Elektroporacja strefy podkomorowej noworodka
11 lutego 2013
Prezentujemy minimalnie inwazyjną technikę określaną jako elektroporacja strefy podkomorowej noworodka. Technika ta polega na wstrzyknięciu plazmidowego DNA do bocznych komór nowonarodzonych młodych i zastosowaniu prądu elektrycznego w celu dostarczenia i genetycznej manipulacji nerwowych komórek macierzystych
Celem tej procedury jest genetyczne znakowanie i manipulowanie składnikami molekularnymi nerwowych komórek macierzystych strefy podkomorowej. Osiąga się to poprzez wprowadzenie najpierw szklanej pipety wypełnionej DNA do bocznej komory P zero P. Drugim krokiem jest wydalenie DNA do płynu mózgowo-rdzeniowego komory bocznej. Następnie prąd jest przykładany do P. Pozwala to na transfer DNA do nerwowych komórek macierzystych wyściełających komory boczne
.Ostatecznie połączenie technik molekularnych, w tym immunohistochemii, biologii molekularnej, mikroskopii i elektrofizjologii, służy do wizualizacji zmian w losie, proliferacji, migracji i dojrzewaniu komórek neuromacierzystych strefy podkomorowej. Elektroporacja strefy podkomorowej noworodków może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurogenezy, takie jak to, które szlaki molekularne są odpowiedzialne za regulację proliferacji, różnicowania, migracji i dojrzewania neuronalnych komórek macierzystych i ich potomstwa. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak myszy transgeniczne, jest to, że pozwala ona na szybkie i solidne znakowanie komórek macierzystych neuronów SVZ w sposób efektywny czasowo i kosztowo.
Po pierwsze, upewnij się, że DNA do elektrooczyszczania ma wysoką czystość i stężenie oraz jest wolne od endotoksyn. Wyciągnij 10-centymetrowe, polerowane ogniowo rurki kapilarne ze szkła krzemionkowego BO do pipet. Używany jest tutaj ściągacz do pipet PP eight 30 ghhi PC 10 do wyciągania jednoetapowego ważonego pociągnięcia w temperaturze 70.5 stopni Celsjusza Po pociągnięciu pipety użyj okrągłych kleszczy, aby złamać końcówkę.
Następnie sprawdź pipetę pod mikroskopem preparacyjnym, aby upewnić się, że nie ma postrzępionych krawędzi. W razie potrzeby końcówkę można ukosować za pomocą kamienia szlifierskiego. Następnie umieść przelane pipety pod lampą UV na 15 minut.
Po upływie 15 minut oznacz pipetę w odległości dwóch milimetrów od krawędzi końcówki markerem z cienką końcówką. Na koniec przygotuj szybko zielony roztwór o masie 0,1 na objętość, mieszając sterylny, przefiltrowany, 0,9% sterylny roztwór soli fizjologicznej z suchym, szybkim zielonym środkiem znieczulającym. Szczenię w wieku od zera do jednego dnia, szklana szalka Petriego wstępnie schłodzona do czterech stopni Celsjusza i umieszczona na zachodnim lodzie Po około pięciu minutach określ stan znieczulenia, wykorzystując reakcję szczypania stopy.
Jeśli nie wystąpi żaden ruch, należy rozpocząć wstrzyknięcie dokomorowe. Połącz szybki zielony roztwór z roztworem DNA i nanieś od jednego do dwóch mikrolitrów na biofilm. Ważne jest, aby zrobić to tuż przed wstrzyknięciem, ponieważ połączenie szybkiego zielonego roztworu z DNA może spowodować szybkie odparowanie i krystalizację, a następnie zablokowanie szklanych pipet, odessanie całej porcji za pomocą strzykawki z mikrofilmem i załadowanie szklanej pipety do wtryskiwacza pod ciśnieniem powietrza.
Teraz delikatnie chwyć i przytrzymaj głowę szczeniaka między kciukiem a palcem wskazującym ostatniej dominującej ręki. Następnie włącz lampę i trzymaj głowę szczeniaka tuż poza wiązką światła. Jeśli komory nie są wyraźnie widoczne, zwilż głowę sterylną solą fizjologiczną, aby zmniejszyć ilość światła odbijanego przez skórę głowy.
