Model danio pręgowanego cukrzycy i pamięci metabolicznej

Pamięć metaboliczna to zjawisko, dzięki któremu powikłania cukrzycowe utrzymują się i postępują bez przeszkód, nawet po osiągnięciu euglikemii farmaceutycznie. W tym miejscu opisujemy model danio pręgowanego z cukrzycą, który jest wyjątkowy, ponieważ pozwala na badanie mitotycznie przenoszonych składników epigenetycznych pamięci metabolicznej in vivo.

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie modelu danio pręgowanego z cukrzycą typu pierwszego, który można wykorzystać do odkrycia molekularnych podstaw powikłań cukrzycy, a co ważniejsze, określenia genetycznych podstaw ich trwałości. Osiąga się to poprzez wywołanie hiperglikemii za pomocą serii wstrzyknięć leku przeciwcukrzycowego STZ i inkubację ryb w obniżonej temperaturze. Następnie, po trzech tygodniach, określa się poziom glukozy we krwi na czczo, aby upewnić się, że stan hiperglikemii został wywołany i lek został odstawiony w celu zainicjowania regeneracji komórek beta.

Następnie płetwa ogonowa jest amputowana i pozostawia się jej regenerację w celu wyizolowania genetycznie przenoszonych składników pamięci metabolicznej i usunięcia potencjalnie komplikujących czynników poprzedniego środowiska hiperglikemicznego. Na koniec przeprowadza się test regeneracji płetw w celu udokumentowania trwałego zmniejszenia regeneracji płetw i zidentyfikowania indukowanych zmian w transektowanej tkance za pomocą interesującego testu. Główną przewagą modelu danio pręgowanego z cukrzycą nad istniejącymi jest to, że pamięć metaboliczną można badać w prawdziwym środowisku glikemicznym U latem w porównaniu z tym, co można zaobserwować u pacjentów po przeszczepie trzustki.

Oczekujemy, że model zostanie wykorzystany do odkrycia modyfikacji epigenetycznych, które leżą u podstaw pamięci metabolicznej i utrzymywania się powikłań cukrzycowych Aby wygenerować danio pręgowanego z cukrzycą, przygotuj zbiornik regeneracyjny z normalną wodą dla ryb i zbiornik anestezjologiczny z wodą rybną o rozcieńczeniu od jednego do 1000 dwóch fenoksyetanolu pod wyciągiem. Przygotować 0,3% roztwór STREPTOZOTOCYNY lub STZ, dodając sześć miligramów STZ do dwóch mililitrów 0,09% chlorku sodu i natychmiast umieścić roztwór na lodzie w osobnej probówce. Ilość soli fizjologicznej w ilości wystarczającej do kontroli.

Ryby napełnij strzykawkę do połowy CC wyposażoną w igłę o rozmiarze 27 i pół z roztworami STZ lub kontrolnymi, upewniając się, że nie zostały uwięzione żadne pęcherzyki powietrza. Znieczul pojedynczą rybę, umieszczając ją w znieczulonej wodzie i czekając, aż ruch pływania ustanie po około jednej do dwóch minut. Po znieczuleniu na krótko umieść rybę na ręczniku papierowym, aby wchłonąć nadmiar wody, a następnie umieść rybę w łodzi i zważ ją.

Następnie połóż rybę na twardej powierzchni. Następnie wprowadzić igłę poza skos do tylnej części brzusznej otrzewnej i wstrzyknąć 0,35 miligrama na gram TZ lub równoważną objętość roztworu kontrolnego do jamy otrzewnowej ryby po wstrzyknięciu. Umieść rybę w zbiorniku na wodę do odzyskiwania i monitoruj go pod kątem normalnej aktywności pływackiej.

Po wstrzyknięciu wystarczającej ilości ryb do eksperymentu, przenieś je do normalnych zbiorników mieszkalnych i utrzymuj w temperaturze od 22 do 24 stopni Celsjusza. Obniżona temperatura ma kluczowe znaczenie dla skutecznej indukcji hiperglikemii w celu wywołania przedłużonego stanu bardzo wysokiej hiperglikemii, postępuj zgodnie z harmonogramem częstych wstrzyknięć w fazie indukcji, a następnie cotygodniowych zastrzyków podtrzymujących, jak pokazano tutaj, w celu pobrania krwi. W celu oznaczenia FBGL należy przygotować znakowaną probówkę PCR dla każdej próbki krwi zawierającej pięć mikrolitrów soli fizjologicznej.

