Eksperymentalny nosiciel pneumokoków u ludzi
15 lutego 2013
Eksperymentalne nosicielstwo ludzkiej pneumokoki oferuje naturalny model nosicielstwa i potencjalny model do wykorzystania w opracowywaniu szczepionek. Technika ta jest cenna, ale złożona i wiąże się z ryzykiem klinicznym związanym z wprowadzeniem patogenu do organizmu człowieka. Opracowaliśmy szczegółowy protokół.
Celem tej procedury jest ustalenie eksperymentalnego nosicielstwa pneumokoków u ludzi. Osiąga się to poprzez uprzednie rozcieńczenie i ilościowe określenie bakterii w inokulum. W drugim etapie ochotnik jest inokulowany donosowo Streptococcus pneumoniae.
Następnie ochotnik ma przepłukanie nosa w drugim, siódmym i czternastym dniu po szczepieniu. Wreszcie, klasyczna mikrobiologia jest używana do określenia, czy ochotnik jest nosicielem zaszczepionej potnicy. Ostatecznie, eksperymentalne nosicielstwo pneumokoków u ludzi może być uzyskane przy użyciu tej bezpiecznej i powtarzalnej metody.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi modelami wózków mysich jest to, że technika ta oferuje model noszenia w naturalnym żywicielu pneumokoków, człowieku. Co więcej, metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie pneumokoków, takie jak: jakie są immunologiczne korelaty ochrony? Jaki jest immunizujący efekt nosicielstwa i jaki jest wpływ nacisku gospodarza na patogen w niszy nosowo-gardłowej?
Zastosowania tej techniki obejmują jej zastosowanie jako metody selekcji nowych szczepionek przeciwko pneumokokom. Planujemy wykorzystać profilaktykę nosicielstwa jako substytut odporności poszczepiennej. Technikę kliniczną zademonstrują Siostra Angie Wright i pielęgniarz David Shaw.
30 minut przed planowaną wizytą ochotnika w probówce z inokulum pobranej z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie odwiruj inokulum tho w mikrowirówce przez trzy minuty po 17 000 razy. G, podczas gdy probówka się obraca, ogrzej kilka płytek z agarem z krwią w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnie usuń bulion z inokulum wirówki i umyj granulki w jednym mililitrze soli fizjologicznej. Powtórz etap wirowania i mycia. Wykonaj zestaw rozcieńczeń dla pożądanego stężenia inokulum, a następnie określ ilościowo ilość bakterii w inokulum metodą podobną do mili i misry.
Wyrosłe kolonie staną się widoczne następnego dnia. Zanieś inokulum ochotnikowi, który powinien wygodnie siedzieć w pozycji półleżącej. Następnie za pomocą P 200 perpe i sterylnych końcówek filtrujących.
Wciągnij 100 mikrolitrów inokulum do końcówki perpe i włóż końcówkę do wnętrza jamy nosowej. Powoli wydal inokulum na błonę śluzową nosa okrężnymi ruchami. Nie należy umieszczać końcówki pipety zbyt daleko z tyłu, ponieważ inokulum spłynie do gardła.
Powtórz inokulację dla drugiego naris, aby uniknąć przedostania się bakterii do krwiobiegu. Uważaj, aby nie naruszyć błony śluzowej za pomocą pipety. Następnie niech ochotnik pozostanie w pozycji półleżącej przez 10 minut, aby bakterie mogły rozprzestrzenić się po błonie śluzowej.
Po podaniu inokulum ochotnikom, powtórz oznaczanie ilościowe bakterii w laboratorium. Następnie oznacz probówkę datą i dawką inokulum i przechowuj inokulum w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Przed rozpoczęciem płukania nosa poproś ochotnika, aby usiadł wygodnie z głową odchyloną do tyłu o 30 stopni od pionu.
Następnie poproś ochotnika, aby wziął i wstrzymał głęboki oddech, jednocześnie popychając język w górę i do tyłu na podniebienie. Niech ochotnik da sygnał, gdy ta pozycja zostanie osiągnięta. Teraz przemyj jamę nosową cztery razy 20 mililitrami soli fizjologicznej, wypuszczając jednorazowo pięć mililitrów soli fizjologicznej do przedniej przestrzeni nosowej.
