Name: Analiza dostępności rozpuszczalników reszt cysteiny na cząstkach wirusopodobnych wirusa rayado fino kukurydzy wytwarzanych w roślinach Nicotiana benthamiana i sieciowanie peptydów z VLP (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Poznaj metodę analizy dostępności rozpuszczalnikowej reszt cysteiny na powierzchni cząsteczek wirusopodobnych MRFV wytwarzanych w roślinach Nicotiana benthamiana oraz technikę sieciowania peptydów z VLP.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Inokulacja wirusa i oczyszczanie VLP z roślin Nicotiana benthamiana
<ol>
	<li>Wyprodukuj zakryte transkrypty T7-RNA z plazmidów wektorowych opartych na wirusie ziemniaka X (PVX) zawierających geny MRFV typu dzikiego (wt) i białka płaszcza (CP) z mutacją Cys 12, używając zestawu T7-mMessage mMachine firmy Ambion.</li>
	<li>Dla każdej reakcji transkryptu T7 zaszczepić dwa w pełni rozwinięte liście N. benthamiana reakcjami 10 μl i inkubować rośliny przez 10 dni w szklarni, przy wilgotności 60% przez 16 godzin w świetle (25 000-30 000 luksów) w temperaturze 25 °C i 8 godzin w ciemności w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Liście zakażone wirusemHarves t N. benthamiana 10 dni po zaszczepieniu (dpi), zważyć tkankę roślinną (50 gramów) i umieścić na lodzie.</li>
	<li>Homogenizować materiał roślinny w mieszarce w obecności 100 ml schłodzonego roztworu 0,5 M buforu cytrynianu na, pH 5,5 (użyć 2 ml buforu na gram tkanki roślinnej).</li>
	<li>Przefiltrować homogenat przez 3 warstwy gazy i sklarować przez odwirowanie przy 27 000 x g przez 30 minut. Przenieść supernatant do schłodzonego cylindra miarowego, zmierzyć objętość, a następnie przenieść do schłodzonej sterylnej zlewki. Wyrzuć granulkę.</li>
	<li>Roztwór supernatantu należy przetworzyć, dodając 10% glikolu polietylenowego 8 000 (PEG 8 000), mieszać przez 15 minut w temperaturze 4 °C i inkubować przez dodatkowe 45 minut w temperaturze 4 °C w celu wytrącenia matrycy cząstki wirusopodobne (VLP)-PEG.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 27 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.</li>
	<li>Przetwarzać osady, dodając 8 ml 0,05 M buforu cytrynianu Na, pH 5,5 zawierającego 2% Triton X-100. Dobrze zakręć probówkami wirówkowymi, aby uwolnić osad. Przenieść osad i bufor do schłodzonej, sterylnej zlewki. Natychmiast przepłukać probówki 2 ml tego samego buforu i dodać do zlewki. Mieszać zawiesinę w temperaturze 4 °C, aż granulki się rozpuszczą (zwykle 1 godzina).</li>
	<li>Klarować przez odwirowywanie przez 5 minut przy 27 000 x g, odrzucić osad i przetworzyć supernatant przez odwirowanie w 140 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad w 1 ml 0,05 M buforu cytrynianu Na, pH 5,5 i umieścić zawiesinę na 10-40% gradientowym sacharozy utworzonym w 0,05 M buforze cytrynianu Na, pH 5,5.</li>
	<li>Odwirowywać gradient przez 3 godziny przy 140 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Oświetlić światłem górną część probówki wirówkowej i zebrać górny pas rozpraszający światło w odległości 4 cm od górnej części probówki, rozcieńczyć 0,05 M buforem cytrynianu na, pH 5,5 i wirować przez 3 godziny w temperaturze 140 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad w 0,5 ml sterylnej wody i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do sześciu miesięcy.</li>
	<li>Określ ilościowo stężenie VLP, wykonując test białka Bradforda. Wydajność VLP wynosi od 1 do 3 μg/g tkanki roślinnej.</li>
</ol>
2. Znakowanie fluoresceiną-5-maleimidem Reakcje VLP
<ol>
	<li>Przygotować 1 mM roztwór 5-maleimidu fluoresceiny (427,37 g/mol) w 50 mM buforze fosforanu sodu o pH 7,0; 1 mM EDTA. Wymieszać za pomocą wiru i sprawdzić, czy całkowicie się rozpuścił. Chroń rurkę przed światłem za pomocą folii aluminiowej.</li>
