Name: Eksperymentalny nosiciel pneumokoków u ludzi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Poznaj metodę eksperymentalnego nosicielstwa pneumokoków u ludzi poprzez inokulację do nosa Streptococcus pneumoniae i monitoring płukaniami nosa. Ta technika umożliwia badanie odporności i rozwój szczepionek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została sfinansowana przez Fundację Billa i Melindy Gatesów (nagroda Grand Challenge Exploration dla SBG), National Institutes for Health Research (NIHR), Centrum Badań Biomedycznych w Chorobach Mikrobiologicznych oraz NIHR Comprehensive Local Research Network. Dziękujemy NWDA za wsparcie infrastrukturalne. Dziękujemy prof. J. N. Weiserowi z University of Pennsylvania i prof. P. Hermansowi z University of Nijmegen za izolaty pneumokoków. Dziękujemy Komitetowi Bezpieczeństwa EHPC za wsparcie i rady, wszystkim naszym wolontariuszom za udział oraz Mathieu Bangertowi za zrobienie zdjęć.

1. Selekcja i selekcja wolontariuszy
<ol>
	<li>Zdrowi ochotnicy są rekrutowani za pośrednictwem plakatów reklamowych i na stronie internetowej uniwersytetu zgodnie z wytycznymi Komisji ds. Badań i Etyki NHS.</li>
	<li>Kryteria uczestnictwa są następujące:
	<ol>
		<li>Dorośli w wieku 18-60 lat.</li>
		<li>Mówi płynnie po angielsku i jest w stanie łatwo komunikować się zarówno przez telefon komórkowy, jak i wiadomości tekstowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kryteria wykluczenia z udziału są następujące:
	<ol>
		<li>Bliski kontakt z osobami z grupy ryzyka (dzieci, dorośli z obniżoną odpornością, osoby starsze, przewlekle chore).</li>
		<li>Obecny palacz lub znacząca historia palenia (>10 paczkolat).</li>
		<li>Astma lub inna choroba układu oddechowego.</li>
		<li>ciąża.</li>
		<li>Alergia na penicylinę lub amoksycylinę.</li>
		<li>Obecny udział w innym badaniu klinicznym, chyba że jest to badanie obserwacyjne lub nieinterwencyjne.</li>
		<li>Nie można wyrazić w pełni świadomej zgody.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstępna wizyta przesiewowa, około tygodnia przed szczepieniem, obejmuje ukierunkowany wywiad kliniczny i ukierunkowane badanie kliniczne.</li>
	<li>Jeśli zostanie stwierdzona wcześniej nierozpoznana nieprawidłowość, ochotnik zostanie wykluczony z badania, a odpowiednie dochodzenie zostanie zorganizowane w ramach podstawowej opieki zdrowotnej.</li>
	<li>Podczas wstępnej wizyty przesiewowej pobierana jest pełna morfologia krwi, aby upewnić się, że liczba białych krwinek mieści się w normalnym zakresie przed wizytą inokulacyjną. Płukanie nosa przeprowadza się w celu wykluczenia naturalnych nosicieli pneumokoków (patrz 6.1).</li>
	<li>Przed szczepieniem ochotnicy są edukowani na temat ryzyka związanego z udziałem w badaniu i otrzymują ulotkę dla pacjenta w nagłych wypadkach, termometr cyfrowy, numery telefonów alarmowych i 3-dniową kurację amoksycyliną.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zapasów do inokulacji
<ol>
	<li>Przygotowanie zapasów do zaszczepiania musi odbywać się w czystym środowisku. Używane pipety powinny być używane wyłącznie do przygotowania inokulum. Wszystkie wyroby szklane i plastikowe powinny być sterylne. Zalecamy, aby zapasy do szczepień były przygotowywane w przeznaczonym do tego pomieszczeniu, przy użyciu dedykowanego dygestorium i inkubatora.</li>
	<li>Szczepy pneumokokowe zaszczepia się na płytce z agarem z krwią. Płytki inkubuje się w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez noc. Następnego dnia wszystkie bakterie są zeskrobywane z płytki agarowej z krwią i zaszczepiane do systemu konserwacji bulwiaków. Te naboje z kulek są używane do przygotowania wywaru do inokulacji. Przetestuj zapasy kulek pod kątem zanieczyszczenia i jednorodności kolonii przed przygotowaniem wywaru do inokulacji.</li>
	<li>Aby przygotować wywar do zaszczepiania, należy zaszczepić płytkę z agarem z krwią dwoma kulkami z pożądanego bulionu serologicznego pneumokoków, tworząc smugi pokrywające całą płytkę. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez noc. Wszystkie kolejne inkubacje będą wykorzystywać te same warunki. Inkubuj również pożywkę Vegitone przez noc, aby zapewnić sterylność.</li>
	<li>Następnego ranka przetrzyj połowę płytki, uważając, aby nie usunąć agaru z krwią, i dodaj do 12 ml podgrzanego bulionu Vegitone. Powtórz czynność używając drugiej połowy płytki. Pozostawić dwie fiolki o pojemności 12 ml w temperaturze 37 °C na 2 godziny lub do momentu, gdy zmiana zmętnienia stanie się widoczna, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej.</li>
	<li>Dodaj 12 ml do 40 ml podgrzanego bulionu Vegitone i dokładnie wymieszaj. Powtórzyć te czynności dla pozostałej fiolki o pojemności 12 ml. To jest punkt czasowy = 0. Usunąć 100 μl, aby odczytać gęstość optyczną (OD) przy 600 nm. Usunąć 20 μl w celu ilościowego określenia bakterii za pomocą liczby jednostek tworzących kolonie (CFU) przy użyciu odmiany metody Milesa i Misry (M&M)7. Inkubować obie fiolki.
