Name: Zewnątrzkomórkowa identyfikacja neuronów ruchowych w puli motorycznej mięśni u Aplysia californica (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: Poznaj metodę zewnątrzkomórkowej identyfikacji neuronów ruchowych w puli motorycznej u Aplysia californica. Technika ta umożliwia monitorowanie aktywności neuronów podczas wzorców motorycznych zachowań pokarmowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez NS047073 grantów NIH i granty NSF DMS1010434.

<ol><li>McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+relationships+of+the+cerebral+giant+cells+with+motoneurones+in+the+feeding+system+of+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis.</a> J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).</li>
<li>Benjamin, P. R., Rose, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+generation+of+bursting+in+the+feeding+system+of+the+snail%2C+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Central generation of bursting in the feeding system of the snail, Lymnaea stagnalis.</a> J. Exp. Biol. 80, 93-118 (1979).</li>
<li>Peters, M., Altrup, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+organization+in+pharynx+of+Helix+pomatia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Motor organization in pharynx of Helix pomatia.</a> J. Neurophysiol. 52 (3), 389-409 (1984).</li>
<li>Church, P. J., Cohen, K. P., Scott, M. L., Kirk, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidergic+motoneurons+in+the+buccal+ganglia+of+Aplysia+californica%3A+immunocytochemical%2C+morphological%2C+and+physiological+characterizations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Peptidergic motoneurons in the buccal ganglia of Aplysia californica: immunocytochemical, morphological, and physiological characterizations.</a> J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 323-336 (1991).</li>
<li>Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+extracellular+stimulation+of+individual+neurons+in+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Eng%22%5BJournal%5D)">Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia.</a> J. Neural. Eng. 5 (3), 287-309 (2008).</li>
<li>Church, P. J., Lloyd, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+diverse+neuropeptide+cotransmitters+by+identified+motor+neurons+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia.</a> J. Neurosci. 11 (3), 618-625 (1991).</li>
<li>Church, P. J., Lloyd, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+multiple+identified+motor+neurons+recorded+intracellularly+during+evoked+feedinglike+motor+programs+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia.</a> J. Neurophys. 72 (4), 1794-1809 (1994).</li>
<li>McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+Vitro+Preparation+for+Eliciting+and+Recording+Feeding+Motor+Programs+with+Physiological+Movements+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica.</a> J. Vis. Exp. (70), e4320(2012).</li>
<li>Cullins, M. J., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrode+fabrication+and+implantation+in+Aplysia+californica+for+multi-channel+neural+and+muscular+recordings+in+intact%2C+freely+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals.</a> J Vis. Exp. (40), e1791(2010).</li>
<li>Zhurov, Y., Weiss, K. R., Brezina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+or+loose+coupling+between+components+of+the+feeding+neuromusculature+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Tight or loose coupling between components of the feeding neuromusculature of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 94 (1), 531-549 (2005).</li>
<li>Hurwitz, I., Goldstein, R. S., Susswein, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+pattern-initiation+and+motor+functions+in+the+B31+and+B32+neurons+of+the+buccal+ganglia+of+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of pattern-initiation and motor functions in the B31 and B32 neurons of the buccal ganglia of Aplysia californica.</a> J. Neurophysiol. 71 (4), 1514-1527 (1994).</li>
<li>Morton, D. W., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+timing+of+activity+in+motor+neurons+that+produce+radula+movements+distinguishes+ingestion+from+rejection+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia.</a> J. Comp. Physiol. A. 173 (5), 519-536 (1993).</li>
<li>Iles, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+synaptic+activation+of+the+fast+coxal+depressor+motoneurone+of+the+cockroach.+Periplaneta+americana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and synaptic activation of the fast coxal depressor motoneurone of the cockroach. Periplaneta americana.</a> J. Exp. Biol. 56 (3), 647-656 (1972).</li>
<li>Westerfield, M., McMurray, J. V., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+motoneurons+and+their+innervation+of+axial+muscles+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish.</a> J. Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).</li>
