach pojęciowych używanych do analizy struktury komórkowej.
Używamy cytozolowego białka czujnika fałdowania w żywych drożdżach, aby uwidocznić różne losy nieprawidłowo sfałdowanych białek w kontroli jakości agregacji komórkowej, używając szybkiego obrazowania fluorescencyjnego 4D. Wrażliwy na temperaturę mutant białka Ubc910-12 (Ubc9ts) jest niezwykle skuteczny zarówno jako czujnik proteostazy komórkowej, jak i fizjologiczny model do śledzenia kontroli jakości agregacji. Podobnie jak w przypadku większości białek ts, Ubc9ts jest w pełni sfałdowany i funkcjonalny w dopuszczalnych temperaturach dzięki aktywnym komórkowym białkom opiekuńczym. Powyżej 30 °C lub gdy komórka stoi w obliczu stresu związanego z nieprawidłowym fałdowaniem, Ubc9ts ulega nieprawidłowemu fałdowaniu i podąża za losem natywnego białka globularnego, które zostało nieprawidłowo sfałdowane z powodu mutacji, denaturacji cieplnej lub uszkodzenia oksydacyjnego. Łącząc go z GFP lub innymi fluoroforami, można go śledzić w 3D, gdy tworzy ogniska naprężeń lub jest kierowany do JUNQ lub IPOD.

<img alt="Schemat agregacji i degradacji białek; szlaki poly-Ub, IPOD i JUNQ w stresie komórkowym." fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Model: Subkomórkowa kompartymentacja białek błędnie sfałdowanych. Mechanizmy kontroli jakości kierują błędnie sfałdowane białka do odrębnych kompartymentów o różnych funkcjach: białka rozpuszczalne, przeznaczone do degradacji, ulegają poliubikwitynacji i są transportowane do przyjądrowego kompartymentu kontroli jakości (Juxta-NuclearQuality control compartment – JUNQ). Białka nierozpuszczalne, których nie można ubikwitynować, są kierowane do ochronnej sekwestracji w osadzie białek nierozpuszczalnych (InsolubleProteinDeposit – IPOD), sąsiadującym z wakuolą, gdzie ulegają aktywnej agregacji.
<img alt="Odpowiedź komórkowa na stres, obrazy z mikroskopii konfokalnej; agregacja białek w różnych temperaturach." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Modelowanie błędnego fałdowania białek z użyciem GFP-Ubc9ts. W normalnych warunkach GFP-Ubc9ts (zielony) jest prawidłowo sfałdowany i zlokalizowany rozproszony w jądrze komórkowym oraz cytozolu. Jądro komórkowe jest znakowane NLS-TFP (czerwony). We wszystkich eksperymentach przed obrazowaniem ekspresja Ubc9ts została wyłączona poprzez dodanie 2% glukozy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50083/50083fig2large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinę</a>.
<ol>
	<li>Po zmianie temperatury na 37 °C białko GFP-Ubc9ts (zielone) ulega błędnemu sfałdowaniu i tworzy cytozolowe ogniska stresu (Stress Foci). Jądro komórkowe jest oznakowane NLS-TFP (czerwone).</li>
	<li>Po regeneracji po szoku termicznym w 23 °C termicznie zdenaturowane GFP-Ubc9ts ulega degradacji, co objawia się obniżeniem poziomu fluorescencji.</li>
	<li>Po zmianie temperatury na 37 °C i zahamowaniu proteasomu za pomocą 80 Mm MG132, białko GFP-Ubc9ts ulega błędnemu sfałdowaniu i jest włączane do inkluzji JUNQ oraz IPOD. Jądro komórkowe jest oznakowane NLS-TFP (czerwone).</li>
	<li>Po zmianie temperatury na 37 °C i zahamowaniu ubikwitynacji, białko GFP-Ubc9ts ulega błędnemu sfałdowaniu i jest włączane do inkluzji IPOD. Jądro komórkowe jest oznakowane NLS-TFP (czerwone). Proteaza ubikwityny 4 (Ubp4) jest nadekspresowana w celu zablokowania ubikwitynacji Ubc9ts.</li>
</ol>
<img alt="Obrazy mikroskopowe po inhibicji proteasomów pokazujące agregację białek w czasie w temperaturze 37°C." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Przebieg czasowy formowania się JUNQ i IPOD. Po zmianie temperatury na 37 °C i inhibicji proteasomów przy użyciu 80 Mm MG132, ogniska stresu (Stress Foci) GFP-Ubc9ts przekształcają się w inkluzje JUNQ i IPOD. Jądro komórkowe jest znakowane NLS-TFP (kolor czerwony). Obrazy 3D były pozyskiwane w odstępach 4 min. (patrz również Film 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50083/50083fig3large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinę</a>.