	<li>Dodaj fluoresceinę-5-maleimid do VLP wytworzonych w kroku 1 i wymieszaj. Użyj 25-krotnego molowego nadmiaru fluoresceiny-5-maleimidu dla molowej ilości sulfhydryli. Ogólnie rzecz biorąc, użycie 30 μl VLP w stężeniu 1 μg/μl i 60 μl roztworu fluoresceiny-5-maleimidu daje akceptowalne wyniki.</li>
	<li>Inkubować reakcję przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zakończyć reakcję przez dodanie ditiotreitolu (DTT) do końcowego stężenia 50 mM.</li>
	<li>Usunąć nieprzereagowaną fluoresceinę za pomocą odsalającej kolumny wirowej (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) i odwirować przez 2 minuty przy 1,500 x g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Do analizy SDS-PAGE dodać 10 μl 2 x bufor próbki SDS-PAGE Laemmli do 10 μl każdej reakcji. Znakowane białko należy przechowywać w temperaturze 4 °C chronione przed światłem przez okres do jednego miesiąca lub w porcjach jednorazowego użytku w temperaturze -20 °C przez okres do 3 miesięcy.</li>
</ol>
3. Etykietowanie reakcji i oznaczanie inkorporacji biotyny
<ol>
	<li>Użyj odsalających kolumn wirowych (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) do przeprowadzenia wymiany buforowej z wody na sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), pH 7,0 VLP wytworzonych w kroku 1.</li>
	<li>Przygotować 20 mM roztwór podstawowy maleimidu-PEG2-biotyny, dodając 190 μl PBS do maleimidu-PEG2-biotyny No-Weigh i mieszać, pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Dodaj maleimid-PEG2-biotynę do VLP i wymieszaj. Użyć 10-krotnego molowego nadmiaru odczynnika do roztworów VLP ≤ 2 mg/ml.</li>
	<li>Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 4 godziny.</li>
	<li>Usunąć nieprzereagowaną maleimid-PEG2-biotynę za pomocą odsalającej kolumny wirowej (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) i odwirować przez 2 minuty przy 1,500 x g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Określ mole biotyny na mol VLP za pomocą zestawu do ilościowego określania biotyny Pierce (Thermo Scientific) i postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
4. Sieciowanie Cys 2-VLP i peptydu F
<ol>
	<li>VLP, które spowodowały udostępnienie reszt cysteiny do sieciowania w kroku 2 (Cys 2-VLPs), są używane w następnym etapie. Przygotować świeży sieciujący roztwór podstawowy (28,63 mM), rozpuszczając 10 mg środka sieciującego NHS-PEG4-maleimid w 680 μl dimetylosulfotlenku.</li>
	<li>Rozpuścić 17 (F)-aminokwasowy peptyd (LLPNMOKDKEACAKAPL) w 50 μl buforu koniugacyjnego (1 x PBS, pH 7,2; 1 mM EDTA) w stężeniu 0,1 mM.</li>
	<li>Dodać 4 μl środka sieciującego do 50 μl rozpuszczonego peptydu (białka-NH2) przy końcowym stężeniu 1 mM (co stanowi 10-krotny nadmiar molowy na 0,1 mM roztworu peptydu).</li>
	<li>Inkubować reakcję przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Oczyść usieciowany peptyd za pomocą kolumny odsalającej (Thermo Scientific Inc., Rockford IL) zrównoważonej buforem koniugacyjnym (1 x PBS, pH 7,2; 1 mM EDTA) przez odwirowanie przy 1,500 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Stwórz mieszaninę reakcyjną łączącą VLP (białko-SH) i usieciowany peptyd (białko-NH2) w stosunku molowym określonym przez liczbę tioli i aktywowanych amin biorących udział w reakcji oraz różnicę w masie cząsteczkowej między VLP a peptydem.</li>
	<li>Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>W przypadku analizy Western blot należy wymieszać otrzymany sprzężony produkt 1:1 z buforem Laemmli, gotować przez 10 minut i kontynuować z SDS-PAGE na wstępnie odlanym 10-20% żelu Tris-Glycine (Invitrogen), a następnie elektroblottować na membranie nitrocelulozowej (Invitrogen). Zablokuj błony 1 x PBS, pH 7,2 zawierającym 0,05% Tween-20 (PBS-Tween) i 5% odtłuszczonego mleka w proszku i sonduj przeciwciałami specyficznymi dla peptydów, a następnie odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym znakowanym fosfatazą.</li>
</ol>

