Eksperymentalny nosiciel pneumokoków u ludzi
February 15th, 2013
Eksperymentalne nosicielstwo ludzkiej pneumokoki oferuje naturalny model nosicielstwa i potencjalny model do wykorzystania w opracowywaniu szczepionek. Technika ta jest cenna, ale złożona i wiąże się z ryzykiem klinicznym związanym z wprowadzeniem patogenu do organizmu człowieka. Opracowaliśmy szczegółowy protokół.
Celem tej procedury jest ustalenie eksperymentalnego nosicielstwa pneumokoków u ludzi. Osiąga się to poprzez uprzednie rozcieńczenie i ilościowe określenie bakterii w inokulum. W drugim etapie ochotnik jest inokulowany donosowo Streptococcus pneumoniae.
Następnie ochotnik ma przepłukanie nosa w drugim, siódmym i czternastym dniu po szczepieniu. Wreszcie, klasyczna mikrobiologia jest używana do określenia, czy ochotnik jest nosicielem zaszczepionej potnicy. Ostatecznie, eksperymentalne nosicielstwo pneumokoków u ludzi może być uzyskane przy użyciu tej bezpiecznej i powtarzalnej metody.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi modelami wózków mysich jest to, że technika ta oferuje model noszenia w naturalnym żywicielu pneumokoków, człowieku. Co więcej, metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie pneumokoków, takie jak: jakie są immunologiczne korelaty ochrony? Jaki jest immunizujący efekt nosicielstwa i jaki jest wpływ nacisku gospodarza na patogen w niszy nosowo-gardłowej?
Zastosowania tej techniki obejmują jej zastosowanie jako metody selekcji nowych szczepionek przeciwko pneumokokom. Planujemy wykorzystać profilaktykę nosicielstwa jako substytut odporności poszczepiennej. Technikę kliniczną zademonstrują Siostra Angie Wright i pielęgniarz David Shaw.
30 minut przed planowaną wizytą ochotnika w probówce z inokulum pobranej z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie odwiruj inokulum tho w mikrowirówce przez trzy minuty po 17 000 razy. G, podczas gdy probówka się obraca, ogrzej kilka płytek z agarem z krwią w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnie usuń bulion z inokulum wirówki i umyj granulki w jednym mililitrze soli fizjologicznej. Powtórz etap wirowania i mycia. Wykonaj zestaw rozcieńczeń dla pożądanego stężenia inokulum, a następnie określ ilościowo ilość bakterii w inokulum metodą podobną do mili i misry.
Wyrosłe kolonie staną się widoczne następnego dnia. Zanieś inokulum ochotnikowi, który powinien wygodnie siedzieć w pozycji półleżącej. Następnie za pomocą P 200 perpe i sterylnych końcówek filtrujących.
Wciągnij 100 mikrolitrów inokulum do końcówki perpe i włóż końcówkę do wnętrza jamy nosowej. Powoli wydal inokulum na błonę śluzową nosa okrężnymi ruchami. Nie należy umieszczać końcówki pipety zbyt daleko z tyłu, ponieważ inokulum spłynie do gardła.
Powtórz inokulację dla drugiego naris, aby uniknąć przedostania się bakterii do krwiobiegu. Uważaj, aby nie naruszyć błony śluzowej za pomocą pipety. Następnie niech ochotnik pozostanie w pozycji półleżącej przez 10 minut, aby bakterie mogły rozprzestrzenić się po błonie śluzowej.
Po podaniu inokulum ochotnikom, powtórz oznaczanie ilościowe bakterii w laboratorium. Następnie oznacz probówkę datą i dawką inokulum i przechowuj inokulum w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Przed rozpoczęciem płukania nosa poproś ochotnika, aby usiadł wygodnie z głową odchyloną do tyłu o 30 stopni od pionu.
Następnie poproś ochotnika, aby wziął i wstrzymał głęboki oddech, jednocześnie popychając język w górę i do tyłu na podniebienie. Niech ochotnik da sygnał, gdy ta pozycja zostanie osiągnięta. Teraz przemyj jamę nosową cztery razy 20 mililitrami soli fizjologicznej, wypuszczając jednorazowo pięć mililitrów soli fizjologicznej do przedniej przestrzeni nosowej.
