Name: Elektroporacja strefy podkomorowej noworodka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Poznaj elektroporację strefy podkomorowej noworodka do genetycznej modyfikacji komórek macierzystych mózgu. Ta metoda umożliwia szybkie i efektywne etykietowanie neuronów w badaniach neurogenezji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Departamentu Obrony (Nagroda za rozwój pomysłów, W81XWH-10-1-0041, A.B.), CT Stem cell grant (A.B.) oraz National Institute of Health NRSA 10668225 (D.M.F). Niniejszy materiał opiera się na pracach częściowo wspieranych przez stan Connecticut w ramach programu Connecticut Stem Cell Research Grants Program. Wyłączną odpowiedzialność za jego treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy stanu Connecticut, Departamentu Zdrowia Publicznego stanu Connecticut lub CT Innovations, Inc. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Ta procedura jest zgodna z wymaganiami IACUC Yale. Naukowcy powinni upewnić się, że wytyczne IACUC są zatwierdzone i przestrzegane zgodnie z ich wymogami instytucjonalnymi.
1. Sekcja 1. Przygotowanie DNA, roztworów i szklanych pipet
<ol>
 <li>Generuj DNA o wysokiej czystości (OD 260/280 > 1,80) i wysokim stężeniu (μg/μl > 2,5) wolnym od endotoksyn.</li>
 <li>Przygotować 0,9% roztwór soli fizjologicznej i sterylny filtr przez filtr 22 μm.</li>
 <li>Umieść 10 cm polerowane ogniowo rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna: 1.5 mm, średnica wewnętrzna: 1.10 mm) w szklanym ściągaczu do pipet model PP-830 Narishige PC-10 z drutem kantalowym. Ustaw ściągacz na jednostopniowe ściąganie z obciążeniem w temperaturze 70,5 °C. Złamij końcówki okrągłymi kleszczami i sprawdź pod mikroskopem preparacyjnym pod kątem postrzępionych krawędzi. Skośne końcówki i umieść pod lampą UV na 15 minut. Wyciągnięte pipety powinny być oznaczone w odległości 2 mm od krawędzi końcówki.</li>
 <li>Przygotuj 0,1% wagowo-objętościowo szybko zielony roztwór, mieszając sterylny, przefiltrowany, 0,9% roztwór soli fizjologicznej z suchym, szybko zielonym roztworem.</li>
</ol>
2. Sekcja 2. Przygotowanie zwierząt, ładowanie szklanych pipet i wstrzykiwanie plazmidu
<ol>
 <li>W dniu poporodowym 0-1 młode należy wyjąć pojedynczo z klatek, umieścić na szklanej szalce Petriego schłodzonej do temperatury 4 °C, a następnie umieścić na mokrym lodzie.</li>
 <li>Po około 5 minutach określ stan znieczulenia, wykorzystując reakcję szczypania stopy. Jeśli nie wystąpi żaden ruch, należy poddać młode wstrzyknięciu dokomorowemu.</li>
 <li>Ważne jest, aby pamiętać, że połączenie szybkiego zielonego roztworu, DNA i soli fizjologicznej może spowodować szybkie parowanie, krystalizację i zablokowanie szklanych pipet. W związku z tym należy wytworzyć roztwór podstawowy i podwielokrotność 1-2 μl na parafilm bezpośrednio przed wstrzyknięciami.</li>
 <li>Odessać całą porcjowaną objętość za pomocą wyciągniętej szklanej pipety.</li>
 <li>Trzymaj głowę szczeniaka między kciukiem a palcem wskazującym mniej dominującej ręki.</li>
 <li>Włącz lampę i przytrzymaj głowę szczeniaka tuż poza wiązką światła. W razie potrzeby posmaruj głowę solą fizjologiczną, aby zmniejszyć ilość światła odbijanego przez szczeniaka. Komory powinny być teraz oświetlone.</li>
 <li>Ręką dominującą wbić igłę do najbliższej komory bocznej (ryc. 1A i 1B). Miejsce wstrzyknięcia powinno znajdować się w przybliżeniu w równej odległości od szwu lambdoidalnego i oka oraz 2 mm bocznie od szwu strzałkowego. Włóż ciągniętą pipetę do oznaczenia 2 mm dla P0 pup, która powinna zapewnić penetrację do komory bocznej. Przypadkowo może dojść do sytuacji, w której płyn mózgowo-rdzeniowy zostanie ponownie napełniony pipetą po uwolnieniu ciśnienia śródczaszkowego. Aby zmniejszyć ciśnienie śródczaszkowe, które pomaga w wstrzyknięciu plazmidu, poluzuj uścisk na głowie szczeniaka. Krok 2.8. Wstrzyknąć około 0,5 μl plazmidu do komory bocznej za pomocą iniektora pod ciśnieniem powietrza (Picospritzer, Parker).</li>
</ol>
3. Sekcja 3. Elektroporacja i odzysk
<ol>
 <li>Ustaw napięcie generatora elektroporacji na 5 impulsów kwadratowych, 50 ms/impuls przy 100 woltach, w odstępach 950 ms. Przestrzenna specyfika elektroporacji plazmidowej podyktowana jest kierunkowością przenoszenia ładunku. Należy zwrócić szczególną uwagę na rozmieszczenie, biorąc pod uwagę niejednorodność populacji komórek macierzystych wzdłuż SVZ8. Stwierdzono różnice w tempie proliferacji i losie komórek w lokalizacjach brzuszno-grzbietowych i rostralno-ogonowych9,10 .</li>
 <li>Po wstrzyknięciu plazmidu zanurz elektrody pęsety w PBS. Ten krok ma na celu maksymalizację transferu ładunku i zapobieżenie oparzeniom spowodowanym rezystywnością.</li>
 <li>Umieść elektrodę dodatnią na grzbietowej bocznej ścianie szczeniaka w pobliżu ucha, ipsilateralnie do miejsca wstrzyknięcia plazmidu (ryc. 1C i 1D). Umieść elektrodę ujemną na półkuli przeciwległej, brzusznej, bocznej w stosunku do pyska szczeniaka.</li>
 <li>Zainicjuj transfer prądu, naciskając pedał przełącznika nożnego impulsu i przesuń elektrody od grzbietu do boku, używając odstępów kąta ~25 °.</li>
 <li>Umieść szczenięta poddane elektryzacji na poduszce grzewczej na 5 minut. Delikatnie obracaj szczenięta co 30 sekund z łagodną stymulacją.</li>
</ol>