Następnie, używając ręki dominującej, wbij igłę w bliższą boczną komorę. Miejsce wstrzyknięcia powinno znajdować się w przybliżeniu w równej odległości od szwu OID i oka oraz dwa milimetry bocznie od szwu strzałkowego. Włóż wyciągniętą pipetę do znaku dwóch milimetrów, aby uzyskać pop P zero, który powinien zapewnić penetrację do komory bocznej.
Ponowne napełnienie płynu mózgowo-rdzeniowego do pipety może nastąpić z powodu uwolnienia ciśnienia śródczaszkowego. Jeśli tak się stanie, poluzuj uchwyt na główce POP, aby zmniejszyć ciśnienie i pomóc w wstrzyknięciu plazmidu. Po optymalnym wprowadzeniu pipety wstrzyknąć około 0,5 mikrolitra plazmidu do komory bocznej.
Ustaw napięcie generatora pracy elektrycznej na pięć impulsów kwadratowych, 50 milisekund na impuls i 100 woltów w odstępach 50 milisekund. Przestrzenna specyfika działania elektro plazmowej zależy od kierunku przenoszenia ładunku, dlatego należy wziąć pod uwagę przestrzenne rozmieszczenie elektrod, biorąc pod uwagę, jak różnorodne są ogniwa SVZ. Ludzie zgłaszali zmiany w zakresie losu komórek i proliferacji w brzusznej części grzbietowej do lokalizacji CAU.
Po wstrzyknięciu zanurzenia plazmidu pęseta wprowadza elektrody do PBS, aby zmaksymalizować transfer ładunku i zapobiec oparzeniom spowodowanym rezystywnością. Następnie umieść elektrodę dodatnią na grzbietowej bocznej ścianie czaszki w pobliżu ucha i zanurz boczną do wstrzyknięcia cytoplazmy. Następnie umieść elektrodę ujemną na półkuli przeciwległej, brzusznej bocznej do pyska.
Rysunek ten przedstawia prawidłową orientację elektrod ujemnych i dodatnich względem osi x, y, z na wstrzykiwanym pup. Zainicjuj transfer prądu, naciskając pedał przełącznika nożnego impulsu i przesuń elektrody od grzbietu do boku, zachowując kąt około 25 stopni. Po zakończeniu elektroporacji umieść wszystkie wyładowane elektrolitycznie szczenięta na poduszce grzewczej na pięć minut.
Delikatnie obracaj szczenięta co 30 sekund z łagodną stymulacją. Ten obraz przedstawia boczną komorę nowonarodzonej myszy 24 godziny po elektroporacji wektora kodującego EGFP. Ogniwa o wartości elektrycznej fluoryzują na zielono.
Tutaj widzimy komorę boczną oznaczoną LV 28 dni po elektroporacji rekombinazy Cree i GFP kodujących plazmidy u myszy przenoszących kod stop przed rekombinacją pomidorów TD indukuje ekspresję pomidora TD widoczną na czerwono, kolejne rozcieńczanie plazmidu, w wyniku którego na stałe ulega ekspresji kilku pozostałych komórek SVZ z dodatnim EGFP lub pomidora TD wyrażonego genomowo. Rozcieńczenie plazmidu, DNA pokazane na zielono jest widoczne, biorąc pod uwagę, że więcej komórek w warstwie komórek ziarnistych opuszki węchowej oznaczonej OB, wyrażało marker genomowy pomidora TD pokazany na czerwono. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oznaczać i manipulować komórkami macierzystymi z SVZ.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Omówienie
W tym artykule przedstawiona jest minimalnie inwazyjna technika znana jako elektroporacja strefy subwentykularnej noworodków, która umożliwia manipulację genetyczną komórek macierzystych nerwów u noworodków. Metoda polega na wstrzyknięciu DNA plazmidowego do komór mózgowych bocznych i zastosowaniu prądu elektrycznego w celu ułatwienia pobierania DNA przez komórki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Inżynieria genetyczna
- Badania komórek macierzystych
Tło
- Komórki macierzyste nerwów w strefie subwentykularnej (SVZ) są kluczowe dla neurogenezy.
- Tradycyjne metody manipulacji genetycznej mogą być czasochłonne i kosztowne.
- Ta technika oferuje szybką i wydajną alternatywę do znakowania i badania tych komórek.