<li>Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+buccal+motor+programs+elicited+by+a+cholinergic+agonist+applied+to+the+cerebral+ganglion+of+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica.</a> J. Comp. Physiol. A. 179 (4), 509-524 (1996).</li>
<li>Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+patterns+of+the+B31%2FB32+pattern+initiators+innervating+the+I2+muscle+of+the+buccal+mass+during+normal+feeding+movements+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica.</a> J. Neurophys. 75 (4), 1309-1326 (1996).</li>
<li>Morton, D. W., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+buccal+nerve+activity+that+distinguishes+ingestion+from+rejection+can+be+used+to+predict+behavioral+transitions+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia.</a> J. Comp. Physiol. A. 172 (1), 17-32 (1993).</li>
<li>Warman, E. N., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+chronic+single-unit+extracellular+recording+in+freely+behaving+animals+using+pipette+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A new technique for chronic single-unit extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes.</a> J. Neurosci. Methods. 57 (2), 161-169 (1995).</li>
<li>Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contingent-dependent+enhancement+of+rhythmic+motor+patterns%3A+an+in+vitro+analog+of+operant+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning.</a> J. Neurosci. 17 (21), 8093-8105 (1997).</li>
<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Behavioral+biology+of+Aplysia%22">Behavioral biology of Aplysia</a>. , Freeman. San Francisco. (1979).</li>
<li>Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+organization+of+the+buccal+system+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica.</a> J. Comp. Neurol. 312 (2), 207-222 (1991).</li>
<li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outputs+of+radula+mechanoafferent+neurons+in+Aplysia+are+modulated+by+motor+neurons%2C+interneurons%2C+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Outputs of radula mechanoafferent neurons in Aplysia are modulated by motor neurons, interneurons, and sensory neurons.</a> J. Neurophysiol. 83 (3), 1621-1636 (2000).</li>
<li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83 (3), 1605-1620 (2000).</li>
<li>Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+an+identified+histaminergic+neuron%2C+and+its+possible+role+in+arousal+of+feeding+behavior+in+semi-intact+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia.</a> J. Neurosci. 6 (8), 2403-2415 (1986).</li>
<li>Rosen, S. C., Teyke, T., Miller, M. W., Weiss, K. R., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+cerebral-to-buccal+interneurons+implicated+in+the+control+of+motor+programs+associated+with+feeding+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of cerebral-to-buccal interneurons implicated in the control of motor programs associated with feeding in Aplysia.</a> J. Neurosci. 11 (11), 3630-3655 (1991).</li>
<li>Jing, J., Weiss, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+variants+of+a+motor+act+in+a+modular+and+hierarchical+motor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network.</a> Curr. Biol. 15 (19), 1712-1721 (2005).</li>
<li>Azizi, F., Lu, H., Chiel, H. J., Mastrangelo, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+neurostimulation+using+pulse+code+modulation+%28PCM%29+microfluidic+chips%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical neurostimulation using pulse code modulation (PCM) microfluidic chips.</a> J. Neurosci. Methods. 192 (2), 193-198 (2010).</li>
<li>Zhurov, Y., Proekt, A., Weiss, K. R., Brezina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+of+internal+state+are+expressed+in+coherent+shifts+of+neuromuscular+activity+in+Aplysia+feeding+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Changes of internal state are expressed in coherent shifts of neuromuscular activity in Aplysia feeding behavior.</a> J. Neurosci. 25 (5), 1268-1280 (2005).</li>
<li>Baker, B. J., Kosmidis, E. K., Vucinic, D., Falk, C. X., Cohen, L. B., Djurisic, M., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+brain+activity+with+voltage-+and+calcium-sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Imaging brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 25 (2), 245-282 (2005).</li>
<li>Fejtl, M., Stett, A., Nisch, W., Boven, K. -H., Möller, A. On Micro-Electrode Array Revival. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFejtl%2C+M+%22Advances+in+Network+Electrophysiology+Using+Multi-Electrode+Arrays%22">Advances in Network Electrophysiology Using Multi-Electrode Arrays</a>. Baudry, M., Taketani, M. , Springer Press. New York. 24-37 (2006).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