	<ol>
		<li>W przypadku M&M podziel płytkę z agarem z krwią na sześć sekcji. Dodać 180 μl sterylnego PBS do sześciu dołków 96-dołkowej płytki (U-bottom). Dodaj 20 μl bulionu do wierzchu i dobrze wymieszaj. Seryjnie rozcieńczyć próbkę w stosunku 1:10 sześć razy i wyrzucić 20 μl z szóstego dołka. Umieść trzy krople o wielkości 10 μl od góry w pierwszej części płytki z agarem do krwi. Powtórz tę czynność dla pozostałych pięciu dołków. Upewnij się, że płytka jest sucha przed odwróceniem i inkubacją.</li>
		<li>Następnego dnia policz liczbę widocznych kolonii w każdej sekcji rozcieńczenia i zapisz. Korzystając z sekcji rozcieńczania z liczbą od 30 do 300, podziel liczbę widocznych kolonii przez trzy, aby uzyskać średnią.</li>
		<li>Pomnóż średnią liczbę kolonii przez współczynnik rozcieńczenia, a następnie podziel przez 10 (ilość kropli 10 μl). Daje to CFU/μl.</li>
		<li>Pomnóż tę liczbę przez 1,000, aby uzyskać jtk/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonuj odczyty OD 600 i oznaczanie ilościowe bakterii metodą M&M co godzinę, aż do osiągnięcia wczesnej fazy środkowej logarytmu, OD 0,25.</li>
	<li>Po osiągnięciu tego OD dodać wysterylizowany 10% glicerol do jednej fiolki i przygotować 1 ml porcji. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>W celu uzyskania bardziej skoncentrowanego wywaru, odwirować drugą fiolkę o stężeniu 3,345 x g przez 15 minut i usunąć supernatant. Zawiesić osad w 22,5 ml pożywki Vegitone i dodać 10% glicerolu. Przygotować 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Pozostawić zapasy w temperaturze -80 °C na co najmniej 48 godzin przed rozmrożeniem i oceną ilościową.</li>
	<li>Określić ilościowo zamrożony materiał bakteryjny metodą M&M. Przetestuj trzy probówki wyjściowe indywidualnie, aby zapewnić powtarzalność. Uzyskaną wartość należy wykorzystać do rozcieńczenia wywaru do pożądanego stężenia inokulum w roztworze soli, jak opisano poniżej.</li>
	<li>W przypadku inokulacji ilość pneumokoków w inokulum oblicza się przed i po inokulacji. To oznaczanie ilościowe bakterii metodą M&M służy do określenia średniej liczby pneumokoków w inokulum, co odpowiada czasowi potrzebnemu do zakończenia całej procedury.
	<ol>
		<li>Przygotować inokulum, rozcieńczając do pożądanego stężenia, i przeprowadzić oznaczanie ilościowe metodą M&M dla liczby "przed inokulacją".</li>
		<li>W naszym Ośrodku Badań Klinicznych wykonanie całej procedury inokulacji zajmuje zespołowi 30 minut. Zawiesiny pneumokokowe w soli fizjologicznej zwykle wykazują zmniejszoną liczbę w tym okresie. Aby to uwzględnić, pozostawiamy rozcieńczone inokulum w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie przeprowadzamy "poinokulacyjną" ocenę ilościową bakterii metodą M&M.</li>
		<li>Weź średnią przed i po, aby określić końcowe stężenie inokulacji. Dostosuj czas "siedzenia" zgodnie z protokołem klinicznym, ale utrzymuj odstęp tak krótki, jak to możliwe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wszystkie nowe zapasy powinny zostać wysłane do laboratorium referencyjnego w celu potwierdzenia czystości i tożsamości stada.</li>
</ol>
3. Przygotowanie inokulum
<ol>
	<li>Przygotowanie inokulum należy rozpocząć na 30 minut przed planowanym terminem szczepienia ochotnika.</li>
	<li>Wyjąć jedną z wcześniej przygotowanych probówek z zamrażarki w temperaturze -80 °C, rozmrozić ją i obracać probówkę w mikrowirówce o stężeniu 17 000 x g przez 3 minuty.</li>
	<li>Ciepłe płytki z agarem z krwią w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Przygotować 96-dołkową płytkę do oznaczania ilościowego bakterii metodą M&M i przygotować probówki rozcieńczające zgodnie z pożądaną dawką.</li>
	<li>Usunąć supernatant bulionowy z probówki odwirówkowej i ponownie zawiesić osad w 1 ml soli fizjologicznej. Ten krok usuwa bulion z inokulum.</li>
	<li>Powtórz etap wirowania.</li>
	<li>Usunąć supernatant soli fizjologicznej i ponownie zawiesić osad w 1 ml soli fizjologicznej.</li>
	<li>Wykonać zestaw do rozcieńczania dla pożądanego stężenia inokulum i określić ilościowo metodą M&M.</li>
	<li>Zanieś inokulum na spotkanie z ochotnikiem i po zaszczepieniu ochotników powtórz oznaczanie ilościowe w laboratorium. Oznaczyć probówkę datą i dawką inokulum i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Aby zapewnić spójność od inokulacji do inokulacji, ważne jest, aby za każdym razem używać tych samych pipet i dedykowanego sprzętu laboratoryjnego.</li>
</ol>
4. Szczepienie
<ol>
	<li>Ochotnicy powinni siedzieć wygodnie w pozycji półleżącej.</li>
	<li>Za pomocą pipety P200 i sterylnych końcówek filtrujących pobrać 100 μl inokulum i wprowadzić końcówkę bezpośrednio do jamy nosowej.</li>
	<li>Powoli wydal inokulum na błonę śluzową nosa okrężnymi ruchami.</li>
	<li>Bardzo ważne jest, aby końcówka pipety nie stykała się z błoną śluzową nosa, ponieważ naruszenie integralności nabłonka może spowodować przedostanie się bakterii do krwiobiegu.</li>
