Name: Stereotaktyczne wstrzyknięcie lentiwirusów eksprymujących mikroRNA do regionu CA1 hipokampa myszy i ocena wyniku behawioralnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj stereotaktyczne wstrzyknięcie lentiwirusów eksprymujących mikroRNA do regionu CA1 hipokampa myszy. Ta metoda umożliwia ocenę wpływu mikroRNA na funkcje poznawcze i regulację genów w mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (stypendium SB), The Legacy Heritage Biomedical Science Partnership Program of the Israel Science Foundation (grant nr 378/11, dla HS) oraz Niemiecko-Izraelską Fundację Badań Naukowych i Rozwoju (G.I.F) (grant nr. 1093-32.2/2010, do HS).

1. Przygotowanie lentiwirusa
<ol>
	<li>Hoduj komórki HEK-293FT do 90% konfluencji.</li>
	<li>W dniu transfekcji należy zmienić pożywkę komórkową na DMEM bez surowicy, uzupełnioną o 1 mM glutaminę i 50 mg/ml penicyliny-streptomycyny.</li>
	<li>Kotransfekować komórki wektorem pLKO.1-Puro i plazmidami kodującymi ugrupowania delta R8.2 i VSV-G oraz miRNA będące przedmiotem zainteresowania, używając 10 μl 1 mg / ml polietylenininy jako nośnika 9.</li>
	<li>Zbierz zapakowane lentiwirusy po 24 godzinach i 48 godzinach po transfekcji, przefiltruj przez filtr 0,45 μm.</li>
	<li>Zagęścić lentiwirusy za pomocą ultrawirowania w 70 000 x g, przez 2 godziny w temperaturze 15 °C, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -70 °C.</li>
	<li>Zmierz miano wirusa, infekując komórki HEK-293T seryjnie rozcieńczonymi preparatami wirusowymi (1 do 10-6 ml wektora na studzienkę). Otrzymane miano (zalecane minimum ~1×109 zakaźnych cząstek na ml) ocenia się pod kątem ekspresji interesującego genu, stosując selekcję puromycyny i ilościowe określenie wirusów eksprymujących GFP poprzez zliczanie komórek fluorescencyjnych.</li>
</ol>
Aby uzyskać bardziej szczegółowy protokół przygotowania lentiwirusa, zobacz 10.
2. Przygotowanie zwierząt do operacji
<ol>
	<li>Strój chirurga powinien obejmować fartuch chirurgiczny, sterylne rękawiczki, czepek i maskę.</li>
	<li>Zważyć zwierzę, a następnie znieczulić je wstrzyknięciem IP mieszaniny ketaminy, o objętości proporcjonalnej do masy zwierzęcia, jak określono dla każdego leku. W przypadku mieszaniny ketaminy/ksylazyny zwykle stosuje się zakres dawek 80-200 mg/kg ketaminy i 7-20 mg/kg ksylazyny.</li>
	<li>Poczekaj, aż zwierzę zostanie w pełni znieczulone, a następnie sprawdź, czy nie ma odruchu wycofania w tylnej kończynie zwierzęcia, rozciągając kończynę, a następnie naciskając ją palcem.</li>
	<li>Należy wstrzyknąć zwierzęciu podskórnie preparat Rimadyl, zgodnie z zaleceniami na pudełku, w celu złagodzenia bólu. Typowy zakres dawek leku Rymadil wynosi 5-10 mg.</li>
	<li>Umieść zwierzę na poduszce grzewczej, aby utrzymać stałą temperaturę ciała i zwilż oczy maścią.</li>
	<li>Ogol obszar między dwoma uszami za pomocą maszyny do przycinania.</li>
	<li>Zdezynfekuj skórę za pomocą betadyny.</li>
</ol>
3. Odsłonięcie czaszki i wiercenie
<ol>
	<li>Umieść zwierzę w stereotakcie, dopasowując pręty do szczelin tuż przed uszami zwierzęcia.</li>
	<li>Za pomocą skalpela wykonaj przednio-tylne nacięcie o długości około 1,5 cm między uszami i utrzymuj je otwarte za pomocą zacisków chirurgicznych (serfines).</li>
	<li>Oczyść powierzchnię czaszki bawełnianym wacikiem, aż do przecięcia szwu koronalnego i szwów strzałkowych; tj. bregma i przecięcie szwów koronalnych i lambdoidalnych; tj. lambda, są widoczne.</li>
	<li>Skieruj końcówkę strzykawki, trzymaną przez stereotakt, na punkt bregma, we wszystkich trzech osiach. Zapisz współrzędne. Punkt ten byłby traktowany jako punkt zerowy we wszystkich trzech osiach.</li>
	<li>Podnieść strzykawkę w osi pionowej tak, aby ruch płaski nie porysował czaszki i przesunąć główkę strzykawki we właściwe miejsce. Wstrzyknięcia CA1 do hipokampa wymagają następujących współrzędnych względem bregmy w mm: -2 na osi przedniej/tylnej, ±1,8 na osi bocznej/przyśrodkowej i -1,5 na osi grzbietowej/brzusznej.</li>
	<li>Opuścić końcówkę strzykawki, aż dotknie czaszki i oznaczyć to miejsce markerem. Wyjąć strzykawkę z powrotem, aby uniknąć dźgnięcia.</li>
	<li>Wywierć płytki otwór, tylko w kości czaszki za pomocą drobnego wiertła. Trzymaj wiertło stabilnie, aby nie kontynuowało wiercenia w tkance miękkiej pod spodem. Można temu zapobiec, podpierając jedną rękę drugą i wiercąc w krótkich impulsach.</li>
</ol>
4. Wstrzyknięcie lentiwirusa
<ol>
	<li>Pobrać 0,5 ml stężonego roztworu lentiwirusa.</li>
	<li>Umieść strzykawkę nad otworem i powoli opuść ją pionowo, aż dotrze do powierzchni czaszki. Kontynuuj bardzo powolne opuszczanie strzykawki do mózgu. Na tym etapie może wystąpić krwawienie, które niekoniecznie wskazuje na nieudaną penetrację. Jeśli wystąpi krwawienie, wytrzyj je bawełnianym wacikiem.</li>
	<li>Ustawić pompę cyfrową na 0,02 ml/min (0,5 μl zostanie wstrzyknięte w ciągu 25 minut) i rozpocząć infuzję. Powolna infuzja pozwala na skuteczne rozprzestrzenianie się wirusa w tkance i zapobiega przepływowi wstecznemu. W niektórych typach strzykawek należy rozważyć włożenie strzykawki na dodatkową głębokość 0,5 mm przed wycofaniem się do pierwotnych współrzędnych i zaparzeniem.</li>
	<li>Po zakończeniu infuzji należy odczekać dodatkowe 5 minut, aby materiał mógł rozprzestrzenić się do mózgu, zamiast wycofywać się z powrotem do kanału utworzonego przez strzykawkę.</li>
	<li>Wyjmować strzykawkę bardzo powoli i obserwować, czy nie ma przepływu wstecznego. Jeśli na tym etapie zaobserwuje się przepływ wsteczny, prawdopodobnie część wstrzykniętego materiału została utracona.</li>
</ol>
