Name: Obrazowanie molekularne w celu ukierunkowania na przeszczepione komórki progenitorowe mięśni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-27T08:54:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Poznaj nieinwazyjną metodę oceny przeszczepu mioblastów z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego i genu reporterowego w modelu myszy MDX. Technika ta umożliwia śledzenie komórek in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Sanjiv Gambhirowi za dar genu reportera fluc/mrfp/sr39tk. Praca ta została sfinansowana przez The Stem Cell Network (SCN) z Kanady oraz The Jesse's Journey Foundation.

1. Utrzymanie i rozprzestrzenianie się mioblastów C2C12
<ol>
	<li>Umieść mioblasty C2C12 w kolbie o średnicy 75cm2 i utrzymuj komórki w zmodyfikowanej surowicy orła o wysokim poziomie glukozy Dulbecco (HG-DMEM) uzupełnionej płodową surowicą bydlęcą (FBS) do końcowego stężenia 10%. Nie pozwól, aby komórki zlały się w dowolnym momencie, ponieważ spowoduje to uszczuplenie populacji mioblastów. Pożywkę należy zmieniać co drugi dzień. Uwaga: przed użyciem zawsze podgrzewaj medium do 37 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Kiedy mioblasty stają się w około 80% zlewne, przejdź komórki do nowej kolby. Aspirować pożywkę hodowlaną. Umyj komórki 4-5 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), aby usunąć wszelkie ślady pożywki hodowlanej, która zawiera surowicę hamującą trypsynę. Krótko przepłukać warstwę komórkową 2-3 ml 0,25% (w/v) roztworu trypsyny-EDTA w celu dysocjacji przylegających mioblastów z kolby. Odessać trypsynę i umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 5 minut.</li>
	<li>Podczas tej inkubacji przygotować nową kolbę z 9 ml HG-DMEM/10% pożywki FBS. Po trypsynizacji dodaj 10 ml kompletnej pożywki do komórek i pipetuj 4-5 razy, aby zapewnić zebranie wszystkich komórek w pożywce. Dodać 1 ml zawiesiny komórek do nowej kolby i inkubować w 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
2. Transfekcja komórek C2C12
<ol>
	<li>Gdy komórki osiągną 50% zbieżności, wykonaj transfekcję zgodnie z instrukcjami producenta Invitrogen. Krótko mówiąc, połączyć 90 μl odczynnika Lipofectamine 2000 z 4,5 ml pożywki OPTI-MEM. W innej probówce połącz 36 μg DNA genu reporterowego trifuzji CMV z 4,5 ml OPTI-MEM. Przesuń każdą rurkę, aby się połączyła i odczekaj 5 minut. Połącz zawartość obu probówek, delikatnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej dokładnie przez trzydzieści minut. nuta: Druga kolba powinna być również zainstalowana dla nietransfekowanych komórek, które otrzymują tylko Lipofektaminę i OPTI-MEM jako kontrolę negatywną.</li>
	<li>Usunąć pożywkę z komórek C2C12 i dodać 15,5 ml świeżej pożywki HG-DMEM/10% FBS. Dodaj pożywkę do transfekcji, aby uzyskać całkowitą objętość do 20 ml.</li>
	<li>Pozostawić komórki do transfekcji przez noc przez co najmniej 20 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Następnego dnia odessać pożywkę do transfekcji i dodać 10 ml HG-DMEM/10%FBS.</li>
	<li>Zobacz komórki pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym. Rejestruj zarówno obrazy w jasnym polu, jak i w czerwonej fluorescencji (przy użyciu kostki filtra TRITC; mrfp ex/em: 584/607 nm). Policz liczbę komórek wyrażających zapytania ofertowe oglądanych we fluorescencji podzieloną przez całkowitą liczbę komórek oglądanych w jasnym polu dla wielu pól widzenia, aby wygenerować wydajność transfekcji.</li>
</ol>
3. Ocena przeżywalności komórek/test MTT
<ol>
	<li>Na dzień przed transfekcją wprowadzić 1x105 komórek C2C12 do każdej studzienki na 24-dołkowej płytce. Komórki należy posiać w objętości 500 μl w HG-DMEM/10%FBS.</li>
	<li>Następnego dnia transfekuj mioblasty przez noc, jak opisano wcześniej. Postępuj zgodnie z sugestiami producenta dotyczącymi objętości odczynników do transfekcji dla płytki 24-dołkowej. Inkubować zestaw studzienek z samą lipofekcaminą (bez DNA) jako kontrolą. Zobacz komórki pod fluorescencją, aby upewnić się, że nastąpiła prawidłowa transfekcja.</li>
