Name: Hybrydyzacja RNA in situ w całych zarodkach Mount i histologia komórek dostosowana do morskich spodoustych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Poznaj metodę hybrydyzacji RNA in situ w całych zarodkach połączoną z histologią u morskich spodoustych. Ta technika umożliwia wizualizację ekspresji genów i badanie decyzji komórkowych w rozwoju embrionalnym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chciałbym podziękować wielu studentom studiów licencjackich, którzy pracowali w moim laboratorium i przyczynili się do rozwoju tych protokołów. NAT otrzymał wsparcie od Skidmore-Union Network, projektu utworzonego dzięki grantowi NSF ADVANCE PAID.

I. RNA Cała góra Hybrydyzacja In situ u morskich spodoustych
1. Utrwalanie i przygotowanie zarodka
<ol>
 <li>Zarodki łyżwiarzy mogą być inscenizowane zgodnie z Ballardem 7. Optymalne etapy wykrywania ekspresji genów zależą od tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Aby śledzić ekspresję genów w przewodzie pokarmowym łyżwy, etapy 27-30 są optymalne 7.</li>
 <li>Rozbioruj zarodki na PBS, oddzielając zarodki od woreczka żółtkowego.</li>
 <li>Umieścić 30 ml świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu (PFA) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc. Poprawka na 24 godziny.</li>
 <li>Umyj zarodki w PBT, dwa razy przez 15 minut, obracając w temperaturze pokojowej. Uwzględniono wszystkie receptury roztworów dla RNA w całości montowanych in situ (Tabela 1).</li>
 <li>Odwodnić zarodki, myjąc je w serii metanolu 25%, 50% i 75% metanolu: PBT kołysząc w temperaturze pokojowej. Czas trwania płukania zależy od stadium rozwoju zarodków. W przypadku zarodków w stadium pre-neurulacji wystarczy 5 minut każdego przemycia w serii metanolu. W przypadku zarodków starszych niż 30 stadium płukanie może trwać do 30 minut. Aby ustalić, czy zarodki są wystarczająco penetrowane i aklimatyzują się do każdego prania, trzymaj rurkę pionowo w dłoni. Jeśli zarodki opadną na dno tuby, jesteś gotowy do następnego prania. Jeśli zarodki unoszą się na wierzchu roztworu, zmień roztwór i powtórz ten konkretny etap odwodnienia.</li>
 <li>Prać dwukrotnie w 100% metanolu przez 10 minut delikatnie kołysząc.</li>
 <li>Po odwodnieniu do 100% metanolu zarodki powinny być przechowywane w temperaturze -20 °C przez co najmniej 24 godziny przed przystąpieniem do stosowania protokołu. Zarodki były z powodzeniem przechowywane w temperaturze -20 °C i wykorzystywane do tworzenia całych wierzchowców RNA przez okres do 1 roku.</li>
</ol>
2. Synteza sondy RNA
<ol>
 <li>Wygeneruj liniowy fragment genu, którego ekspresję chcesz wykryć. Można to zrobić przez amplifikację PCR lub linearyzację plazmidu z interesującym Cię genem. Aby amplifikować metodą PCR, wybierz startery, których miejsca wiązania flankują wstawkę genu i zachowują miejsca wiązania polimerazy RNA w amplifikowanym regionie. W przypadku powszechnie stosowanych plazmidów, takich jak pBS lub pGEM, idealne są startery M15 do przodu i do tyłu. Alternatywnie, linearyzuj plazmid, trawiąc 15 μl DNA QIAGEN miniprep za pomocą enzymu, który rozszczepia się na końcu 5' genu. Ekstrakt żelowy i oczyszczanie za pomocą odpowiedniego zestawu QIAquick.</li>
 <li>Odwrotną transkrypcję sondy RNA przy użyciu 8 μl liniowego plazmidu lub 100 ng produktu PCR jako matrycy przy użyciu odpowiedniej polimerazy RNA (patrz Tabela 2 dla reakcji transkrypcyjnej).</li>
 <li>Inkubować reakcję odwrotnej transkrypcji przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
 <li>Aby potwierdzić reakcję, uruchom 1 μl reakcji transkrypcji na 1% żelu agaroza/TAE. Uruchom żel pod napięciem 100 mV, aż barwnik po prostu wpłynie do żelu. Powinien być widoczny pojedynczy wyraźny pasek. Liniowy fragment matrycy DNA może być słabo widoczny przy większej masie cząsteczkowej.</li>
 <li>Dodać 1 μl bezkrwistego DNAzy I do reakcji transkrypcji i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