5. Uszczelnianie ran i rekonwalescencja
<ol>
	<li>Uszczelnij ranę histoakrylem. Należy pamiętać, aby nie dopuścić do przeciekania histoakrylu do oczu.</li>
	<li>Wstrzyknąć zwierzęciu dootrzewnowo (IP) 1 ml podgrzanego roztworu soli fizjologicznej, aby uniknąć odwodnienia.</li>
	<li>Umieść zwierzę w klatce regeneracyjnej, która jest umieszczona na podgrzewanej podkładce. Obserwuj zwierzę, gdy dochodzi do siebie przez dodatkową godzinę.</li>
</ol>
W przypadku utraty wagi, braku apetytu, osłabienia/niemożności uzyskania paszy lub wody, stanu agonalnego lub infekcji, należy przeprowadzić eutanazję zwierzęcia. Dopuszczalnymi metodami eutanazji gryzoni są barbiturany, wziewne środki znieczulające, CO2, CO lub chlorek potasu w połączeniu ze znieczuleniem ogólnym.
Po 4 do 6 tygodniach, ocena pamięci nawigacyjnej zwierzęcia jest oceniana w Labiryncie Wodnym Morrisa. lentiwirus zwykle infekuje większość komórek w sferze iniekcyjnej.
6. Ocena zachowania w wodnym labiryncie Morrisa
<ol>
	<li>Trenuj zwierzęta w wodnym labiryncie Morrisa. Dokładny protokół szkolenia i testowania znajduje się w punkcie 11. Po każdej próbie osusz zwierzę suchym ręcznikiem, umieść je w klatce i odśwież wodę w zbiorniku.</li>
	<li>Testuj zwierzęta w labiryncie wodnym Morris przez 3 kolejne dni, 4 próby każdego dnia. Każdego dnia wprowadzaj zwierzę do labiryntu w każdym z 4 kierunków labiryntu (północ, południe, wschód i zachód) w zmieniającej się kolejności, na przykład dzień pierwszy: wschód-zachód-północ-południe, dzień drugi: zachód-południe-północny-wschód. Wytrzyj zwierzęta po każdej próbie.</li>
	<li>Podczas prób testowych śledź zwierzę za pomocą systemu śledzenia, takiego jak system śledzenia Noldus.</li>
	<li>Po 12. próbie testowej włóż zwierzę do zbiornika na wodę bez platformy na jedną minutę. Zostanie to wykorzystane do analizy strategii poszukiwawczej, którą przyjmuje zwierzę.</li>
	<li>Przeanalizuj dane zgodnie z sugestią w punkcie 12.</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+screen+implicates+microRNA-138-dependent+regulation+of+the+depalmitoylation+enzyme+APT1+in+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).</li>
<li>Jin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+interaction+between+the+fragile+X+mental+retardation+protein+and+the+microRNA+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway.</a> Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).</li>
<li>Simon, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+miR-1+regulates+a+MEF-2-dependent+retrograde+signal+at+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions.</a> Cell. 133, 903-915 (2008).</li>
<li>Consiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+therapy+of+metachromatic+leukodystrophy+by+lentiviral+vectors%3A+correction+of+neuropathology+and+protection+against+learning+impairments+in+affected+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice.</a> Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).</li>
<li>Jakobsson, J., Lundberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+for+use+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors for use in the central nervous system.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).</li>
<li>Berson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic-associated+loss+of+hnRNP-A%2FB+in+Alzheimer%27s+disease+impairs+cortical+splicing+and+cognitive+function+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice.</a> EMBO Molecular Medicine. , (2012).</li>
<li>Haramati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+as+repressors+of+stress-induced+anxiety%3A+the+case+of+amygdalar+miR-34%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).</li>
<li>Shaltiel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+microRNA-132+mediates+stress-inducible+cognitive+deficits+through+its+acetylcholinesterase+target%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target.</a> Brain Structure & Function. , 10-1007 (2012).</li>
<li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo%3A+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).</li>
<li>Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Packaging+HIV-+or+FIV-based+lentivector+expression+constructs+%26+transduction+of+VSV-G+pseudotyped+viral+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs & transduction of VSV-G pseudotyped viral particles.</a> J. Vis. Exp. (62), e3171(2012).</li>
<li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morris+Water+Maze+Experiment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Morris Water Maze Experiment.</a> J. Vis. Exp. (19), e897(2008).</li>
<li>Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morris+water+maze+test+for+learning+and+memory+deficits+in+Alzheimer%27s+disease+model+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice.</a> J. Vis. Exp. (53), e2920(2011).</li>
<li>Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approach+for+intracerebroventricular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic approach for intracerebroventricular delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie lentiwirusa jest stosunkowo szybką metodą oceny in vivo zarówno w górę, jak i w dół regulacji różnych genów i miRNA. Główną alternatywą jest genetycznie zmodyfikowana mysz, która jest znacznie bardziej pracochłonną i czasochłonną techniką niż bezpośrednie wstrzyknięcie lentiwirusa. Ponadto regulacja w górę, w przypadku wstrzyknięcia lentiwirusa, zachodzi w określonym czasie u dorosłej myszy i nie obejmuje żadnej możliwości nieszczelności podczas rozwoju, jak to najczęściej ma miejsc...