<ol><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).</li>
<li>Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+methods+to+identify+and+manipulate+newly+born+neurons+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain.</a> Frontiers in Neuroscience. 5, 64(2011).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li>
<li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PloS ONE. 3, e1883(2008).</li>
<li>Chesler, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+gene+expression+by+postnatal+electroporation+during+olfactory+interneuron+nurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis.</a> PloS ONE. 3, e1517(2008).</li>
<li>Platel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+activated+by+subventricular+zone+astrocytic+glutamate+are+critical+for+neuroblast+survival+prior+to+entering+a+synaptic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network.</a> Neuron. 65, 859-872 (2010).</li>
<li>Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heterogeneity+of+adult+neural+stem+cells+and+the+emerging+complexity+of+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).</li>
<li>Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+of+defined+lateral+ventricular+walls%3A+a+novel+and+rapid+method+to+study+fate+specification+during+postnatal+forebrain+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis.</a> Neural Development. 6, 13(2011).</li>
<li>de Chevigny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-7a+regulation+of+Pax6+controls+spatial+origin+of+forebrain+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons.</a> Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).</li>
<li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+recording+subventricular+zone+progenitor+cells+in+live+tissue+of+postnatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).</li>
<li>Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+neurogenesis+generates+heterotopias%2C+olfactory+micronodules+and+cortical+infiltration+following+single-cell+Tsc1+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion.</a> Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).</li>
<li>Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tightly+controlled+conditional+knockdown+system+using+the+Tol2+transposon-mediated+technique%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique.</a> PloS ONE. 7, e33380(2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych ujawnień do ujawnienia.

