Name: Ex vivo Test hemolizy krwinek czerwonych do oceny czynników endosomolitycznych reagujących na pH do cytozolowego dostarczania leków biomakromolekularnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Poznaj test hemolizy erytrocytów do oceny aktywności endosomolitycznej wektorów dostarczania leków. Ta metoda pozwala badać mechanizmy uwalniania biomakromolekuł do cytoplazmy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy potwierdzają finansowanie przez Departament Obrony Kongresowo Kierowane Programy Badań Medycznych (#W81XWH-10-1-0445), Narodowe Instytuty Zdrowia (NIH R21 HL110056) oraz Amerykańskie Towarzystwo Kardiologiczne (#11SDG4890030).

1. Przygotowanie i sterylizacja i czynników testowych
<ol>
 <li>Bufor 150 mM NaCl: Rozpuść 4,383 g kryształów NaCl w 500 ml wody nanoczystej.</li>
 <li>pH: Przygotuj fosforanowe o pH 5,6, 6,2, 6,8 i 7,4, mieszając odpowiednie ilości jednozasadowego i dwuzasadowego fosforanu sodu. Jeżeli próbki mają być badane przy niższych wartościach pH (tj. pH < 5,6), należy użyć bardziej odpowiedniego buforu, takiego jak bufor cytrynianowy. Receptury są łatwo dostępne, a przykładowe odniesienie znajduje się tutaj. 12 </li>
 <li>Wysterylizuj wszystkie wymienione powyżej za pomocą butelkowego aparatu do filtracji próżniowej i ponownie sprawdź pH buforu. </li>
 <li>20% Triton X-100 (kontrola pozytywna): Wymieszaj 20 ml czystego Triton X-100 w 80 ml wody nanoczystej. Energicznie wirować i sonikować do rozpuszczenia. Pozostaw w temperaturze pokojowej na noc przed użyciem. </li>
</ol>
2. Przygotowanie erytrocytów
<ol>
 <li>Pobrać 25 ml krwi od anonimowego dawcy ludzkiego, pobranej bezpośrednio do probówek Vacutainer pokrytych K2-EDTA, aby zapobiec krzepnięciu. </li>
</ol>
UWAGA: Wszystkie procedury muszą być wstępnie zatwierdzone przez odpowiednią Instytucjonalną Komisję Rewizyjną (IRB), a nakłucie żyły i pobranie krwi musi być wykonane przez wyszkolonego flebotomistę, aby zminimalizować ryzyko dla dawcy. Standardowe procedury flebotomii zostały opublikowane w innym miejscu. 13
<ol start="2">
 <li>Odwirować krew o stężeniu 500 x g przez 5 minut i zaznaczyć poziom hematokrytu (czerwona, dolna warstwa) i osocza (żółtawa, górna warstwa) na probówce.</li>
 <li>Delikatnie odessać osocze za pomocą mikropipetora, dodać do wybielacza i wyrzucić do odpadów niebezpiecznych biologicznie. </li>
 <li>Napełnij probówkę hematokrytu do zaznaczonej linii (oryginalny poziom osocza) roztworem NaCl o stężeniu 150 mM. Zakręć i odwróć kilka razy, aby delikatnie wymieszać. Wirować przy 500 x g przez 5 min. </li>
 <li>Powtórz krok 2.3-2.4, aby ponownie umyć krwinki. Następnie odessać supernatant i zastąpić PBS o pH 7,4. Odwróć, aby wymieszać. </li>
 <li>Podziel krew równomiernie na cztery probówki, odpowiadające każdemu pH, które będzie badane. Oznaczyć probówki zgodnie z każdym badanym pH (5.6, 6.2, 6.8, 7.4).</li>
 <li>Odwirować probówki z krwią o stężeniu 500 x g przez 5 minut. Zaznaczyć poziomy na probówkach, a następnie odessać supernatant.</li>
 <li>Napełnić każdą probówkę do oznaczonej linii buforem o odpowiednim pH (jak wskazano w ppkt 2.6). </li>
 <li>Oznaczyć cztery stożkowe probówki o pojemności 50 ml (po jednej na pH do testu) i odpipetować 49 ml PBS o odpowiednim pH do każdej stożkowej probówki. </li>
 <li>Dodać 1 ml erytrocytów (o tym samym pH) do odpowiedniej probówki w celu rozcieńczenia w stosunku 1:50. Sprawdź wzrokowo rozcieńczoną krew, która powinna być mętna i opadnie, jeśli nie zostanie zakłócona. Jeśli nie tworzy się osad, komórki uległy lizie. </li>