Rola poszczególnych miRNA w funkcjonowaniu układu nerwowego została ostatnio zakwestionowana przez iniekcję lentiwirusową w kilku badaniach. Stwierdzono, że MiRNA mają kluczowe znaczenie dla utrzymania i ponownego kształtowania struktury synaps 1, synaptogenezy 2 oraz przebudowy i utrzymania synaps 3. Badania te silnie sugerują, że miRNA są zaangażowane, poprzez wielopoziomowe efekty regulacyjne, zarówno w kształtowanie, jak i utrzymywanie głównego wyjścia układu nerwowego, funkcji poznawczych. Stereotaktyczne wstrzykiwanie cząstek lentiwirusa do określonych regionów mózgu gryzoni umożliwia poszukiwanie zmian w morfologii synaps i aktywności neuronalnej, a także wykorzystano do ustalenia funkcjonalnego znaczenia nadekspresji transkryptów 4,5. Bezpośrednie zakażenie neuronów w dobrze zdefiniowanych obszarach mózgu lentiwirusami wyrażającymi miRNA może być związane z badaniami nad starzeniem się, zaburzeniami mózgu i neurodegeneracją; Badania miRNA w sferze regulacji behawioralnej 6-8 są na znacznie mniej zaawansowanym etapie, a stereotaktyczne wstrzyknięcie cząstek lentiwirusa eksprymujących miRNA, a następnie testy behawioralne może być przydatne do takich celów. Znacznie bardziej pracochłonna metoda wywoływania nadmiernej lub niedostatecznej ekspresji obejmuje genetycznie modyfikowane myszy knock-in lub knockout. Systemy genetyczne mogą ponadto pozwalać na warunkową i czasową kontrolę ekspresji (np. systemy Cre-Lox, Tet), ale prawie nie zapewniają one przestrzennej specyficzności procedury wstrzykiwania i prawie zawsze występuje pewna nieszczelność. Ponadto procedury inżynieryjne nie wymagają operacji i mogą być stosowane w laboratoriach ze stosunkowo dobrą odtwarzalnością; Są one jednak wolniejsze i wymagają znacznie większej siły roboczej i środków finansowych. Ponadto czasowa kontrola nadmiernej lub niedostatecznej ekspresji u myszy, którym wstrzyknięto zastrzyk, jest znacznie dokładniejsza w porównaniu z myszami modyfikowanymi genetycznie.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Waga dla gryzoni</td><td>Burtons (UK)</td><td>115-455</td><td></td></tr><tr><td>poduszka grzewcza</td><td>FIRstTechnology</td> Maszyna do przycinania <td>DCT-25</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Stoelting</td><td>51465</td><td></td></tr><tr><td>stereotact</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel i ostrza</td><td>Kent scientific</td><td></td><td></td>INS500348</tr><tr><td>Strzykawka Harland</td><td>Wiertarka Hamilton</td><td>7632-01</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pompa cyfrowa Stoelting</td><td>51449</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Aparatura Harvard</td><td>704507</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik na wodę i platforma</td><td>Stoelting</td><td>60135</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reodczynniki</td></tr><tr><td>ketamina </td><td>Vetoquinol (Lure France)</td><td></td><td></td>3055503</tr><tr><td>domitor</td><td>Orion pharma</td><td>107140-10</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl</td><td>Pfizer zdrowie zwierząt</td><td>24751</td><td></td></tr><tr><td>maść nawilżająca - Synthomycine 5%</td><td>Rekah Pharmaceutical</td><td>195</td><td> </td></tr><tr><td>histoacryl</td><td>Braun</td><td>112101</td><td></td></tr><tr><td>sola fizjologiczna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr></tbody></table>