 <li>Aby się wytrącić, dodać 100 μl TE pH 8, 10 μl 4 M LiCl, 300 μl 100% EtOH i inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 60 minut lub przez noc.</li>
 <li>Wirować przez 10 minut w mikrofugach o temperaturze 4 °C przy 14 000 obr./min.</li>
 <li>Umyj granulat 70% EtOH i wysusz na powietrzu.</li>
 <li>Zawiesić sondę RNA w 20 μl dH2O. Dodać 80 μl buforu hybrydyzacyjnego (bufor hybrydyzacyjny należy wstępnie ogrzać do 70 °C). Sonda może być przechowywana w 80% buforze hybrydyzacyjnym przez kilka miesięcy w temperaturze -20 °C lub dłużej w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Wstępne leczenie zarodków i hybrydyzacja
<ol>
 <li>Usunąć zarodki przechowywane w 100% metanolu z temperatury -20 °C. W przypadku młodszych zarodków należy postępować zgodnie z krokiem (3.2). W przypadku zarodków w późniejszym stadium rozwoju (stadium 29/30 <) może pojawić się warstwa naskórka, która "oderwała się" od ciała zarodka. Pod mikroskopem ostrożnie wypreparuj warstwę naskórka, aby zmaksymalizować penetrację sondy.</li>
 <li>Umieść zarodki w czystych szklanych fiolkach scyntylacyjnych. Ponownie nawodnić zarodki w odwróconej serii metanolu opisanej powyżej: (75%, 50%, 25% metanolu:PBT), delikatnie kołysząc każdy roztwór przez 5-30 minut w temperaturze pokojowej. Pełne nawodnienie dzięki dwóm myciom PBT po 10 minut każde, delikatnie kołysząc.</li>
 <li>Aby usunąć pigment, wybielaj zarodki 6% nadtlenkiem wodoru w PBT przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, kołysząc.</li>
 <li>Usunąć nadtlenek wodoru przez trzykrotne przemycie w PBT (kołysanie w temperaturze pokojowej, 10 minut każde).</li>
 <li>Traktuj zarodki proteinazą K, aby umożliwić penetrację sondy podczas hybrydyzacji. Ilość proteinazy K i czas trwania leczenia zależy od tkanki, którą chcesz zbadać oraz wieku zarodka. Bardziej powierzchowne tkanki i młodsze zarodki wymagają krótszej i mniejszej ilości proteinazy K, podczas gdy głębsze tkanki i starsze zarodki wymagają wyższego stężenia i dłuższego czasu leczenia, aby w pełni przeniknąć zarodek do hybrydyzacji sondowej. Na przykład, aby wykryć Shh w endodermie jelitowej zarodków łyżwiarzy w stadium 29, 30 μg/ml proteinazy K/PBT inkubuje się przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Szybko wypłucz zarodki w PBT, aby zmyć proteinazę K.</li>
 <li>Aby dezaktywować proteinazę K, należy postfix zarodków z 4% PFA, 0,2% aldehydem glutarowym w PBT przez 20 minut, delikatnie kołysząc.</li>
 <li>Umyć dwa razy przez 10 minut z PBT.</li>
 <li>
 <ol class="lalpha">
 <li>W celu wstępnej hybrydyzacji dodaj do zarodków 2-3 ml podgrzanego roztworu hybrydyzacyjnego, tylko tyle, aby je przykryć. Delikatnie rozdrabniać w podgrzewanej łaźni wodnej w temperaturze 70 °C przez 1 godzinę.</li>
 <li>Aby przygotować roztwór hybrydyzacyjny, podgrzej sondę RNA do 70 °C przez 10 minut i ostudź na lodzie. Rozcieńczyć 15-20 μl sondy RNA do 2 ml świeżo podgrzanego roztworu hybrydyzacyjnego, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5-1,0 μg/ml. Usuń pre-hybe i dodaj rozcieńczoną sondę RNA do zarodków. Zarodki należy po prostu przykryć roztworem, w razie potrzeby dodać więcej roztworu do hybrydyzacji. Szczelnie zabezpieczyć pokrywkę fiolki scyntylacyjnej. Hybrydyzuj przez delikatne kołysanie w podgrzewanej łaźni wodnej w temperaturze 70 °C przez noc.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
4. Mycie po hybrydyzacji i hybrydyzacja przeciwciał
<ol>
 <li>Usunąć roztwór hybrydyzacyjny za pomocą sondy z zarodków i umieścić w świeżej fiolce scyntylacyjnej lub probówce Eppendorfa. Sonda może być przechowywana w temperaturze -20 °C i ponownie wykorzystana w przyszłości. W celu przepłukania po hybrydyzacji umieść zarodki w Netwell osadzonym na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.</li>
 <li>Prać 3 razy po 30 minut w podgrzanym roztworze #1, kołysząc w temperaturze 70 °C.</li>
 <li>Umyć 3 razy po 30 minut w podgrzanym roztworze #2, kołysząc w temperaturze 70 °C.</li>