</ol>
3. Test lizy 96 Konfiguracja płytki dołkowej i kwantyfikacja
<ol>
 <li>Przygotować roztwory podstawowe wszystkich eksperymentalnych środków do dostarczania leków, o 20-krotnym pożądanym stężeniu końcowym do badania (test wymaga 10 μl środka dostarczającego lek + 190 μl rozcieńczonych czerwonych krwinek, co prowadzi do rozcieńczenia 1:20 oryginalnego środka dostarczającego lek do końcowej mieszaniny testowej). Sugerowane są zapasy 20, 100 i 800 μg/ml, co daje końcowe stężenia testowe odpowiednio 1, 5 i 40 μg/ml.</li>
 <li>Odpipetować 10 μl każdego roztworu podstawowego do 96-dołkowych płytek z dnem w kształcie litery V. Aby uzyskać optymalne wyniki, załaduj każdą próbkę w trzech lub czterech egzemplarzach.</li>
</ol>
UWAGA: Dla ułatwienia, zaleca się, aby dla każdego badanego pH przygotować oddzielną 96-dołkową płytkę, z każdą próbką (przy każdym stężeniu) załadowaną na n=3-4 na płytkę. 
<ol start="3">
 <li>W przypadku studzienek kontroli pozytywnej dodać 10 μl 20% Triton X-100. </li>
 <li>W przypadku studzienek kontroli ujemnej dodać 10 μl buforu fosforanowego. Użyj buforu o tym samym pH, który ma być badany.</li>
 <li>Odmierzyć pipetę 190 μl rozcieńczonych erytrocytów (patrz 2.10) do każdej studzienki, upewniając się, że roztwór podstawowy komórki pozostaje jednorodny podczas przenoszenia. Wskazówka: Użyj pipety wielokanałowej, aby uprościć to zadanie. </li>
 <li>Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez godzinę (opcjonalnie: użyć wytrząsarki orbitalnej lub kołyski). </li>
 <li>Wirować na płytkach przez 5 minut przy 500 x g, aby osadzać nienaruszone erytrocyty. Uwaga: podczas wyjmowania płytki z wirówki i transportowania jej do następnego etapu należy obchodzić się z nią ostrożnie i upewnić się, że nie naruszysz osadu komórkowego. </li>
 <li>Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 100 μl supernatantu z każdej studzienki do przezroczystej, płaskodennej płytki 96-dołkowej. Uwaga: jeśli osad komórkowy zostanie przypadkowo naruszony w przypadku którejkolwiek próbki (próbek), można ponownie odwirować płytkę, a następnie przystąpić do przenoszenia supernatantu. </li>
 <li>Zmierzyć absorbancję supernatantów za pomocą czytnika płytkowego. Należy pamiętać, że można stosować różne długości fal (400 - 541 nm). </li>
</ol>
UWAGA: Różne czytniki płytek mogą mieć różne punkty nasycenia i czułości, więc wybór długości fali do pomiarów zależy od tego, czy dane hemolizy z próbek eksperymentalnych mogą być wiarygodnie znormalizowane w stosunku do maksymalnej hemolizy wywołanej przez leczenie detergentem. Wymaga to dokładnego pomiaru wartości absorbancji dodatnich próbek kontrolnych. 
<ol start="10">
 <li>Korzystając z programu Microsoft Excel lub podobnego oprogramowania do analizy danych, znajdź średnią odczytów absorbancji tła z próbek kontroli ujemnej ustawionych dla każdego pH (krok 3.4). Odejmij tę wartość absorbancji tła od wszystkich innych próbek, które zostały zmierzone przy tym pH.</li>
 <li>Po odjęciu tła określić średnią absorbancję próbek poddanych działaniu detergentu w ramach kontroli dodatniej (krok 3.3). Następnie znormalizuj wszystkie dane eksperymentalne do tej średniej wartości absorbancji, która powinna reprezentować 100% hemolizę. Na koniec pomnóż wartość każdego dołka przez 100%, aby obliczyć % hemolizy, która wystąpiła w każdym pojedynczym studzience w stosunku do kontroli detergentu.</li>
</ol>