stereotaktyczne wstrzyknięcie lentiwirusów eksprymujących mikrorna do regionu ca1 hipokampa myszy i ocena wyniku behawioralnego

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MikroRNA (miRNA) to małe regulatorowe jednoniciowe cząsteczki RNA o długości około 22 nukleotydów, z których każda może celować w liczne transkrypty mRNA i zaciemniać cały szlak ekspresji genów poprzez indukowanie destrukcji i/lub hamowanie translacji tych celów. Kilka miRNA odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu struktury i funkcji neuronów oraz w funkcjach mózgu wyższego poziomu, a także poszukuje się metod manipulowania ich poziomami w celu zbadania tych funkcji. W tym miejscu przedstawiamy bezpośrednią metodę in vivo do badania poznawczych konsekwencji wymuszonego nadmiaru miRNA u myszy poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie cząstek wirusa kodujących miRNA. W szczególności obecny protokół obejmuje wstrzyknięcie do regionu CA1 hipokampa, który przyczynia się do konsolidacji pamięci ssaków, uczenia się i reakcji na stres oraz zapewnia wygodne miejsce wstrzyknięcia. Współrzędne są mierzone zgodnie z myszą bregma, a perfuzja wirusa jest kontrolowana cyfrowo i utrzymywana bardzo powoli. Po wstrzyknięciu rana pooperacyjna zostaje uszczelniona, a zwierzęta wracają do zdrowia. Lentiwirusy kodujące tłumiki odpowiednich celów mRNA służą do implikowania specyficznej interakcji miRNA/cel odpowiedzialnej za obserwowany efekt, z myszami naiwnymi, myszami, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną i myszami, którym wstrzyknięto "puste" wektory lentiwirusowe jako kontrole. Miesiąc po wstrzyknięciu zwierzęta są badane w Morris Water Maze (MWM) w celu oceny ich zdolności do uczenia się nawigacji i zapamiętywania. MWM to okrągły zbiornik wypełniony kolorową wodą z małą platformą zanurzoną 1 cm pod powierzchnią wody. Stałe sygnały wizualne wokół zbiornika pozwalają na nawigację przestrzenną (dźwięk i pole magnetyczne Ziemi mogą również pomagać zwierzętom w nawigacji). Monitoring z kamer wizyjnych umożliwia pomiar trasy przepłynięcia oraz czasu odnalezienia i oszacowania pomostu. Mysz najpierw uczy się, że wejście na ukrytą platformę oferuje ucieczkę od wymuszonego pływania; Następnie jest testowany pod kątem korzystania z tej ucieczki, a na koniec platforma jest usuwana, a testy sondy sprawdzają, czy mysz pamięta swoją poprzednią lokalizację. Powtarzające się testy przez kilka kolejnych dni wskazują na poprawę wydajności testowanych myszy przy krótszych opóźnieniach w znalezieniu i zamontowaniu platformy, a także jako bardziej bezpośrednie drogi do dotarcia do platformy lub jej lokalizacji. Brak wykazania takiej poprawy oznacza upośledzenie uczenia się i pamięci i/lub lęk, które mogą być następnie specjalnie przetestowane (np. w labiryncie podwyższonym plus). Takie podejście umożliwia walidację specyficznych miRNA i docelowych transkryptów w badanych procesach poznawczych i/lub związanych ze stresem.