U zwierząt z dużymi zidentyfikowanymi neuronami, takich jak (na przykład Lymnaea, Helix i Aplysia), analiza puli motorycznej jest zwykle wykonywana przy użyciu zapisu wewnątrzkomórkowego1,2,3,4. W tym protokole opisujemy proces jednoznacznej identyfikacji neuronów ruchowych dla puli motorycznej przy użyciu techniki zewnątrzkomórkowej. Jako ilustrację tego procesu posłużyliśmy się pomiarami siły. Można również użyć EMG do pomiaru unerwienia mięśni. Krótko mówiąc, aby to zrobić, protok...

<table><tbody><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671</td><td>Biologiczny, certyfikowany</td></tr><tr><td>chlorek potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td>Certyfikowany ACS</td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Acros Organics</td><td>19753</td><td>99% </td></tr><tr><td>siedmiowodny siarczan magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63</td><td>Certyfikowany ACS </td></tr><tr><td>Dwuwodny</td> <td>chlorek wapniaFisher Scientifc</td><td>C79</td><td>Certyfikowany ACS </td></tr><tr><td>Glukoza (dekstroza)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Bufor BioXtra MOPS</td><td>Acros Organics</td><td>17263</td><td>99%</td></tr><tr><td>Carbachol</td><td>Acros Organics</td><td>10824</td><td>99%</td></tr> <tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255</td><td>Certyfikowany</td></tr><tr><td>kwas solny</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA49</td><td>Certyfikowany</td></tr><tr><td>jednolufowy ściągacz do</td> mikropipet <td>jednolufowych A-M Systems</td><td>6150</td><td></td></tr><tr><td>Flaming-Brown model P-80/PC</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Zastosowany filament: FT345B</td></tr><tr><td>Drut ze stali nierdzewnej pokryty emalią</td><td>California Fine Wire</td><td></td><td>0,001D, powłoka h </td></tr><tr><td>Klej do silikonu domowego II GE </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Duro Quick-Gel superglue </td><td>Henkel Corp.</td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Wzmacniacz A-M Systems model 1700 </td><td>Systemy</td><td></td> AM <td>Ustawienia filtra: 10-500 Hz dla nerwu/mięśnia I2; 300-500 Hz dla wszystkich pozostałych nerwów </td></tr><tr><td>Wielokanałowy stymulator Pulsemaster</td><td>World Precision Instruments</td> Izolator bodźców <td>A300</td><td></td></tr><tr><td></td><td>World Precision Instruments</td><td>A360</td><td></td></tr><tr><td>AxoGraph X</td><td>Oprogramowanie naukowe</td><td></td><td>AxoGraph dla nagrania</td></tr><tr><td>Złote piny złącza</td><td>Bulgin</td><td>SA3148/1</td><td></td></tr><tr><td>Złote gniazda złączy</td><td>Bulgin</td><td>SA3149/1</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastomer silikonowy</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm Naczynie krystalizujące</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Smar wysokopróżniowy</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-375D</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki Minutien</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Modelina</td><td>Sargent Art</td><td>22-4400</td><td></td></tr><tr><td>Pompa powietrza Whisper</td><td>Tetra</td><td>77849</td><td></td></tr><tr><td>Rurki akwariowe</td><td>Eheim</td><td>7783</td><td>12/16 mm</td></tr><tr><td>Elite Airstone</td><td>Hagen</td><td>A962</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Nożyczki sprężynowe</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze do drobnych</td><td>narzędzi naukowych</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr></tbody></table>