<ol><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22">Molecular Biology of the Cell</a>. , 4th, Garland Science. (2002).</li>
<li>Boasson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Bacteriolysis+by+Lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">On the Bacteriolysis by Lysozyme.</a> The Journal of Immunology. 34, 281-293 (1938).</li>
<li>Convertine, A. J., Benoit, D. S., Duvall, C. L., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+endosomolytic+diblock+copolymer+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Development of a novel endosomolytic diblock copolymer for siRNA delivery.</a> J. Control. Release. 133, 221-229 (2009).</li>
<li>Duvall, C. L., Convertine, A. J., Benoit, D. S., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Delivery+of+a+Proapoptotic+Peptide+via+Conjugation+to+a+RAFT+Synthesized+Endosomolytic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Intracellular Delivery of a Proapoptotic Peptide via Conjugation to a RAFT Synthesized Endosomolytic.</a> 7, 468-476 (2010).</li>
<li>Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+escape+pathways+for+delivery+of+biologicals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Endosomal escape pathways for delivery of biologicals.</a> Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).</li>
<li>Plank, C., Oberhauser, B., Mechtler, K., Koch, C., Wagner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+endosome-disruptive+peptides+on+gene+transfer+using+synthetic+virus-like+gene+transfer+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The influence of endosome-disruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-like gene transfer systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 269, 12918-12924 (1994).</li>
<li>Ratner, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Cells+Are+Sensitive+Detectors+of+Bacterial+Pore-forming+Toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Epithelial Cells Are Sensitive Detectors of Bacterial Pore-forming Toxins.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 12994-12998 (2006).</li>
<li>Saar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides%3A+A+comparative+membrane+toxicity+study%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides: A comparative membrane toxicity study.</a> Analytical Biochemistry. 345, 55-65 (2005).</li>
<li>Kichler, A., Leborgne, C., Coeytaux, E., Danos, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine-mediated+gene+delivery%3A+a+mechanistic+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine-mediated gene delivery: a mechanistic study.</a> The Journal of Gene Medicine. 3, 135-144 (2001).</li>
<li>Behr, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Proton+Sponge%3A+a+Trick+to+Enter+Cells+the+Viruses+Did+Not+Exploit%5BTitle%5D)+AND+%22CHIMIA+International+Journal+for+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Proton Sponge: a Trick to Enter Cells the Viruses Did Not Exploit.</a> CHIMIA International Journal for Chemistry. 51, 34-36 (1997).</li>
<li>Dawson, R. M. C., Elliot, D. C., Elliot, W. H., Jones, K. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDawson%2C+RMC+%22Data+for+Biochemical+Research%22">Data for Biochemical Research</a>. , 3rd, Oxford University Press. (1986).</li>
<li>Ernst, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aErnst%2C+DJ+%22Applied+Phlebotomy%22">Applied Phlebotomy</a>. , 1st, Lippincott Williams & Wilkins. (2005).</li>
<li>Bulmus, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+pH-responsive+and+glutathione-reactive%2C+endosomal+membrane-disruptive+polymeric+carrier+for+intracellular+delivery+of+biomolecular+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release+%3A+official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">A new pH-responsive and glutathione-reactive, endosomal membrane-disruptive polymeric carrier for intracellular delivery of biomolecular drugs.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 93, 105-120 (2003).</li>
<li>Lackey, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolytic+Activity+of+pH-Responsive+Polymer-Streptavidin+Bioconjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hemolytic Activity of pH-Responsive Polymer-Streptavidin Bioconjugates.</a> Bioconjugate Chemistry. 10, 401-405 (1999).</li>
<li>Murthy, N., Campbell, J., Fausto, N., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinspired+pH-responsive+polymers+for+the+intracellular+delivery+of+biomolecular+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+chemistry%22%5BJournal%5D)">Bioinspired pH-responsive polymers for the intracellular delivery of biomolecular drugs.</a> Bioconjugate chemistry. 14, 412-419 (2003).</li>
<li>Murthy, N., Robichaud, J. R., Tirrell, D. A., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+and+synthesis+of+polymers+for+eukaryotic+membrane+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release+%3A+official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">The design and synthesis of polymers for eukaryotic membrane disruption.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 61, 137-143 (1999).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+endosomal+barrier+by+amphotericin+B-loaded+dual+pH-responsive+PDMA-b-PDPA+micelleplexes+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Overcoming endosomal barrier by amphotericin B-loaded dual pH-responsive PDMA-b-PDPA micelleplexes for siRNA delivery.</a> ACS nano. 5, 9246-9255 (2011).</li>
<li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+local+delivery+of+siRNA+from+an+injectable+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Sustained local delivery of siRNA from an injectable scaffold.</a> Biomaterials. 33, 1154-1161 (2012).</li>
<li>Miozzari, G. F., Niederberger, P., Hütter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+microorganisms+by+Triton+X-100%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of microorganisms by Triton X-100.</a> Analytical Biochemistry. 90, 220-233 (1978).</li>
<li>Chen, H., Zhang, H., McCallum, C. M., Szoka, F. C., Guo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unsaturated+Cationic+Ortho+Esters+for+Endosome+Permeation+in+Gene+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Unsaturated Cationic Ortho Esters for Endosome Permeation in Gene Delivery.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 50, 4269-4278 (2007).</li>
<li>Roth, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Measurements+and+Rational+Materials+Design+for+Intracellular+Delivery+of+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Quantitative Measurements and Rational Materials Design for Intracellular Delivery of Oligonucleotides.</a> Biotechnology Progress. 24, 23-28 (2008).</li>
<li>Blumenthal, R., Seth, P., Willingham, M. C., Pastan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-dependent+lysis+of+liposomes+by+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">pH-dependent lysis of liposomes by adenovirus.</a> Biochemistry. 25, 2231-2237 (1986).</li>
<li>Moore, N. M., Sheppard, C. L., Barbour, T. R., Sakiyama-Elbert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+endosomal+escape+peptides+on+in+vitro+gene+delivery+of+polyethylene+glycol-based+vehicles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">The effect of endosomal escape peptides on in vitro gene delivery of polyethylene glycol-based vehicles.</a> The Journal of Gene Medicine. 10, 1134-1149 (2008).</li>
<li>Panyam, J., Zhou, W. Z., Prabha, S., Sahoo, S. K., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+endo-lysosomal+escape+of+poly%28DL-lactide-co-glycolide%29+nanoparticles%3A+implications+for+drug+and+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid endo-lysosomal escape of poly(DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles: implications for drug and gene delivery.</a> The FASEB Journal. 16, 1217-1226 (2002).</li>
</ol>