Wstrzyknięcie 0,5 μl lentiwirusa do obszaru CA1 w hipokampie myszy, przy szybkości przepływu określonej w sekcji protokołu, pozwala uzyskać zainfekowaną sferę o średnicy około 1 mm w osi rostralno-kaudalnej oraz około 0,5 mm w osiach przyśrodkowej-bocznej i przednio-tylnej (Rysunek 3).
<img alt="Układ do chirurgii stereotaktycznej z diagramem; punkty orientacyjne czaszki, narzędzia do precyzyjnego nacięcia." src="/files/ftp_upload/50170/50...

MikroRNA odgrywają znaczącą rolę w strukturze i funkcjonowaniu mózgu. Tutaj opisujemy metodę wymuszania nadmiernej ekspresji miRNA w hipokampie za pomocą stereotaktycznego wstrzykiwania zmodyfikowanego lentiwirusa wykazującego ekspresję miRNA. Podejście to może służyć jako stosunkowo szybki sposób oceny skutków in vivo nadmiernej ekspresji miRNA w określonych regionach mózgu.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie lentiwirusów eksprymujących mikroRNA do regionu CA1 hipokampa myszy i ocena wyniku behawioralnego

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest ocena neurologicznych i poznawczych skutków nadekspresji mikroRNA u myszy. Zostaje to osiągnięte poprzez przygotowanie lentiwirusa wykazującego ekspresję mikroRNA w drugim etapie. Lentiwirus jest wstrzykiwany do konkretnego obszaru mózgu, co umożliwia nadekspresję mikroRNA i regulację jego celów.Uzyskane wyniki wykazują efekty poznawcze wynikające z nadekspresji mikroRNA dzięki anatomicznie celowanemu dostarczaniu lentiwirusa do mózgu myszy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak inżynieria genetyczna, jest to, że inżynieria genetyczna jest techniką znacznie bardziej pracochłonną i czasochłonną niż bezpośrednie wstrzyknięcie lentiwirusa. Dodatkowo wstrzyknięcie lentiwirusa umożliwia pełną kontrolę przestrzenną i czasową oraz monitorowanie nadeksprymowanej cząsteczki.Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuronowych mikroRNA, takie jak wpływ nadekspresji lub niedoekspresji konkretnego mikroRNA na uczenie się i pamięć oceniane w testach behawioralnych. Zastosowania tej techniki rozszerzają się na terapię chorób neurodegeneracyjnych, ponieważ mikroRNA nadają się do interwencji terapeutycznych. Inkubować wysiane komórki pakujące do momentu osiągnięcia 90% konfluencji, następnie przeprowadzić transfekcję, a następnie zmienić medium na bezserumowe DMEM uzupełnione o 1 mM glutaminy i 50 mg/mL.Następnie dodaj penicylinę i streptomycynę, a komórki kotransfekuj za pomocą plazmidu wektora A-P-L-K-O 0.1 kodującego fragmenty delta R 8.2 oraz VSVG oraz plazmidu z interesującym mikro-RNA. W odstępach 24 h i 48 h użyj 10 µL glikolu polietylenowego o stężeniu 1 mg/ml jako nośnika. Po transfekcji zbierz zapakowane lentiwirusy i przefiltruj je przez filtr 0,45 µm.Skoncentrować filtrat zawierający lentiwirusy w wirówce ultracentryfugalnej w temperaturze 15 °C przy 70 000 Gs przez dwie godziny. Odrzucić nadsącz i zawiesić lentiwirusy w takiej ilości dejonizowanej wody destylowanej, która będzie niezbędna do całkowitego rozpuszczenia osadu, tak aby nie było widocznych grudek. Następnie przygotować alikwoty koncentratu i przechowywać je w temperaturze -70 °C.Następnie należy wyznaczyć miano wirusa, zakażając komórki pakujące seryjnie rozcieńczonym wirusem. W płytce 12-dołkowej należy zastosować rozcieńczenia od 1 mL wektora do 10⁻⁶ mL wektora na dołek. Otrzymane miano powinno wynosić co najmniej 1 miliard cząstek zakaźnych na mL.Zważ zwierzę i podaj mu znieczulenie w postaci domięśniowego wstrzyknięcia mieszaniny ketaminy. Zastosuj objętość proporcjonalną do masy ciała zwierzęcia, zgodnie z dawkowaniem dla każdego leku. Odczekaj, aż zwierzę zostanie całkowicie znieczulone.Następnie sprawdź brak odruchu wycofywania kończyny tylnej w przypadku braku odruchu. Wstrzyknij zwierzęciu podskórnie środek przeciwbólowy IL zgodnie z instrukcją na opakowaniu. Umieść zwierzę pod lampą grzewczą lub na podkładce grzewczej i zwilż jego oczy maścią.Na koniec ogolić obszar między uszami za pomocą maszynki do strzyżenia i zdezynfekować skórę 70% ethanol. Umieścić zwierzę w stereotaksie i dopasować pręty w szczelinach, bezpośrednio wewnątrz uszu zwierzęcia. Następnie za pomocą skalpela wykonać cięcie przednio-tylne o długości około 1,5 cm między uszami i utrzymać nacięcie otwarte za pomocą kleszczyków chirurgicznych.Następnie należy oczyścić