	<li>Ważne jest również, aby inokulum nie było umieszczone zbyt daleko z tyłu, ponieważ będzie spływać do gardła; powinno znajdować się w jamie nosowej.</li>
	<li>Powtórz dla drugiego naris.</li>
	<li>Niech ochotnik pozostanie w pozycji półleżącej przez 10 minut bez wąchania lub wydmuchiwania nosa. Daje to czas na rozproszenie się bakterii po błonie śluzowej.</li>
</ol>
5. Monitorowanie
<ol>
	<li>Ochotnicy są monitorowani codziennie po zaszczepieniu. Obejmuje to codzienną wiadomość tekstową wysyłaną przez wolontariusza do śledczych przed godziną 14.</li>
	<li>Jeśli wiadomość nie zostanie otrzymana do godziny 14, skontaktujemy się z wolontariuszem w celu zapewnienia mu dobrego samopoczucia. Jeśli wolontariusz nie odpowie, skontaktuje się z wyznaczoną mu najbliższą rodziną w celu zapewnienia dobrego samopoczucia wolontariusza.</li>
	<li>Wolontariusze proszeni są o zgłaszanie wszelkich objawów ze strony górnych dróg oddechowych podczas każdej wizyty. Personel kliniczny poprosi ochotnika o opisanie jego objawów i podejmie działania następcze w przypadku wszelkich dolegliwości.</li>
	<li>Antybiotyki podawane ochotnikom mogą być przyjmowane tylko w trzech okolicznościach: w przypadku, gdy chorzy są chorzy i zostali poinstruowani, aby je przyjąć przez zespół badawczy, jeśli są nosicielami pneumokoków pod koniec badania lub jeśli źle się czują i nie są w stanie skontaktować się z zespołem badawczym. Ochotnik jest zachęcany do noszenia tego pakietu ratunkowego przy sobie przez cały czas trwania badania i jest proszony o codzienne kontaktowanie się z zespołem badawczym przez następne 7 dni.</li>
	<li>Nasz zespół jest dostępny 24 godziny na dobę, 7 dni w tygodniu, z pielęgniarką kontaktową w godzinach pracy i dwoma lekarzami dostępnymi poza godzinami pracy. Wszystkie zapytania są rozpatrywane telefonicznie i/lub w trybie natychmiastowym. W razie potrzeby dostępne są przepisy umożliwiające natychmiastowe, bezpośrednie przyjęcie na oddział chorób zakaźnych.</li>
</ol>
6. Procedura płukania nosa (NW)
<ol>
	<li>Płukanie nosa (NW) wykonuje się podczas wstępnej wizyty przesiewowej, a także 48 godzin, 7 i 14 dni po szczepieniu. Zastosowana metoda NW została zaczerpnięta z Naclerio et al.8 Ochotnicy naturalnie skolonizowani przez S. pneumoniae są wykluczeni z inokulacji i obserwacji.</li>
	<li>Ochotnik siedzi wygodnie, a głowa jest odchylona do tyłu o 30° od pionu.</li>
	<li>Poproś ochotnika, aby wziął głęboki wdech i wstrzymał oddech, jednocześnie popychając język w górę i do tyłu na podniebienie. Będąc w tej pozycji, wolontariusz jest proszony o zasygnalizowanie, że jest gotowy.</li>
	<li>Strzykawkę wypełnioną 20 ml soli fizjologicznej wprowadza się do przedniej przestrzeni nosowej i wydala się 5 ml soli fizjologicznej. Następnie ochotnik natychmiast pochyla się do przodu i wydala płyn, szybko wydychając powietrze przez nos do foliowej miski.</li>
	<li>Powtórz tę procedurę jeszcze 3 razy, tak aby każdy naris został umyty dwukrotnie i zużyto pełne 20 ml.</li>
	<li>Zebrać wszystkie próbki razem w probówce wirówkowej i wysłać do laboratorium w temperaturze pokojowej w celu przetworzenia.</li>
</ol>
7. Przetwarzanie płukania nosa
<ol>
	<li>Odwirowywać próbki przez 10 minut przy 3,345 x g.</li>
	<li>Usunąć supernatant i przechowywać w postaci 1 ml podwielokrotności w oznakowanych probówkach Eppendorfa w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Do granulatu dodać 100 μl pożywki STGG9 i dokładnie wymieszać. Upewnij się, że całkowita objętość w probówce w tym momencie jest określona. Rozcieńczenie to zostanie wykorzystane do obliczenia CFU NW o dodatnim przewodzeniu.</li>
	<li>Umieścić na płytce o objętości 20 μl kropli STGG zawierającej ponownie zawieszony osad na płytce z agarem z krwią zawierającej gentamycynę i pokryć ją smugami.
	<ol>
		<li>Jeżeli NW jest po inokulacji, usunąć 10 μl z STGG zawierającego ponownie zawieszony osad i użyć do oznaczania ilościowego bakterii metodą M&M.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj kolejne 800 μl STGG do probówki NW i dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Umieść 25 μl na płytce z agarem z krwią i 25 μl na płycie z agarem czekoladowym, rozsypując smugi na całej płytce.</li>
	<li>Pozostałą ilość bakterii zawieszonych w pożywce STGG podzielić na 2 kriowiale i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc w 5% CO2 .</li>
	<li>Następnego dnia należy zbadać płytki pod kątem pneumokoków i innych potencjalnych patogenów układu oddechowego.</li>
	<li>Pneumokoki są identyfikowane na płytkach na podstawie morfologii kolonii. Kolonie alfa hemolityczne o morfologii rysownika są hodowane na agarze z krwią za pomocą krążka optochiny i inkubowane przez noc.</li>
	<li>Przypuszczalne kolonie pneumokoków, które są wrażliwe na optochinę, są barwione metodą Grama w celu potwierdzenia Gram-dodatnich diplocokoków i serotypowane przy użyciu zestawu Statens Serum Institut Pneumotest-Latex.</li>
</ol>