 <li>Prać 3 razy po 5 minut w TBST, kołysząc w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Wstępnie zablokuj 10% inaktywowaną termicznie surowicą owczą w TBST przez 1 godzinę, kołysząc w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przenieść zarodki z Netwell do świeżej szklanej fiolki scyntylacyjnej. Dodaj anty-DIG Fab Fragments (1:5,000) w 1% inaktywowanej termicznie surowicy owczej/TBST do zarodków. Kołysz przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
5. Mycie po hybrydyzacji przeciwciał
<ol>
 <li>Usuń przeciwciało i wyrzuć. Umieść zarodki z powrotem w Netwell w celu umycia.</li>
 <li>Prać 3 razy po 5 minut w TBST, bujając się w temperaturze pokojowej</li>
 <li>Prać co najmniej 6 razy przez 1 godzinę każde, kołysząc w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Prać przez noc w TBST, kołysząc w temperaturze 4 °C. Ponieważ płukanie przeciwciałami pomaga ograniczyć barwienie tła, preferowana jest maksymalizacja liczby i czasu trwania prania. Zarodki są rutynowo myte w TBST w temperaturze 4 °C w weekendy.</li>
</ol>
6. Wykrywanie sondy
<ol>
 <li>Uzupełnić świeży roztwór NTMT i wysterylizować filtrem.</li>
 <li>Odrzucić roztwór do płukania TBST i umieścić zarodki w czystej szklanej fiolce scyntylacyjnej. Umyj zarodki 3 razy w świeżym NTMT przez 10 minut każdy w temperaturze pokojowej, kołysząc.</li>
 <li>Usunąć płukanie NTMT i dodać mieszaninę reakcyjną 1 x NBT / 1 x BCIP w NTMT. Ponieważ te reagenty są wrażliwe na światło, przykryj fiolkę scyntylacyjną folią i rozdrobnij w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Monitoruj reakcję koloru co 15 minut, aż pożądana ekspresja genów będzie wyraźnie widoczna. Silne sondy mogą potrzebować zaledwie 10 minut, aby się rozwinąć. Słabe sondy mogą zająć 1-2 godziny. Nie pozwól, aby reakcja trwała zbyt długo, ponieważ zacznie pojawiać się zabarwienie tła (cały zarodek zacznie zmieniać kolor na matowy fioletowy lub brązowy).</li>
 <li>Prać 2 razy po 10 minut w PBT w temperaturze pokojowej, kołysząc.</li>
 <li>Postfix zarodki w 4% paraformaldehydzie, 0,1% aldehydu glutarowego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Zarodki mogą być przechowywane przez czas nieokreślony w utrwalaczu w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Wizualizuj zarodki za pomocą mikroskopu stereoskopowego do preparacji. Aby uzyskać jasnoniebieskie tło do zdjęć, umieść zarodki w naczyniu ze wstępnie utwardzoną 1% agarozą/PBS.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki dla I. Hybrydyzacja in situ RNA Whole Mount u morskich spodoustych
RNA całe wierzchowanie in situ, przedstawiające ekspresję jeża Sonic (Shh) i Hoxa13 w zarodkach skaterów, pokazano na rysunku 1. Ekspresja Shh u wyższych kręgowców znajduje się w strunie grzbietowej i endodermie jelitowej i ten wzorzec ekspresji jest zachowany w łyżwach (ryc. 1a) 8,9 . Morskie spodouste mają unikalną metodę osmoregulacji, która wykorzystuje gruczoł odbytniczy do wydzielania soli. Ekspresja Hoxa13 jest wysoka w rozwijającym się gruczole odbytniczym (ryc. 1b) 10. Rola produktu genu Hoxa13 w kształtowaniu gruczołu odbytniczego pozostaje nieznana.
II. Parafina zatapiająca i cięta na sekcje tkanki spodoustej
1. Pobieranie i przygotowanie tkanek
<ol>
 <li>Wypreparuj pożądaną tkankę i utrwal 10% formalinę przez 24-48 godzin, kołysząc w temperaturze pokojowej. 4% paraformaldehyd (PFA) może być również stosowany jako utrwalacz (patrz Dyskusja).</li>
 <li>Wypłukać utrwalacz przez mycie w PBS, 3 razy po 30 minut. W zależności od wielkości chusteczki czas prania może zostać skrócony do 10 minut lub wydłużony do 1 godziny.</li>
 <li>Odwodnić zarodki, myjąc je w serii etanolu 25%, 50% i 75% etanolu: PBS kołysząc w temperaturze pokojowej. Ponownie, czas każdego prania będzie zależał od rozmiaru chusteczki. Na 0,5 cm3 tkankę inkubować każde płukanie przez 15 minut. Zwiększ czas dla większych elementów. Jeśli pożądane jest długotrwałe przechowywanie tkanki, należy przemyć ją dodatkowo dwa razy w 75% etanolu i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do jednego roku. W przeciwnym razie przejdź do następnego kroku.</li>