	<li>Usunąć pożywkę transfekcyjną i inkubować mioblasty z 5 mg/ml bromku tiazolilu niebieskiego tetrazolu (MTT) w HG-DMEM/10% FBS. Dodać D-lucyferynę do ośmiu transfekowanych studzienek i inkubować w temperaturze 37 °C przez cztery godziny.</li>
	<li>Usuń pożywkę ze studzienek. Rozpuszczaj niebieskie kryształy formazanu, dodając 180 μl izopropanolu do każdego dołka. Wstrząsać w temperaturze 37 °C przez 15 min.</li>
	<li>Unikając wytrącania się, odpipetować roztwór do 96-dołkowej płytki i odczytać absorbancję przy 575 nm.</li>
</ol>
4. Przygotowanie mioblastów do przeszczepu
<ol>
	<li>Usuń pożywkę, umyj mioblasty HBSS i trypsynizuj komórki, jak opisano w 1.1.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 4 ml kompletnego podłoża.</li>
	<li>Za pomocą hemocytometru policz komórki, aby wygenerować woluminy zawierające 106 mioblastów. Odpipetować objętość do sterylnych mikroprobówek o pojemności 1,5 ml. Przy skuteczności transfekcji wynoszącej ~10% wartości te wskazują, że po przeszczepie na skanerze GE ExploreOptix można wykryć 100 000 komórek wykazujących ekspresję lucyferazy.</li>
	<li>Osiągnąć końcową objętość wstrzyknięcia wynoszącą 15 μl, zawierającą 106 komórek C2C12. W razie potrzeby odwirować mikroprobówki z prędkością 2 000 obr./min przez jedną minutę. Ostrożnie odessać supernatant za pomocą pipety. Ponownie zawiesić komórki w 15 μl HG-DMEM bez FBS.</li>
</ol>
5. Implantacja komórek
<ol>
	<li>Znieczulić mysz 2% izofluranem/2%O2. Wyrwij włosy z grzbietowej części kończyny tylnej. Utrzymuj znieczulenie na poziomie 1,5%izofluranu/2%O2.</li>
	<li>Upewnij się, że mioblasty C2C12 są dobrze zawieszone. Trzymając mysz w pozycji leżącej, wyprostuj tylną kończynę i za pomocą strzykawki insulinowej wstrzyknij komórki bezpośrednio do bocznej głowy mięśnia brzuchatego łydki pod kątem 30 °. Wstrzyknąć transfekowane mioblasty do prawej kończyny tylnej, a nietransfekowane mioblasty do przeciwległej (lewej) kończyny tylnej.</li>
	<li>Wykonaj podstawowe skanowanie bioluminescencyjne: Szybko przenieś mysz na stolik w skanerze optycznym, kładąc mysz w pozycji leżącej. Podłącz przewód znieczulający. Aby upewnić się, że mysz pozostaje znieczulona, powinna być obecna druga osoba, która podłączy linię znieczulającą, podczas gdy druga umieszcza zwierzę w skanerze.</li>
	<li>Delikatnie wyprostuj kończynę tylną, tak aby miejsce wstrzyknięcia było widoczne. Przyklej tylne kończyny na miejscu delikatnym klejem, takim jak taśma medyczna.</li>
	<li>Zamknij komorę i upewnij się, że żadne światło nie ma dostępu do wnętrza skanera, ponieważ zwiększy to wykrywany sygnał tła. Skaner powinien być ustawiony na parametry zawarte w instrukcjach producenta dotyczących obrazowania bioluminescencyjnego. W szczególności upewnij się, że wybrano opcję "brak lasera".</li>
	<li>Narysuj obszar zainteresowania (ROI) wokół oskubanego obszaru i rozpocznij skanowanie.</li>
</ol>
6. Wstrzyknięcie substratu fluc, D-lucyferyny, do myszy Mdx
<ol>
	<li>Podczas gdy mysz jest znieczulona dootrzewnowo, wstrzyknąć 150 mg / kg substratu lucyferazy świetlika, D-lucyferyny (z roztworu podstawowego 40 mg / ml, przygotowanego zgodnie z instrukcjami producenta).</li>
	<li>Odzyskaj mysz i odczekaj 15-minutowy okres pobierania myszy przed przygotowaniem myszy do następnego skanowania.</li>
</ol>
7. BLI celuje w MPC z ekspresją Luc po wszczepieniu implantu do mysich modeli DMD
<ol>
	<li>Po okresie wchłaniania należy ponownie znieczulić mysz, jak opisano w 5.1.</li>
	<li>Przenieś mysz z powrotem do skanera optycznego i wykonaj kolejny skan bioluminescencyjny w taki sam sposób, jak skanowanie w tle.</li>
	<li>Chociaż 20-minutowy okres absorpcji powinien zapewnić maksymalną intensywność sygnału, można wykonać kolejne skanowanie.</li>
	<li>Po zakończeniu pozyskiwania obrazu poświęć mysz zgodnie z wytycznymi określonymi przez Instytucjonalną Komisję Etyki Zwierząt i Kanadyjską Radę ds. Opieki nad Zwierzętami (CCAC). Wyizoluj mięsień kończyny tylnej i natychmiast umieść w 10% formalinie, aby utrwalić do osadzenia parafiny. Wykonaj barwienie immunohistochemiczne dla lucyferazy, aby potwierdzić domięśniowe wstrzyknięcie mioblastów.</li>
</ol>