powierzchnię czaszki za pomocą patyczka higienicznego, aż do momentu, gdy widoczne stanie się przecięcie szwu czołowego i szwów strzałkowych. Obejmuje to punkt bgma oraz przecięcie szwów czołowego i lambda lub punkt lambda. Teraz należy ustawić końcówkę strzykawki zamocowanej w stereotaksie na punkcie bgma na wszystkich trzech osiach, zgodnie z podanymi współrzędnymi.Są to punkty zerowe. Następnie unieś strzykawkę w osi pionowej, aby ruch w płaszczyźnie nie porysował czaszki od bgma. Przesuń strzykawkę w wymagane miejsce dla hippocampal ca one, na przykład: o 2 mm w dół w osi AP, o 1,8 mm w górę i w dół w osi LM oraz o 1,5 mm w dół w osi DV.Następnie obniż końcówkę strzykawki, aż dotknie ona czaszki. Zaznacz to miejsce, a następnie odsun strzykawkę, aby zrobić miejsce dla wiertła w tym punkcie. Używając precyzyjnej wiertarki, wykonaj płytki otwór w kości czaszki.Utrzymaj wiertarkę stabilnie i nie wierć w tkance miękkiej. Podczas wiercenia pomocne może być wykonywanie krótkich impulsów. Prowadź jedną rękę drugą, aby podczas wiercenia w kości nie zagłębić się zbyt mocno w tkance miękkiej.Pobrać 0,5 mL skoncentrowanego roztworu lentiwirusa do strzykawki. Umieścić strzykawkę nad otworem i powoli opuszczać ją pionowo, aż dotrze do powierzchni czaszki. Kontynuować bardzo powolne wprowadzanie strzykawki do mózgu.Ustaw pompę cyfrową na 0,02 ml/min, aby powolnie wstrzyknąć objętość w ciągu 25 minut. Zapobiegnie to cofaniu się płynu i zapewni prawidłowe rozprowadzenie. Rozpocznij infuzję w przypadku niektórych typów strzykawek.Należy rozważyć wsunięcie strzykawki o dodatkowe pół milimetra przed powrotem do pierwotnych współrzędnych i rozpoczęciem infuzji podczas podawania substancji. Należy zwilżyć odsłonięty obszar roztworem PBS, aby zapobiec odwodnieniu tkanki. Po zakończeniu procedury należy odczekać pięć minut przed wycofaniem strzykawki.Pozwala to na rozprowadzenie materiału w mózgu, zapobiegając jego cofaniu się wzdłuż toru wprowadzenia strzykawki. Następnie bardzo powoli wyjmij strzykawkę, obserwując, czy nie dochodzi do cofania się treści. Jeśli zaobserwowano cofanie, prawdopodobnie utracona została część wstrzykniętego materiału.Zamknąć ranę za pomocą histo acron, uważając, aby preparat nie przedostał się do oczu zwierzęcia. Następnie, aby zapobiec odwodnieniu zwierzęcia, wstrzyknąć dojamowo 1 mL podgrzanej soli fizjologicznej. Umieścić zwierzę w klatce rekonwalescencyjnej znajdującej się na podgrzewanej macie.Obserwuj zwierzę podczas godziny rekonwalescencji po upływie czterech do sześciu tygodni, następnie oceń pamięć nawigacyjną zwierzęcia w taki sam sposób, jak w wodnym labiryncie Morrisa. Lentiwirus zainfekował już większość komórek docelowych. W tym czasie wykonano wstrzyknięcie 0,5 µL lentiwirusa do ca.Jeden obszar hipokampa myszy przygotowano zgodnie z opisem w protokole. Następnie zwierzę uśmiercono i przeanalizowano skrawki mózgu o grubości 40 mikronów. W przypadku ekspresji GFP, barwienie DAPI jest widoczne na czerwono.Podsumowując, pozwoliło to uzyskać zainfekowaną sferę o średnicy około jednego milimetra w osi rostralnej i około 0,5 milimetra w osiach przyśrodkowej bocznej oraz przedniej tylnej. Myszy wstrzyknięte wektorem lenti kodującym mikro-RNA porównano z grupą kontrolną w labiryncie wodnym Morrisa. Po trzech dniach treningu reprezentatywna ścieżka myszy kontrolnej do zanurzonej platformy, zaznaczonej kolorem zielonym, była znacznie krótsza niż ścieżka zwierzęcia eksperymentalnego, zaznaczona kolorem czerwonym.Ogólnie rzecz biorąc, zwierzęta doświadczalne miały większe trudności z opanowaniem zadania niż grupa kontrolna. Po opanowaniu technika ta zajmuje około 40 minut na jedną mysz. Jedynym czynnikiem ograniczającym podczas wykonywania tej procedury jest szybkość przepływu.W celu udzielenia odpowiedzi na pytania dotyczące tego, w jakim stopniu procedura ta zmienia komunikację między mózgiem a organizmem, można zastosować inne metody, takie jak systematyczne wstrzykiwanie oligonukleotydów. Należy pamiętać, że praca z lentiwirusami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego należy stosować środki ostrożności, takie jak jednorazowe fartuchy laboratoryjne z Tyveku oraz rękawice neutralne. Ponadto szkło i tworzywa sztuczne zawierające odpady ciekłe muszą zostać zdekontaminowane przed wyrzuceniem do worka na odpady biologiczne.