<ol><li>Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turnip+yellow+mosaic+virus+as+a+chemoaddressable+bionanoparticle%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconj.+Chem%22%5BJournal%5D)">Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle.</a> Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).</li>
<li>Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potato+virus+X+as+a+vector+for+gene+expression+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Potato virus X as a vector for gene expression in plants.</a> Plant J. 2, 549-557 (1992).</li>
<li>Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Packaging+of+gold+particles+in+viral+capsids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanosci.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Packaging of gold particles in viral capsids.</a> J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).</li>
<li>Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+mosaic+virus+liquid+crystals+as+templates+for+the+interior+design+of+silica+mesophases+and+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles.</a> Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).</li>
<li>Gazit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+biomolecular+templates+for+the+fabrication+of+metal+nanowires%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS.+J%22%5BJournal%5D)">Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires.</a> FEBS. J. 274, 317-322 (2007).</li>
<li>Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modification+of+a+viral+cage+for+multivalent+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation.</a> Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).</li>
<li>Hammond, R. W., Hammond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+rayado+fino+virus+capsid+proteins+assemble+into+virus-like+particles+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli.</a> Virus Res. 147, 208-215 (2010).</li>
<li>Hermamson, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermamson%2C+GT+%22Bioconjugate+techniques%22">Bioconjugate techniques</a>. , Academic Press. San Diego. (1991).</li>
<li>Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+studies+of+protein+cage+nanoparticles+demonstrate+broad+tissue+distribution+and+rapid+clearance+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Nanomed%22%5BJournal%5D)">Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo.</a> Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).</li>
<li>Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotemplate+synthesis+of+3-nm+nickel+and+cobalt+nanowires%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires.</a> Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).</li>
<li>Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+CuCl2+concentration+on+the+aggregation+and+mineralization+of+Tobacco+mosaic+virus+biotemplate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Colloid.+Interface.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate.</a> J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).</li>
<li>Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successive+deposition+of+alternate+layers+of+polyelectrolytes+and+a+charged+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus.</a> Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).</li>
<li>Natilla, A., Hammond, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+rayado+fino+virus+virus-like+particles+expressed+in+tobacco+plants%3A+a+new+platform+for+cysteine+selective+bioconjugation+peptide+display%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display.</a> J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).</li>
<li>Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+trafficking+of+plant+virus+nanoparticles+in+mice+via+the+oral+route%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route.</a> Virology. 343, 2224-2235 (2005).</li>
<li>Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+virus-polymer+materials.+Synthesis+and+properties+of+PEG-decorated+Cowpea+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus.</a> Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).</li>
<li>Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+silica-coated+Tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus.</a> J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).</li>
<li>Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-surface+modification+in+the+Tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).</li>
<li>Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+viruses+as+biotemplates+for+materials+and+their+use+in+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).</li>
</ol>