<ol><li>Emery, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">The muscular dystrophies.</a> Lancet. 359, 687-695 (2002).</li>
<li>Blake, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+and+genetics+of+dystrophin+and+dystrophin-related+proteins+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle.</a> Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).</li>
<li>Goldring, K., Partridge, T., Watt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Muscle stem cells.</a> J. Pathol. 197, 457-467 (2002).</li>
<li>Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+that+participate+in+regeneration+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Cells that participate in regeneration of skeletal muscle.</a> Gene Ther. 9, 752-753 (2002).</li>
<li>Moss, F. P., Leblond, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+as+the+source+of+nuclei+in+muscles+of+growing+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Satellite cells as the source of nuclei in muscles of growing rats.</a> Anat. Rec. 170, 421-435 (1971).</li>
<li>Snow, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autoradiographic+study+of+satellite+cell+differentiation+into+regenerating+myotubes+following+transplantation+of+muscles+in+young+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">An autoradiographic study of satellite cell differentiation into regenerating myotubes following transplantation of muscles in young rats.</a> Cell Tissue Res. 186, 535-540 (1978).</li>
<li>Kuang, S., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+biology+of+satellite+cells+and+their+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential.</a> Trends Mol. Med. 14 (2), 82(2008).</li>
<li>Hoffman, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+dystrophin+in+muscle-biopsy+specimens+from+patients+with+Duchenne%27s+or+Becker%27s+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne's or Becker's muscular dystrophy.</a> N. Engl. J. Med. 318, 1363-1368 (1988).</li>
<li>Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+validation+of+improved+triple+fusion+reporter+gene+vectors+for+molecular+imaging+of+living+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects.</a> Cancer Res. 67 (7), 3085(2007).</li>
<li>Ray, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tri-fusion+multimodality+reporter+gene+expression+in+living+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects.</a> Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).</li>
<li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+in+living+subjects%3A+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+lights%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new lights.</a> Genes Dev. 17, 545-580 (2003).</li>
<li>Sicinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+muscular+dystrophy+in+the+mdx+mouse%3A+a+point+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation.</a> Science. 244, 1578-1580 (1989).</li>
<li>Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMattson%2C+MP+%22Pathogenesis+of+neurodegenerative+disorders.+In%3A+Contemporary+neuroscience%22">Pathogenesis of neurodegenerative disorders. In: Contemporary neuroscience</a>. X, Humana. Totowa, NJ. 294(2001).</li>
<li>Andersson, J. E., Bressler, B. H., Ovalle, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regeneration+in+hind+limb+skeletal+muscle+of+the+mdx+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Muscle+Res.+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Functional regeneration in hind limb skeletal muscle of the mdx mouse.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 9, 499-515 (1988).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu opisaliśmy szybkie i niezawodne obrazowanie molekularne, podejście genów reporterowych do nieinwazyjnie docelowych mioblastów/MPC po przeszczepie. Podczas gdy badanie to pokazuje krótkoterminową lokalizację przeszczepionych MPC za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego (BLI), sposób, w jaki komórki są celowane, może być w rzeczywistości łatwo zastosowany do podłużnej oceny wszczepienia komórek poprzez implantację komórek, które stabilnie wyrażają gen reporterowy. W tym celu nasza grupa wy...