<ol><li>Ferreira, D. M., Jambo, K. C., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+human+pneumococcal+carriage+models+for+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Experimental human pneumococcal carriage models for vaccine research.</a> Trends in Microbiology. 19, 464-470 (2011).</li>
<li>Mera, R., Miller, L. A., Fritsche, T. R., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+and+multiple+resistance+in+Streptococcus+pneumoniae+after+the+introduction+of+the+conjugate+pneumococcal+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Drug+Resistance%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement and multiple resistance in Streptococcus pneumoniae after the introduction of the conjugate pneumococcal vaccine.</a> Microbial Drug Resistance. 14, 101-107 (2008).</li>
<li>Tocheva, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Declining+serotype+coverage+of+new+pneumococcal+conjugate+vaccines+relating+to+the+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae+in+young+children%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Declining serotype coverage of new pneumococcal conjugate vaccines relating to the carriage of Streptococcus pneumoniae in young children.</a> Vaccine. 29, 4400-4404 (2011).</li>
<li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).</li>
<li>Wu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+Streptococcus+pneumoniae+nasopharyngeal+colonization+model+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice.</a> Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).</li>
<li>Wright, A. K. A., Ferreira, D. M., Gritzfeld, J. F., Wright, A. D., Armitage, K., Jambo, K. C., Bate, E., Batrawy, S. E. l, Collins, A., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Nasal+Challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+is+Immunising+in+the+Absence+of+Carriage%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Human Nasal Challenge with Streptococcus pneumoniae is Immunising in the Absence of Carriage.</a> PloS Pathogens. 8 (4), e1002622(2012).</li>
<li>Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+estimation+of+the+bactericidal+power+of+the+blood%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">The estimation of the bactericidal power of the blood.</a> The Journal of Hygiene. 38, 732-749 (1938).</li>
<li>Naclerio, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediator+release+after+nasal+airway+challenge+with+allergen%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Rev.+Respir.+Dis%22%5BJournal%5D)">Mediator release after nasal airway challenge with allergen.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 128, 597-602 (1983).</li>
<li>O'Brien, K. L., Nohynek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+from+a+WHO+working+group%3A+standard+method+for+detecting+upper+respiratory+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Infect.+Dis+J%22%5BJournal%5D)">Report from a WHO working group: standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae.</a> Pediatr. Infect. Dis J. 22, 133-140 (2003).</li>
<li>Gritzfeld, J. F., Roberts, P., Roche, L., Batrawy, S. E. l, Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+nasopharyngeal+swab+and+nasal+wash%2C+using+culture+and+PCR%2C+in+the+detection+of+potential+respiratory+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Comparison between nasopharyngeal swab and nasal wash, using culture and PCR, in the detection of potential respiratory pathogens.</a> BMC Research Notes. 4, 122(2011).</li>
<li>McCool, T. L., Cate, T. R., Moy, G., Weiser, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+to+pneumococcal+proteins+during+experimental+human+carriage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage.</a> J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Platforma EHPC ma szereg potencjalnych zastosowań, w tym jako model szczepionki błony śluzowej oraz jako substytut ochrony do testowania nowych szczepionek białkowych. Metoda opiera się na spójnej technice inokulacji i wysokiej jakości NW.
Odtwarzalność może być problemem w przypadku inokulum. Ze względu na zmienny charakter zamrożonych podwielokrotności bakteryjnych odtworzenie pożądanej dawki może być trudne. Uważa się, że zmniejszenie o połowę lub podwojenie pożądanej dawki mieści się w zakresie. Bardzo ważne jest, aby kwantyfikacja bakterii została przeprowadzona bezpośrednio przed i po inokulacji, w celu dokładnego określenia ilościowego stężenia bakterii na podstawie liczby CFU. Z tego powodu może być pomocne, jeśli spotkania z ochotnikami odbywają się równocześnie, tak aby trzeba było przygotować tylko jedno inokulum, a posiew kwantyfikacyjny wykonany przed i po inokulacji odbywa się w odstępie nie dłuższym niż 30 minut.
Metoda NW wymaga współpracy wolontariusza i nie byłaby idealną metodą u dzieci. Jeśli wydajność jest mniejsza niż 5 ml, procedurę można powtórzyć, używając do dodatkowych 20 ml. Noszenie protez zębowych może zmniejszyć wydajność NW. Jeśli ochotnik ma zatkany nos, a sól fizjologiczna wypływa z przodu po włożeniu, przedmuchaj nos, włóż strzykawkę nieco dalej do tyłu i w razie potrzeby odchyl głowę bardziej do tyłu.
NW to technika, która staje się lepsza wraz z praktyką. Zwykle część objętości zostanie utracona, więc celem jest zwrot co najmniej 10 ml. Jeśli ochotnik odczuwa smak soli fizjologicznej podczas NW, oznacza to, że połączenie między tylną częścią nosogardzieli a częścią ustno-gardłową nie zostało odpowiednio zamknięte przez język ochotnika. Jeśli ochotnik połknie większość soli fizjologicznej, wyjaśnij procedurę ponownie, kładąc nacisk na dociskanie języka do podniebienia. Następnie powtórz procedurę, aby zwiększyć zwróconą głośność.
Jeśli NW zawiera znaczną ilość śluzu, najlepiej usunąć go przed odwirowaniem. Spulchnij próbkę, aby poluzować wszystko, co może być związane ze śluzem, a następnie usuń jak najwięcej dużych kawałków, usuwając jak najmniej soli fizjologicznej.
Poprzednie badanie EHPC w USA zostało przeprowadzone bezpiecznie i nie wykazało żadnych zdarzeń niepożądanych11. Aby zapewnić ciągłe bezpieczeństwo platformy EHPC, ustaliliśmy protokół awaryjny, który opiera się na 24-godzinnym dostępie do zespołu badawczego. Ochotnicy otrzymują dane kontaktowe, dzięki czemu mają dostęp do zespołu badawczego 24 godziny na dobę. Wszelka potrzebna opieka medyczna jest świadczona w Szpitalu Uniwersyteckim Royal Liverpool. Jako kolejny środek ochrony, komitet ds. bezpieczeństwa składający się z klinicystów i naukowców spoza grupy badawczej otrzymuje cotygodniowy raport bezpieczeństwa. Raport zawiera dawkę bakteryjną, którą otrzymał każdy ochotnik oraz informację, czy zgłoszono jakiekolwiek objawy lub chorobę. Raport ten pozwala na zewnętrzną krytykę bezpieczeństwa badania bez uprzedzeń. Komitet ds. bezpieczeństwa jest również dostępny 24 godziny na dobę w mało prawdopodobnym przypadku wystąpienia sytuacji awaryjnej.