Żywotność komórek zależy od szybkiego i skutecznego radzenia sobie z nieprawidłowym fałdowaniem białek. W tym miejscu opisujemy metodę wizualizacji różnych potencjalnych losów nieprawidłowo sfałdowanego białka: ponownego fałdowania, degradacji lub sekwestracji w inkluzjach. Demonstrujemy zastosowanie czujnika składania, Ubc9ts, do monitorowania proteostazy i kontroli jakości agregacji w żywych komórkach za pomocą mikroskopii 4D.

Obrazowanie 4D agregacji białek w żywych komórkach

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Ten eksperymentalny system pozyskuje obrazy fluorescencyjne 3D o wysokiej rozdzielczości w żywych komórkach w celu monitorowania i oznaczania czasoprzestrzennej dynamiki kontroli jakości fałdowania białek. Najpierw przygotuj komórki do badania szybko poruszających się kompleksów białkowych. Uzyskaj stos obrazów Z w wysokiej rozdzielczości Z.Następnie uzyskaj szereg czasowy złożony z Zacksa, wyrenderuj wynikowe obrazy w filmie 3D i przeanalizuj powstałe obrazy. Ostatecznie, obrazowanie czterokierunkowe umożliwia śledzenie dynamicznych i przejściowych zjawisk w komórkach w różnych warunkach. Główną przewagą obrazowania czterowymiarowego nad istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia szerokokątna i poklatkowa, jest to, że pozwala nam jednocześnie wizualizować dynamikę i przestrzenny rozkład czasowy całej populacji białek w komórce w wysokiej rozdzielczości.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii komórki w zakresie agregacji białek, kontroli jakości i fałdowania białek. Są to procesy bardzo dynamiczne i przejściowe. Stąd, bez wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej, wiele z nich byłoby niemożliwych do zaobserwowania.Ta metoda może zapewnić wgląd w kontrolę jakości agregacji. Może również zrewolucjonizować badania nad interakcjami i dynamiką białek. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ robienie filmów 3D z endogennie znakowanymi lub nisko eksprymowanymi białkami wymaga stabilności systemu.Wysoka czułość i niskie fotowybielanie Przekształć szczepy drożdży za pomocą plazmidu ekspresyjnego dla białka fuzyjnego fluoru połączonego z cytozolowym białkiem czujnika fałdowania, takim jak wrażliwy na temperaturę mutant dziewiątki UBC. Hoduj drożdże w pożywkach syntetycznych zawierających 2% rafinozy przez 24 godziny, a następnie rozcieńcz z powrotem do 2% pożywki zawierającej galaktozę na noc, rozcieńcz szczep zapytania do OD 600 około 0,2 i hoduj przez cztery do sześciu godzin, aż kultura osiągnie OD 600 między 0,8 a 1,0 30 minut przed obrazowaniem. Stłumić ekspresję za pomocą pożywki syntetycznej uzupełnionej 2% glukozą.Ten krok pozwala na monitorowanie tylko już translowanej i złożonej puli białka ekspresowego. Teraz poddaj ogniwa szokowi termicznemu przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby wywołać nieprawidłowe składanie, wybierz odpowiednią płytkę, aby utrzymać ostrość podczas czterech akwizycji D.Obrazowanie.Przykryj spód płytki 0,25 miligrama na mililitr con A przez 10 minut. Con A służy do przylegania komórek do szkiełka, co umożliwia śledzenie pojedynczej komórki w czasie. Zassać kon A i strzałkę, wysuszyć płytkę w kapturze chemicznym.Następnie dodaj 200 mikrolitrów próbki drożdży. Inkubować przez 15 minut, aby komórki przylgnęły do płytki. Wykonaj trzy płukania pożywką, aby uzyskać pojedynczą warstwę komórek do obrazowania drożdży.Użyj mikroskopu konfokalnego z kilkoma niestandardowymi modyfikacjami, jak opisano w dołączonym tekście. Ten system obrazowania drożdży wykorzystuje do czterech laserów i do czterech probówek z powielaczem zdjęć wyposażonych w filtry. Większość naszych obrazowań odbywa się za pomocą zestawu zielonych filtrów dla EGFP i czerwonego zestawu filtrów dla pomidorów m cherry i TD.Wyposaż również konfokalny w system doskonałego