Niech ochotnik natychmiast pochyli się do przodu i szybko wydycha powietrze przez nos do foliowej miski, aby wydalić płyn po każdym pięciomililitrowym spłukiwaniu solą fizjologiczną. Po umyciu jamy nosowej czterema 20 mililitrami, zebrać wszystkie zebrane próbki razem w probówce wirówkowej. Teraz odwiruj próbki z ochotniczego płukania nosa przez 10 minut w temperaturze 3, 345 razy G. Usuń supinat i przechowuj go jako jednomililitrowe porcje w oznakowanych probówkach einor w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Dodaj 100 mikrolitrów pożywki STGG do granulki i dokładnie wymieszaj, a następnie określ całkowitą objętość w probówce. Następna płytka, 20 mikrolitrów kropli zawieszonego osadu na płytce z agarem z krwią zawierającej gentamycynę i rozprowadź smugi na całej płytce. Jeśli płukanie nosa następuje po inokulacji, należy użyć 10 mikrolitrów STGG zawierającego zawieszone osady.
W celu ilościowego określenia ilości bakterii metodą mil i Misry, dodaj kolejne 800 mikrolitrów STGG do rurki do płukania nosa i dokładnie wymieszaj. Następnie rozłóż 25 mikrolitrów roztworu komórek bakteryjnych STGG na inną płytkę z agarem z krwią i 25 mikrolitrów na płytce z agarem czekoladowym, pokrywając całość obu płytek. Następnie zamroź pozostałe bakterie w dwóch fiolkach kriograficznych w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc w 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia zbadaj płytki pod kątem pneumokoków i innych potencjalnych patogenów układu oddechowego. Płytki z agarem z krwią, zaszczepione płynami do płukania nosa, mogą być trudne do odczytania.
To zdjęcie przedstawia przykład tabliczki, która jest łatwa do odczytania z wyraźnie widocznymi pneumokokami. Tabliczka ta zawiera jednak wiele flory kokolonizacyjnej, co utrudnia określenie, czy pneumokoki są obecne podczas każdej wizyty. Ochotników poproszono o opisanie wszelkich objawów ze strony górnych dróg oddechowych, jeśli występowały, oraz podkreślono porównanie między nosicielami i osobami niebędącymi nosicielami.
Spośród 145 osób niedawno zaszczepionych pneumokokami, 28 skarżyło się na objawy, które podsumowano w poniższej tabeli. Ośmiu z tych ochotników było nosicielami, 20 nie. Wszystkie skargi zostały rozpatrzone przez Komitet ds. Bezpieczeństwa Zewnętrznego i poprzedzone pełnym dochodzeniem.
Choroby pneumokokowej nie przypisano żadnych objawów. Najczęstszymi objawami były ból gardła, zatkany nos i choroba grypopodobna. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby mieć bardzo dokładny plan bezpieczeństwa, który obejmuje każdy etap metody, szczególnie dla bezpieczeństwa ochotników.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ustalić eksperymentalne nosicielstwo pneumokoków u ludzi i wykryć nosicielstwo za pomocą płynu do płukania nosa.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół ustanawiania eksperymentalnego nosicielstwa pneumokoków u ludzi, który stanowi cenny model w opracowywaniu szczepionek. Metoda ta polega na inokulacji donosowej Streptococcus pneumoniae oraz późniejszym monitorowaniu stanu za pomocą płukania nosa.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Immunologia
- Opracowywanie szczepionek
Wprowadzenie
- Eksperymentalna kolonizacja człowieka przez pneumokoki służy jako naturalny model do badania zakażeń pneumokokowych.
- Technika ta niesie ze sobą ryzyko kliniczne związane z wprowadzeniem patogenu do organizmu człowieka.
- Oferuje ona przewagi nad modelami mysimi dzięki możliwości badania patogenu w jego naturalnym gospodarzu.
- Model ten pozwala na udzielenie odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad pneumokokami.
Cel badania
- Opracowanie bezpiecznej i powtarzalnej metody indukowania kolonizacji pneumokokowej u ludzi.
- Zbadanie immunologicznych korelacji ochrony oraz wpływu kolonizacji na organizm gospodarza.
- Ułatwienie procesu selekcji nowych szczepionek przeciw pneumokokom.
Zastosowane Metody
- Przygotowanie inokulum bakteryjnego poprzez rozcieńczenie i kwantyfikację.
- Inokulacja donosowa ochotników bakterią Streptococcus pneumoniae.
- Płukanie nosa wykonywane w określonych odstępach czasu w celu monitorowania kolonizacji.
- Analiza mikrobiologiczna w celu potwierdzenia obecności inokulowanych bakterii.
Główne wyniki
- Pomyślne ustanowienie kolonizacji pneumokokowej u ochotników.
- Monitorowanie wykazało powszechne objawy górnych dróg oddechowych u niektórych ochotników.
- Po dokładnym badaniu nie przypisano żadnych objawów chorobie pneumokokowej.
- Podczas całej procedury kładziono nacisk na protokoły bezpieczeństwa.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia wiarygodny model do badania kolonizacji pneumokokowej u ludzi.
- Może ona pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące odporności na pneumokoki.
