Name: Izolacja, hodowla i charakterystyka funkcjonalna kardiomioktaków dorosłych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-24T18:10:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Poznaj metodę izolacji kardiomiocytów dorosłych myszy za pomocą systemu perfuzji Langendorffa. Technika ta umożliwia hodowlę, transfekcję wirusową oraz analizę funkcjonalną komórek sercowych w badaniach kardiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Chlopcikova, S., Psotová, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+rat+cardiomyocytes-a+model+for+the+study+of+morphological%2C+biochemical+and+electrophysiological+characteristics+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Papers%22%5BJournal%5D)">Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart.</a> Biomedical Papers. , (2001).</li>
<li>Rosenthal, N., Brown, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+ascending%3A+perspectives+for+human-disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The mouse ascending: perspectives for human-disease models.</a> Nat. Cell Biol. 9, 993-999 (2007).</li>
<li>Ballou, L. M., Lin, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+and+mTOR+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapamycin and mTOR kinase inhibitors.</a> J. Chem. Biol. 1, 27-36 (2008).</li>
<li>Brette, F., Orchard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Tubule+Function+in+Mammalian+Cardiac+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">T-Tubule Function in Mammalian Cardiac Myocytes.</a> Circ Res. , (2003).</li>
<li>Sakata, Y., Hoit, B., Liggett, S., Walsh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decompensation+of+pressure-overload+hypertrophy+in+G%3Fq-overexpressing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Decompensation of pressure-overload hypertrophy in G?q-overexpressing mice.</a> Circulation. , (1998).</li>
<li>Lieu, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+Transverse+Tubules+Contributes+to+Non-Uniform+Ca+2%2BWavefronts+in+Mouse+and+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Absence of Transverse Tubules Contributes to Non-Uniform Ca 2+Wavefronts in Mouse and Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Stem Cells and Development. 18, 1493-1500 (2009).</li>
<li>Lim, H., De Windt, L., Mante, J., Kimball, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+cardiac+hypertrophy+in+transgenic+disease+models+by+calcineurin+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Reversal of cardiac hypertrophy in transgenic disease models by calcineurin inhibition.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 32 (4), 697-709 (2000).</li>
<li>Muthuchamy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+a+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+mutation+in+alpha-tropomyosin+manifests+cardiac+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse model of a familial hypertrophic cardiomyopathy mutation in alpha-tropomyosin manifests cardiac dysfunction.</a> Circ. Res. 85, 47-56 (1999).</li>
<li>Müller, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+the+cardiac+sodium+calcium+exchanger+promoter+in+adult+and+neonatal+cardiomyocytes+by+Nkx2.5+and+serum+response+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 34, 807-821 (2002).</li>
<li>Epstein, F., Hunter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+for+cardiac+hypertrophy+and+failure%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways for cardiac hypertrophy and failure.</a> New England Journal of Medicine. 341 (17), 1276-1283 (1999).</li>
<li>Snopko, R., Aromolaran, A., Karko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+modifies+Ca+2%2B+signaling+during+excitation-contraction+coupling+in+neonate+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Cell culture modifies Ca 2+ signaling during excitation-contraction coupling in neonate cardiac myocytes.</a> Cell Calcium. , (2007).</li>
<li>Ranu, H., Terracciano, C., Davia, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Na%2B%2FCa2%2B-exchanger+overexpression+on+excitation-contraction+coupling+in+adult+rabbit+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Effects of Na+/Ca2+-exchanger overexpression on excitation-contraction coupling in adult rabbit ventricular myocytes.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 34 (4), 389-400 (2002).</li>