ustawiania ostrości stopnia pi nano pizo, a zarówno skanery galwanowe, O, jak i rezonansowe równoważą system mikroskopu, aż do osiągnięcia żądanej temperatury. Przed obrazowaniem na podstawie współczynnika załamania światła ośrodka obrazowania w stosunku do ośrodka próbki, należy wybrać odpowiedni obiektyw: wodę, olej lub powietrze. Wyreguluj kołnierz korekcyjny w zależności od grubości płytki.Wyczyść obiektyw za pomocą chusteczek do soczewek i etanolu. Wyczyść również szkiełko, na którym znajduje się próbka. Umieść płytkę bezpiecznie na uchwycie stolika i sprawdź stabilność uchwytu próbki, aby zapewnić prawidłowe ustawienia dla każdej próbki.Wyreguluj kołnierz korekcyjny podczas używania koralików fluorescencyjnych, aby zobrazować funkcję rozpraszania punktowego za pomocą portu oka. Określ położenie i orientację drożdży. Następnie włącz wymagane światło fluorescencyjne epi i skup się na komórkach wykazujących odpowiedni fenotyp.Następnie, korzystając z jasnego pola, oceń zdrowie i żywotność komórek zgodnie z kształtem i teksturą w celu oceny żywotności komórek. Wizualizuj jądro z florą pomidora TD Fluor połączoną z sygnałem SV 40 i LS. TFP jest dwa razy większy niż GFP.Ponieważ znajduje się powyżej granicy dyfuzji jądra, bardzo dobrze sprawdza się jako marker jądrowy. Wzbudz TFP zielonym laserem o długości 4 88 nm jednocześnie jako GFP, ale zbierz zielone i czerwone emisje do dwóch oddzielnych PMT w celu uzyskania rozdzielczości spektralnej. Aby zminimalizować szumy i nasycenie, dostosuj moc lasera i średnicę otworu zgodnie z opisem w dołączonym manuskrypcie.Jeśli różne siły flory emitują przystającą długość fali, użyj funkcji detektora spektralnego, która umożliwia wybór wirtualnych filtrów w celu uzyskania obrazów poklatkowych zgodnie z projektem eksperymentalnym, Misfolded Protein U BBC nine Ts zapewnia system modelowy do śledzenia kontroli jakości agregacji w czasie i przestrzeni. W cytozolu w temperaturze dopuszczającej UBC dziewięć Ts jest fałdowane i dyfundowane w jądrze i cytozolu w wyniku nieprawidłowego fałdowania wywołanego ciepłem. Początkowo tworzy szybko dyfundujące małe cytozolowe skupiska punktowe, które są przetwarzane w celu degradacji proteasomalnej.Kiedy proteasom jest częściowo zahamowany, te puncta są przekształcane w śmieci i inkluzje iPoda w ciągu około dwóch godzin. W normalnych warunkach GFP UBC nine Ts jest natywnie pofałdowany i jest zlokalizowany dyfuzyjnie w cytozolu jądra, jak pokazano tutaj na zielono. Po zmianie temperatury do 37 stopni Celsjusza białko fuzyjne ulega nieprawidłowemu sfałdowaniu i tworzy cytozolowe agregaty puncta po powrocie do zdrowia po szoku cieplnym w temperaturze 23 stopni Celsjusza.Termicznie zdenaturowany G-F-P-U-B-C dziewięć T ulega degradacji, na co wskazuje obniżony poziom fluorescencji. Jądro jest oznaczone na czerwono przez N-L-S-T-F-P. Kiedy zmiana temperatury do 37 stopni Celsjusza jest sprzężona z hamowaniem proteasomu, dziewięć T G-F-P-U-B-C jest nieprawidłowo składane i przetwarzane na śmieci i inkluzje do iPodów.W tym przypadku proteaza ubikwityny cztery ulega nadmiernej ekspresji, aby zablokować hamowanie ubikwitynacji wraz ze zmianą temperatury, co powoduje przetwarzanie G-F-P-U-B-C dziewięciu T do inkluzji iPoda. Te zdjęcia poklatkowe wykonane w czterominutowych odstępach wyraźnie pokazują dynamikę powstawania śmieci i iPodów. Technika ta może być stosowana do monitorowania proteostazy komórkowej w czasie za pomocą UBC nine Ts jako czujnika składania.Obrazowanie Four D można również wykonać w innych systemach modelowych, takich jak komórki ssaków i C elegance. Obrazowanie Four D umożliwia również wgląd w inne subtelne zdarzenia w kontroli jakości agregacji, takie jak powstawanie i dynamika rozpuszczalnych ognisk naprężeń agregatów oraz dostarczanie agregatów do przegródek na śmieci i iPody.