stereotactic-injection-microrna-expressing-lentiviruses-to-mouse

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Wstrzyknięcie stereotaktyczne lentiwirusów ekspresujących mikroRNA do regionu CA1 hipokampu mysiego i ocena wyniku behawioralnego

Ten film demonstruje hamowanie pobudzających prądów synaptycznych za pośrednictwem mikroRNA w wycinkach mózgu myszy w hipokampie. Neurony CA3 zostały zainfekowane rekombinowanym wektorem wirusowym zawierającym konstrukt do ekspresji fluorescencyjnego reportera, aktywowany światłem kanał błonowy i mikroRNA, który obniża ekspresję kanałów wapniowych bramkowanych napięciem. Po umieszczeniu wycinka w komorze rejestracyjnej i załataniu neuronu CA1 za pomocą pipety rejestrującej, impulsy świetlne...

Hamowanie pobudzających prądów postsynaptycznych za pośrednictwem mikroRNA w mysich wycinkach hipokampa

Źródło: Chen, S., et al., Stereotaktyka chirurgiczna w komórkach prążkowia noworodków w mózgach myszy noworodków. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego kodującego rekombinazę Cre i białko zielonej fluorescencji lub GFP do prążkowia genetycznie zmodyfikowanego szczeniaka myszy w celu uzyskania manipulacji genami poprzez wycięcie kasety STOP po bokach loxP, aktywując białko czerwonej fluorescencji lub RFP jako reportera.