W tym miejscu szczegółowo opisujemy technikę elektroporacji SVZ u noworodków, technikę szybkiego i solidnego znakowania i manipulowania komórkami macierzystymi SVZ i ich potomstwem. Istnieje kilka zalet, jakie ma elektroporacja w porównaniu z innymi technikami. Po pierwsze, biorąc pod uwagę ogniskowe znakowanie komórek, można dostrzec efekty autonomiczne i nieautonomiczne komórek. Po drugie, manipulacja genetyczna za pomocą systemów indukowalnych pozwala na porównanie efektów przed lub po integracji synaptycznej. Ponadto...

<table><tbody><tr><td>Ciężkie, polerowane rurki borokrzemianowe </td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-110-10</td><td></td></tr><tr><td>Dwustopniowy ściągacz do mikropipet szklanych </td><td>Narishige</td><td>PC-10H</td><td></td></tr><tr><td>Szybki zielony </td><td>Fischer Scientific</td><td>0521192205</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 Generator impulsów fali prostokątnej </td><td>Aparat Harvard</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Pęsety</td><td>Aparat</td> <td>Harvarda45-0488</td><td></td></tr><tr><td>Światłowodowe źródło światła</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-562-36</td><td></td></tr><tr><td>Wolframowa lampa halogenowa</td><td>USHIO America, Inc</td><td>1002247</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer II</td><td>Parker Instruments</td><td>052-0312-900</td><td></td></tr></tbody></table>

elektroporacja strefy podkomorowej noworodka

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Nerwowe komórki macierzyste (NSC) wyściełają boczne komory poporodowe i dają początek wielu typom komórek, w tym neuronom, astrocytom i komórkom wyściółki1. Zrozumienie szlaków molekularnych odpowiedzialnych za samoodnowę, zaangażowanie i różnicowanie NSC ma kluczowe znaczenie dla wykorzystania ich unikalnego potencjału do naprawy mózgu i lepszego zrozumienia zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego. Poprzednie metody manipulacji systemami ssaków wymagały czasochłonnego i kosztownego wysiłku inżynierii genetycznej na poziomie całego zwierzęcia2. W związku z tym zdecydowana większość badań dotyczyła funkcji cząsteczek NSC in vitro lub w bezkręgowcach.
Tutaj demonstrujemy prostą i szybką technikę manipulowania NPC noworodków, która jest określana jako elektroporacja strefy podkomorowej noworodka (SVZ). Podobne techniki zostały opracowane dziesięć lat temu w celu badania embrionalnych NSC i pomogły w badaniach nad rozwojem kory mózgowej3,4 . Ostatnio zastosowano to do badania przodomózgowia gryzoni po urodzeniu5-7. Technika ta skutkuje solidnym oznakowaniem NSC SVZ i ich potomstwa. W związku z tym poporodowa elektroporacja SVZ stanowi efektywną kosztowo i czasowo alternatywę dla inżynierii genetycznej NSC u ssaków.

Elektroporacja strefy podkomorowej u noworodków skutkuje oznakowaniem niemal wszystkich glejów radialnych przylegających do grzbietowej, grzbietowo-bocznej i bocznej strefy podkomorowej po wykonaniu ruchu „zamiatania” elektrodą pęsetową (Rycina 1E). Jednakże electroporację można dostosować do wymagań konkretnego eksperymentu, rezygnując z zamiatania elektrodą i stosując specyficzne rozmieszczenie oraz orientację, zgodnie ze szczegółami przedstawionymi w filmie. Na przykład, ponieważ gleje radialne zlokal...

Prezentujemy minimalnie inwazyjną technikę określaną jako elektroporacja strefy podkomorowej noworodka. Technika ta polega na wstrzyknięciu plazmidowego DNA do bocznych komór nowonarodzonych młodych i zastosowaniu prądu elektrycznego w celu dostarczenia i genetycznej manipulacji nerwowych komórek macierzystych