<table><tbody><tr><td>Mioblasty C2C12</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane technologie średniego życia Dulbecco Eagle's Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca</td><td>Life Technologies</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-72</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanksa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-5</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xenolight D-lucyferin</td><td>PerkinElmer</td><td>122796</td><td>40 mg/ml w PBS</td></tr></tbody></table>

obrazowanie molekularne w celu ukierunkowania na przeszczepione komórki progenitorowe mięśni

Molecular Imaging to Target Transplanted Muscle Progenitor Cells

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest ciężką genetyczną chorobą nerwowo-mięśniową, która dotyka 1 na 3 500 chłopców i charakteryzuje się postępującym zwyrodnieniem mięśni1, 2. U pacjentów zdolność rezydentnych komórek satelitarnych mięśni (SC) do regeneracji uszkodzonych włókien mięśniowych staje się coraz mniej efektywna4. Dlatego przeszczep komórek progenitorowych mięśni (MPC)/mioblastów od zdrowych osób jest obiecującym podejściem terapeutycznym do DMD. Głównym ograniczeniem w stosowaniu terapii komórkami macierzystymi jest jednak brak wiarygodnych technologii obrazowania do długoterminowego monitorowania wszczepionych komórek i oceny jej skuteczności. W tym miejscu opisujemy nieinwazyjne podejście w czasie rzeczywistym do oceny powodzenia przeszczepu mioblastów. Metoda ta wykorzystuje zunifikowany gen reporterowy fuzyjny złożony z genów (lucyferazy świetlika [fluc], monomerycznego białka czerwonej fluorescencji [MRFP] i kinazy tymidynowej sr39 [sr39tk]), których ekspresję można obrazować za pomocą różnych metod obrazowania9, 10. Obecnie dostępnych jest wiele metod obrazowania, w tym pozytonowa tomografia emisyjna (PET), tomografia komputerowa z emisją pojedynczych fotonów (SPECT), obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI), obrazowanie optyczne i ultrasonografia 3D o wysokiej częstotliwości, z których każda ma unikalne zalety i ograniczenia11. Na przykład badania obrazowania bioluminescencyjnego (BLI) mają tę zaletę, że są stosunkowo tanie i wysokoprzepustowe. Z tego powodu w tym badaniu wykorzystujemy sekwencję genu reporterowego lucyferazy świetlika (fluc) zawartą w genie fuzyjnym i obrazowaniu bioluminescencyjnym (BLI) do krótkoterminowej lokalizacji żywotnych mioblastów C2C12 po implantacji do mysiego modelu DMD (dystrofia mięśniowa na chromosomie X [mdx] myszy)12-14. Co ważne, BLI dostarcza nam środków do badania kinetyki znakowanych MPC po implantacji i będzie przydatny do wielokrotnego śledzenia komórek w czasie i po migracji. Nasze podejście oparte na genach reporterowych pozwala nam dodatkowo połączyć wiele modalności obrazowania u jednego żywego pacjenta; Biorąc pod uwagę tomograficzny charakter, precyzyjną rozdzielczość przestrzenną i zdolność do skalowania do większych zwierząt i ludzi10,11, PET będzie stanowić podstawę przyszłych prac, które, jak sugerujemy, mogą ułatwić szybkie przełożenie metod opracowanych w komórkach na modele przedkliniczne i do zastosowań klinicznych.

Po osiągnięciu 50-60% konfluencji, mioblasty C2C12 poddano transientnej transfekcji wyżej wspomnianym konstruktem reporterowym genu fuzyjnego, składającym się z lucyferazy świetlika [fluc], monomerowego czerwonego białka fluorescencyjnego [mrfp] oraz tymidynokinazy sr39 [sr39tk](Rysunek 1A). Wydajność transfekcji obliczono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Rysunki 1B,C), wykorzystując sekwencję mrfp w naszym konstrukcie reporterowym. Przeżywalnoś...