Zatwierdzenie IRB: Procedury z udziałem ludzi zostały zatwierdzone przez Vanderbilt University Institutional Review Board (IRB; Protokół #111251). Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Polimery reagujące na pH lub inne środki przeznaczone do funkcji endosomolitycznej można szybko i skutecznie przebadać przesiewowo na podstawie lizy czerwonych krwinek przy wartościach pH napotkanych w endosomie (ryc. 1; pH 6,8 - wczesny endosom, pH 6,2 - późny endosom, pH 5,6 - lizosom). Hemoliza zależna od pH 14-17 została wykorzystana do badania przesiewowego zdolności nośników do pośredniczenia w endosomalnym uwalnianiu terapii biomakromolekularnych (np. peptydów, siRNA, ODN, biał...

Chociaż wewnątrz komórki znajduje się wiele potencjalnych celów terapeutycznych o dużym wpływie, wewnątrzkomórkowe dostarczanie środków stanowi poważne wyzwanie. Często leki, zwłaszcza biologiczne, są internalizowane przez komórki i transportowane do pęcherzyków, które albo prowadzą do degradacji ich zawartości przez szlak endolizosomalny, albo są transportowane z powrotem z komórki przez egzocytozę. 1 W tym ostatnim procesie wewnętrzne pH pęcherzyków jest zakwaszane do około 5-6, co jest optymalnym pH dla aktywności enzymów działających w tym kompartmencie, takich jak lizozym. cyfra arabska 
Ostatnio, wiele materiałów zostało specjalnie zaprojektowanych, aby wykorzystać zakwaszenie endosomów do ułatwienia cytozolowego dostarczania ich ładunku. Jednym z przykładów takiego podejścia są syntetyczne, polimerowe nanocząstki miceli, których rdzeń jest jonowy i neutralny pod względem ładunku przy fizjologicznym pH (tj. 7,4). Jednak przy pH 6,0 - 6,5 polimery ulegają protonacji i uzyskują dodatni ładunek netto, który destabilizuje rdzeń miceli, a odsłonięte segmenty polimeru oddziałują z błoną endosomalną i ją zakłócają. Wykazano, że aktywność ta sprzyja endosomalnej ucieczce leków opartych na peptydach i kwasach nukleinowych, umożliwiając im dostęp do celów cytozolowych. 3,4 Inne przykłady metod opracowanych w celu pośredniczenia w ucieczce endosomalnej, które zakłócają barierę błonową, obejmują "fuzogenne" peptydy lub białka, które mogą pośredniczyć w fuzji błonowej lub przejściowym tworzeniu porów w dwuwarstwie fosfolipidowej. 5 Homopolimery anionowych alkilowych kwasów akrylowych, takie jak poli(kwas propyloakrylowy), to kolejne dobrze zbadane podejście, aw tych polimerach stan protonacji wiszącego kwasu karboksylowego dyktuje przejście w stan hydrofobowy, zakłócający błonę w endolizosomalnych zakresach pH. 6,7
Jednym z użytecznych modelowych systemów do badania zachowań endosomolitycznych jest test hemolizy ex vivo zależny od pH. 8 W tym systemie modelowym błona erytrocytów służy jako substytut dwuwarstwowej błony lipidowej, która otacza pęcherzyki endolizosomalne. Ten uogólniony model został wykorzystany przez innych do oceny endosomolitycznego zachowania peptydów penetrujących komórki i innych polimerowych systemów dostarczania genów. 8-11 W tym eksperymencie ludzkie krwinki czerwone i materiały testowe są jednocześnie inkubowane w o określonych pH, które naśladują środowiska zewnątrzkomórkowe (7,4), wczesne endosomalne (6,8) i późne endolizomalne (< 6,8). Ilość hemoglobiny uwalnianej w okresie inkubacji określa się ilościowo jako miarę lizy czerwonych krwinek, która jest normalizowana do ilości hemoglobiny uwalnianej w dodatnich próbkach kontrolnych poddanych lizie detergentu. 
Z badania przesiewowego małej biblioteki potencjalnie endosomolitycznych materiałów testowych, można wywnioskować, że próbki, które nie wytwarzają hemolizy przy pH 7,4, ale znacznie podwyższoną hemolizę przy pH < 6,5, będą najbardziej skutecznymi i cytokompatybilnymi kandydatami do dostarczania leków cytozolowych. Oczekuje się, że materiały, które spełniają te kryteria, pozostaną obojętne i nie będą bezkrytycznie niszczyć dwuwarstwowych błon lipidowych (tj. To może powodować cytotoksyczność), dopóki nie zostaną wystawione na spadek lokalnego pH po internalizacji do kompartmentów endolizosomalnych. 
W tym protokole, erytrocyty są izolowane od ludzkiego dawcy i jednocześnie inkubowane przy pH 5,6, 6,2, 6,8 lub 7,4 z eksperymentalnymi środkami do dostarczania leków endosomolitycznych. Nienaruszone erytrocyty są granulowane, a supernatanty (zawierające hemoglobinę uwalnianą z lizowanych erytrocytów) są analizowane pod kątem charakterystycznej absorbancji hemoglobiny za pomocą czytnika płytek (ryc. 1).