<li>Kaab, S., Nuss, H. B., Chiamvimonvat, N., O'Rourke, B., Pak, P. H., Kass, D. A., Marban, E., Tomaselli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+mechanism+of+action+potential+prolongation+in+ventricular+myocytes+from+dogs+with+pacing-induced+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Ionic mechanism of action potential prolongation in ventricular myocytes from dogs with pacing-induced heart failure.</a> Circ. Res. 78 (2), (1996).</li>
<li>Splawski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+of+SCN5A+sodium+channel+implicated+in+risk+of+cardiac+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Variant of SCN5A sodium channel implicated in risk of cardiac arrhythmia.</a> Science. 297, 1333-1336 (2002).</li>
<li>Zhou, Y., Wang, S., Zhu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+adenoviral+infection+of+adult+mouse+cardiac+myocytes%3A+methods+for+cellular+genetic+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279 (1), 429-436 (2000).</li>
<li>Sussman, M., Lim, H., Gude, N., Taigen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+cardiac+hypertrophy+in+mice+by+calcineurin+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition.</a> Science. , (1998).</li>
<li>Heinzel, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+diazoxide-induced+formation+of+reactive+oxygen+species+and+loss+of+cardioprotection+in+connexin+43+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Impairment of diazoxide-induced formation of reactive oxygen species and loss of cardioprotection in connexin 43 deficient mice.</a> Circ. Res. 97, 583-586 (2005).</li>
<li>Li, X., Heinzel, F. R., Boengler, K., Schulz, R., Heusch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+connexin+43+in+ischemic+preconditioning+does+not+involve+intercellular+communication+through+gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Role of connexin 43 in ischemic preconditioning does not involve intercellular communication through gap junctions.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 36, 161-163 (2004).</li>
<li>Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J., Chein, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+atrial-specific+and+inducible+expression+of+an+atrial+natriuretic+factor+transgene+in+an+in+vivo+murine+model+of+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).</li>
<li>Nakamura, A., Rokosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LV+systolic+performance+improves+with+development+of+hypertrophy+after+transverse+aortic+constriction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">LV systolic performance improves with development of hypertrophy after transverse aortic constriction in mice.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281 (3), 1104-1112 (2001).</li>
<li>Boström, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PGC1-%3F-dependent+myokine+that+drives+brown-fat-like+development+of+white+fat+and+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A PGC1-?-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis.</a> Nature. 481, 463-468 (2012).</li>
<li>Liao, R., Jain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+analysis+of+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional analysis of adult mouse cardiomyocytes.</a> Methods Mol. Med. 139, 251-262 (2007).</li>
<li>Volz, A., Piper, H. M., Siegmund, B., Schwartz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+of+adult+ventricular+rat+heart+muscle+cells+in+serum-free+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Longevity of adult ventricular rat heart muscle cells in serum-free primary culture.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 23, 161-173 (1991).</li>
<li>Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. -S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuatimosim%2C+S+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. 689, Humana Press. 205-214 (2010).</li>
<li>Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+Clamp+and+Perfusion+Techniques+for+Studying+Ion+Channels+Expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes.</a> J. Vis. Exp. (47), e2269(2011).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+Clamp+Recording+of+Ion+Channels+Expressed+in+Xenopus+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes.</a> J. Vis. Exp. (20), e936(2008).</li>