<table><tbody><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher</td><td>G/0650/08</td><td></td></tr><tr><td>0,9% Chlorek sodu</td><td>B. Braun</td><td>3627667</td><td></td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko w proszku</td><td>Fluka</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>Bulion sojowy tryptonowy</td><td>Becton Dickinson</td><td>211768</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>BDH</td><td>284504S</td><td></td></tr><tr><td>Columbia Agar z czekoladową krwią końską</td><td>Oxoid</td><td>PB0124</td><td></td></tr><tr><td> Pneumotest-zestaw lateksowy</td><td>Statens Serum Institut</td><td>51823</td><td></td></tr></tbody></table>

eksperymentalny nosiciel pneumokoków u ludzi

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Eksperymentalne nosicielstwo ludzkiej pneumokoki (EHPC) jest naukowo ważne, ponieważ nosicielstwo Streptococcus pneumoniae w nosogardzieli jest zarówno głównym źródłem transmisji, jak i warunkiem wstępnym choroby inwazyjnej. Model nosicielstwa pozwoli na dokładne określenie immunologicznych korelatów ochrony, uodparniającego efektu nosicielstwa oraz wpływu nacisku gospodarza na patogen w niszy nosowo-gardłowej. Ponadto można porównać metody wykrywania nosicielstwa przydatne w badaniach epidemiologicznych, w tym w badaniach nad szczepionkami.
Cel
Naszym celem jest opracowanie platformy EHPC, która jest bezpieczną i użyteczną powtarzalną metodą, która mogłaby być wykorzystana do selekcji kandydatów na nowe szczepionki przeciwko pneumokokom z zapobieganiem nosicielstwu jako substytut odporności indukowanej szczepionką. Będzie on pracował nad testowaniem potencjalnych szczepionek i opisami mechanizmów leżących u podstaw EHPC i ochrony poszczepiennej od nosicielstwa1. Obecnie skoniugowane szczepionki przeciwko pneumokokom chronią dzieci przed chorobami inwazyjnymi, chociaż pilnie potrzebne są nowe szczepionki, ponieważ obecna szczepionka nie zapewnia optymalnej ochrony przed niebakteriemicznym zapaleniem płuc i istnieją dowody na zastąpienie serotypów serotypami2-4 nieszczepionkowymi.
Metoda
Zaszczepiamy S. pneumoniae zawieszone w 100 μl soli fizjologicznej. Bezpieczeństwo jest głównym czynnikiem w rozwoju modelu EHPC i jest osiągane poprzez intensywne badania przesiewowe i monitorowanie ochotników. Komitet ds. bezpieczeństwa składający się z klinicystów i naukowców, którzy są niezależni od badania, co tydzień dostarcza obiektywnych informacji zwrotnych.
Inokulum bakteryjne jest ustandaryzowane i wymaga, aby ochotnikom nie szczepiono żadnych produktów pochodzenia zwierzęcego (pożywki roślinne i sól fizjologiczna). Dawki wymagane do kolonizacji (10,4-10,5) są znacznie niższe niż te stosowane w modelach zwierzęcych (10,7)5. Wykrywanie nosicielstwa pneumokoków jest wspomagane przez dużą objętość (najlepiej >10 ml) płynu do płukania nosa, który jest stosunkowo wolny od śluzu. Protokół ten będzie po kolei zajmował się najważniejszymi częściami protokołu. Są to: (a) selekcja ochotników, (b) przygotowanie inokulum pneumokoków, (c) inokulacja, (d) obserwacja i (e) wykrywanie nosicielstwa.
Wyniki
Nasz obecny protokół był bezpieczny dla ponad 100 ochotników w różnych dawkach przy użyciu dwóch różnych serotypów bakteryjnych6. Obecnie prowadzone jest badanie zakresu dawek z użyciem S. pneumoniae 6B i 23F w celu określenia optymalnej dawki inokulacji dla 50% nosicielstwa. Przewidywany 50-procentowy wskaźnik nosicielstwa pozwoli modelowi EHPC na wysoką czułość skuteczności szczepionki przy małej liczbie badań.