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer - Rurki próżniowe K2EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-253-145</td><td>Do pobierania krwi</td></tr><tr><td>Igły do pobierania krwi BD Vacutainer, 20,5-gauge</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-665-31</td><td>Do pobierania krwi</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Uchwyt rurki / adapter igły</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-289-953</td><td>Do pobierania krwi</td></tr><tr><td>Waciki z alkoholem izopropylowym marki BD</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-680-63</td><td>Do pobierania krwi</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Bezlateksowa opaska uciskowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-657-6</td><td>Do pobierania krwi</td></tr><tr><td>Kwas solny (stężenie)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td>Do regulacji pH D-PBS.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Kontrola pozytywna</td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene MF75 Sterylny jednorazowy filtr butelkowy z membraną SFCA</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-44A</td><td></td></tr><tr><td>BD Płytki 96-dołkowe, płaskodenne, polistyren poddany kulturom tkankowym</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-2C</td><td>Do odczytu z tabliczki na końcu testu.</td></tr><tr><td>BD 96-dołkowe, okrągłodenne, polistyren poddany kulturom tkankowym</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-17</td><td>Do inkubacji czerwonych krwinek za pomocą środków eksperymentalnych.</td></tr></tbody></table>

ex vivo test hemolizy krwinek czerwonych do oceny czynników endosomolitycznych reagujących na ph do cytozolowego dostarczania leków biomakromolekularnych

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

Dwuwarstwowe fosfolipidy, które tworzą pęcherzyki endolizosomalne, mogą stanowić barierę dla dostarczania leków biologicznych do celów wewnątrzkomórkowych. Aby pokonać tę barierę, zaprojektowano szereg syntetycznych nośników leków, które aktywnie zakłócają błonę endosomalną i dostarczają ładunek do cytoplazmy. W tym miejscu opisujemy test hemolizy, który może być stosowany jako szybkie, wysokoprzepustowe badanie przesiewowe pod kątem cytozgodności i aktywności endosomolitycznej wewnątrzkomórkowych systemów dostarczania leków. 
W teście hemolizy, ludzkie czerwone krwinki i materiały testowe są współinkubowane w o określonych pH, które naśladują środowiska zewnątrzkomórkowe, wczesne endosomalne i późne endolizomalne. Po etapie wirowania w celu osadzenia nienaruszonych krwinek czerwonych, ilość hemoglobiny uwalnianej do pożywki jest mierzona spektrofotometrycznie (405 nm dla najlepszego zakresu dynamiki). Procent rozerwania czerwonych krwinek jest następnie oznaczany ilościowo w stosunku do pozytywnych próbek kontrolnych poddanych lizie z detergentem. W tym systemie modelowym błona erytrocytów służy jako substytut dwuwarstwowej błony lipidowej, która otacza pęcherzyki endolizosomalne. Pożądanym rezultatem jest znikoma hemoliza przy fizjologicznym pH (7,4) i silna hemoliza w endolizosomalnym zakresie pH od około 5,8 do pH.

Zazwyczaj substancje wykazujące idealne pH-zależne zachowanie hemolityczne mają największy potencjał w dostarczaniu leków, kwasów nukleinowych lub innych cząsteczek bioaktywnych do cytozolu. Przykładem jest Substancja nr 1 przedstawiona na Rysunku 2, która wykazuje minimalną hemolizę przy pH 7,4, ale gwałtowny wzrost aktywności hemolitycznej w zakresach pH endosomalnego (&lt; 6,5). Niektóre substancje mogą wykazywać znaczny poziom zachowań hemolitycznych w fizjologicznych zakresach pH (Substancja nr 2 pr...

Test hemolizy może być używany jako szybkie, wysokoprzepustowe badanie cytokompatybilności i aktywności endosomolitycznej systemów dostarczania leków do wewnątrzkomórkowego dostarczania ładunków. Test mierzy rozerwanie błon erytrocytów w funkcji pH środowiska.

Ex vivo Test hemolizy krwinek czerwonych do oceny czynników endosomolitycznych reagujących na pH do cytozolowego dostarczania leków biomakromolekularnych