 <li>Dalej odwodnić, myjąc 3 razy w 100% etanolu przez 15 minut każde, kołysząc.</li>
</ol>
2. Osadzanie i cięcie parafiny
<ol>
 <li>Sklarować tkankę, myjąc 2 razy w ksylenie przez 5 minut każdy w szklanych fiolkach scyntylacyjnych z zakrętkami. Ksylen sprawi, że tkanka stanie się krucha, więc nie przekraczaj łącznie 10 minut na pranie. Tkanka powinna wyglądać na półprzezroczystą, gdy trzymasz ją pod światło. Jeśli po dwóch praniach chusteczka jest nadal bardzo nieprzezroczysta, wykonaj dodatkowe płukanie w ksylenie przez 5 minut, a następnie postępuj zgodnie z protokołem. Z ksylenem należy obchodzić się wyłącznie w dygestoriach w rękawiczkach.</li>
 <li>Usunąć ksylen i napełnić fiolkę scyntylacyjną w 2/3 stopioną parafiną. Inkubować w piecu o temperaturze 60 °C przez 30 minut. Podczas umieszczania parafiny w fiolce można zauważyć, że parafina krzepnie wzdłuż boków fiolki. Umieścić fiolkę w piekarniku i odczekać, aż parafina ponownie się rozpuści przez kilka minut. Wyjąć fiolkę z suszarki i szybko zamieszać roztwór, aby wymieszać i umieścić w piecu do końca inkubacji.</li>
 <li>Powtórz inkubację parafiny jeszcze dwa razy przez 30 minut.</li>
 <li>Inkubować w parafinie dwa razy przez godzinę. Zmienić parafinę po raz ostatni i inkubować przez noc w piecu o temperaturze 60 °C.</li>
 <li>Następnego dnia umieść tkankę w podgrzewanej komorze kąpieli parafinowej i umieść pod próżnią na 2-3 godziny. Ułatwi to infiltrację parafiny do tkanki i usunie wszelkie pęcherzyki powietrza. W przypadku niektórych rodzajów cienkich tkanek stopień podciśnienia może nie być wymagany, ale jest konieczny w przypadku całych zarodków lub przewodu pokarmowego i innych narządów z przedziałami świetlnymi.</li>
 <li>Po infiltracji próżniowej tkanki należy umieścić tkankę w metalowej formie z roztopioną parafiną i ostudzić na płycie lodowej. Pozostaw na lodzie lub w temperaturze 4 °C na noc przed próbą usunięcia chusteczki z formy. Bloki parafiny mogą być przechowywane w nieskończoność w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Umieść blok parafiny na mikrotomie i wytnij odcinki o grubości 8 μm. Sekcje powinny być unoszone na łaźni wodnej podgrzanej do 48 °C i montowane na szklanych szkiełkach Superfrost*Plus.</li>
 <li>Suszyć szkiełka przez noc w piekarniku o temperaturze 37 °C.</li>
 <li>Przechowywać skrawki w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą potrzebne.</li>
</ol>
III. Błękit alcki / Jądrowa czerwona plama tkanki spodoustej
1. Alcian Blue Bejca do mucyn
<ol>
 <li>Umieść slajdy sekcjami skierowanymi do góry na podgrzewaczu do slajdów. Topić przez 45 min.</li>
 <li>Umieść slajdy w uchwycie na slajdy. Wszystkie powstałe roztwory znajdują się w wannach wewnątrz dygestorium. Szkiełka myje się, przenosząc je z jednej wanny z roztworem do drugiej. Upewnij się, że poziom roztworu w wannach zakrywa szkiełka; Tkanki na szkiełkach są całkowicie zanurzone. Rozpuść parafinę, myjąc szkiełka 2 razy w ksylenie przez 5 minut każda.</li>
 <li>Umyj szkiełka dwa razy 100% etanolem przez 1 minutę każda.</li>
 <li>Preparaty nawadniające w serii etanolowej (75%, 50%, 25% etanolu) myć w każdym roztworze przez 1 min. Myć w dH2O przez 1 min.</li>
 <li>Barwienie w roztworze Alcian Blue o pH 2,5 przez 15 min.</li>
 <li>Plamę można uzyskać, myjąc ją pod bieżącą wodą z kranu przez 3 minuty. Zanurz raz w dH2O.</li>
 <li>Barwienie przeciwbarwiące w roztworze Nuclear Fast Red Counterstain, przez 10 min.</li>
 <li>Myć pod bieżącą wodą z kranu przez 3 minuty i zanurzyć jednorazowo w dH2O.</li>
 <li>Odwadniać w serii etanolu (25%, 50%, 75%, 100%, 100%) przez 20 zanurzeń każdy lub 1 minutę każdy. Umyj 2 razy w ksylenie po 5 minut. Montaż za pomocą medium montażowego DPX i szkiełek nakrywkowych. Pozostaw medium montażowe do wyschnięcia i stwardnienia przez 48 godzin w dygestoriach przed manipulowaniem szkiełkami.</li>
</ol>