4d-imaging-of-protein-aggregation-in-live-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie demonstrujemy komórkowy test agregacji białek za pomocą inhibitorów proteasomów, które blokują aktywność proteasomu, zapobiegając nieprawidłowo sfałdowanym, zmutowanym białkom, połączonym z fluorescencyjnym znacznikiem, przed degradacją proteasomalną zależną od ubikwityny, prowadzącą do ich akumulacji w cytoplazmie komórki. Agregaty białkowe są następnie wizualizowane i oznaczane ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Test tworzenia agregatów białkowych: metoda wykrywania i ilościowego określania agregacji białek w hodowanych komórkach po indukcji przez inhibitor proteasomu

Ten film demonstruje obrazowanie i kwantyfikację agregatów białkowych w genetycznie zmodyfikowanych mózgach Drosophila. Mózgi są naprawiane, myte i traktowane środkiem zapobiegającym blaknięciu przed zamontowaniem. Obrazy są rejestrowane za pomocą mikroskopu konfokalnego i oznaczane ilościowo w celu obserwacji transmisji zmutowanych agregatów białkowych.

Obrazowanie i kwantyfikacja agregatów białkowych w genetycznie zmodyfikowanych mózgach Drosophila

Czasoprzestrzenne informacje o dynamicznych białkach wewnątrz żywych komórek są kluczowe dla zrozumienia biologii. Rodzaj mikroskopii superrozdzielczej, zwany szybką mikroskopią oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM), ujawnia unikalne informacje na temat cytokinetycznego pierścienia Z u bakterii: zarówno jego wygląd podobny do koralików, jak i szybką dynamikę FtsZ w pierścieniu.

Obrazowanie cytokinetycznego pierścienia Z w superrozdzielczości u żywych bakterii przy użyciu szybkiej mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM)

Czterowymiarowe (4D) obrazowanie jest wykorzystywane do badania zachowania i interakcji między dwoma typami endosomów w zakończonych nerwach żywych kręgowców.  Ruch tych małych struktur jest scharakteryzowany w trzech wymiarach, co pozwala na potwierdzenie zdarzeń takich jak fuzja endosomów i egzocytoza.

Wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

Coraz więcej dowodów potwierdza tezę, że patogenne agregaty białkowe związane z chorobami neurodegeneracyjnymi rozprzestrzeniają się między komórkami z właściwościami podobnymi do prionów. W tym miejscu opisano metodę, która umożliwia wizualizację rozprzestrzeniania się między komórkami agregatów podobnych do prionów w organizmie modelowym Drosophila melanogaster.

Monitorowanie transmisji między komórkami priopodobnych agregatów białkowych u Drosophila melanogaster

Ten protokół opisuje analizę fluorescencyjnie znakowanych przedziałów wewnątrzkomórkowych w pączkujących drożdżach za pomocą wielokolorowej mikroskopii konfokalnej 4D (time-lapse 3D). Parametry obrazowania dobierane są tak, aby wychwycić odpowiednie sygnały przy jednoczesnym ograniczeniu fotouszkodzeń. Niestandardowe wtyczki ImageJ umożliwiają śledzenie oznaczonych struktur i analizę ilościową.

Mikroskopia 4D drożdży

Ten protokół wyjaśnia, jak przygotować i zamontować próbki bakterii do trójwymiarowego obrazowania na żywo oraz jak zrekonstruować trójwymiarowy kształt E. coli na podstawie tych obrazów.

Trójwymiarowe obrazowanie komórek bakteryjnych w celu dokładnego odwzorowania komórek i precyzyjnej lokalizacji białek

Wprowadzamy tutaj procedurę pomiaru oligomerów białkowych i agregacji w lizacie komórkowym i żywych komórkach za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji.

Wykrywanie agregacji białek za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

Tutaj prezentowana jest metoda analizy kinetyki agregacji białek u nicieni Caenorhabditis elegans. Zwierzęta z populacji zsynchronizowanej pod względem wieku są obrazowane w różnych punktach czasowych, a następnie następuje półautomatyczne zliczanie inkluzji w CellProfiler i dopasowywanie do modelu matematycznego w AmyloFit.

Monitorowanie kinetyki agregacji białek in vivo przy użyciu automatycznego zliczania inkluzji u Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje spersonalizowane znakowanie fluorescencyjne oparte na przeciwciałach i wstrzykiwanie do wczesnych zarodków Drosophila, aby umożliwić obrazowanie na żywo białek o niskiej obfitości lub modyfikacji potranslacyjnych, które są trudne do wykrycia przy użyciu tradycyjnych metod GFP/mCherry-tag.

Wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach Drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych

Wykazano, że wiele wewnętrznie nieuporządkowanych białek uczestniczy w tworzeniu wysoce dynamicznych kondensatów biomolekularnych, co jest ważne dla wielu procesów komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy opartą na obrazowaniu pojedynczych cząsteczek metodę ilościowego określania dynamiki, za pomocą której białka oddziałują ze sobą w kondensatach biomolekularnych w żywych komórkach.

Jednocząsteczkowy pomiar dynamiki oddziaływań białek w kondensatach biomolekularnych

Poznaj metodę 4D mikroskopii do obrazowania dynamiki agregacji białek w żywych komórkach. Technika ta umożliwia śledzenie procesów kontroli jakości składania białek w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie 4D agregacji białek w żywych komórkach

Przeglądaj więcej filmów