Phospholipid bilayers that constitute endo-lysosomal vesicles can pose a barrier to delivery of biologic drugs to intracellular targets. To overcome this ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest ilościowa ocena potencjału destabilizacji błony przez wektory dostarczania leków przeznaczonych do wewnątrzkomórkowego dostarczania biologicznych substancji leczniczych, przy wykorzystaniu erytrocytów jako biologicznego modelu błony endosomalnej. Film ten został zrealizowany przez Advanced Therapeutics Laboratory na Vanderbilt University. Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Radę Przeglądową (Institutional Review Board) Vanderbilt University.Najpierw krótki wstęp do endocytozy, hemolizy i hemolizy. Nośniki leków biologicznych są pobierane do endosomów przez komórkę w procesie endocytozy nieswoistej lub za pośrednictwem receptorów. Po endocytozie.Ładunek jest albo degradowany w lizosomach, albo transportowany w procesie egzocytozy z powrotem do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Jak pokazano, spadek pH w endosomie może być jednak wykorzystany w przypadku nośników leków reagujących na pH, które w środowisku kwasowym stają się zdolne do rozrywania błon, fizycznie tworząc pory lub destabilizując błonę endosomalną; po zniszczeniu endosomu ładunek leku może zostać uwolniony do cytoplazmy i rozprzestrzenić się do docelowych lokalizacji w cytoplazmie, mitochondriach lub jądrze komórkowym. W tym badaniu erytrocyty służą jako model błony endosomalnej w fizjologicznym pH.Idealne nośniki dostarczające powinny pozostać stabilne i nie naruszać błony komórkowej erytrocytów. Jednakże, po obniżeniu pH, nośnik stanie się niestabilny, co doprowadzi do oddziaływań hydrofobowych niszczących błonę komórkową erytrocytów i uwalniających hemoglobinę. Hemoglobinę można następnie wyizolować z erytrocytów i określić jej ilość spektrofotometrycznie poprzez pomiar absorbancji przy 405, 450 lub 541 nanometrach.Wyższe wartości absorbancji będą korelować z silniejszym działaniem endolitycznym. Można to zwizualizować za pomocą mikroskopii poklatkowej przy pH fizjologicznym. Erytrocycie pozostają stabilne w obecności nośnika leku.Jednakże przy niższym pH, charakterystycznym dla szlaku endosomalnego, nośniki dostarczające szybko rozrywają i niszczą błony komórkowe erytrocytów. Materiały niezbędne do niniejszego badania obejmują 150 millimolar chlorek sodu, przygotowany z 500 mililitrów wody dejonizowanej i 4,383 gram chlorku sodu, przefiltrowany sterylnie za pomocą aparatu do filtracji próżniowej z filtrem nakręcanym na butelkę. Roztwory soli fosforanowo-buforowanej (PBS) o pH 7,4, 6,8, 6,2 oraz 5,6 przygotowano poprzez zmieszanie odpowiednich ilości buforów fosforanowych jedno- i dwusodowych, a następnie przefiltrowano sterylnie za pomocą aparatu do filtracji próżniowej z filtrem nakręcanym na butelkę.Wartość pH monitorowano za pomocą pH-metru i/lub pasków wskaźnikowych pH, stosując kilka metod w celu zapewnienia dokładności pomiarów. 20% roztwór Triton X przygotowano poprzez rozpuszczenie 20 mililitrów Triton X 102 w 80 mililitrach wody nanopure, energicznie wstrząsając i sonikując do całkowitego rozpuszczenia, po uzyskaniu zgody komisji etycznej. Pielęgniarka badawcza lub flebotomista powinna pobrać 25 mililitrów krwi pełnej od anonimowego dawcy do probówek próżniowych powlekanych EDTA potasem w celu zapobiegania koagulacji.W tym filmie zastosowano igłę do pobierania krwi o rozmiarze 20,5 gauge połączoną z adapterem do probówek próżniowych. Pobraną krew odwirowano przy 500 ×g przez pięć minut. Po wirowaniu powinny być wyraźnie widoczne warstwa osocza oraz warstwa erytrocytów.Należy uważać, aby nie zakłócić warstw poprzez wstrząsanie. Zaznaczyć poziomy osocza, a następnie ostrożnie odessać je za pomocą mikropipety lub aspiratora próżniowego i zutylizować w roztworze wybielacza. Zastąpić osocze 150 millimolar roztworem chlorku sodu, dopełniając do zaznaczonej linii.Zakręć fiolkę i odwróć ją kilkakrotnie, aby delikatnie wymieszać zawartość, a następnie odwiruj po raz drugi przy 500 G przez pięć minut, po czym odessaj nadsącz. Uzupełnij objętość nadsączu do zaznaczonej linii roztworem chlorku sodu 150 mM i odwróć fiolkę kilkakrotnie, aby delikatnie wymieszać, a następnie odwiruj po raz trzeci przy 500 G przez pięć minut. Odessaj nadsącz i uzupełnij objętość do zaznaczonej linii buforem PBS o pH 7.4.Równomiernie rozdziel krew do czterech probówek. Każda z nich posłuży do badania innego pH, w tym fizjologicznego pH 7.4, pH wczesnych endosomów 6.8, pH późnych endosomów 6.2 oraz pH późnych endosomów lub lizosomów 5.8. Powtórz wirowanie po raz czwarty i ostatni przy 500 G przez pięć minut.Zaznaczyć poziom nadsączu, a następnie ostrożnie go odessać, wylewając nadsącz do roztworu