Elektroporacja strefy podkomorowej noworodka

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

Celem tej procedury jest genetyczne znakowanie i manipulowanie składnikami molekularnymi nerwowych komórek macierzystych strefy podkomorowej. Osiąga się to poprzez wprowadzenie najpierw szklanej pipety wypełnionej DNA do bocznej komory P zero P. Drugim krokiem jest wydalenie DNA do płynu mózgowo-rdzeniowego komory bocznej. Następnie prąd jest przykładany do P. Pozwala to na transfer DNA do nerwowych komórek macierzystych wyściełających komory boczne.Ostatecznie połączenie technik molekularnych, w tym immunohistochemii, biologii molekularnej, mikroskopii i elektrofizjologii, służy do wizualizacji zmian w losie, proliferacji, migracji i dojrzewaniu komórek neuromacierzystych strefy podkomorowej. Elektroporacja strefy podkomorowej noworodków może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurogenezy, takie jak to, które szlaki molekularne są odpowiedzialne za regulację proliferacji, różnicowania, migracji i dojrzewania neuronalnych komórek macierzystych i ich potomstwa. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak myszy transgeniczne, jest to, że pozwala ona na szybkie i solidne znakowanie komórek macierzystych neuronów SVZ w sposób efektywny czasowo i kosztowo.Po pierwsze, upewnij się, że DNA do elektrooczyszczania ma wysoką czystość i stężenie oraz jest wolne od endotoksyn. Wyciągnij 10-centymetrowe, polerowane ogniowo rurki kapilarne ze szkła krzemionkowego BO do pipet. Używany jest tutaj ściągacz do pipet PP eight 30 ghhi PC 10 do wyciągania jednoetapowego ważonego pociągnięcia w temperaturze 70.5 stopni Celsjusza Po pociągnięciu pipety użyj okrągłych kleszczy, aby złamać końcówkę.Następnie sprawdź pipetę pod mikroskopem preparacyjnym, aby upewnić się, że nie ma postrzępionych krawędzi. W razie potrzeby końcówkę można ukosować za pomocą kamienia szlifierskiego. Następnie umieść przelane pipety pod lampą UV na 15 minut.Po upływie 15 minut oznacz pipetę w odległości dwóch milimetrów od krawędzi końcówki markerem z cienką końcówką. Na koniec przygotuj szybko zielony roztwór o masie 0,1 na objętość, mieszając sterylny, przefiltrowany, 0,9% sterylny roztwór soli fizjologicznej z suchym, szybkim zielonym środkiem znieczulającym. Szczenię w wieku od zera do jednego dnia, szklana szalka Petriego wstępnie schłodzona do czterech stopni Celsjusza i umieszczona na zachodnim lodzie Po około pięciu minutach określ stan znieczulenia, wykorzystując reakcję szczypania stopy.Jeśli nie wystąpi żaden ruch, należy rozpocząć wstrzyknięcie dokomorowe. Połącz szybki zielony roztwór z roztworem DNA i nanieś od jednego do dwóch mikrolitrów na biofilm. Ważne jest, aby zrobić to tuż przed wstrzyknięciem, ponieważ połączenie szybkiego zielonego roztworu z DNA może spowodować szybkie odparowanie i krystalizację, a następnie zablokowanie szklanych pipet, odessanie całej porcji za pomocą strzykawki z mikrofilmem i załadowanie szklanej pipety do wtryskiwacza pod ciśnieniem powietrza.Teraz delikatnie chwyć i przytrzymaj głowę szczeniaka między kciukiem a