<li>Arman, A. C., Sampath, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+Clamp+Recordings+from+Mouse+Retinal+Neurons+in+a+Dark-adapted+Slice+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation.</a> J. Vis. Exp. (43), e2107(2010).</li>
<li>Wen, H., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+patch+clamp+recordings+from+motor-neuron+and+target+skeletal+muscle+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Paired patch clamp recordings from motor-neuron and target skeletal muscle in zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (45), e2351(2010).</li>
<li>Maier, S., Westenbroek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpected+role+for+brain-type+sodium+channels+in+coupling+of+cell+surface+depolarization+to+contraction+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An unexpected role for brain-type sodium channels in coupling of cell surface depolarization to contraction in the heart.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (6), 4073-4078 (2002).</li>
<li>Shroff, S. G., Saner, D. R., Lal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+micromechanical+properties+of+cultured+rat+atrial+myocytes+measured+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic micromechanical properties of cultured rat atrial myocytes measured by atomic force microscopy.</a> Am. J. Physiol. 269, 286-292 (1995).</li>
<li>Domke, J., Parak, W. J., George, M., Gaub, H. E., Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+mechanical+pulse+of+single+cardiomyocytes+with+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope.</a> European Biophysics Journal. 28, 179-186 (1999).</li>
<li>Smith, B. A., Tolloczko, B., Martin, J. G., Grütter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+Viscoelastic+Behavior+of+Cultured+Airway+Smooth+Muscle+Cells+with+Atomic+Force+Microscopy%3A+Stiffening+Induced+by+Contractile+Agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Probing the Viscoelastic Behavior of Cultured Airway Smooth Muscle Cells with Atomic Force Microscopy: Stiffening Induced by Contractile Agonist.</a> Biophysical Journal. 88, 2994-3007 (2005).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W niniejszym raporcie opisaliśmy techniki niezbędne do skutecznej izolacji i hodowli dorosłych CM z serca myszy. Nasza technika pozwala na późniejsze badanie funkcji CM i pobudliwości przy użyciu metod opisanych powyżej. Krytycznym parametrem dla badania funkcjonalności dorosłych CM jest zdrowie i jakość izolowanych CM. Jak opisano powyżej, nasze techniki pozwalają na uzyskanie wysokiej wydajności funkcjonalnych komórek, które są podatne na manipulację ekspresją genów przy użyciu infekcji adenowirusowych/lentiwirusowy...

Mysie modele chorób sercowo-naczyniowych posłużyły jako skuteczne narzędzia do wyjaśnienia podstawowych mechanizmów choroby1,2, jak również do identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych1,3. W szczególności wykorzystanie zarówno mysich modeli nabytych chorób serca (takich jak przeciążenie ciśnienie)4,5, jak i transgenicznych modeli myszy pogłębiło naszą wiedzę na temat chorób serca6-8. Zastosowanie technik hodowli komórkowych do badania kaskad sygnałowych3,9,10 i zmian w poszczególnych białkach, które leżą u podstaw pobudliwości komórkowej i sprzężenia pobudzenie-skurcz w sercu11-13 na poziomie pojedynczej komórki, uzupełniło modele myszy in vivo. Jednak brak odpowiednich linii komórkowych, które odzwierciedlałyby strukturę i funkcję dorosłego CM, był znaczącym ograniczeniem. Badacze starali się przezwyciężyć ten problem, badając pojedyncze białka, takie jak kanały jonowe, w heterologicznych systemach ekspresji14 i chociaż badania te dostarczyły nam użytecznych informacji w zakresie biofizyki kanałów jonowych lub transportu białek, nieodpowiednia reprezentacja natywnego mikrośrodowiska CM jest znaczącym ograniczeniem. Po drugie, ponieważ większość tych heterologicznych komórek nie ma dojrzałego aparatu skurczowego, nie było możliwe zbadanie funkcji skurczowej i złożonej zależności między pobudliwością komórkową a skurczem. Z tego powodu naukowcy zwrócili się do pierwotnych hodowli komórek serca w wielu swoich badaniach funkcjonalnych in vitro. Wreszcie, izolowane badania kardiomiocytów pozwalają na ocenę funkcji skurczowej bez czynników zakłócających preparatu wielokomórkowego, w tym wpływu blizny lub zwłóknienia i orientacji włókien.