- Elektroporacja zwiększa dostarczanie DNA do komórek, poprawiając wyniki eksperymentalne.
Cel badania
- Genetyczne znakowanie i manipulacja składnikami molekularnymi komórek macierzystych nerwów SVZ.
- Badanie szlaków molekularnych regulujących zachowanie komórek macierzystych.
- Zapewnienie opłacalnej metody badania neurogenezy.
Wykorzystane metody
- Wstrzyknięcie DNA plazmidowego do komory mózgowej bocznej za pomocą szklanej pipety.
- Zastosowanie impulsów elektrycznych w celu ułatwienia pobierania DNA przez komórki macierzyste nerwów.
- Wykorzystanie immunohistochemii i mikroskopii do wizualizacji zmian w zachowaniu komórek.
- Monitorowanie losu komórek, proliferacji, migracji i dojrzewania po elektroporacji.
Główne wyniki
- Pomyślne znakowanie komórek macierzystych nerwów SVZ za pomocą markerów fluorescencyjnych.
- Wykazano zmiany w losie komórek i proliferacji w odpowiedzi na elektroporację.
- Dostarczyło wglądu w mechanizmy molekularne rządzące neurogenezą.
- Podkreślono zalety tej techniki w porównaniu z tradycyjnymi metodami manipulacji genetycznej.
Wnioski
- Elektroporacja strefy subwentykularnej noworodków jest cennym narzędziem dla badań neurobiologicznych.
- Ta metoda umożliwia wydajną manipulację genetyczną komórek macierzystych nerwów.
- Otwiera nowe ścieżki badania dynamiki neurogenezy i biologii komórek macierzystych.
Najczęściej zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Neonatal subventricular zone electroporation enables rapid, cost-effective genetic manipulation of neural stem cells, supporting early-stage target validation in neurogenesis research. The technique provides a scalable alternative to transgenic models, reducing time and resource investment in preclinical target de-risking. It enhances predictive confidence by allowing direct interrogation of molecular pathways in a disease-relevant postnatal mammalian system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of molecular pathways regulating neural stem cell proliferation, differentiation, migration, and maturation.
- Operational Value: Provides rapid, robust labeling of SVZ neural stem cells and progeny for downstream phenotypic analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively assessable cellular readouts via immunohistochemistry, microscopy, and electrophysiology to evaluate genetic manipulations.
- Operational Value: Supports assay standardization through reproducible electroporation parameters and consistent DNA delivery to the lateral ventricle.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking genetic perturbations to cellular phenotypes in a postnatal rodent forebrain model.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of electroporated cells and their progeny, supporting biomarker-aligned outcome assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven manipulation of neural stem cells prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports target validation through direct genetic manipulation of SVZ neural stem cells and quantification of fate, proliferation, migration, and maturation changes.
- Screening: Delivers standardized, reproducible transfection efficiency for consistent compound or genetic perturbation screening in neural stem cell-derived systems.
- Analytics: Generates multiplexed readouts (fluorescent labeling, electrophysiological migration, immunohistochemical maturation) enabling comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects discovery-phase mechanistic insights to preclinical continuity via permanent genomic reporters (e.g., TD tomato) and dilution-tracked plasmid expression.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative target interrogation across multiple genetic constructs and timepoints.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct observation of stem cell behavior changes in an intact neonatal niche.
- Operational Value: Standardization via defined electroporation parameters (5 pulses, 50 ms, 100 V) and reproducible DNA injection volumes (0.5 µL).
- Strategic Value: Reduced biological risk in go/no-go decisions by enabling rapid, cost-effective target de-risking versus transgenic model generation.
- Portfolio Impact: Accelerates prioritization of neurodevelopmental targets by providing early functional evidence in a disease-relevant system.
Implementation Considerations
- Required expertise in neonatal pup handling, microsurgery, and electrophysiology-based injection techniques.
- Need for precision instrumentation including pipette pullers, microinjectors, and electroporation generators with pulse control.
- Standardization of DNA preparation (high purity, endotoxin-free, optimal concentration) and electrode placement for consistent charge transfer.
- Adaptation considerations across rodent strains and developmental timepoints (P0-P1) to maintain ventricular access and cell targeting efficiency.
- Practical limitations include variable transfection efficiency due to ventricular anatomy and CSF dynamics, requiring operator training for reproducibility.