<ol><li>Forester, R., Goldstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+osmoregulatory+role+of+amino+acids+and+urea+in+marine+elasmobranchs%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular osmoregulatory role of amino acids and urea in marine elasmobranchs.</a> Am. J. Physiol. 230, 925-931 (1976).</li>
<li>Shuttleworth, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShuttleworth%2C+T+%22Physiology+of+elasmobranch+fishes%22">Physiology of elasmobranch fishes</a>. Shuttleworth, R. , Springer-Verlag. 171-194 (1988).</li>
<li>Yancey, P. H., Clark, M. E., Hand, S. C., Bowlus, R. D., Somero, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+with+water+stress%3A+evolution+of+osmolyte+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Living with water stress: evolution of osmolyte systems.</a> Science. 217, 1214-1222 (1982).</li>
<li>Ballatori, N., Villalobos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+molecular+and+cellular+basis+of+toxicity+using+comparative+models%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicl.+Appl.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Defining the molecular and cellular basis of toxicity using comparative models.</a> Toxicl. Appl. Pharmacol. 183, 207-220 (2002).</li>
<li>Nieto, M. A., Patel, K., Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+analysis+of+chick+embryos+in+whole+mount+and+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization analysis of chick embryos in whole mount and tissue sections.</a> Methods Cell Biol. 51, 219-235 (1996).</li>
<li>Jass, J. R., Walsh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+mucin+expression+in+the+gastrointestinal+tract%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Altered mucin expression in the gastrointestinal tract: a review.</a> J Cell Mol Med. 5, 327-351 (2001).</li>
<li>Ballard, W. W., Mellinger, J., Lechenault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+for+development+of+Scyliorhinus+canicula%2C+the+lesser+spotted+dogfish+%28Chondrichthyes%3B+Scyliorhinidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages for development of Scyliorhinus canicula, the lesser spotted dogfish (Chondrichthyes; Scyliorhinidae).</a> J. Exp. Zool. 267, 318-336 (1993).</li>
<li>Echelard, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog%2C+a+member+of+a+family+of+putative+signaling+molecules%2C+is+implicated+in+the+regulation+of+CNS+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog, a member of a family of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity.</a> Cell. 75, 1417-1430 (1993).</li>
<li>Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75, 1401-1416 (1993).</li>
<li>Theodosiou, N. A., Hall, D. A., Jowdry, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+acid+mucin+goblet+cell+distribution+and+Hox13+expression+patterns+in+the+developing+vertebrate+digestive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool.+B.+Mol.+Dev.+Evol%22%5BJournal%5D)">Comparison of acid mucin goblet cell distribution and Hox13 expression patterns in the developing vertebrate digestive tract.</a> J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 442-453 (2007).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. Ch. 7. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3B+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning; A Laboratory Manual</a>. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 7.82(2001).</li>
<li>Zhang, G., Miyamoto, M. M., Cohn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamprey+type+II+collagen+and+Sox9+reveal+an+ancient+origin+of+the+vertebrate+collagenous+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Lamprey type II collagen and Sox9 reveal an ancient origin of the vertebrate collagenous skeleton.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3180-3185 (2006).</li>
<li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSheehan%2C+DC+%22Theory+and+practice+of+histotechnology%22">Theory and practice of histotechnology</a>. , 2, Battelle Press. (1980).</li>
<li>Theodosiou, N. A., Simeone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+rudimentary+colon+in+the+elasmobranch%2C+Leucoraja+erinacea%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Evidence of a rudimentary colon in the elasmobranch, Leucoraja erinacea.</a> Dev. Genes Evol. 222, 237-243 (2012).</li>
<li>Filipe, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucins+in+the+human+gastrointestinal+epithelium%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Cell+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mucins in the human gastrointestinal epithelium: a review.</a> Invest. Cell Pathol. 2, 195-216 (1979).</li>
<li>Corfield, A. P., Wagner, S. A., Clamp, J. R., Kriaris, M. S., Hoskins, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucin+degradation+in+the+human+colon%3A+production+of+sialidase%2C+sialate+O-acetylesterase%2C+N-acetylneuraminate+lyase%2C+arylesterase%2C+and+glycosulfatase+activities+by+strains+of+fecal+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Mucin degradation in the human colon: production of sialidase, sialate O-acetylesterase, N-acetylneuraminate lyase, arylesterase, and glycosulfatase activities by strains of fecal bacteria.</a> Infect. Immun. 60, 3971-3978 (1992).</li>
<li>Reid, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+and+histological+progression+to+malignancy+in+Barrett%27s+esophagus%3A+prospective+endoscopic+surveillance+of+a+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric and histological progression to malignancy in Barrett's esophagus: prospective endoscopic surveillance of a cohort.</a> Gastroenterology. 102, 1212-1219 (1992).</li>
<li>Mowry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+staining+of+pancreatic+beta-cell+granules.+Evolution+and+present+status%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Pathol.+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Selective staining of pancreatic beta-cell granules. Evolution and present status.</a> Arch. Pathol. Lab Med. 107, 464-468 (1983).</li>
<li>Roberts, D. J., Smith, D. M., Goff, D. J., Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+signaling+during+the+regionalization+of+the+chick+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal signaling during the regionalization of the chick gut.</a> Development. 125, 2791-2801 (1998).</li>
</ol>