zewnątrzkomórkowa identyfikacja neuronów ruchowych w puli motorycznej mięśni u aplysia californica

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

U zwierząt z dużymi zidentyfikowanymi neuronami (np.), analiza puli motorycznej odbywa się za pomocą technik wewnątrzkomórkowych1,2,3,4. Niedawno opracowaliśmy technikę zewnątrzkomórkowej stymulacji i zapisu pojedynczych neuronów w Aplysia californica5. Opisujemy teraz protokół wykorzystania tej techniki do unikalnej identyfikacji i scharakteryzowania neuronów ruchowych w puli motorycznej.
Ta technika zewnątrzkomórkowa ma zalety. Po pierwsze, elektrody zewnątrzkomórkowe mogą stymulować i rejestrować neurony przez osłonkę5, więc nie trzeba jej usuwać. W ten sposób neurony będą zdrowsze w eksperymentach zewnątrzkomórkowych niż w wewnątrzkomórkowych. Po drugie, jeśli zwoje są obracane przez odpowiednie przypięcie osłonki, elektrody zewnątrzkomórkowe mogą uzyskać dostęp do neuronów po obu stronach zwoju, co ułatwia i usprawnia identyfikację wielu neuronów w tym samym preparacie. Po trzecie, elektrody zewnątrzkomórkowe nie muszą przenikać do komórek, a zatem mogą być łatwo przenoszone tam iz powrotem między neuronami, powodując mniejsze ich uszkodzenia. Jest to szczególnie przydatne, gdy próbuje się nagrać wiele neuronów podczas powtarzających się wzorców motorycznych, które mogą utrzymywać się tylko przez kilka minut. Po czwarte, elektrody zewnątrzkomórkowe są bardziej elastyczne niż wewnątrzkomórkowe podczas ruchów mięśni. Elektrody wewnątrzkomórkowe mogą wyciągać i uszkadzać neurony podczas skurczów mięśni. W przeciwieństwie do tego, ponieważ elektrody zewnątrzkomórkowe są delikatnie dociskane do osłonki nad neuronami, zwykle pozostają nad tym samym neuronem podczas skurczów mięśni, a zatem mogą być stosowane w bardziej nienaruszonych preparatach.
Aby jednoznacznie zidentyfikować neurony ruchowe dla puli motorycznej (w szczególności mięśnia I1/I3 w Aplysia) za pomocą elektrod zewnątrzkomórkowych, można użyć cech, które nie wymagają pomiarów wewnątrzkomórkowych jako kryteriów: wielkości i lokalizacji somy, projekcji aksonalnej i unerwienia mięśni4,6,7. Dla konkretnej puli motorycznej użytej do zilustrowania techniki, zarejestrowaliśmy nerwy policzkowe 2 i 3, aby zmierzyć projekcje aksonalne i zmierzyliśmy siły skurczu mięśnia I1 / I3, aby określić wzór unerwienia mięśni dla poszczególnych neuronów ruchowych.
Pokazujemy cały proces najpierw identyfikacji neuronów ruchowych za pomocą unerwienia mięśniowego, a następnie charakteryzowania ich czasu podczas wzorców motorycznych, tworząc uproszczoną metodę diagnostyczną do szybkiej identyfikacji. Uproszczona i szybsza metoda diagnostyczna jest lepsza w przypadku bardziej nienaruszonych preparatów, np. w zawieszonym preparacie masy policzkowej8 lub in vivo9. Proces ten może być również stosowany w innych basenach motorowych10,11,12 w Aplysia lub w innych systemach zwierzęcych2,3,13,14.