Niech ochotnik natychmiast pochyli się do przodu i szybko wydycha powietrze przez nos do foliowej miski, aby wydalić płyn po każdym pięciomililitrowym spłukiwaniu solą fizjologiczną. Po umyciu jamy nosowej czterema 20 mililitrami, zebrać wszystkie zebrane próbki razem w probówce wirówkowej. Teraz odwiruj próbki z ochotniczego płukania nosa przez 10 minut w temperaturze 3, 345 razy G. Usuń supinat i przechowuj go jako jednomililitrowe porcje w oznakowanych probówkach einor w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Dodaj 100 mikrolitrów pożywki STGG do granulki i dokładnie wymieszaj, a następnie określ całkowitą objętość w probówce. Następna płytka, 20 mikrolitrów kropli zawieszonego osadu na płytce z agarem z krwią zawierającej gentamycynę i rozprowadź smugi na całej płytce. Jeśli płukanie nosa następuje po inokulacji, należy użyć 10 mikrolitrów STGG zawierającego zawieszone osady.
W celu ilościowego określenia ilości bakterii metodą mil i Misry, dodaj kolejne 800 mikrolitrów STGG do rurki do płukania nosa i dokładnie wymieszaj. Następnie rozłóż 25 mikrolitrów roztworu komórek bakteryjnych STGG na inną płytkę z agarem z krwią i 25 mikrolitrów na płytce z agarem czekoladowym, pokrywając całość obu płytek. Następnie zamroź pozostałe bakterie w dwóch fiolkach kriograficznych w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc w 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia zbadaj płytki pod kątem pneumokoków i innych potencjalnych patogenów układu oddechowego. Płytki z agarem z krwią, zaszczepione płynami do płukania nosa, mogą być trudne do odczytania.
To zdjęcie przedstawia przykład tabliczki, która jest łatwa do odczytania z wyraźnie widocznymi pneumokokami. Tabliczka ta zawiera jednak wiele flory kokolonizacyjnej, co utrudnia określenie, czy pneumokoki są obecne podczas każdej wizyty. Ochotników poproszono o opisanie wszelkich objawów ze strony górnych dróg oddechowych, jeśli występowały, oraz podkreślono porównanie między nosicielami i osobami niebędącymi nosicielami.
Spośród 145 osób niedawno zaszczepionych pneumokokami, 28 skarżyło się na objawy, które podsumowano w poniższej tabeli. Ośmiu z tych ochotników było nosicielami, 20 nie. Wszystkie skargi zostały rozpatrzone przez Komitet ds. Bezpieczeństwa Zewnętrznego i poprzedzone pełnym dochodzeniem.
Choroby pneumokokowej nie przypisano żadnych objawów. Najczęstszymi objawami były ból gardła, zatkany nos i choroba grypopodobna. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby mieć bardzo dokładny plan bezpieczeństwa, który obejmuje każdy etap metody, szczególnie dla bezpieczeństwa ochotników.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ustalić eksperymentalne nosicielstwo pneumokoków u ludzi i wykryć nosicielstwo za pomocą płynu do płukania nosa.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół ustanowienia eksperymentalnego nosicielstwa pneumokoków u ludzi, modelu cenionym dla rozwoju szczepionek. Metoda polega na inokulacji donośnej Streptococcus pneumoniae i następczym monitorowaniu poprzez płukanie nosa.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Immunologia
- Rozwój szczepionek
Tło
- Eksperymentalne nosicielstwo pneumokoków służy jako naturalny model do badania infekcji pneumokokowymi.
- Ta technika wiąże się z ryzykiem klinicznym związanym z wprowadzeniem patogenu do ludzkiego organizmu.
- Oferuje zalety w porównaniu z modelami mysimi, ponieważ bada patogena w jego naturalnym żywicielu.
- Kluczowe pytania w badaniach nad pneumokokami mogą być zadane za pomocą tego modelu.