Opisano nieinwazyjny sposób oceny sukcesu przeszczepu mioblastów. Metoda wykorzystuje zunifikowany gen reporterowy fuzyjny złożony z genów, których ekspresję można obrazować za pomocą różnych metod obrazowania. W tym przypadku wykorzystujemy sekwencję genu reporterowego fluc do celowania w komórki za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Obrazowanie molekularne w celu ukierunkowania na przeszczepione komórki progenitorowe mięśni

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe genetic neuromuscular disorder that affects 1 in 3,500 boys, and is characterized by progressive muscle ...

Ogólnym celem tej procedury jest nieinwazyjna ocena powodzenia przeszczepu mioblastów przy użyciu podejścia reporterowego i obrazowania bioluminescencyjnego. Osiąga się to poprzez wprowadzenie najpierw zgłoszonego genu trifuzyjnego, który wyraża f Luke, MRFP i SR trzy 90 tk pod kontrolą promotora CMV do unieśmiertelnionej linii komórkowej C 2 C 12 mioblastów. Drugim krokiem jest ilościowe określenie liczby mioblastów, które wyrażają gen porter.W tym badaniu skuteczność transfekcji oblicza się poprzez zliczanie komórek wyrażających ekspresję MRFP pod mikroskopem fluorescencyjnym. Następnie 10 do pięciu zmodyfikowanych komórek o objętości równej lub mniejszej niż 15 mikrolitrów wszczepia się domięśniowo do tylnej kończyny dystroficznych myszy MDX. Komórki transfekowane UNT są wszczepiane do przeciwległej kończyny tylnej jako kontrola, a następnie wykonywany jest skan wyjściowy.Ostatnim krokiem jest wstrzyknięcie dootrzewnowe, wstrzyknięcie opisanego przez Luke'a substratu genu Lucyfer po okresie wychwytu około 20 minut, przeprowadzenie drugiego skanowania bioluminescencyjnego w celu uzyskania obrazu wszczepionych komórek. Ostatecznie wychwyt Lucyfera obserwuje się szczególnie w komórkach wykazujących ekspresję Luke'a bez wykrywalnej bioluminescencji w komórkach kontrolnych, które nie wyrażają genu raportu. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie technologii łagodnego transferu strat, takich jak migracja komórek po implantacji, a także przeżycie komórek po przeszczepie.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób mięśniowych, takich jak dystrofia mięśniowa Duchenne'a, ponieważ jest to szybki i niezawodny sposób nieinwazyjnego celowania w komórki Po przeszczepie możemy zatem ocenić przeszczepiony obszar w czasie i ocenić sukces lub porażkę leczenia. Procedurę zademonstrują Kelly gut pe, doktorantka, i Rebecca Mcg, technik badawczy z naszego laboratorium, przepraszam, Kultura C two C 12 mioblastów w pożywce o wysokim poziomie glukozy dcos zmodyfikowane orły z 10% płodową surowicą bydlęcą zgodnie ze standardowymi procedurami dla tej linii komórkowej. Nie pozwól, aby komórki stały się zlewające się w więcej niż 80%, ponieważ spowoduje to uszczuplenie populacji miotycznej.Aby przygotować komórki do transfekcji, najpierw zbierz komórki z kolby podstawowej, na krótko pokrywając warstwę komórek płukania HBSS trypsyną. Następnie szybko zasysamy trypsynę i umieszczamy kolbę w inkubatorze do hodowli tkankowych na pięć minut. Podczas inkubacji przygotować dwie kolby T 75, z których każda zawiera dziewięć mililitrów pożywki hodowlanej.Po zakończeniu czasu inkubacji dodać 10 mililitrów pożywki do kolby i przepłukać pożywkę na dnie kolby cztery do pięciu razy, aby zapewnić zebranie wszystkich komórek. Następnie zasiać każdą z kolb T 75 jedną dziesiątą zawiesiny komórek z kolby wyjściowej T 75. Przy pierwszej próbie tej procedury należy przeprowadzić test MTT, aby ocenić wpływ znakowania komórek na przeżycie i różnicowanie komórek oraz żywotność zmodyfikowanych mioblastów przed przeszczepem.Gdy komórki osiągną 50% konfluencji, należy przetransfekować jedną kolbę T 75 z 36 mikrogramami genu reporterowego CMV Tri fusion w 4,5 mililitrowej objętości optymalnej przy użyciu Lipofectamine 2000 zgodnie z instrukcjami producenta. Ponadto należy przeprowadzić próbną transfekcję drugiej kolby T 75 przy użyciu wyłącznie lipo 2000 i optymalnego bez DNA jako kontroli ujemnej. Pozostawić komórki do transfekcji przez co najmniej 20 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza następnego dnia, odessać pożywkę do transfekcji i zastąpić odpowiednią objętością pożywki hodowlanej