Rysunki 4 i 5 przedstawiają typowe wyniki wykorzystywane do identyfikacji dwóch neuronów ruchowych I1/I3. Rysunek 4 pokazuje rejestracje z somy dużego neuronu ruchowego B3 podczas wzorców przypominających egestję i ingestję (Rysunki 4C, 4D). Jedno-do-jednej odpowiadające impulsy w kanale somy i w ipsilateralnym kanale BN2 (Rysunek 4E) wykazują, że specyficzność rejestracji z somy B3 została zachowana podczas wzorców. B3 wyładowuje w środ...

U zwierząt z dużymi zidentyfikowanymi neuronami (np.), analiza puli motorycznej odbywa się za pomocą technik wewnątrzkomórkowych1,2,3,4. Niedawno opracowaliśmy technikę zewnątrzkomórkowej stymulacji i zapisu pojedynczych neuronów w Aplysia californica5. Opisujemy teraz protokół wykorzystania tej techniki do unikalnej identyfikacji i scharakteryzowania neuronów ruchowych w puli motorycznej.

Zewnątrzkomórkowa identyfikacja neuronów ruchowych w puli motorycznej mięśni u Aplysia californica

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pozakomórkowa identyfikacja pojedynczych neuronów ruchowych w obrębie grupy motorycznej, a następnie monitorowanie i kontrolowanie ich podczas wzorców ruchowych. Jest to realizowane poprzez umieszczenie przygotowanej masy policzkowej z przymocowanymi elektrodami hakowymi do kluczowych nerwów w specjalistycznej szalce do rejestracji, a następnie przygotowanie zwojów policzkowych i zwoju mózgowego do stymulacji pozakomórkowej i rejestracji. Drugim krokiem jest przymocowanie elektrod ssących do kluczowych nerwów i mięśni masy policzkowej, podłączenie przetworników siły do docelowego mięśnia oraz umieszczenie pozakomórkowych elektrod szklanych na osłonce zwojów policzkowych.Następnie, za pomocą zewnątrzkomórkowych elektrod szklanych należy zlokalizować docelowe motoneurony. Ostatnim krokiem jest zewnątrzkomórkowa stymulacja i rejestracja aktywności docelowych motoneuronów przy jednoczesnym pomiarze siły skurczu mięśni. W rezultacie technika stymulacji i rejestracji zewnątrzkomórkowej służy do identyfikacji poszczególnych motoneuronów oraz analizy ich aktywności neuronalnej podczas różnych wzorców ruchowych, takich jak np. odżywianie.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wewnątrzkomórkowa identyfikacja neuronów, jest to, że szklane elektrody zewnątrzkomórkowe umożliwiają identyfikację i monitorowanie wielu neuronów ruchowych w tym samym preparacie podczas ruchów mięśni. W zademonstrowaniu procedury pomoże Jeff McManus, inny doktorant z mojego laboratorium. W celu przygotowania elektrod ssących, najpierw odetnij kawałek rurki polietylenowej o długości około 10 centymetrów. Przytrzymaj rurkę za oba końce i umieść ją bardzo blisko płomienia palnika Bunsena, obracając ją, aż stanie się miękka.Następnie ostrożnie rozciągnij rurkę, odsuwając ją od płomienia. Środkowa część rurki ulegnie wydłużeniu i zwężeniu podczas ciągnięcia; po tym zabiegu przetnij rurkę na pół, aby utworzyć dwie elektrody sekcyjne. Elektrody ssące te stosuje się zazwyczaj do przeciętych końców nerwów lub mięśni, choć niekiedy mogą być one stosowane w sposób passant.Po przymocowaniu elektrod hakowych pod mikroskopem, przetnij obustronnie pierwszy nerw policzkowy oraz nerw przełykowy w miejscu ich przyczepu do masy policzkowej. Następnie odciągnij zwoje mózgowe do przodu, aby przesunąć je z drogi mięśnia I2. Po tym przetnij mięsień I2 nad workiem ulnarnym.Przedłuż nacięcie bocznie i przednio, a następnie odciągnij płat mięśnia I two w przód, aby odsłonić nerw łokciowy. Przetnij dwie gałęzie RN, upewniając się, że są one wystarczająco długie do przymocowania elektrod ssących. Kontynuuj nacięcie I two, wykonując szeroki okrąg wokół zwojów policzkowych.Należy uważać, aby nie przeciąć nerwów BN2 ani BN3, dopóki zwoje gębowe i przytwierdzona część mięśnia I2 nie zostaną całkowicie oddzielone od masy gębowej. Następnie należy przeciąć obustronnie nerwy BN3 w miejscu ich przyczepu do masy gębowej, poza punktem mocowania elektrody hakowej. Po tym zabiegu należy nałożyć cienką warstwę smaru próżniowego na wycięcie w naczyniu pomiarowym, które łączy tylną komorę ze środkową platformą.Następnie nanieś cienką warstwę szybkoschnącego kleju super glue w żelu na szklane dno przedniej komory, w miejscu, gdzie zostanie umieszczona masa bukkalna. Ostrożnie przenieś zwoje mózgowe, zwoje bukkalne oraz masę bukkalną do naczynia rejestracyjnego. Upewnij się, że