Stereotaktyczne mikrowstrzyknięcie wektora wirusowego do manipulacji genami u prążkowia szczeniąt myszy

Źródło: Pereira, M. et al., In Vivo Bezpośrednie przeprogramowanie rezydentnych komórek glejowych do interneuronów przez domózgowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film demonstruje stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem do kory mózgowej transgenicznej myszy w celu dostarczenia zależnego od Cre przeprogramowania neuronów i fluorescencyjnych genów reporterowych do komórek glejowych.

Stereotaktyczne wstrzykiwanie wektorów wirusowych do przeprogramowania komórek glejowych w modelu mysim

Źródło: Fricano-Kugler, C. J., et al. Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa w celu precyzyjnej edycji genów neuronalnych w mózgu myszy. Protokół zapewnia dokładne dostarczanie wirusa do zakrętu zębatego, umożliwiając znakowanie fluorescencyjne i nokaut genów za pośrednictwem CRISPR w celu badania obwodów neuronalnych, funkcji genów i...

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa do celowanej edycji genów neuronalnych w mózgu myszy

Ten artykuł opisuje, jak mikrowstrzykiwać wektory wirusowe do mózgu myszy, a następnie testować w warunkowym paradygmacie preferencji miejsca, który obejmuje fazę przejęcia, wyginięcia i przywrócenia.

Stereotaktyczne mikroiniekcja wektorów wirusowych eksprymujących rekombinazę Cre w celu zbadania roli genów docelowych w preferencjach miejsca uwarunkowanego kokainą

Stereotaktyczne wstrzykiwanie lentiwirusów wyrażających cDNA lub shRNA może modulować ekspresję genów w określonych obszarach mózgu myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół łączący zastrzyki stereotaktyczne z zadaniami behawioralnymi, takimi jak Test Otwartego Pola (OFT) i Test Wymuszonego Pływania (FST).

Zastosowanie techniki iniekcji stereotaktycznej do badania wpływu genetycznego na zachowania zwierząt

Tutaj prezentujemy protokół bezpośredniej stereotaktycznej infuzji beta-amyloidu do mózgu. Metodologia ta zapewnia alternatywny model mysi in vivo w celu rozwiązania krótkoterminowych skutków beta-amyloidu na neurony mózgowe.

Stereotaktyczny wlew oligomerycznego beta-amyloidu do hipokampa myszy

MikroRNA odgrywają kluczową rolę w mózgu i są potencjalnymi celami do modelowania neurodegeneracji. Jednak zaburzanie poziomów miRNA jest trudne ze względu na krótką długość miRNA i niedostępność tkanki mózgowej. Ten film przedstawia metodę projektowania antagomiru i dostarczania specyficznego dla mózgu przy użyciu neuropeptydu u myszy.

Prosta alternatywa dla wstrzyknięcia stereotaktycznego w celu specyficznego dla mózgu knockdownu miRNA

System CRISPR/Cas9 oferuje potencjał, aby uczynić ukierunkowaną edycję genomu dostępną i przystępną cenowo dla społeczności naukowej. Protokół ten ma na celu zademonstrowanie, jak tworzyć wirusy, które znokautują interesujący nas gen za pomocą systemu CRISPR/Cas9, a następnie wstrzykną je stereotaktycznie do mózgu dorosłej myszy.

Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną

Celem tego protokołu jest opisanie podejścia do analizy zachowania dorosłych nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych w odpowiedzi na manipulację chemogenetyczną specyficznego lokalnego obwodu neuronowego.

Regulacja specyficzna dla obwodu testowego dorosłych nerwowych komórek prekursorowych hipokampa

Ten artykuł demonstruje przygotowanie specjalnego okna obrazowania uzupełnionego o kaniulę infuzyjną i jej implantację w regionie CA1 hipokampa u myszy.

Procedura kraniotomii do wizualizacji aktywności neuronalnej w hipokampie zachowujących się myszy

Poznaj stereotaktyczne wstrzyknięcie lentiwirusów eksprymujących mikroRNA do regionu CA1 hipokampa myszy. Ta metoda umożliwia ocenę wpływu mikroRNA na funkcje poznawcze i regulację genów w mózgu.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie lentiwirusów eksprymujących mikroRNA do regionu CA1 hipokampa myszy i ocena wyniku behawioralnego

Przeglądaj więcej filmów