Mamy doświadczenie w inokulacji 159 osób, z których 35 wykazywało kolonizację pneumokokami. Najniższa dawka serotypu 6B, przy której uzyskano kolonizację, wynosiła 11 100 CFU/100 μl na każdą dziurkę nosowa, natomiast najwyższa dawka wynosiła 313 000 CFU/100 μl na każdą dziurkę nosową. Najniższa dawka serotypu 23F, przy której uzyskano kolonizację, wynosiła 9 000 CFU/100 μl na każdą dziurkę nosową, a najwyższa dawka wynosiła 84 500 CFU/100 μl na każdą dziurkę nosową.
Naszą metodą oceny kolonizacji jest płukanie nosa, wybrane ze względu na niedawne badanie10, które wykazało, że 91% ochotników uznało płukanie nosa za bardziej komfortowe niż wymaz z nosogardzieli; płukanie nosa częściej pozwalało również na wykrycie patogenów za pomocą hodowli mikrobiologicznej. Flora mikrobiologiczna uzyskana na płytkach z agarem krwi zaszczepionych materiałem z płukania nosa może być zróżnicowana i trudna do interpretacji. Gentamycynę stosuje się na pierwszej płytce z agarem krwi w celu selekcji pneumokoków. Płytka z agarem czekoladowym oraz druga płytka z agarem krwi służą do wykrywania innych potencjalnych patogenów układu oddechowego, które mogą wspomagać lub utrudniać kolonizację pneumokokową. Przykład łatwej do interpretacji płytki z agarem krwi zaszczepionej materiałem z płukania nosa przedstawiono na Rysunku 1a; trudna do interpretacji płytka zawierająca liczne rodzaje flory przedstawiona jest na Rysunku 1b.
Podczas każdej wizyty wolontariusze byli proszeni o opisanie wszelkich objawów ze strony górnych dróg oddechowych, jeśli wystąpiły, a następnie podkreślono różnice między nosicielami a osobami niebędącymi nosicielami. Spośród 145 osób niedawno inokulowanych pneumokokami, 28 skarżyło się na wystąpienie objawów (Tabela 1). Ośmiu z nich było nosicielami, a dwudziestu nie. Najczęstszymi objawami były nieswoiste dolegliwości nosa (Tabela 1). W przypadkach, w których zgłoszono objawy ogólnoustrojowe, w tym gorączkę i/lub złe samopoczucie, żadne z przeprowadzonych badań nie wykazało dowodów na chorobę pneumokokową, a objawy były zgodne z jednoczesną infekcją wirusową, z wyjątkiem jednego przypadku zapalenia migdałków. Dwóch wolontariuszy z dodatnim wynikiem w kierunku pneumokoków leczono antybiotykami. Jeden skarżył się na ból gardła i ucha i po konsultacji z lekarzem prowadzącym badanie zalecono mu przyjęcie antybiotyków profilaktycznie. U drugiego wolontariusza klinicznie zdiagnozowano zapalenie migdałków. U wszystkich wolontariuszy objawy ustąpiły szybko.
<img alt="Wzrost bakterii na płytkach z agarem, porównanie kolonii, eksperyment mikrobiologiczny, szalki Petriego." src="/files/ftp_upload/50115/50115fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Płytka z agarem krwią posiana NW. Odczyt płytek z agarem krwią posianych NW może być utrudniony. 1a przedstawia przykład płytki łatwej do odczytu, na której pneumokoki są wyraźnie widoczne. 1b przedstawia płytkę z liczną florą współkolonizującą, co utrudnia wykrycie obecności pneumokoków.
<table border="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Objawy</td>
			<td> </td>
			<td >Nośnictwo (n=32)</td>
			<td >Brak nośnictwa (n=112)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wszystkie objawy</td>
			<td> </td>
			<td >24%</td>
			<td >18%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ogólnoustrojowe</td>
			<td >Gorączka</td>
			<td >3%</td>
			<td >4%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td> </td>
			<td >Źle samopoczucie*</td>
			<td >9%</td>
			<td >4%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Miejscowe</td>
			<td >Uszy</td>
			<td >9%</td>
			<td >3%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td> </td>
			<td >Nos</td>
			<td >0</td>
			<td >10%</td>
		</tr>
		<tr >
			<td> </td>
			<td >Gardło</td>
			<td >12%</td>
			<td >3%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Charakterystyka objawów zgłoszonych przez ochotników po inokulacji S. pneumoniae 6B. Wszystkie dolegliwości zostały przeanalizowane przez zewnętrzny komitet ds. bezpieczeństwa i po pełnym dochodzeniu stwierdzono, że żadne z objawów nie wynikało z choroby pneumokokowej. Najczęstszymi objawami były ból gardła, zatkany nos i objawy grypopodobne.

Eksperymentalne nosicielstwo ludzkiej pneumokoki oferuje naturalny model nosicielstwa i potencjalny model do wykorzystania w opracowywaniu szczepionek. Technika ta jest cenna, ale złożona i wiąże się z ryzykiem klinicznym związanym z wprowadzeniem patogenu do organizmu człowieka. Opracowaliśmy szczegółowy protokół.