Nie mam nic do ujawnienia.

Przedstawione protokoły są klasycznymi metodami monitorowania ekspresji genów i identyfikacji zróżnicowanych typów komórek i zostały przystosowane do stosowania u morskich spodoustych. Konieczne mogą być dalsze modyfikacje tych protokołów w celu dostosowania się do różnych gatunków spodoustych.
Najczęstszym problemem związanym z gromadzeniem się RNA w całości in situ jest ryzyko zanieczyszczenia RNazą, a tym samym degradacji sondy RNA i wiadomości endogennych. Należy wziąć pod uwagę d...

<table><tbody><tr><td>10 x bufor transkrypcyjny</td><td>Roche</td><td>11-465-384-001</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka znakująca DIG-RNA</td><td>Roche</td><td>11-277-073-910</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNAzy</td><td>Roche</td><td>03-335-399-001</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza RNA - SP6</td><td>Roche</td><td>10-810-274-001</td><td></td></tr><tr><td>DNAseI, bez RNAse </td><td>Roche</td><td>10-776-785-001</td><td></td></tr><tr><td>RNA</td> <td>drożdżyInvitrogen</td><td>15401-029</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>EMD-Millipore</td><td>220201</td><td></td></tr><tr><td>heparyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>DEPC (pirowęglan dietylu)</td><td>Research Organics</td><td>2106D</td><td></td></tr><tr><td>Moria Perforowana łyżka</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-17</td><td></td></tr><tr><td>Netwell wkłada</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>64713-00</td><td>Studzienki sieciowe do stosowania w 6-dołkowych naczyniach do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli tkankowych</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Szklane fiolki scyntylacyjne z zakrętkami</td><td>Weaton Science Products</td><td>986540</td><td></td></tr><tr><td>formamid</td><td>Fisher</td><td>BP227500</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Invitrogen</td><td>59895 (AM2542)</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td></td><td>11585029001</td><td></td></tr><tr><td>BCIP</td><td>Roche</td><td>11585002001</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru, 30%</td> <td>EMD</td><td>HX0635-1</td><td></td></tr><tr><td>Surowica owcza</td><td>VWR</td><td>101301-478</td><td></td></tr><tr><td>aldehyd glutarowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche</td><td>10-109-541-001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-DIG Fab Fragments</td><td>Roche</td><td>1137-6623</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Tabela 3. Odczynniki i aparatura do całego montażu RNA in situ's.</td></tr><tr><td>1% błękit alcyjny 8GS, pH 2,5</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>26323-01</td><td></td></tr><tr><td>Nauka o szybkiej czerwonej</td><td>mikroskopii elektronowej</td> jądrowej <td>26078-05</td><td></td></tr><tr><td>DPX Mikroskopia</td><td>elektronowa z</td> mocowaniem <td>13510</td><td></td></tr><tr><td>Parafina (Paraplast X-tra)</td><td>McCormick</td><td>Scientific 39503002</td><td></td></tr><tr><td>10% formalina, NBF</td><td>VWR 95042-908</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szklane fiolki scyntylacyjne z zakrętkami</td><td>Weaton Science Products</td><td>986540</td><td></td></tr><tr><td>Formy na bazie stali nierdzewnej</td><td>Tissue-Tek</td><td>4161-4165</td><td>Dostępne różne rozmiary.</td></tr><tr><td>Kasety </td><td>Podgrzewacz do</td> szkiełek Tissue-Tek <td>4170</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher-Scientific</td><td>12-594Q</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do zatapiania tkanek</td><td>Leica Microsystems</td><td>EG1160</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom, obrotowe</td><td>Leica Microsystems</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia szkiełek Tissue-Tek</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>62540-01</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek 24-Slide Holder</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62543-06</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost*Plus Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-17</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 4. Odczynniki i sprzęt do barwienia Alcian Blue .</td></tr></tbody></table>

hybrydyzacja rna in situ w całych zarodkach mount i histologia komórek dostosowana do morskich spodoustych