Wzmianki o nazwach handlowych produktów handlowych w publikacji mają na celu wyłącznie dostarczenie konkretnych informacji i nie oznaczają rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych.

Przedstawiona metoda umożliwia bardzo czułą i szybką analizę reaktywnych cystein obecnych na powierzchni VLP wytwarzanych przez rośliny, a także na innych kompleksach białkowych. Maleimidy są odczynnikami specyficznymi dla tioli, które reagują z wolnymi cząsteczkami zawierającymi sulfhydryl, tworząc stabilne wiązania tioeterowe. Metoda ta opiera się na specyficzności maleimidów w zakresie reagowania z grupami sulfhydrylowymi niebiorącymi udziału w interakcjach z innymi aminokwasami. Zachowanie natywnej struktury VLP jest...

<table><tbody><tr><td>Cienkościenne, ultraprzezroczyste tuby</td><td>Beckman</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Kit </td><td>Life Tecnologies</td><td>AM1344M</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceino-5-maleimidu </td><td>Thermo Scientific Life Technologies</td><td>46130 F150</td><td>46130 jest niesprawnym zamiennikiem F150 </td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania biotyny Pierce</td><td>Thermo Scientific</td><td>28005</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotyna, No-Weigh Format </td><td>Thermo Scientific</td><td>21901</td><td></td></tr><tr><td>SM(PEG)n Crosslinkers </td><td>Thermo Scientific</td><td>22107</td><td></td></tr><tr><td>10-20 % Tris-Glycine Gel</td><td>Invitrogen</td><td>EC61352</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer </td><td>Bio-Rad</td><td>1610737</td><td></td></tr><tr><td>Tris Glycine SDS Running Buffer </td><td>Invitrogen</td><td>LC2675</td><td></td></tr><tr><td>Tris Glycine Bufor transferowy </td><td>Invitrogen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtracyjny z membraną nitrocelulozową Sandwich</td><td>Invitrogen</td><td>LC2001</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza oznaczona powinowactwem Oczyszczone przeciwciało do króliczej IgG</td><td>Laboratoria Kirkegaarda i Perry'ego</td><td>0751516</td><td></td></tr><tr><td>Substrat fosfatazy NBT/BCIP </td><td>Laboratoria Kirkegaard i Perry</td><td>508107</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza dostępności rozpuszczalników reszt cysteiny na cząstkach wirusopodobnych wirusa rayado fino kukurydzy wytwarzanych w roślinach nicotiana benthamiana i sieciowanie peptydów z vlp

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Naśladowanie i wykorzystywanie właściwości wirusów oraz cech fizykochemicznych i fizycznych daje nadzieję na rozwiązanie niektórych z najpilniejszych wyzwań na świecie. Sam zakres i rodzaje wirusów w połączeniu z ich intrygującymi właściwościami potencjalnie dają nieskończone możliwości zastosowań w technologiach opartych na wirusach. Wirusy mają zdolność samoorganizowania się w cząsteczki o dyskretnym kształcie i wielkości, specyficzności symetrii, poliwalencji i stabilnych właściwościach w szerokim zakresie temperatur i pH. Nic dziwnego, że przy tak niezwykłym zakresie właściwości, wirusy są proponowane do stosowania w biomateriałach 9, szczepionkach 14, 15, materiałach elektronicznych, narzędziach chemicznych i molekularnych pojemnikach elektronicznych4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
Aby wykorzystać wirusy w nanotechnologii, muszą one zostać zmodyfikowane z ich naturalnych form, aby nadać im nowe funkcje. Ten trudny proces można przeprowadzić za pomocą kilku mechanizmów, w tym genetycznej modyfikacji genomu wirusa i chemicznego przyłączania obcych lub pożądanych cząsteczek do grup reaktywnych cząstek wirusa 8. Zdolność do modyfikowania wirusa zależy przede wszystkim od właściwości fizykochemicznych i fizycznych wirusa. Ponadto modyfikacje genetyczne lub fizykochemiczne muszą być przeprowadzane bez negatywnego wpływu na natywną strukturę i funkcję wirusa. Białka płaszcza wirusa kukurydzy rayado fino (MRFV) samoorganizują się w Escherichia coli, wytwarzając stabilne i puste VLP, które są stabilizowane przez interakcje białko-białko i które mogą być wykorzystywane w technologiach opartych na wirusach 8. VLP wytwarzane w roślinach tytoniu badano jako rusztowanie, na którym można kowalencyjnie eksponować różne peptydy 13. W tym miejscu opisujemy kroki, które należy wykonać: 1) określić, które z dostępnych dla rozpuszczalnika cystein w kapsydzie wirusa są dostępne do modyfikacji, oraz 2) biosprzężonych peptydów ze zmodyfikowanymi kapsydami. Dzięki zastosowaniu natywnych lub mutacyjnie wstawionych reszt aminokwasowych i standardowych technologii sprzęgania, na powierzchni wirusów roślinnych pojawiła się szeroka gama materiałów, takich jak wirus mozaiki bromu 3, wirus pstrości goździka 12, wirus pstrości chlorotycznej wspięgi chińskiej 6, wirus mozaiki tytoniu 17, wirus żółtej mozaiki rzepy 1 i MRFV 13.