Eksperymentalny nosiciel pneumokoków u ludzi

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Celem tej procedury jest ustalenie eksperymentalnego nosicielstwa pneumokoków u ludzi. Osiąga się to poprzez uprzednie rozcieńczenie i ilościowe określenie bakterii w inokulum. W drugim etapie ochotnik jest inokulowany donosowo Streptococcus pneumoniae.Następnie ochotnik ma przepłukanie nosa w drugim, siódmym i czternastym dniu po szczepieniu. Wreszcie, klasyczna mikrobiologia jest używana do określenia, czy ochotnik jest nosicielem zaszczepionej potnicy. Ostatecznie, eksperymentalne nosicielstwo pneumokoków u ludzi może być uzyskane przy użyciu tej bezpiecznej i powtarzalnej metody.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi modelami wózków mysich jest to, że technika ta oferuje model noszenia w naturalnym żywicielu pneumokoków, człowieku. Co więcej, metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie pneumokoków, takie jak: jakie są immunologiczne korelaty ochrony? Jaki jest immunizujący efekt nosicielstwa i jaki jest wpływ nacisku gospodarza na patogen w niszy nosowo-gardłowej?Zastosowania tej techniki obejmują jej zastosowanie jako metody selekcji nowych szczepionek przeciwko pneumokokom. Planujemy wykorzystać profilaktykę nosicielstwa jako substytut odporności poszczepiennej. Technikę kliniczną zademonstrują Siostra Angie Wright i pielęgniarz David Shaw.30 minut przed planowaną wizytą ochotnika w probówce z inokulum pobranej z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie odwiruj inokulum tho w mikrowirówce przez trzy minuty po 17 000 razy. G, podczas gdy probówka się obraca, ogrzej kilka płytek z agarem z krwią w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie usuń bulion z inokulum wirówki i umyj granulki w jednym mililitrze soli fizjologicznej. Powtórz etap wirowania i mycia. Wykonaj zestaw rozcieńczeń dla pożądanego stężenia inokulum, a następnie określ ilościowo ilość bakterii w inokulum metodą podobną do mili i misry.Wyrosłe kolonie staną się widoczne następnego dnia. Zanieś inokulum ochotnikowi, który powinien wygodnie siedzieć w pozycji półleżącej. Następnie za pomocą P 200 perpe i sterylnych końcówek filtrujących.Wciągnij 100 mikrolitrów inokulum do końcówki perpe i włóż końcówkę do wnętrza jamy nosowej. Powoli wydal inokulum na błonę śluzową nosa okrężnymi ruchami. Nie należy umieszczać końcówki pipety zbyt daleko z tyłu, ponieważ inokulum spłynie do gardła.Powtórz inokulację dla drugiego naris, aby uniknąć przedostania się bakterii do krwiobiegu. Uważaj, aby nie naruszyć błony śluzowej za pomocą pipety. Następnie niech ochotnik pozostanie w pozycji półleżącej przez 10 minut, aby bakterie mogły rozprzestrzenić się po błonie śluzowej.Po podaniu inokulum ochotnikom, powtórz oznaczanie ilościowe bakterii w laboratorium. Następnie oznacz probówkę datą i dawką inokulum i przechowuj inokulum w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Przed rozpoczęciem płukania nosa poproś ochotnika, aby usiadł wygodnie z głową odchyloną do tyłu o 30 stopni od pionu.Następnie poproś ochotnika, aby wziął i wstrzymał głęboki oddech, jednocześnie popychając język w górę i do tyłu na podniebienie. Niech ochotnik da sygnał, gdy ta pozycja zostanie osiągnięta. Teraz przemyj jamę nosową cztery razy 20 mililitrami soli fizjologicznej, wypuszczając jednorazowo pięć mililitrów soli fizjologicznej do przedniej przestrzeni nosowej.Niech ochotnik natychmiast pochyli się do przodu i szybko wydycha powietrze przez nos do foliowej miski, aby wydalić płyn po każdym pięciomililitrowym spłukiwaniu solą fizjologiczną. Po umyciu jamy nosowej czterema 20 mililitrami, zebrać wszystkie zebrane próbki razem w probówce wirówkowej. Teraz odwiruj próbki z ochotniczego płukania nosa przez 10 minut w temperaturze 3, 345 razy G. Usuń supinat i przechowuj go jako jednomililitrowe porcje w oznakowanych probówkach einor w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Dodaj 100 mikrolitrów pożywki STGG do granulki i dokładnie wymieszaj, a następnie określ całkowitą objętość w probówce. Następna płytka, 20 mikrolitrów kropli zawieszonego osadu na płytce z agarem z krwią zawierającej gentamycynę i rozprowadź smugi na całej płytce. Jeśli płukanie nosa następuje po inokulacji, należy użyć 10 mikrolitrów STGG zawierającego zawieszone osady.W celu ilościowego określenia ilości bakterii metodą mil i Misry, dodaj kolejne 800 mikrolitrów STGG do rurki do płukania nosa i dokładnie wymieszaj. Następnie rozłóż 25 mikrolitrów roztworu komórek bakteryjnych STGG na inną płytkę z agarem z krwią i 25 mikrolitrów na płytce z agarem czekoladowym, pokrywając całość obu płytek. Następnie zamroź pozostałe bakterie w dwóch fiolkach kriograficznych w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc w 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia zbadaj płytki pod kątem pneumokoków i innych potencjalnych patogenów układu oddechowego. Płytki z agarem z krwią, zaszczepione płynami do płukania nosa, mogą być trudne do odczytania.To zdjęcie przedstawia przykład tabliczki, która jest łatwa do odczytania z wyraźnie widocznymi pneumokokami. Tabliczka ta zawiera jednak wiele flory kokolonizacyjnej, co utrudnia określenie, czy pneumokoki są obecne podczas każdej wizyty. Ochotników poproszono o opisanie wszelkich objawów ze strony górnych dróg oddechowych, jeśli występowały, oraz podkreślono porównanie między nosicielami i osobami niebędącymi nosicielami.Spośród 145 osób niedawno zaszczepionych pneumokokami, 28 skarżyło się na objawy, które podsumowano w poniższej tabeli. Ośmiu z tych ochotników było nosicielami, 20 nie. Wszystkie skargi zostały rozpatrzone przez Komitet ds. Bezpieczeństwa Zewnętrznego i poprzedzone pełnym dochodzeniem.Choroby pneumokokowej nie przypisano żadnych objawów. Najczęstszymi objawami były ból gardła, zatkany nos i choroba grypopodobna. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby mieć bardzo dokładny plan bezpieczeństwa, który obejmuje każdy etap metody, szczególnie dla bezpieczeństwa ochotników.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ustalić eksperymentalne nosicielstwo pneumokoków u ludzi i wykryć nosicielstwo za pomocą płynu do płukania nosa.