Po znieczuleniu ryby osusz nadmiar wody, umieść rybę na szkiełku mikroskopowym i za pomocą skalpela usuń głowę u podstawy wieczka, zbierz krew uwolnioną na szkiełku i szybko dodaj ją do probówki PCR sterylnego, normalnego pipetowania soli fizjologicznej w górę iw dół, aby upewnić się, że krew nie krzepnie natychmiast, umieść próbkę na lodzie. Określ objętość próbki krwi, mierząc całkowitą objętość płynu w probówce i odejmując pięć mikrolitrów soli fizjologicznej. Przenieś pięć mikrolitrów rozcieńczonej krwi z każdej probówki PCR do 1,5 mililitrowej mikroprobówki fuge i użyj zestawu do oznaczania stężenia glukozy w chromie kwantowym zgodnie z instrukcjami producenta, aby określić stężenie glukozy we krwi.

Po znieczuleniu ryby umieść ją na szalce Petriego i pod lunetą sekcyjną użyj sterylnego skalpela w rozmiarze 10, aby amputować płetwę dorszowatą, przecinając linię prostą proksymalnie do pierwszego punktu rozgałęzienia tchawicy lipidowej dla fazy wzrostu regeneracyjnego testu. Umieść rybę w zbiorniku regeneracyjnym w temperaturze 33 stopni Celsjusza, aby zobrazować regenerujące się płetwy. Po znieczuleniu ryby należy rozłożyć płetwę tak, aby była w pełni wysunięta i użyć lunety preparacyjnej wyposażonej w kamerę i oprogramowanie elementu NIS.

Zbieraj obrazy w powiększeniu x, aby zmierzyć wzrost regeneracyjny. Wydrukuj obrazy i użyj oprogramowania do obrazowania J oraz bloku rysunkowego, aby obrysować cały obszar nowego wzrostu w celu uzyskania dokładności śledzenia. Upewnij się, że nie ma cieni ani kropelek wody i wykonaj każdy pomiar pięć razy, aby obliczyć średnią.

Aby znormalizować pomiary, należy zmierzyć długość miejsca amputacji wzdłuż grzbietowej osi brzusznej i podzielić wcześniej wyznaczony obszar przez ten pomiar. Po wygenerowaniu grupy DM FISH i ich kontroli po 21 dniach, określ FBGL dla podzbioru grupy i podziel ryby DM na dwie podgrupy na czas trwania eksperymentu. Kontynuuj cotygodniowe zastrzyki STZ dla jednej z grup, ponieważ kontrole DM dla drugiej grupy zaprzestają wstrzyknięć STZ i inkubują ryby w normalnej temperaturze.

W ciągu 14 dni te ryby pręgowane przywrócą prawidłową kontrolę insuliny i glukozy we krwi poprzez regenerację trzustki. Ryby te są teraz nazywane pamięcią metaboliczną lub MM, ryby w 30 dniu po odstawieniu leku amputują płetwy rozdęte ryb kontrolnych DM i MM, jak pokazano wcześniej w tym filmie, aby umożliwić wzrost metabolicznej tkanki pamięci. Przywróć ryby do normalnych warunków wodnych w celu regeneracji płetw przez 30 dni w 60 dniu.

Wykonaj drugą amputację w obrębie tkanki, która została zregenerowana w okresie od 30 do 60 dni i wykonaj test regeneracji płetwy dorszowej, wyizoluj tkankę i wykonaj interesujący Cię test. Danio pręgowany z cukrzycą typu pierwszego nie tylko wykazuje znane wtórne powikłania retinopatii i nefropatii, ale także wykazuje dodatkowe powikłanie upośledzone regenerację płetwy dorszowej, co można zobaczyć tutaj po 72 godzinach od amputacji. To powikłanie utrzymuje się z powodu pamięci metabolicznej u ryb, które przywróciły normalną kontrolę glukozy po okresie hiperglikemii, jak pokazano tutaj, ryba zebry mm wykazuje deficyt regeneracji płetw o około 40% w porównaniu z rybami kontrolnymi, a upośledzenie zaobserwowano nawet 150 dni po amputacji.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zainicjować stan hiperglikemii u danio pręgowanego, zmierzyć poziom glukozy we krwi na czczo, przeprowadzić badania regeneracji płetw i ostatecznie wygenerować pamięć metaboliczną.