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Morskie spodouste są cenionymi modelami zwierzęcymi do badań biomedycznych i genomicznych, ponieważ są najbardziej prymitywnymi kręgowcami posiadającymi odporność adaptacyjną i unikalne mechanizmy osmoregulacji 1-3. Jako najbardziej prymitywne żyjące kręgowce szczękowe z parzystymi wyrostkami, spodouste są ewolucyjnie ważnym modelem, szczególnie dla badań nad ewolucją i rozwojem. Morskie spodouste zostały również wykorzystane do badania toksykologii wodnej i fizjologii stresu w odniesieniu do zmian klimatycznych 4. W związku z tym konieczne jest opracowanie i dostosowanie metodologii, aby ułatwić i rozszerzyć wykorzystanie tych prymitywnych kręgowców na wiele dyscyplin biologicznych. W tym miejscu przedstawiam udaną adaptację hybrydyzacji RNA w całości i technik histologicznych do badania ekspresji genów i histologii komórek u spodoustych.
Monitorowanie ekspresji genów jest charakterystycznym narzędziem biologów rozwojowych i jest szeroko stosowane do badania procesów rozwojowych 5. Hybrydyzacja in situ RNA w całości pozwala na wizualizację i lokalizację określonych transkryptów genów w tkankach rozwijającego się zarodka. Wzorzec ekspresji wiadomości genu może dostarczyć informacji o tym, jakie procesy rozwojowe i decyzje dotyczące losu komórki gen może kontrolować. Porównując wzorzec ekspresji genu na różnych etapach rozwoju, można uzyskać wgląd w to, jak zmienia się rola genu podczas rozwoju.
Podczas gdy całe montowanie in situ umożliwia lokalizację ekspresji genów w tkance, techniki histologiczne pozwalają na identyfikację zróżnicowanych typów komórek i tkanek. Barwienia histologiczne pełnią różne funkcje. Barwienia ogólne służą do podkreślenia morfologii komórek, na przykład hematoksylina i eozyna do ogólnego barwienia jąder i cytoplazmy, odpowiednio. Inne plamy mogą uwydatniać określone typy komórek. Na przykład niebieska plama alciańska opisana w tym artykule jest szeroko stosowanym barwnikiem kationowym do identyfikacji mukozacharydów. Barwienie przewodu pokarmowego błękitem alcyjnym może zidentyfikować rozmieszczenie komórek kubkowych, które wytwarzają mukozacharydy. Różnice w składnikach mukosacharydów na krótkich peptydach rozróżniają komórki kubkowe według funkcji w przewodzie pokarmowym 6. Stosując jednocześnie metody RNA in situ i metody histochemiczne, decyzje dotyczące losu komórki można powiązać z ekspresją specyficzną dla genu.
Chociaż RNA in situ i histochemia są szeroko stosowane przez badaczy, ich adaptacja i zastosowanie u morskich spodoustych spotkało się z ograniczonym i zróżnicowanym sukcesem. Prezentuję tu protokoły opracowane dla zwierząt spodoustych i stosowane na co dzień w moim laboratorium. Chociaż dalsza modyfikacja metody hybrydyzacji RNA in situ może być konieczna w celu przystosowania się do różnych gatunków, opisane tutaj protokoły stanowią silny punkt wyjścia dla badaczy, którzy chcą dostosować wykorzystanie morskich spodoustych do swoich badań naukowych.

Przykłady barwienia błękitem alcianem w różnych obszarach przewodu pokarmowego L. erinacea przedstawiono na Rysunku 2. Komórki kubkowe zawierające mucyny kwaśne są wyraźnie widoczne po barwieniu błękitem alcianem w całym przewodzie pokarmowym. Rozkład mucyn kwaśnych różni się w zależności od odcinka przewodu pokarmowego, co odzwierciedla różnice w pełnionych funkcjach. Mucyny kwaśne są w niewielkim stopniu produkowane w jelicie spiralnym i kloace, natomiast wysokie stężenie mucyn kwaśnych stwier...

Łącząc metody hybrydyzacji in situ i histologii całego RNA, ekspresja genów może być powiązana z decyzjami dotyczącymi losu komórki w rozwijającym się zarodku. Metody te zostały dostosowane do morskich zwierząt spodoustych i ułatwiają wykorzystanie tych zwierząt jako organizmów modelowych do badań biomedycznych, toksykologicznych i porównawczych.

Hybrydyzacja RNA in situ w całych zarodkach Mount i histologia komórek dostosowana do morskich spodoustych

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie ekspresji genów i decyzji dotyczących siarczanów w rozwijającym się brzegu mariny. Osiąga się to poprzez pierwszą hybrydyzację, specyficzną dla genu sondę RNA w zarodkach montowanych w domu. Drugim krokiem procedury jest wizualizacja ekspresji genów w zarodkach po podziale i barwieniu na Sian blue i nuclear fast red, zbadanie tkanki pod kątem ekspresji wiadomości specyficznych dla genu oraz obecności kwaśnych komórek kubkowych wytwarzających mucynę.Cześć, nazywam się Nicole the Dosio i jestem adiunktem biologii w Union College. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami hybrydyzacji całego montażu i situ RNA jest to, że protokół ten jest specjalnie dostosowany do morskich rang SMA. Rozpocznij ten protokół od etapowego zarodków skate w metanolu przechowywanych w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i przygotowanej sondy RNA dla zarodków w stadium zaawansowania.W wieku 29 30 lat lub później ciało naskórka może zostać podniesione z zarodka pod mikroskopem. Ostrożnie odetnij warstwę naskórka, aby zmaksymalizować penetrację sondy. Najważniejszym etapem tego protokołu jest zapewnienie pełnej penetracji sondy dla starszych zarod

rna-situ-hybridization-whole-mount-embryos-cell-histology-adapted-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Hybridyzacja in situ RNA w zarodkach całych i histologii komórkowej przystosowanych dla morskich ryb chrzęstnoszkieletowych