Pierwotne kardiomiocyty komorowe noworodków szczurów (NRVM) są stosunkowo łatwe do hodowli, mogą być infekowane adenowirusami i lentiwirusami do manipulowania ekspresją genów15, dlatego były z powodzeniem stosowane1, ale mają swoje własne ograniczenia. Chociaż zapewniają one fizjologiczne mikrośrodowisko1 i są koniem pociągowym pola sygnalizacyjnego, znaczne różnice między morfologią i organizacją subkomórkową NRVM i dorosłych kardiomioktaków sprawiają, że są one nieodpowiednim modelem do badania strumieni jonowych i sprzężenia wzbudzenie-skurcz w dorosłym sercu. W szczególności NRVM nie mają definitywnego podsystemu t-rurowego4. Ponieważ strumień i dynamika Ca2 + są krytycznie zależne od dojrzałej struktury kanalików t i siateczki sarkoplazmatycznej (SR)6, dynamika Ca2 + i badania funkcjonalne kurczliwości serca w NRVM nie są dokładnym odzwierciedleniem tych krytycznych procesów w dorosłych kardiomiocytach. Co więcej, niektóre składniki szlaków sygnałowych różnią się między noworodkami i dorosłymi myszami9, co stanowi kolejne ograniczenie w badaniu procesów chorobowych i ich wpływu na pobudliwość komórkową i kurczliwość w NRVM. Wreszcie, rozkład maszynerii kurczliwej prowadzi do wielokierunkowego i niejednorodnego skracania komórek, co ogranicza dokładność pomiarów kurczliwości.
Użycie izolowanych dorosłych kardiomiocytów zapewnia zatem dokładniejszy system modelowania in vitro. Niezwykły wzrost wiedzy, który stał się możliwy dzięki manipulacjom genetycznym na myszach, podkreśla znaczenie uzyskania funkcjonalnych izolowanych kardiomiocytów od myszy. W rzeczywistości charakterystyka dorosłych CM wyizolowanych z modeli mysich rzuciła światło na wiele zdarzeń biologicznych i patologicznych. Wyizolowane CM z transgenicznych modeli myszy pozwoliły na badania przyrostu lub utraty funkcji białek na właściwości kurczliwe pojedynczych komórek2,16 oraz żywotności w modelach chorób, takich jak niedokrwienie/reperfuzja17,18, uzupełniając w ten sposób informacje uzyskane z badań in vivo na tych myszach. Zastosowanie izolowanych dorosłych CM z mysich modeli nabytej choroby serca3,19,20 (takich jak przeciążenie ciśnieniowe wywołane zwężeniem poprzecznym aorty, które naśladuje nadciśnienie lub zwężenie zastawki aortalnej) lub ćwiczenia5,21 (do modelowania przerostu fizjologicznego) pozwala na zbadanie interakcji kaskad sygnałowych zaangażowanych w te procesy z pobudliwością komórkową i sprzężeniem wzbudzenie-skurcz na poziomie pojedynczej komórki. Co więcej, możliwość manipulowania ekspresją genów za pomocą ekspresji genów sterowanych przez adenowirusy w dorosłych CM daje nam możliwość przeanalizowania składników złożonych szlaków sygnałowych. 
Z punktu widzenia elektrofizjologicznego, eksperymenty z napięciem i prądem w całych ogniwach na izolowanych dorosłych CM były kluczowe w wyjaśnieniu natury strumieni jonowych na linii wyjściowej i w różnych stanach chorobowych. Ze względu na złożoną strukturę błony komórkowej i zróżnicowane struktury rusztowań białkowych między dorosłymi CM i NRVM lub heterologicznymi liniami komórkowymi, zdolność do łatania dorosłych komórek daje znacznie lepszą reprezentację wpływu niektórych białek błonowych, białek strukturalnych i partnerów oddziałujących z kanałami jonowymi na elektrofizjologiczne składniki dorosłego serca. 