palcem wskazującym ostatniej dominującej ręki. Następnie włącz lampę i trzymaj głowę szczeniaka tuż poza wiązką światła. Jeśli komory nie są wyraźnie widoczne, zwilż głowę sterylną solą fizjologiczną, aby zmniejszyć ilość światła odbijanego przez skórę głowy.Następnie, używając ręki dominującej, wbij igłę w bliższą boczną komorę. Miejsce wstrzyknięcia powinno znajdować się w przybliżeniu w równej odległości od szwu OID i oka oraz dwa milimetry bocznie od szwu strzałkowego. Włóż wyciągniętą pipetę do znaku dwóch milimetrów, aby uzyskać pop P zero, który powinien zapewnić penetrację do komory bocznej.Ponowne napełnienie płynu mózgowo-rdzeniowego do pipety może nastąpić z powodu uwolnienia ciśnienia śródczaszkowego. Jeśli tak się stanie, poluzuj uchwyt na główce POP, aby zmniejszyć ciśnienie i pomóc w wstrzyknięciu plazmidu. Po optymalnym wprowadzeniu pipety wstrzyknąć około 0,5 mikrolitra plazmidu do komory bocznej.Ustaw napięcie generatora pracy elektrycznej na pięć impulsów kwadratowych, 50 milisekund na impuls i 100 woltów w odstępach 50 milisekund. Przestrzenna specyfika działania elektro plazmowej zależy od kierunku przenoszenia ładunku, dlatego należy wziąć pod uwagę przestrzenne rozmieszczenie elektrod, biorąc pod uwagę, jak różnorodne są ogniwa SVZ. Ludzie zgłaszali zmiany w zakresie losu komórek i proliferacji w brzusznej części grzbietowej do lokalizacji CAU.Po wstrzyknięciu zanurzenia plazmidu pęseta wprowadza elektrody do PBS, aby zmaksymalizować transfer ładunku i zapobiec oparzeniom spowodowanym rezystywnością. Następnie umieść elektrodę dodatnią na grzbietowej bocznej ścianie czaszki w pobliżu ucha i zanurz boczną do wstrzyknięcia cytoplazmy. Następnie umieść elektrodę ujemną na półkuli przeciwległej, brzusznej bocznej do pyska.Rysunek ten przedstawia prawidłową orientację elektrod ujemnych i dodatnich względem osi x, y, z na wstrzykiwanym pup. Zainicjuj transfer prądu, naciskając pedał przełącznika nożnego impulsu i przesuń elektrody od grzbietu do boku, zachowując kąt około 25 stopni. Po zakończeniu elektroporacji umieść wszystkie wyładowane elektrolitycznie szczenięta na poduszce grzewczej na pięć minut.Delikatnie obracaj szczenięta co 30 sekund z łagodną stymulacją. Ten obraz przedstawia boczną komorę nowonarodzonej myszy 24 godziny po elektroporacji wektora kodującego EGFP. Ogniwa o wartości elektrycznej fluoryzują na zielono.Tutaj widzimy komorę boczną oznaczoną LV 28 dni po elektroporacji rekombinazy Cree i GFP kodujących plazmidy u myszy przenoszących kod stop przed rekombinacją pomidorów TD indukuje ekspresję pomidora TD widoczną na czerwono, kolejne rozcieńczanie plazmidu, w wyniku którego na stałe ulega ekspresji kilku pozostałych komórek SVZ z dodatnim EGFP lub pomidora TD wyrażonego genomowo. Rozcieńczenie plazmidu, DNA pokazane na zielono jest widoczne, biorąc pod uwagę, że więcej komórek w warstwie komórek ziarnistych opuszki węchowej oznaczonej OB, wyrażało marker genomowy pomidora TD pokazany na czerwono. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oznaczać i manipulować komórkami macierzystymi z SVZ.