za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.Rejestruj obrazy zarówno jasnego pola, jak i czerwonej fluorescencji, aby obliczyć wydajność transfekcji. Po zebraniu transfekowanego mioblastu za pomocą trypsyny i resusu zawieszającego komórki w czterech mililitrach kompletnego podłoża, użyj cytometru hemologicznego, aby wykonać zliczanie komórek. Pipetować od 10 do sześciu komórek do sterylnej mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra o wydajności transfekcji około 10%Ta liczba komórek powinna dać początek 100 000 wykrywalnych matryc Lucyfera wyrażających komórki po przeszczepie, końcowa objętość wstrzyknięcia powinna wynosić 15 mikrolitrów.Jeśli objętość w probówce jest większa, należy odwirować mikroprobówki z prędkością 2000 obr./min przez jedną minutę, zastrzec supinat, a następnie ponownie zgiąć w maksymalnej objętości 15 mikrolitrów wzrostu. Podłoże bez FBS Po wywołaniu znieczulenia u myszy za pomocą 2% izofluoru zmień na 1,5% izofluoru w celu utrzymania znieczulenia. Podczas zabiegu ułóż mysz w pozycji leżącej i wyrwij włosy z grzbietowej części kończyny tylnej.Upewnij się, że mioblasty C 2 C 12 są dobrze zawieszone, a następnie załaduj zawiesinę komórkową do strzykawki insulinowej. Wstrzyknij komórki bezpośrednio do bocznej głowy mięśnia żołądkowego pod kątem 30 stopni. Po wstrzyknięciu transfekowanych mioblastów do prawej kończyny tylnej należy powtórzyć procedurę z mioblastami transfekowanymi UNT w przeciwległą kończynę tylną.Wykonaj podstawowe skanowanie bioluminescencyjne. Jedna osoba powinna szybko przenieść mysz na stolik w skanerze optycznym, układając mysz w pozycji leżącej. Druga osoba jednocześnie podłącza linię znieczulającą, aby upewnić się, że mysz pozostaje znieczulona.Delikatnie wyprostuj kończyny tylne i użyj taśmy medycznej, aby przytrzymać kończynę na miejscu, tak aby oba obszary wstrzyknięcia były widoczne. Zamknij komorę i upewnij się, że żadne światło nie ma dostępu do wnętrza skanera, ponieważ zwiększy to wykrywany sygnał tła. Skaner powinien być ustawiony na parametry zawarte w instrukcji producenta dla obrazowania bioluminescencyjnego.Narysuj obszar zainteresowania wokół oskubanego obszaru wstrzyknięcia i rozpocznij skanowanie, aby uzyskać obraz linii bazowej, podczas gdy mysz jest znieczulona. Wewnątrzotrzewnowe. Wstrzyknij 150 miligramów na kilogram substratu lucyferazy świetlika Lucyfer. Umieść mysz w czystej klatce i pozwól jej dojść do siebie po znieczuleniu.Odczekaj 15-minutowy okres pobierania myszy przed przygotowaniem myszy do następnego skanowania. Po 15-minutowym okresie absorpcji. Znieczulij mysz i przenieś do skanera jak poprzednio.Wykonaj drugie skanowanie luminescencyjne w taki sam sposób, jak skanowanie w tle. Całkowity 20-minutowy okres absorpcji powinien zapewnić maksymalną intensywność sygnału, ale w razie potrzeby można wykonać kolejne skanowanie. Ten schemat przedstawia konstrukcję reportera CMV Tri Fusion.Lewy panel pokazuje obraz jasnego pola C dwóch mioblastów C 12 transfekowanych plazmidem reporterowym fuzji, a prawy panel pokazuje ten sam obszar jako obraz fluorescencyjny, jak widać tutaj. Rysowany jest obszar zainteresowania, aby objąć oskubany obszar kończyny tylnej, do którego wstrzyknięto mioblasty. Bioluminescencja nie jest wykrywana podczas skanowania w tle.Po 23 minutach od wstrzyknięcia Lucyferianu wykrywany jest wyraźny sygnał z prawej tylnej kończyny, do której wstrzyknięto mioblasty wyrażające lucyferazy. Nie wykrywa się bioluminescencji w przeciwległej kończynie tylnej, do której wstrzyknięto niewycięte mioblasty, jak widać. Tutaj immunohistochemia z użyciem przeciwciała lucyferazy świetlika potwierdza domięśniową implantację transfekowanych komórek C dwóch C 12.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o stosowaniu aseptycznych technik hodowli tkankowej i odpowiednich praktyk obchodzenia się ze zwierzętami po jej rozwinięciu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się chorobami mięśni do zbadania skuteczności terapii komórkowej w przedklinicznych modelach choroby na małych zwierzętach. Następnie, w warunkach klinicznych u pacjentów, po obejrzeniu tego filmu, powinieneś dobrze zrozumieć, jak wszczepiać komórki i jak nieinwazyjnie lokalizować przeszczepione mioblasty za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