żadna z elektrod hakowych nie jest zbyt mocno naciągnięta, co mogłoby doprowadzić do uszkodzenia nerwów.Następnie ostrożnie umieść masę policzkową na kleju w przedniej komorze naczynia rejestracyjnego. Upewnij się, że jej powierzchnia brzuszna jest przyklejona do dna naczynia, a zwoje i elektrody nie dotykają kleju. Następnie dodaj do naczynia sól fizjologiczną plegia, aby zaindukować tężenie kleju.Następnie pod mikroskopem, chwyć pęcherzyk zwoju mózgowego i pociągnij go do tylnej komory za pomocą pęsety, upewniając się, że CBC przechodzą przez wycięcie. Następnie przypnij nerwy zwoju mózgowego z wyjątkiem CBC, aby uniknąć uszkodzenia nienaruszonych CBC.Nanieś więcej smaru próżniowego na CBC, tak aby poziom smaru był nieco wyższy niż ścianka osłony, co zapobiegnie wyciekom między komorami. Następnie dodaj więcej soli fizjologicznej do obu komór naczynia, aby zwoje były całkowicie zanurzone. Aby ustabilizować zwoje gębowe, najpierw przypnij końce BN threes do podstawy cygarowej środkowej platformy.Ponieważ zapis z trzech nerwów BN będzie prowadzony za pomocą elektrod hakowych, piny należy umieścić bardziej dystalnie niż punkty mocowania elektrod hakowych, a następnie przypiąć końce nerwów BN oraz ich zakończenia. Następnie należy użyć dwóch pinów, zgiętych pod kątem 90 stopni w formie haków, aby rozciągnąć i zakotwiczyć CBC w sposób, który nie doprowadzi do ich uszkodzenia. W kolejnym kroku należy przypiąć gałęzie RN pomiędzy komorą tylną a zwojami policzkowymi.Mięsień I2 będzie znajdować się nad zwojami policzkowymi; aby odsłonić nerw I2, należy chwycić mięsień I2 pęsetą, odsunąć go znad zwojów policzkowych i przytwierdzić dwa jego narożniki szpilkami, aby uniknąć uszkodzenia nerwu I2. Następnie należy przeciąć nerw I2 dystalnie względem miejsca, w którym jego dwie gałęzie unerwiają mięsień I2, wyciąć pozostałą część mięśnia I2 i odsunąć nerw I2 z powrotem, przypinając go szpilką pomiędzy dwiema gałęziami RN. Następnie należy skorygować położenie szpilek, aby rozciągnąć i zwiększyć napięcie, jeśli nerw jest zbyt luźny, lub zmniejszyć napięcie, jeśli nerw jest zbyt mocno naciągnięty.Aby dodatkowo ustabilizować zwoje jawowe, należy wbić więcej szpilek w osłonkę pomiędzy nerwami. Ponieważ zwoje jawowe są ułożone stroną grzbietową do góry, należy obrócić zwoje jawowe, jeżeli interesujące nas neurony znajdują się po stronie rostralnej.Aby obrócić jeden z dwóch zwojów policzkowych, należy użyć precyzyjnej pęsety, aby chwycić nadmiar osłonki CBC znajdujący się w pobliżu zwojów policzkowych. Następnie nadmiar osłonki CBC należy przytwierdzić szpilką między CBC a BM three, a dodatkową szpilkę umieścić na osłonce zwoju policzkowego po stronie bliskiej przedniej komorze, aby zminimalizować ruch zwoju policzkowego. Następnie należy przyciąć osłonkę pokrywającą zwoje policzkowe.Za pomocą precyzyjnej pęsety chwyć osłonkę po stronie znajdującej się najbliżej komory tylnej. Następnie odetnij nadmiar osłonki precyzyjnymi nożyczkami, uważając, aby nie odsłonić ciał komórkowych. W celu zminimalizowania uszkodzeń usuń tylko taką ilość osłonki, która jest niezbędna do uwidocznienia ciał komórkowych.Po przycięciu osłonki zwojów policzkowych, odciągnij nerw iTune oraz RNy nad zwoje policzkowe i przymocuj je szpilkami między zwojami policzkowymi a przednią komorą. Aby dalej obrócić zwoje policzkowe w celu napełnienia elektrody solą fizjologiczną, przymocuj wolny koniec rurki polietylenowej o długości od 15 do 20 cm z zestawu strzykawki do końca elektrody szklanej. Następnie odciągnij tłok strzykawki, aby napełnić elektrodę solą fizjologiczną.Umieść napełnioną szklaną elektrodę zewnątrzkomórkową w wycięciu uchwytu na manipulatorze. Następnie za pomocą manipulatora wprowadź końcówkę elektrody do soli fizjologicznej plegia zawierającej zwoje policzkowe. Po tym czasie wprowadź do elektrody drut srebrno-chlorkowy, który będzie pełnił funkcję przewodu rejestrującego, i podłącz go za pomocą kabla BNC do wzmacniacza.Następnie przymocuj do kabla BNC kolejny przewód, który będzie pełnił funkcję przewodu referencyjnego, umieszczając jego drugi koniec w soli fizjologicznej. Na tym etapie przytnij wąski koniec końcówki elektrody ssącej tak, aby dopasować ją do średnicy nerwu. Średnica wewnętrzna końcówki elektrody powinna być zbliżona do średnicy nerwu lub nieco mniejsza, aby zapewnić szczelne przyssanie.Ponieważ nerw iTune