neonatal-subventricular-zone-electroporation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Elektroporacja strefy podkomorowej u noworodków

Wewnątrzmaciczna iniekcja in vivo oraz elektroporacja nowokory embrionalnego szczura stanowią potężne narzędzie do manipulacji pojedynczymi komórkami progenitorowymi...

Wewnątrzkomorowe wstrzykiwanie i elektroporacja in utero embrionów szczura w 16. dniu rozwoju (E16)

In-utero in-vivo iniekcja i elektroporacja zarodkowego neokortyksu myszy stanowią potężne narzędzie do manipulacji pojedynczymi komórkami progenitorowymi ...

Wewnątrzkomorowe wstrzyknięcie i elektroporacja in utero embrionów myszy w 15. dniu rozwoju (E15)

In utero elektroporacja umożliwia szybkie dostarczanie genów w sposób kontrolowany przestrzennie i czasowo do rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W niniejszej pracy opisujemy wysoce adaptowalny protokół elektroporacji in utero, który może być wykorzystany do dostarczania konstruktów ekspresyjnych do wielu embrionalnych domen OUN, w tym do telencefalonu, diencefalonu i siatkówki.

Efektywne dostarczanie genów do wielu obszarów OUN z wykorzystaniem elektroporacji in utero

Ten protokół opisuje ulepszoną procedurę eksplantacji, która obejmuje elektroporację ex utero, sekcję i hodowlę całych półkul mózgowych od embrionalnej myszy. Preparat ułatwia badania farmakologiczne i testy funkcji genów we wczesnym okresie rozwoju kory mózgowej.

Ex utero Elektroporacja i eksplantaty całej półkuli: prosta metoda eksperymentalna do badań nad wczesnym rozwojem kory mózgowej

Migracja neuroblastów jest fundamentalnym wydarzeniem w neurogenezie poporodowej. Opisujemy protokół skutecznego znakowania neuroblastów za pomocą elektroporacji poporodowej in vivo i późniejszej wizualizacji ich migracji za pomocą obrazowania poklatkowego ostrych wycinków mózgu. Dołączamy opis do ilościowej analizy dynamiki neuroblastów za pomocą śledzenia wideo.

In vivo (in vivo) Poporodowa elektroporacja i obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów w ostrych wycinkach mózgu myszy

Powierzchnia pial to unikalna strefa progenitorowa w OUN, której poświęca się coraz więcej uwagi.  W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy metodę szybkiej manipulacji genetycznej tej strefy progenitorowej przy użyciu zmodyfikowanej metody elektroporacji.  Procedura ta może być stosowana do badań komórkowych i molekularnych linii komórkowych i szlaków sygnałowych zaangażowanych w różnicowanie komórek oraz do wyjaśnienia losów i właściwości komórek potomnych.

Elektroporacja powierzchni pialu noworodków

Ta procedura pokazuje, jak celować w interneurony w rozwijającym się przodomózgowiu myszy za pomocą elektroporacji in utero. Technika ta okazała się szczególnie skuteczna w osiąganiu selektywnej ekspresji genów w podtypach interneuronów przeznaczonych do powierzchownych warstw kory mózgowej.

Elektroporacja selektywna dla podtypów interneuronów korowych

Ten manuskrypt zawiera protokoły, które wykorzystują elektroporację in utero (IUE) do opisania strukturalnej łączności neuronów na poziomie pojedynczej komórki i pobudliwości neuronów znakowanych fluorescencyjnie. Histologia służy do charakteryzowania projekcji dendrytycznych i aksonalnych. Zapis całych komórek w ostrych wycinkach służy do badania pobudliwości.

In Utero (w macicy) Podejścia elektroporacyjne do badania pobudliwości subpopulacji neuronalnych i połączeń pojedynczych komórek

Podwójna elektroporacja w macicy pozwala na celowanie w populacje komórek, które są przestrzennie i czasowo oddzielone. Technika ta jest przydatna do wizualizacji interakcji między tymi populacjami komórek przy użyciu białek fluorescencyjnych w normalnych warunkach, ale także po eksperymentach funkcjonalnych w celu zakłócenia interesujących genów.

Podwójna elektroporacja in utero w celu ukierunkowania na czasowo i przestrzennie oddzielone populacje komórek

Prezentowany tutaj jest protokół do przeprowadzenia manipulacji genetycznej w mózgu fretki embrionalnej za pomocą elektroporacji in utero. Metoda ta pozwala na celowanie w neuronalne komórki progenitorowe w korze nowej in vivo.

Celowanie in vivo w neuronalne komórki progenitorowe w korze nowej fretki za pomocą elektroporacji in utero

Elektroporacja organoidów mózgowych naczelnych zapewnia precyzyjne i skuteczne podejście do wprowadzania przejściowych modyfikacji genetycznych do różnych typów progenitorów i neuronów w systemie modelowym zbliżonym do rozwoju (pato)fizjologicznej kory nowej naczelnych. Pozwala to na badanie procesów neurorozwojowych i ewolucyjnych, a także może być stosowane do modelowania chorób.

Ukierunkowana mikroiniekcja i elektroporacja organoidów mózgowych naczelnych w celu modyfikacji genetycznej

Poznaj elektroporację strefy podkomorowej noworodka do genetycznej modyfikacji komórek macierzystych mózgu. Ta metoda umożliwia szybkie i efektywne etykietowanie neuronów w badaniach neurogenezji.

Elektroporacja strefy podkomorowej noworodka

Przeglądaj więcej filmów