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Eksperymentalne ludzkie nosicielstwo pneumokoków

Źródło: Jagau, H. i wsp. Zakażenie Pneumokokami pierwotnych komórek śródbłonka człowieka w stałym przepływie. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje wizualizację w czasie rzeczywistym przyczepiania się pneumokoków do sznurków czynnika von Willebranda (VWF) na komórkach śródbłonka w warunkach stałego przepływu pożywki. Przedstawiono w nim etapy stymulowania uwalniania VWF, znakowania strun i ilościowego określania wiązania bakterii.

Ocena przyczepiania się pneumokoków do pierwotnych komórek śródbłonka człowieka przy stałym przepływie pożywki

Opisano kolonizację mysiego nosogardzieli Streptococcus pneumoniae i późniejszą ekstrakcję przylegających lub zrekrutowanych komórek. Technika ta polega na przepłukiwaniu nosogardzieli i zbieraniu płynu przez nozdrza i można ją dostosować do różnych odczytów, w tym różnicowej kwantyfikacji komórek i analizy ekspresji mRNA in situ.

Charakterystyka reakcji zapalnych podczas kolonizacji donosowej Streptococcus pneumoniae

Testy przestrzegania zaleceń in vitro mogą być wykorzystane do badania przyczepiania się Streptococcus pneumoniae do monowarstw komórek nabłonka i do zbadania potencjalnych interwencji, takich jak użycie probiotyków do hamowania kolonizacji pneumokoków.

Badanie wpływu probiotyków na kolonizację pneumokoków za pomocą testu przylegania in vitro

Śledzenie w czasie rzeczywistym wpływu czynników wirulencji pneumokoków w modelu ostrego mysiego zapalenia płuc z wykorzystaniem bakterii bioluminescencyjnych

W literaturze opisano kilka metod modelowania bakteryjnego zapalenia płuc u myszy. W niniejszym artykule opisano nieinwazyjną, niedrogą i szybką metodę wywoływania zapalenia płuc poprzez aspirację (tj. wdychanie) inokulum bakteryjnego pipetowanego do jamy ustnej i gardła. Szczegółowo opisano również dalsze metody oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej płuc.

Nieinwazyjna i technicznie nieintensywna metoda indukcji i fenotypowania eksperymentalnego bakteryjnego zapalenia płuc u myszy

Opisano metodę wykrywania infekcji płuc u gryzoni immunokompetentnych. Przy wprawdzie metodę tę można szybko i łatwo przeprowadzić w celu wywołania stabilnego zakażenia wieloma izolatami S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae i A. baumannii.

Solidny model zapalenia płuc u immunokompetentnych gryzoni w celu oceny skuteczności przeciwbakteryjnej przeciwko S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa lub A. baumannii

Przedstawiono uproszczony protokół do przeprowadzenia obszernej charakterystyki biochemicznej i strukturalnej białka wiążącego substrat węglowodanowy ze Streptococcus pneumoniae.

Charakterystyka biochemiczna i strukturalna białka wiążącego substrat transportu węglowodanów SP0092

Tutaj opisujemy szczep S. pneumoniae serotyp 1 519/43, który może być genetycznie modyfikowany poprzez wykorzystanie jego zdolności do naturalnego pozyskiwania DNA i plazmidu samobójczego. Jako dowód tej zasady stworzono izogenicznego mutanta w genie pneumolizyny (ply).

Konstruowanie mutantów w serotypie 1 Streptococcus pneumoniae szczep 519/43

Ten artykuł opisuje nowy model myszy do przejścia pneumokoków z bezobjawowego kolonizatora w patogen chorobotwórczy podczas infekcji wirusowej. Model ten można łatwo zaadaptować do badania interakcji wielodrobnoustrojowych i gospodarz-patogen w różnych fazach progresji choroby i u różnych gospodarzy.

Mysi model przejścia Streptococcus pneumoniae z kolonizatora w patogen po koinfekcji wirusowej podsumowuje chorobę zaostrzoną wiekiem

Niniejszy artykuł opisuje procedury eksperymentalnego testu przerzutowania, który jest wykorzystywany do określania potencjału metastatycznego ludzkich linii komórkowych raka.

Test eksperymentalny przerzutowania

Poznaj metodę eksperymentalnego nosicielstwa pneumokoków u ludzi poprzez inokulację do nosa Streptococcus pneumoniae i monitoring płukaniami nosa. Ta technika umożliwia badanie odporności i rozwój szczepionek.

Eksperymentalny nosiciel pneumokoków u ludzi

Przeglądaj więcej filmów