Przejściowa ekspresja genów mutantów białka kapsydu (CP) wirusa MRFV w roślinach N. benthamiana przy użyciu wektora opartego na PVX produkującego VLPs została przedstawiona na Rysunku 1. Zmodyfikowany gen białka kapsydu MRFV jest amplifikowany metodą PCR, a następnie poddany kontroli transkrypcyjnej zduplikowanego subgenomowego promotora CP w wektorze opartym na PVX, pP2C2S 2 (dar od D. Baulcombe, Sainsbury Laboratories, Norwich, Anglia). Transkrypcja RNA in vitro pozwala na ...

Opisano metodę analizy dostępności rozpuszczalnika grupy tiolowej reszt cysteinowych wirusa Maize rayado fino virus (MRFV) - wirusopodobnych cząstek (VLP), po których następuje reakcja sieciowania peptydów. Metoda wykorzystuje dostępność kilku grup chemicznych na powierzchni VLP, które mogą być celami dla określonych reakcji.

Analiza dostępności rozpuszczalników reszt cysteiny na cząstkach wirusopodobnych wirusa rayado fino kukurydzy wytwarzanych w roślinach Nicotiana benthamiana i sieciowanie peptydów z VLP

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest przeprowadzenie analizy dostępności rozpuszczalnika reszt cysteiny na powierzchni cząsteczek przypominających wirusy (VLP), a następnie sieciowanie peptydów z cysteiną na cząsteczkach przypominających wirusy. Osiąga się to poprzez najpierw sklonowanie białka kapsydu wirusa Maize rayado fino virus (MRFV) w wektorze wirusowym opartym na wirusie X ziemniaka. Następnie rośliny N. benthamiana są inokulowane zmodyfikowanym wirusem, a powstałe z białka kapsydu VLP MRFV są oczyszczane. Na koniec VLP i peptydy są sieciowane przy użyciu amoniaku-PEG4-maleimidu i wykrywane za pomocą metody western blot. Uzyskane wyniki potwierdzają produkcję kompleksów VLP-peptyd poprzez analizę western blot. Technika ta poszerza wiedzę na temat chemicznej modyfikacji powierzchni wirusów i cząsteczek przypominających wirusy w celu wytwarzania nowych materiałów do nanotechnologii.Po otrzymaniu transkryptów T7-RNA z cappingiem z plazmidowych wektorów opartych na wirusie X ziemniaka, zawierających geny białka otoczki MRFV typu dzikiego oraz zmutowanego pod kątem cysteiny, użyć dwóch alikwotów po 10 µL każdy do inokulacji dwóch liści N. benthamiana. Inkubować rośliny przez 10 dni w szklarni przy wilgotności 60%, z 16-godzinnym okresem oświetlenia w temperaturze 25 °C i ośmiogodzinnym okresem ciemności w temperaturze 20 °C. Po zakończeniu inkubacji zebrać zainfekowane wirusem liście, zważyć tkankę roślinną i umieścić ją na lodzie. Po oczyszczeniu cząsteczek przypominających wirusy (VLP) zgodnie z protokołem tekstowym, przygotować 1 mM roztwór fluoresceiny-5-maleimidu w 50 mM buforze fosforanowym sodu o pH 7,0 i 1 mM EDTA. Wymieszać na wirówce typu vortex do całkowitego rozpuszczenia i zabezpieczyć roztwór przed światłem za pomocą folii aluminiowej. Wymieszać około 30 µL VLP o stężeniu 1 µg/µL z 60 µL fluoresceiny-5-maleimidu i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Przerwać reakcję poprzez dodanie DTT do końcowego stężenia 50 mM. Za pomocą kolumny odsolającej typu spin usunąć niereaktywną fluoresceinę. Aby zwizualizować VLP z dostępnymi resztami cysteiny do sieciowania, przeprowadzić analizę SDS-PAGE, dodając 10 µL buforu do próbek 2x do 10 µL każdej reakcji. Przechowywać znakowane białko w ciemności w temperaturze 4 °C do jednego miesiąca lub w alikwotach do jednorazowego użycia w temperaturze -20 °C do trzech miesięcy.Przygotuj świeży roztwór stokowy czynnika sieciującego, rozpuszczając 10 mg sieciującego NHS-PEG4-maleimidu w 680 µL dimetylosulfotlenku. Rozpuść peptyd o długości 17 (F)-aminokwasów w 50 µL buforu