Pomimo tak znaczących zalet w badaniu dorosłych kardiomiocytów myszy, izolowanie i hodowla kardiomiocytów dorosłych myszy było wyzwaniem, co wymaga systematycznego i dokładnego opisu metodologii izolowania żywotnych kardiomiocytów myszy i utrzymywania ich w hodowli, aby umożliwić dalszą manipulację genetyczną za pomocą wektorów wirusowych. W poprzednich badaniach stosowano albo ostro izolowane dorosłe CM myszy, albo hodowane dorosłe CM szczurów. Te ostatnie są łatwiejsze do hodowli niż dorosłe myszy CM, a większość eksperymentów manipulujących ekspresją genów in vitro wykorzystywała CM dorosłych szczurów. Niewiele badań z powodzeniem zmieniło i zbadało funkcjonalną ekspresję genów u dorosłych CM myszy, co stanowi duże ograniczenie w zakresie eksperymentów. Dlatego tutaj szczegółowo przedstawiamy takie metodologie, zmodyfikowane w stosunku do poprzednich badań, dla izolacji7,8,22, hodowli3,10,15,23, infekcji adenowirusowej11-13,15 oraz analizy funkcjonalnej kardiomioktionów komorowych dorosłych myszy. Ten protokół izolacji skutkuje tolerancyjnymi, pobudliwymi kardiomiocytami tolerującymi Ca2+, które z powodzeniem hodowaliśmy przez okres do 72 godzin i przejściowo transfekowaliśmy adenowirusem. Funkcjonalność tych izolowanych komórek można ocenić za pomocą systemu obrazowania MMSYS14,24 i patch clamp, które również zostaną omówione.

<table><tbody><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza minimalna</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Monoksym 2,3-butanodionu</td><td>Sigma</td><td>B0752</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza B</td><td>Roche Nauki stosowane</td><td>11088807001</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza D</td><td>Roche Nauki stosowane</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza XIV ze Streptomyces griseus</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Albumina z surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Minimum niezbędnych pożywek</td><td>Sigma</td><td>51411C</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór albuminy z surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka z seleninu insuliny-transferyny sodu suplement</td><td>Sigma</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek cezu</td><td>Sigma</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/289329?lang=en&amp; region=US" target="_blank">289329</a></td><td></td></tr><tr><td>Glutaminian</td><td>Sigma</td><td>G3291</td><td></td></tr><tr><td>Sól magnezowa adenozyny 5'-trifosforanu</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy-bis(2-aminowy&#8211; kwas N,N,N',N'-tetraoctowy</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku cezu</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wodorotlenku tetraetyloamonu</td><td>Sigma</td><td>86643</td><td></td></tr><tr><td>Szklany wizjer lornetkowy OptiVisor</td><td>Dohegan Optical Company Inc.</td><td></td><td>Nie dotyczy</td></tr><tr><td>Kleszczyki do tkanek, 5,5", 1x2 zęby</td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-8164</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Moloney - 4,5" (11,5 cm) długości lekkiej krzywizny, ząbkowane </td><td>Kleszcze Roboz Scientific</td><td>RS-8254</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3, Dumostar, rozmiar końcówki 0,17 x 0,10 mm</td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-4966</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do komarów Packer 5" Proste płaskie</td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-7114</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do mikro preparacji 4,5 "Zakrzywione Ostre / Ostre </td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-5917</td><td></td></tr><tr><td>Mikro nożyczki preparacyjne 3,5" Proste Ostre / Ostre20mm</td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-5907</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja, hodowla i charakterystyka funkcjonalna kardiomioktaków dorosłych myszy

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

Użycie pierwotnych kardiomiocytów (CM) w hodowli dostarczyło potężnego uzupełnienia mysich modeli chorób serca w pogłębianiu naszego zrozumienia chorób serca. W szczególności możliwość badania homeostazy jonów, funkcji kanałów jonowych, pobudliwości komórkowej i sprzężenia pobudzenie-skurcz oraz ich zmian w stanach chorobowych i mutacjach powodujących chorobę doprowadziła do istotnych informacji na temat chorób serca. Co więcej, brak odpowiedniej, unieśmiertelnionej linii komórkowej do naśladowania dorosłych CM oraz ograniczenia CM noworodków (którym brakuje wielu strukturalnych i funkcjonalnych biomechanik charakterystycznych dla dorosłych CM) w hodowli utrudniły nam zrozumienie złożonej zależności między szlakami sygnałowymi, kanałami jonowymi i właściwościami skurczowymi w dorosłym sercu, wzmacniając znaczenie badania dorosłych izolowanych kardiomiocytów. W tym miejscu przedstawiono metody izolacji, hodowli, manipulacji ekspresją genów przez białka ulegające ekspresji adenowirusa, a następnie analizy funkcjonalnej kardiomiocytów dorosłej myszy. Zastosowanie tych technik pomoże rozwinąć mechanistyczny wgląd w szlaki sygnałowe, które regulują pobudliwość komórkową, dynamikę Ca2 + i kurczliwość oraz zapewnią znacznie bardziej fizjologicznie istotną charakterystykę chorób sercowo-naczyniowych.