molecular-imaging-to-target-transplanted-muscle-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Obrazowanie molekularne w celu uwidocznienia przeszczepowanych komórek prekursorowych mięśni

Opisujemy in vivo protokół obrazowania fluorescencyjnego służący do monitorowania regeneracji mięśni za pomocą mioblastów znakowanych białkiem GFP po transplantacji do mięśni szkieletowych myszy zdrowych oraz dystroficznych. Protokół ten można zaadaptować do badania regeneracji mięśni poprzez transplantację innych typów komórek, a także w innych stanach chorobowych mięśni.

Śledzenie dynamiki wszczepiania mięśni u małych zwierząt za pomocą obrazowania fluorescencyjnego in vivo

Niniejszy artykuł opisuje zoptymalizowaną sekwencję zdarzeń dla obrazowania multimodalnego przeszczepów komórkowych w mózgu gryzoni z wykorzystaniem: (i) bioluminescencji in vivo i obrazowania rezonansem magnetycznym oraz (ii) pośmiertnej analizy histologicznej. Połączenie tych metod obrazowania u jednego zwierzęcia pozwala na ocenę przeszczepów komórkowych z wysoką rozdzielczością, czułością i swoistością.

Multimodalne obrazowanie implantacji komórek macierzystych w ośrodkowym układzie nerwowym myszy

Złożone masy tkankowe, od organów po guzy, składają się z różnych elementów komórkowych. Wyjaśniliśmy udział fenotypów komórkowych w tkance przy użyciu wieloznakowanych fluorescencyjnych myszy transgenicznych w połączeniu z wieloparametrowym barwieniem immunofluorescencyjnym, a następnie rozmieszaniem widmowym w celu rozszyfrowania pochodzenia komórek, a także cech komórek na podstawie ekspresji białka.

Ilościowa analiza wielospektralna po przeszczepie tkanki fluorescencyjnej w celu wizualizacji pochodzenia, typów i interakcji komórek

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pochodzące z miogennych komórek macierzystych są obiecującymi kandydatami na strategie terapii komórkowej w leczeniu dystrofii mięśniowych. Protokół ten opisuje przeszczep i pomiary funkcjonalne wymagane do oceny wszczepienia i różnicowania mezoangioblastów pochodzących z iPSC (rodzaj komórek progenitorowych mięśni) w mysich modelach ostrej i przewlekłej regeneracji mięśni.