do konjugacji do uzyskania stężenia 0,1 mM. Dodaj 4 µL czynnika sieciującego do 50 µL rozpuszczonego peptydu, aby uzyskać stężenie końcowe 1 mM. Inkubuj reakcję przez dwie godziny w temperaturze 4 °C. Następnie oczyść produkt reakcji za pomocą kolumny odsolonej. Wykorzystując VLP z dostępnymi resztami cysteiny do sieciowania oraz usieciowany peptyd, przygotuj mieszaninę reakcyjną w stosunku molowym określonym przez liczbę grup tiolowych i aktywowanych grup aminowych uczestniczących w reakcji oraz różnicę w masie cząsteczkowej między VLP a peptydem. Po inkubacji reakcji przez dwie godziny w temperaturze pokojowej poddaj ją analizie za pomocą elektroforezy SDS-PAGE i western blottingu zgodnie z protokołem tekstowym.Poniżej przedstawiono przykład reaktywnych aminokwasów białka otoczki MRFV. Każdy wybrany aminokwas może zostać wykorzystany do przyłączenia grup funkcjonalnych, pod warunkiem że znajduje się on na powierzchni białka. Techniki chemiczne obejmują tradycyjne strategie biokoniugacji, takie jak acylowanie grupy aminowej lizyny, alkilowanie grupy sulfhydrylowej cysteiny oraz aktywacja reszt kwasów karboksylowych i ich sprzęganie z dodanymi aminami.Ponadto grupy aromatyczne tyrozyny i tryptofanu mogą być atrakcyjnymi celami dla biokoniugacji poprzez diazotowanie i alkilowanie. Przedstawiono tutaj dostępność rozpuszczalnika dla reszt Cys w VLP dla reagentów specyficznych względem grup tiolowych. Oczyszczone VLP typu dzikiego oraz mutanty cys-VLP posiadające reszty cysteiny w pozycjach 107–111 i 192–194 genu CP są nieaktywne w warunkach natywnych wobec reagentu specyficznego dla tioli. Fluoresceina-5-maleimid nadaje pomarańczową fluorescencję wyłącznie mutantowi Cys-VLP posiadającemu reszty cysteiny w pozycjach 125–129 genu CP. Wynik ten pokazuje, że VLP w ścieżce drugiej mają taką rozmieszczenie geometryczne reszt cysteiny, które skutkuje powstaniem dostępnych dla rozpuszczalnika wolnych grup tiolowych, podczas gdy reszty cysteiny w próbkach w ścieżkach pierwszej i trzeciej są prawdopodobnie zaangażowane w mostki dwusiarczkowe w strukturze białka otoczki. Reakcje znakowania z maleimid-PEG2-biotyną, a następnie test biotinylacji, stanowią kolejny przykład analizy dostępności rozpuszczalnika dla reszt cys. Ponieważ biotyna jest stosunkowo małą cząsteczką, może zostaćskoniugowana w wielu kopiach na VLP, z których każda łączy się z jedną cząsteczką awidyny, jak pokazano tutaj. Poziom biotinylacji, 84,74 mola biotyny na mol białka, wskazuje liczbę cząsteczek biotyny przyłączonych do VLP, a w konsekwencji liczbę ligandów, które mogą być eksponowane na powierzchni zewnętrznej. Dzięki dostępności kilku grup tiolowych na VLP, peptydy mogą być przyłączane za pomocą reakcji sieciowania z NHS-PEG4-maleimidem.Odczynnik ten jest heterobifunkcyjnym czynnikiem sieciującym, który zawiera końce reaktywne, takie jak N-hydroksysukcynimid lub ester NHS oraz grupy maleimidowe, co umożliwia kowalencyjną konjugację cząsteczek zawierających grupy aminowe i sulfhydrylowe. W tym przykładzie ester NHS reaguje z aminami pierwszorzędowymi, tworząc wiązania amidowe, natomiast maleimid reaguje z grupami sulfhydrylowymi, tworząc stabilne wiązania tioestrowe. Jak widać tutaj, reakcje sieciowania prowadzą do powstania kompleksów VLP-peptyd, które wykazują immunoreaktywność ze specyficznymi przeciwciałami w analizie western blot.Opracowanie to pokazuje badaczom z dziedziny wirusologii, w jaki sposób badać wykorzystanie cząsteczek wirusowych jako rusztowania do przyłączania szerokiej gamy ligandów w regularnym układzie geometrycznym w licznych zastosowaniach.