oraz RN znajdują się bardzo blisko siebie, należy umieścić ich elektrody w tym samym manipulatorze, aby zaoszczędzić miejsce. Obróć obie elektrody i upewnij się, że ich końcówki znajdują się blisko siebie. Następnie wybierz jedną z nich do rejestracji z nerwu iTune, a drugą do rejestracji z RN.Umieścić końcówkę elektrody w soli fizjologicznej. Wolny koniec rurki polietylenowej przymocowanej do strzykawki podłączyć do elektrody ssącej. Następnie za pomocą strzykawki napełnić elektrodę solą fizjologiczną.Następnie zbliż końcówkę elektrody do końca nerwu I2 i za pomocą strzykawki zassij nerw do wnętrza elektrody. Długość nerwu wewnątrz elektrody powinna wynosić od 0,5 do 1 mm. Aby zapewnić szczelność, powtórz ssanie w przypadku elektrody, która zostanie przymocowana do rn, w celu podłączenia przetworników siły do mięśnia.Zagiąć zakrzywioną igłę każdej nici chirurgicznej i przywiązać nić do przetwornika siły. Delikatnie chwycić i unieść niewielką ilość mięśnia za pomocą pęsety, a następnie wprowadzić igłę przez tylną część mięśnia I one I three aż do punktu zagięcia igły. Teraz przyłączyć drugi przetwornik siły do przedniej części mięśnia w obrębie żuchwy.Następnie unieś przetworniki siły, aż szwy zostaną napięte, jednak nie rozciągaj ich zbyt mocno podczas sprawdzania. Odczytaj pomiar z przetwornika siły w momencie, gdy szew jest lekko poluzowany. Po tym unieś przetwornik, aż wartość pomiaru znajdzie się nieco powyżej tego poziomu bazowego.Aby zlokalizować potencjalny neuron, należy użyć manipulatora, by delikatnie docisnąć końcówkę szklanej elektrody zewnątrzkomórkowej do osłonki nad centrum somy neuronu, co stanowi optymalne miejsce do stymulacji i rejestracji selektywności komórki. Rysunek ten przedstawia stymulację zewnątrzkomórkową B three oraz rejestrację z somy B three, a także z odpowiadających im nerwów i obszarów mięśniowych, kolejno od góry do dołu. Kanały reprezentują rejestracje z somy B three, przeciwległego BN two, ipsilateralnego BN two, ipsilateralnego BN three, siłę skurczu przedniego regionu mięśnia I one I three oraz siłę skurczu tylnego regionu mięśnia I one I three.Niebieska ramka wyróżnia czas trwania sił w obszarach przednich i tylnych mięśnia I one I three; B three rzutuje wyłącznie na ipsilateralne BN two. Poniżej przedstawiono rejestracje zewnątrzkomórkowe z somy B three i nerwów podczas wzorca ruchowego typu EST, a także wzorca ruchowego typu ingestywnego. Niebieskie ramki wskazują fazy protrakcji i retrakcji danych wzorców.Czerwone paski w kanale B three SOMA zaznaczają potencjały czynnościowe zarejestrowane z somy B three, natomiast czerwone paski w kanale IB two wskazują odpowiadający im czas wyładowań B three w ipsilateralnym BN two podczas wzorców ruchowych żerowania. Należy zauważyć, że jednostka BN two dla B three jest największa spośród wszystkich jednostek.W ten sposób możemy również wykryć jednostki BN two oraz B three bezpośrednio z zapisów BN two, bez konieczności wykonywania zapisów z SOMA. Rysunek ten przedstawia stymulację zewnątrzkomórkową B 43 oraz zapisy z jej somy, a także z odpowiadających im nerwów i obszarów mięśniowych, patrząc od góry do dołu. Kanały przedstawiają zapisy z somy B 43, przeciwległego BN two, ipsilateralnego BN two, ipsilateralnego BN three, siłę skurczu przedniego odcinka mięśnia I one I three oraz siłę skurczu tylnego odcinka mięśnia I one I three.Niebieska ramka wyróżnia pomiary siły mięśnia I 1 I 3 podczas aktywności B 43. Aktywność B 43 rzutuje wyłącznie na ipsilateralny BN 2. Przedstawiono tutaj zapisy zewnątrzkomórkowe z somy i nerwów B 43 podczas wzorca ruchowego przypominającego pobieranie pokarmu, a także wzorca ruchowego przypominającego pobieranie pokarmu.Niebieskie pola wskazują fazy protrakcji i retrakcji wzorców. Czerwone paski w kanale B 43 SOMA podkreślają potencjały czynnościowe zarejestrowane z somy B 43, natomiast czerwone paski w kanale IBN two wskazują odpowiadający im czas wyładowań B 43 w ipsilateralnym BN two. W tych wzorcach należy zauważyć, że jednostki BN two dla B 43 są małe i bardzo trudne do wykrycia bez rejestracji sumarycznej, ale wyładowują się konsekwentnie na końcu programu motorycznego BN two, co stanowi alternatywny sposób ich identyfikacji.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przeprowadzić zewnątrzkomórkową identyfikację pojedynczych nowoczesnych neuronów w celu wielu.