Cel badania
- Ustanowienie bezpiecznej i powtarzalnej metody wywoływania nosicielstwa pneumokoków u ludzi.
- Zbadanie immunologicznych korelatów ochrony i wpływu nosicielstwa na żywiciela.
- Ułatwienie selekcji nowych szczepionek przeciwko pneumokokom.
Stosowane metody
- Przygotowanie inokulum bakterii poprzez rozcieńczenie i ilościowe oznaczenie.
- Inokulacja donosowa ochotników Streptococcus pneumoniae.
- Płukanie nosa wykonywane w określonych odstępach czasowych, aby monitorować nosicielstwo.
- Analiza mikrobiologiczna w celu potwierdzenia obecności zaszczepionych bakterii.
Główne wyniki
- Udane ustanowienie nosicielstwa pneumokoków u ochotników.
- Monitorowanie wykazało typowe objawy górnych dróg oddechowych u niektórych ochotników.
- Po dokładnym zbadaniu żadne objawy nie zostały przypisane chorobie pneumokoków.
- Protokoły bezpieczeństwa były podkreślane na każdym etapie procedury.
Wnioski
- Metoda zapewnia niezawodny model do badania nosicielstwa pneumokoków u ludzi.
- Może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące odporności na pneumokoki.
- Przyszłymi zastosowaniami będzie ocena nowych szczepionek opartych na zapobieganiu nosicielstwu.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Establishing experimental human pneumococcal carriage provides a natural host model to evaluate vaccine candidates by measuring prevention of colonization as a surrogate for protective immunity. This approach supports early de-risking of novel pneumococcal vaccines by linking immunological responses to carriage blockade in humans, informing go/no-go decisions before costly efficacy trials. The model enables mechanistic insight into host-pathogen interactions in the nasopharyngeal niche, enhancing predictive confidence in translational outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by assessing whether vaccine-induced immunity prevents pneumococcal colonization in humans.
- Operational Value: Enables functional validation of antigen targets through direct measurement of carriage reduction post-immunization.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying candidates that demonstrate biological activity in the relevant human niche.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized, reproducible human-derived samples for downstream immunological and microbiological assays.
- Operational Value: Establishes quantitative carriage detection via nasal wash and culture-based methods, enabling consistent readouts across studies.
- Platform Readiness: Facilitates assay standardization and scalability for evaluating multiple vaccine candidates under controlled conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges preclinical findings to human relevance by testing vaccine effects in the natural host of S. pneumoniae.
- Mechanistic De-risking: Clarifies immunological correlates of protection and the impact of host pressure on pathogen dynamics in the nasopharynx.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs decisions on vaccine progression based on carriage prevention efficacy and safety monitoring.
Pipeline & Workflow Integration
The EHPC model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical support, offering a human-relevant checkpoint prior to large-scale field trials.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on vaccine-induced immunity and its effect on pneumococcal colonization in the human nasopharynx.
- Screening: Delivers assay-ready biological samples with standardized inoculation and wash protocols for reproducible carriage detection.
- Analytics: Enables quantitative microbiological readouts (CFU/mL) from nasal washes to compare vaccine and control groups.
- Translational Research: Connects immunological findings to preclinical models by validating mechanisms of carriage inhibition in humans.
- Enterprise Reuse: Serves as a reusable platform for iterative evaluation of vaccine candidates across serotypes and formulations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in vaccine efficacy by demonstrating prevention of carriage in the natural human host.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized inoculum preparation, volunteer monitoring, and nasal wash sampling.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing biological uncertainty in early vaccine evaluation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on human carriage prevention data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in clinical volunteer management, microbiological techniques, and biosafety protocols.
- Dependent on controlled laboratory infrastructure for bacterial quantification, anaerobic culture, and sample storage at −80°C.
- Necessitates cross-team standardization between clinical, microbiological, and immunological units for consistent sample handling.
- Involves adaptation considerations when assessing different pneumococcal serotypes or vaccine-induced immune responses.
- Involves practical limitations including volunteer recruitment complexity, symptom monitoring burden, and carriage detection sensitivity thresholds.