wybielacza. Zastąpić nadsącz buforem PBS o odpowiednim pH. Końcowe zapasy erytrocytów przygotowuje się poprzez 50-krotne rozcieńczenie roztworów zapasowych w buforze o odpowiednim pH.W tym przypadku jeden mililitr skoncentrowanych erytrocytów dodano do 49 mililitrów PBS, a następnie delikatnie odwrócono fiolkę kilka razy, aby wymieszać erytrocyty przed przygotowaniem krwi. Należy przygotować roztwory zapasowe nośników w 20-krotnym stężeniu. W przypadku polimerów sugerujemy 2100 oraz 800 µg/mL jako początkowe stężenia testowe; po rozcieńczeniu stężenia końcowe do inkubacji wyniosą odpowiednio 105 i 40 µg/mL. Należy użyć płytek stożkowych lub z okrągłym dnem, aby nieuszkodzone erytrocyty można było usunąć poprzez wirowanie. Do każdej studni należy napipetować 10 µL 20-krotnie stężonego roztworu polimeru.Sugerujemy przygotowanie próbek w co najmniej trzech lub czterech powtórzeniach, aby zoptymalizować wyniki. Triton X spowoduje lizę wszystkich komórek i może być stosowany jako kontrola dodatnia; roztwór 1% PBS o pH 7,4 może służyć jako kontrola ujemna. Do każdego dołka pipetujemy 190 µL rozcieńczonych erytrocytów. Należy upewnić się, że zawiesina erytrocytów pozostaje jednorodna, co może wymagać lekkiego wstrząśnięcia lub wymieszania w celu utrzymania komórek w zawiesinie.Należy pamiętać, że po dodaniu erytrocytów można już zaobserwować początek lizy w przypadku związków o bardzo silnym działaniu hemolitycznym. Inkubować przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C, aby umożliwić przeprowadzenie lizy. Wyjąć płytki i odwirować je przy 500 G w celut osadzenia erytrocytów.Następnie ostrożnie przenieś 100 µL supernatantu do płytki 96-dołkowej z płaskim dnem. Kluczowe jest, aby nie poruszyć osadu erytrocytów, dlatego należy postępować z dużą ostrożnością. Zmierz absorbancję każdego dołka za pomocą czytnika płytek przy 450 nm.W przypadku zbyt dużego stężenia hemoglobiny i uzyskania wysokich odczytów absorbancji, płytki można odczytać przy 541 nanometrach. Alternatywnie, jeśli hemoglobina jest zbyt rozcieńczona i uzyskiwane są niskie odczyty absorbancji, płytki można odczytać przy 405 nanometrach, aby zmaksymalizować absorbancję. Aby przeanalizować dane, można obliczyć procent hemolizy, przyjmując, że PBS nie spowoduje lizy żadnych erytrocytów, natomiast Triton X spowoduje lizę 100% erytrocytów.Przedstawione równanie pozwoli na obliczenie procentu homolizy dla każdej próbki. Oprogramowanie takie jak Microsoft Excel może zostać wykorzystane do szybkiej analizy eksperymentów z setek studzienek. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki dla kilku stężeń w omówionych zakresach pH.Sformułowanie to wykazuje idealną odpowiedź na pH i nie wykazuje aktywności hemolitycznej w pH fizjologicznym, natomiast w pH endosomalnym przejawia zachowanie typu przełącznika, co prowadzi do znacznego rozpadu błony, co wskazano czerwoną strzałką. Właśnie obejrzeli Państwo film z naszego laboratorium opisujący test hemolizy czerwonych krwinek zależny od pH. Jest to stosunkowo niedrogi, łatwy w użyciu i wysokoprzepustowy test, który może być wykorzystany do przesiewania bibliotek kombinatorycznych serii polimerów zaprojektowanych do litycznego dostarczania leków biologicznych.Uznano, że test ten charakteryzuje się wysoką zdolnością do przewidywania dostarczania do cytozolu oraz bioaktywności szerokiego zakresu leków biologicznych, w tym białek, peptydów i kwasów nukleinowych. Należy jednak wspomnieć o pewnych potencjalnych słabych stronach tej metody. Uważa się, że jest ona skutecznym narzędziem prognostycznym w przypadku polimerów lub peptydów, które faktycznie powodują fizyczne przerwanie błony endosomalnej.Nie jest to jednak odpowiednie narzędzie prognostyczne w przypadku polimerów lub innych układów działających w oparciu o mechanizm gąbki protonowej. Ponadto należy wziąć pod uwagę, że skład dwuwarstwy lipidowej erytrocytów nie odzwierciedla dokładnie składu błon endosomalnych lub lizosomalnych. Biorąc pod uwagę skład lipidowy i zawartość cholesterolu, należy zawsze być przygotowanym na przeprowadzenie dalszych badań weryfikujących.Każdy wynik hemolizy erytrocytów uzupełnia się stosownymi technikami i analizami. Na przykład mikroskopia fluorescencyjna stosowana w połączeniu z barwnikami endosomalnymi lub lizosomalnymi może być wykorzystana w badaniach kolokalizacji do wizualizacji ucieczki leków biologicznych z szlaków endolizosomalnych. Ponadto ostatnim krokiem powinien być zawsze pomiar bioaktywności lub efektów końcowych dostarczonego leku lub substancji biologicznej.Na koniec pamiętaj, aby odpady biologicznie niebezpieczne zawsze obchodzić i utylizować zgodnie z procedurami obowiązującymi w Twojej jednostce macierzystej. To kończy nasz film. Powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