analysis-solvent-accessibility-cysteine-residues-on-maize-rayado-fino

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Analiza dostępności dla środków rozpuszczających reszt cysteiny na cząstkach podobnych do wirusa Maize rayado fino virus wytwarzanych w roślinach Nicotiana benthamiana oraz łączeniu peptydów do CPV

Niniejsze badanie opisuje metodę pozwalającą na szybką i jednoznaczną diagnostykę chorób wirusowych roślin w czasie około pół dnia, wykorzystując połączenie wspomaganego mikrofalowo przygotowania próbek roślinnych do transmisyjnej mikroskopii elektronowej oraz metod barwienia negatywowego.

Szybka diagnostyka chorób wirusowych roślin z wykorzystaniem wspomagania mikrofalowego za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Badanie oddziaływań białko-białko jest niezbędne do analizy funkcjonalności białek. W niniejszym materiale przedstawiamy test wiązania białko-białko in vitro, służący do badania interakcji między białkiem unieruchomionym w błonie a białkiem rozpuszczalnym. Test ten stanowi niezawodną metodę sprawdzania oddziaływań pomiędzy białkiem nierozpuszczalnym a białkiem w roztworze.

Analiza nakładkowa białek błonowych: protokół badania interakcji między białkami rozpuszczalnymi a nierozpuszczalnymi in vitro

Poziom reaktywnych form tlenu wzrasta, gdy komórki znajdują się w warunkach stresowych. Przedstawiamy tutaj przykład barwienia 3',3'-diaminobenzydyną oraz znakowania cysTMT i spektrometrii mas w celu profilowania proteomu redoks w liściach pomidora traktowanych Pseudomonas syringae.

Profilowanie proteomu redoks grup tiolowych z wykorzystaniem spektrometrii mas z tagowaniem izotopowym

Nanocząstki wirusowe pochodzenia roślinnego (VNPs) stanowią obiecujące platformy do zastosowań w biomedycynie. W niniejszym materiale opisujemy procedury propagacji, oczyszczania, charakteryzacji oraz biokoniugacji roślinnych VNP. Na koniec przedstawiamy zastosowanie VNP w celowanym dostarczaniu do guzów oraz obrazowaniu z wykorzystaniem modelu ksenoprzeszczepu u myszy i obrazowania fluorescencyjnego.