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano dwukolorową hybrydyzację in situ w całym preparacie (whole mount in situ hybridization), metodę umożliwiającą wizualizację przestrzennego i czasowego wzorca ekspresji dwóch różnych genów w młodych embrionach kurczaka. Metoda ta została pierwotnie wprowadzona przez Davida Wilkinsona, Domingosa Henrique, Phila Inghama i Davida Ish-Horowicza.

Podwójna hybrydyzacja in situ całego preparatu wczesnych zarodków kurczego

Hybrydyzacja in situ w preparatach całych jest jedną z najszerzej stosowanych technik w biologii rozwoju. Przedstawiamy tutaj protokół podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości, służący do analizy precyzyjnego wzorca ekspresji pojedynczego genu oraz określania nakładania się domen ekspresji dwóch genów. Włączyliśmy barwienie jąder jodkiem propidyny w celu uwydatnienia organizacji tkanki.

Wysokorozdzielcza podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w całych embrionach ryby danio-ostrobłysku

Hybrydyzacja in situ całego preparatu (WISH) została zastosowana w ramach zaawansowanego kursu biologii porównawczej kręgowców dla studentów studiów licencjackich, jako uzupełnienie sekcji kręgowców. Dzięki temu studenci mieli możliwość zbadania wzorców ekspresji genów oraz anatomii makroskopowej, co pozwoliło na powiązanie badań nad biologią molekularną i organizmalną w ramach jednego kursu.

Zastosowanie preparatów całych (Whole Mount) in situ Hybrydyzacja w celu powiązania biologii molekularnej i organizmalnej

Niniejszy protokół hybrydyzacji in situ w preparatach całych określa krytyczne etapy zapewniające powtarzalne, wysokiej jakości wyniki w badaniach ekspresji genów w embrionach myszy w wieku od E8.5 do E11.5 dnia.

Hybrydyzacja in situ w całym preparacie zarodków myszy od E8.5 do E11.5

Danio pręgowany, mała tropikalna ryba, stała się popularnym modelem do badania funkcji genów podczas rozwoju i choroby kręgowców. Czasową i przestrzenną ekspresję genów docelowych można określić za pomocą hybrydyzacji in situ. Nasz ulepszony protokół pozwala na wykrywanie mało obfitych transkryptów z niskim niespecyficznym sygnałem tła.

Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

Rozwój rzęsek jest niezbędny do prawidłowego organogenezy. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę oznaczania i wizualizacji komórek rzęskowych danio pręgowanego.

Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

Celem tego protokołu jest przeprowadzenie hybrydyzacji in situ na próbkach dorosłych koralowców, które zostały zatopione w parafinie i pocięte na szkiełka podstawowe. Jest to metoda jakościowa stosowana do wizualizacji ekspresji przestrzennej sondy antysensownej RNA w tkankach zanurzonych w parafinie.

In Situ Techniki hybrydyzacji próbek dorosłych koralowców zanurzonych w parafinie

Ten protokół umożliwia wizualizację ekspresji genów u embrionalnych ryb jaskiniowych Astyanax. Podejście to zostało opracowane w celu maksymalizacji sygnału ekspresji genów, przy jednoczesnej minimalizacji niespecyficznego barwienia tła.

Wholemount Hybrydyzacja in situ dla zarodków Astyanax

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania białek za pośrednictwem przeciwciał fluorescencyjnych w całych preparatach zarodków i larw danio pręgowanego.

Immunohistochemia całego wierzchowca w zarodkach i larwach danio pręgowanego

Ten protokół opisuje, jak uzyskać obrazy poprzez połączenie hybrydyzacji in situ i immunohistochemii odcinków embrionalnych danio pręgowanego. Przed kriosekcją przeprowadzono hybrydyzację in situ, a następnie barwienie przeciwciałami. Przydatne jest wykrycie wzorców ekspresji dwóch genów u danio pręgowanego, jeśli występuje niedobór przeciwciał.

In Situ Hybrydyzacja połączona z immunohistochemią w kriosekcji zarodków danio pręgowanego

Poznaj metodę hybrydyzacji RNA in situ w całych zarodkach połączoną z histologią u morskich spodoustych. Ta technika umożliwia wizualizację ekspresji genów i badanie decyzji komórkowych w rozwoju embrionalnym.

Hybrydyzacja RNA in situ w całych zarodkach Mount i histologia komórek dostosowana do morskich spodoustych

Przeglądaj więcej filmów