- Przyszłe zastosowania obejmują ocenę nowych szczepionek opartych na zapobieganiu kolonizacji.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ustanowienie eksperymentalnego nosicielstwa pneumokoków u ludzi zapewnia naturalny model gospodarza do oceny kandydatów na szczepionki poprzez pomiar zapobiegania kolonizacji jako wskaźnika zastępczego dla odporności ochronnej. Podejście to umożliwia wczesną minimalizację ryzyka przy opracowywaniu nowych szczepionek przeciw pneumokokom poprzez powiązanie odpowiedzi immunologicznych z blokadą nosicielstwa u ludzi, co dostarcza informacji niezbędnych do podjęcia decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań przed kosztownymi próbami skuteczności. Model ten pozwala na uzyskanie wglądu w mechanizmy oddziaływań między patogenem a gospodarzem w niszy nosogardzielnej, zwiększając pewność prognostyczną w odniesieniu do wyników translacyjnych.
Strategiczne Zastosowania w Badaniach i Rozwoju Biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez ocenę, czy odporność indukowana szczepionką zapobiega kolonizacji pneumokokowej u ludzi.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celów antygenowych poprzez bezpośredni pomiar redukcji nosicielstwa po immunizacji.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację kandydatów wykazujących aktywność biologiczną w odpowiedniej niszy u ludzi.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zestandaryzowanych i powtarzalnych próbek pochodzenia ludzkiego do dalszych analiz immunologicznych i mikrobiologicznych.
- Wartość operacyjna: Ustanowienie ilościowego wykrywania kolonizacji za pomocą płukania nosa i metod hodowlanych, co umożliwia spójne odczyty w różnych badaniach.
- Gotowość platformy: Ułatwia standaryzację i skalowanie testów w celu oceny wielu kandydatów na szczepionki w kontrolowanych warunkach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy wyniki badań przedklinicznych z ich znaczeniem dla ludzi poprzez testowanie działania szczepionki u naturalnego gospodarza S. pneumoniae.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia immunologiczne korelaty ochrony oraz wpływ presji gospodarza na dynamikę patogenu w nosogardzieli.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Dostarcza informacji do podejmowania decyzji o dalszym rozwoju szczepionki w oparciu o skuteczność zapobiegania kolonizacji oraz monitorowanie bezpieczeństwa.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model EHPC wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po wsparcie przedkliniczne, oferując punkt kontrolny istotny dla człowieka przed rozpoczęciem szerokich badań polowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących odporności indukowanej szczepionką oraz jej wpływu na kolonizację nosogardzieli człowieka przez pneumokoki.
- Przesiewy: Dostarcza gotowe do analizy próbki biologiczne ze zstandaryzowanymi protokołami inokulacji i płukania, zapewniając powtarzalną detekcję nosicielstwa.
- Analityka: Umożliwia ilościowe odczyty mikrobiologiczne (CFU/mL) z płukania nosa w celu porównania grupy szczepionej i kontrolnej.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki immunologiczne z modelami przedklinicznymi poprzez walidację mechanizmów hamowania nosicielstwa u ludzi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma do iteracyjnej oceny kandydatów na szczepionki w różnych serotypach i formulacjach.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zapewnia wiarygodność prognostyczną w kwestii skuteczności szczepionki poprzez wykazanie zapobiegania nosicielstwu u naturalnego gospodarza ludzkiego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji przygotowania inokulum, monitorowaniu ochotników oraz pobieraniu próbek z płukania nosa.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez zmniejszenie niepewności biologicznej we wczesnej ocenie szczepionek.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o dane dotyczące zapobiegania nosicielstwu u ludzi.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie zarządzania wolontariuszami klinicznymi, technik mikrobiologicznych oraz protokołów bezpieczeństwa biologicznego.
- Zależne od kontrolowanej infrastruktury laboratoryjnej do ilościowego oznaczania bakterii, hodowli beztlenowych oraz przechowywania próbek w temperaturze −80°C.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej pomiędzy jednostkami klinicznymi, mikrobiologicznymi i immunologicznymi w celu zapewnienia spójnego postępowania z próbkami.
- Uwzględnia konieczność adaptacji podczas oceny różnych serotypów pneumokoków lub odpowiedzi immunologicznych indukowanych szczepionką.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, w tym złożoność rekrutacji wolontariuszy, obciążenie związane z monitorowaniem objawów oraz progi czułości wykrywania nosicielstwa.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące Biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:41
Inoculum Preparation and Volunteer Inoculation
3:41
Nasal Wash (NW) Procedure
4:35
Nasal Wash Processing
6:11
Results: Representative Pneumococcal Blood Agar Plate Cultures and Reported Symptoms in Pneumococcal Inoculum Recipients
7:18
Conclusion