Nanocząsteczki wirusowe do obrazowania guzów in vivo

Ukierunkowana degradacja białek stanowi główny mechanizm regulujący funkcjonowanie komórki. Zachodzi za pośrednictwem konserwatywnego szlaku ubikwityna-proteasom, który przyłącza łańcuchy poliubikwityny do białka docelowego, które następnie służą jako molekularne "znaczniki" dla proteasomu 26S. W tym miejscu opisujemy prosty i niezawodny bezkomórkowy test proteasomalnej degradacji białek.

Oznaczanie degradacji proteasomalnej w systemie bezkomórkowym u roślin

Określenie struktury roztworu białka za pomocą rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) wymaga próbek monodyspersyjnych. W tym miejscu przedstawiamy dwie możliwości zapewnienia minimalnych opóźnień między przygotowaniem próbki a akwizycją danych: chromatografia wykluczania wielkości online (SEC) i chromatografia jonowymienna online (IEC).

Wykluczenie według wielkości i chromatografia jonowymienna online na linii badawczej SAXS

Analizy biochemiczne i strukturalne glikozylowanych białek wymagają stosunkowo dużej ilości jednorodnych próbek. W tym miejscu przedstawiamy skuteczną metodę chemiczną specyficznej dla miejsca glikozylacji rekombinowanych białek oczyszczonych z bakterii poprzez celowanie w reaktywne tiole Cys.

Ukierunkowanie tioli cysteinowych na glikozylację białek rekombinowanych in vitro specyficzną dla miejsca

Tutaj prezentujemy procedurę fluorescencyjnej funkcjonalizacji dwusiarczków na Qβ VLP za pomocą dibromomaleimidu. Opisujemy ekspresję i oczyszczanie Qβ, syntezę cząsteczek funkcjonalizowanych dibromomaleimidem oraz reakcję koniugacji między dibromomaleimidem a Qβ. Powstała w ten sposób żółta fluorescencyjna sprzężona cząstka może być używana jako sonda fluorescencyjna wewnątrz komórek.

Wytwarzanie indukowanych przez koniugację fluorescencyjnych pegylowanych cząstek wirusopodobnych za pomocą chemii dibromomaleimidowo-dwusiarczkowej

Przedstawiamy ogólny protokół identyfikacji krótkich odcinków homologicznych sekwencji białka gospodarz-patogen (SSHHPS) osadzonych w poliproteinie wirusa. SSHHP są rozpoznawane przez proteazy wirusowe i kierują ukierunkowanym niszczeniem określonych białek gospodarza przez kilka wirusów grupy IV.

Analiza wirusowych SSHHPS grupy IV przy użyciu metod in vitro i in silico

Ten protokół opisuje wybór optymalnych markerów plazmodesmalnych do analiz opartych na mikroskopii konfokalnej białek ukierunkowanych na plazmodesmat podczas interakcji wirus-plazmodesmata lub transportu plazmodesmalnego.

Mikroskopia konfokalna Analiza sortowania białek do plazmodesmatów u Nicotiana benthamiana

Poznaj metodę analizy dostępności rozpuszczalnikowej reszt cysteiny na powierzchni cząsteczek wirusopodobnych MRFV wytwarzanych w roślinach Nicotiana benthamiana oraz technikę sieciowania peptydów z VLP.

Analiza dostępności rozpuszczalników reszt cysteiny na cząstkach wirusopodobnych wirusa rayado fino kukurydzy wytwarzanych w roślinach Nicotiana benthamiana i sieciowanie peptydów z VLP (Wideo) | JoVE Journal

Analiza dostępności rozpuszczalników reszt cysteiny na cząstkach wirusopodobnych wirusa rayado fino kukurydzy wytwarzanych w roślinach Nicotiana benthamiana i sieciowanie peptydów z VLP

Przeglądaj więcej filmów