extracellularly-identifying-motor-neurons-for-muscle-motor-pool

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Pozakomórkowa identyfikacja neuronów ruchowych dla puli ruchowej mięśniowej w Aplysia californica

Pierwotne kultury neuronów czuciowo-ruchowych Aplysia stanowią modelowe przygotowanie do badania powstawania synaps i plastyczności synaps in vitro.  Film ten przedstawia identyfikację i mikrodysekcję neuronów czuciowych i ruchowych z Aplysia ganglia, a także metody tworzenia i utrzymywania neuronów czuciowo-ruchowych w hodowli.

Przygotowanie kultur czuciowo-ruchowych komórek neuronalnych Aplysia

Doświadczenia te prezentują prosty sposób, dzięki któremu studenci mogą zdobyć doświadczenie w badaniu struktury mięśni, odpowiedzi synaptycznych oraz wpływu gradientów jonowych i przepuszczalności na potencjały błonowe. Przedstawiono również obwód sensoryczny-OUN-motoryczny-mięśniowy, aby pokazać metodę testowania wpływu związków chemicznych na obwód neuronalny.

Potencjały błonowe, odpowiedzi synaptyczne, obwody neuronalne, neuromodulacja i histologia mięśni z wykorzystaniem raka rzecznego: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów

Ta nowa metoda umożliwia jednoczesną rejestrację wewnątrzkomórkową pojedynczego motoneuronu dorosłej myszy oraz pomiar siły generowanej przez jego włókna mięśniowe. Połączone badanie właściwości elektrycznych i mechanicznych jednostek motorycznych u zwierząt zdrowych i modyfikowanych genetycznie stanowi przełom w badaniach nad układem nerwowo-mięśniowym.

Symultaniczne rejestrowanie wewnątrzkomórkowe lędźwiowego motoneuronu oraz siły generowanej przez jego jednostkę motoryczną u dorosłej myszy in vivo

Ślimak morski Aplysia californica był powszechnie używany jako model neurobiologiczny do badań nad komórkowymi i molekularnymi podstawami zachowania. Opisano metodologię badania układu nerwowego Aplysia do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych pojedynczych neuronów zidentyfikowanych obwodów neuronalnych.

Aplizja Przygotowanie zwojów nerwowych do analiz elektrofizjologicznych i molekularnych pojedynczych neuronów

Tutaj opisujemy sekcję rdzenia nerwowego brzucha raka. Demonstrujemy również technikę elektrofizjologiczną rejestrowania fikcyjnej lokomocji z neuronów ruchowych pływaka.

System pływacki raków: praktyczny przewodnik po rozwarstwieniu rdzenia nerwowego i zewnątrzkomórkowych zapisach wzorca motorycznego

Skuteczność domięśniowego wychwytu i wstecznego transportu cząsteczek do odpowiednich neuronów ruchowych zależy od lokalizacji miejsc wstrzyknięć w stosunku do płytek końcowych silnika (MEP). W tym miejscu opisujemy, jak zlokalizować MEP na mięśniach szkieletowych, aby zoptymalizować wsteczny transport znaczników do neuronów ruchowych.

Iniekcje domięśniowe wzdłuż płytek końcowych silnika: minimalnie inwazyjne podejście do przenoszenia znaczników bezpośrednio do neuronów ruchowych

Ta praca opisuje standardową metodę immunohistochemiczną do wizualizacji projekcji neuronów ruchowych zarodków Drosophila melanogaster w późnym stadium 16. Wyfiletowany preparat utrwalonych zarodków wybarwionych przeciwciałem FasII stanowi potężne narzędzie do scharakteryzowania genów wymaganych do znajdowania ścieżki aksonów ruchowych i rozpoznawania celów podczas rozwoju neuronalnego.

Wizualizacja wzorca projekcji aksonalnej embrionalnych neuronów ruchowych u Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół minimalnie inwazyjnego chirurgicznego uszkadzania mięśni nieodłącznie związanych z aparatem żywieniowym morskiego Aplysia californica, aby zrozumieć rolę tych mięśni podczas zachowania żywieniowego.

Minimalnie inwazyjna technika zmiany mięśni nieodłącznie związana z odontoforem Aplysia californica

Opisujemy metodę wstecznego śledzenia embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych.

Wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych

Ten protokół przedstawia metodę obrazowania aktywności populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczej komórki u nietransgenicznych gatunków bezkręgowców przy użyciu barwników absorbancyjnych wrażliwych na napięcie i matrycy fotodiodowej. Takie podejście umożliwia szybki przepływ pracy, w którym obrazowanie i analiza mogą być realizowane w ciągu jednego dnia.

Obrazowanie optyczne oparte na fotodiodach do rejestrowania dynamiki sieci z rozdzielczością pojedynczego neuronu u bezkręgowców nietransgenicznych

Opisujemy metodę generowania ludzkich jednostek motorycznych w komercyjnie dostępnych urządzeniach mikroprzepływowych poprzez kokulturację ludzkich indukowanych pluripotencjalnych neuronów ruchowych pochodzących z komórek macierzystych z ludzkimi pierwotnymi miotubami pochodzącymi z mezoangioblastów, co prowadzi do powstania funkcjonalnie aktywnych połączeń nerwowo-mięśniowych.

Generacja jednostek motorycznych człowieka z funkcjonalnymi połączeniami nerwowo-mięśniowymi w urządzeniach mikroprzepływowych

Poznaj metodę zewnątrzkomórkowej identyfikacji neuronów ruchowych w puli motorycznej u Aplysia californica. Technika ta umożliwia monitorowanie aktywności neuronów podczas wzorców motorycznych zachowań pokarmowych.

Zewnątrzkomórkowa identyfikacja neuronów ruchowych w puli motorycznej mięśni u Aplysia californica

Przeglądaj więcej filmów