Przeszczep indukowanych pluripotencjalnych progenitorów miogennych podobnych do mezoangioblastów pochodzących z mezoangioblastów w mysich modelach regeneracji mięśni

Opisujemy metodę programowania komórek macierzystych do nadekspresji czynników terapeutycznych dla angiogenezy za pomocą biodegradowalnych nanocząsteczek polimerowych. Opisane procesy obejmują syntezę polimerów, transfekcję komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej in vitro oraz walidację skuteczności zaprogramowanych komórek macierzystych w promowaniu angiogenezy w mysim modelu niedokrwienia kończyn tylnych.

Programowanie komórek macierzystych do angiogenezy terapeutycznej z wykorzystaniem biodegradowalnych nanocząstek polimerowych

Izolacja i hodowla czystej populacji spokojnych komórek satelitarnych, populacji komórek macierzystych mięśni, jest niezbędna do zrozumienia biologii i regeneracji komórek macierzystych mięśni, a także przeszczepu komórek macierzystych do terapii dystrofii mięśniowej i innych chorób zwyrodnieniowych.

Izolacja, hodowla i przeszczep satelitarnych komórek mięśniowych

Ten protokół opisuje znakowanie radioaktywne mezenchymalnych komórek macierzystych koni i ich implantację do urazów ścięgien u konia w celu określenia przeżycia komórek i dystrybucji tkanek za pomocą scyntygrafii gamma.

In vivo (in vivo) Obrazowanie i śledzenie mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego znakowanych technetem-99m w tendinopatii koni

Tutaj używamy obrazowania bioluminescencyjnego, rentgenowskiego i pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej, aby zbadać, jak hamowanie aktywności mTOR wpływa na guzy szpiczaka kostnego przeszczepionego szpiczakiem kostnym w modelu ksenoprzeszczepu. Pozwala to na fizjologicznie istotne, nieinwazyjne i multimodalne analizy działania przeciwszpiczaka mózgu terapii ukierunkowanych na guzy szpiczaka kostnego przeszczepione szpiczakiem kostnym in vivo.

Multimodalna bioluminescencyjna i pozytroniczna tomografia emisyjna/tomografia obliczeniowa ksenoprzeszczepów szpiczaka mnogiego szpiku kostnego u myszy NOG

Opisujemy intraparenchymalne przeszczepienie ludzkich nerwowych komórek progenitorowych transdukowanych podwójnym wektorem reporterowym wyrażającym lucyferazy-zielone białko fluorescencyjne (GFP) w mózgu myszy. Po przeszczepie sygnał lucyferazy jest wielokrotnie mierzony za pomocą bioluminescencji in vivo i przeszczepionych komórek wykazujących ekspresję GFP, identyfikowanych w sekcjach mózgu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Przeszczep domózgowy i śledzenie bioluminescencji in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy

Przedstawiony tutaj protokół umożliwia identyfikację i wielowymiarową analizę komórek macierzystych i progenitorowych mięśni za pomocą jednokomórkowej cytometrii masowej oraz ich oczyszczanie przez FACS w celu dogłębnych badań ich funkcji. Podejście to można zastosować do badania dynamiki regeneracji w modelach chorobowych i testowania skuteczności interwencji farmakologicznych.

Identyfikacja i analiza progenitorów miogennych in vivo podczas ostrego uszkodzenia mięśni szkieletowych za pomocą wysokowymiarowej cytometrii masowej pojedynczej komórki

Terapia komórkowa oferuje obiecujące leczenie dla pacjentów z przewlekłą chorobą płuc poprzez zastosowanie komórek progenitorowych do naprawy uszkodzonych tkanek i poprawy funkcji płuc. Ponieważ obrazowanie odgrywa kluczową rolę w śledzeniu integracji komórek, opisujemy tutaj śledzenie in vivo terapii komórkowej dla przewlekłej choroby płuc w modelu mysim z wykorzystaniem obrazowania cząstek magnetycznych.

Zobrazenie in vivo sterydowane obrazem śledzenia przeszczepowanych komórek macierzystych nabłonka odległych płuc w przypadku zwłóknienia płuc przy użyciu obrazowania z zastosowaniem cząstek magnetycznych

Poznaj nieinwazyjną metodę oceny przeszczepu mioblastów z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego i genu reporterowego w modelu myszy MDX. Technika ta umożliwia śledzenie komórek in vivo.

Obrazowanie molekularne w celu ukierunkowania na przeszczepione komórki progenitorowe mięśni

Przeglądaj więcej filmów