ex-vivo-red-blood-cell-hemolysis-assay-for-evaluation-ph-responsive

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ex Vivo test hemolityczny czerwonych krwinek do oceny pH-odpowiedzialnych środków endosomolitycznych do dostarczania leków biomakrocząsteczkowych do cytozolu

Ten film opisuje test in vitro mający na celu określenie hemolizy lub lizy czerwonych krwinek w ludzkiej próbce wywołanej jonoforem wapnia. Test mierzy procent hemolizy poprzez ilościowe określenie hemoglobiny uwalnianej z pękniętych erytrocytów.

Test hemolizy: metoda in vitro do pomiaru lizy indukowanej jonoforem wapnia w ludzkich erytrocytach

W tym filmie pokazujemy test wiązania Aneksyny V do pomiaru stopnia eryptozy, zaprogramowanej śmierci komórki erytrocytów, za pomocą barwienia fluorescencyjnego Aneksyny V. Erytrocyty apoptotyczne wykazują translokację fosfatydyloseryny z wewnętrznej do zewnętrznej płatki błony komórkowej, powodując wiązanie się znakowanej fluoroforem aneksyny V z translokowaną fosfatydyloseryną, emitując w ten sposób sygnał fluorescencyjny.

Test wiązania aneksyny V: technika oparta na fluorescencji do identyfikacji erytrocytów apoptotycznych poprzez znakowanie fosfatydyloseryną

Ten film demonstruje test do badania skuteczności uszczelniania błony plazmatycznej w komórkach ssaków. Komórki są wystawione na działanie bakteryjnej toksyny tworzącej pory, która tworzy pory w błonie komórkowej. W obecności zewnątrzkomórkowych jonów wapnia pory powodują napływ wapnia, wywołując zdarzenia ponownego uszczelniania błony. Skuteczność ponownego zamykania ocenia się za pomocą barwnika jodku propydyny wiążącego DNA, który dostaje się do komórek tylko bez ponownie uszczelnionej błony.

Test fluorescencyjny in vitro do pomiaru skuteczności ponownego uszczelniania błony plazmatycznej

Test cytotoksyczności krwi pełnej (WCA) jest testem cytotoksyczności opracowanym przez połączenie wysokoprzepustowej technologii pozycjonowania komórek z mikroskopią fluorescencyjną i automatycznym przetwarzaniem obrazu. Tutaj opisujemy, w jaki sposób komórki chłoniaka leczone przeciwciałem anty-CD20 mogą być analizowane w czasie rzeczywistym w ludzkiej krwi pełnej w celu zapewnienia ilościowej analizy cytotoksyczności komórkowej.

Testy cytotoksyczności w czasie rzeczywistym w ludzkiej krwi pełnej

Aby dostarczyć leki przeciwnowotworowe do miejsc nowotworowych o wysokiej swoistości i zmniejszonych skutkach ubocznych, potrzebne są nowe metody oparte na nanocząsteczkach. Tutaj opisujemy usieciowane micele dwusiarczkowe, które można łatwo przygotować przez utlenianie za pośrednictwem nadtlenku wodoru i są w stanie skutecznie dysocjować w środowisku redukującym guza, aby uwolnić ładunki.

Łatwe i wydajne podejście do produkcji odwracalnych miceli usieciowanych dwusiarczkowym

Opracowano test czasu rzeczywistego o wysokiej przepustowości, aby jednocześnie zidentyfikować (1) środki przeciwdrobnoustrojowe penetrujące komórki eukariotyczne skierowane na wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny i (2) ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. Wariant tej samej technologii został następnie połączony z technologią cyfrowego dozowania, aby umożliwić łatwe badania w wysokiej rozdzielczości, zależności od dawki oraz dwu- i trójwymiarowej synergii.

Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

Mitochondria komórek śródbłonka są niezbędne do utrzymania integralności bariery krew-mózg. Wprowadzamy protokół pomiaru funkcji bioenergetycznych w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych.

Ocena funkcji bioenergetycznych w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych

Ten artykuł przedstawia proces pracy mikroskopii o wysokiej zawartości do jednoczesnej kwantyfikacji wewnątrzkomórkowych poziomów ROS, jak również potencjału i morfologii błony mitochondrialnej - wspólnie określanych jako morfofunkcja mitochondriów - w żywych komórkach przylegających przy użyciu przenikających komórkę fluorescencyjnych cząsteczek reporterowych 5-(i-6)-chlorometylo-2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny dioctanu, ester acetylowy (CM-H2DCFDA) i ester metylowy tetrametylodaminy (TMRM).

Profilowanie redoks komórkowe przy użyciu mikroskopii o wysokiej zawartości

Protokół indukcji eryptozy, programowanej śmierci komórki w erytrocytach, przy użyciu jonoforu wapnia, jonomycyny, jest dostarczony. Powodzenie eryptozy ocenia się, monitorując lokalizację fosfatydyloseryny w zewnętrznej płatku błony. Zbadano czynniki wpływające na powodzenie protokołu i zapewniono optymalne warunki.

Indukcja eryptozy w czerwonych krwinkach za pomocą jonoforu wapnia

Protokół opisuje szybki, wysokoprzepustowy, niezawodny, niedrogi i bezstronny test do skutecznego określania żywotności komórek. Ten test jest szczególnie przydatny, gdy mitochondria komórek zostały uszkodzone, co zakłóca działanie innych testów. Test wykorzystuje automatyczne zliczanie komórek wybarwionych dwoma barwnikami jądrowymi – Hoechst 33342 i jodkiem propidyny.

Zautomatyzowany różnicowy test barwienia jądrowego do dokładnego określania cytotoksyczności mitokanu

Ten protokół ilustruje test transcytozy komórek śródbłonka in vitro jako model do oceny przepuszczalności wewnętrznej bariery krew-siatkówka poprzez pomiar zdolności ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego siatkówki do transportu peroksydazy chrzanowej przez komórki w procesach transportu transkomórkowego, w których pośredniczą kaweole.

Test transcytozy komórek śródbłonka jako model in vitro do oceny przepuszczalności wewnętrznej bariery krew-siatkówka

Poznaj test hemolizy erytrocytów do oceny aktywności endosomolitycznej wektorów dostarczania leków. Ta metoda pozwala badać mechanizmy uwalniania biomakromolekuł do cytoplazmy.

Ex vivo Test hemolizy krwinek czerwonych do oceny czynników endosomolitycznych reagujących na pH do cytozolowego dostarczania leków biomakromolekularnych (Wideo) | JoVE Journal

Ex vivo Test hemolizy krwinek czerwonych do oceny czynników endosomolitycznych reagujących na pH do cytozolowego dostarczania leków biomakromolekularnych

Przeglądaj więcej filmów