Izolacja dorosłych kardiomiocytów pozwala na uzyskanie komórek o kształcie pręcikowatym, prążkowanych i spoczynkowych (niebijących samoistnie) (Rycina 5A). Martwe komórki będą miały kształt kulisty i nie będą wykazywać prążkowania. Komórki spoczynkowe można hodować i transfekować adenowirusami w celu manipulacji ekspresją genów (Ryciny 5B oraz 5C). Po 24 h hodowli morfologia żywych komórek nie ulega zmianie, pozostają one tolerancyjne na Ca2+ i mogą być stymul...

Tutaj opisujemy izolację dorosłych kardiomioktyesów myszy za pomocą systemu perfuzyjnego Langendorffa. Powstałe komórki tolerują Ca2+, są elektrycznie uśpione i mogą być hodowane i transfekowane adeno- lub lentiwirusami w celu manipulowania ekspresją genów. Ich funkcjonalność może być również analizowana za pomocą systemu MMSYS i technik zacisków krosowych.

Izolacja, hodowla i charakterystyka funkcjonalna kardiomioktaków dorosłych myszy

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie hodowli oraz wizualizacja skurczu i gospodarki wapniowej w dojrzałych kardiomiocytach lustrzanych. Osiąga się to poprzez najpierw usunięcie serca mysiego i umieszczenie go w PBS w temperaturze pokojowej; serce może zostać kaniulowane w naczyniu, jak pokazano na schemacie, lub bezpośrednio na igle przymocowanej do systemu perfuzyjnego, tak jak w filmie.Trzecim krokiem jest przemycie i trawienie serca poprzez pompowanie perfuzatu, buforu, a następnie buforu enzymatycznego przez układ. Ostatnim etapem jest wycięcie komór do naczynia z buforem transferowym i delikatne posiekanie tkanki pęsetą. Ostatecznie wyniki mogą wykazywać skurcz pojedynczych kardiomiocytów oraz gospodarkę wapniową za pomocą pomiarów całej komórki i/lub długości sarkomeru oraz analizy ratiometrycznej.Wskaźniki wapnia, takie jak RO 2:00 AM, z systemem Ion Optic. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą zazwyczaj napotykają trudności, ponieważ szybkie zawieszenie serca za aortę bez uszkodzenia naczynia lub samego serca może być problematyczne. Wstrzyknij dorosłym myszom w wieku około 12 tygodni 150 USP heparyny sodowej do jamy brzusznej.Jeśli mysz jest odwodniona, należy wstrzyknąć 1 cc roztworu soli fizjologicznej. Mysz znieczula się poprzez wstrzyknięcie mieszaniny ketaminy i ksylazyny w dawce zależnej od masy ciała. Następnie sprawdza się, czy myszy znajdują się w stanie głębokiej narkozy, weryfikując zanik odruchu na uciśnięcie palca tylnej kończyny oraz spowolnienie częstości oddechów. Uspokojoną mysz unieruchamia się na podkładce operacyjnej, następnie wycina serce i umieszcza je w naczyniu z solą fizjologiczną.Używając gogli do mikrodissekcji opti vision, zidentyfikuj i odsłoń aortę. Usunięcie tkanki wokół aorty nie jest wymagane do izolacji komórek. Gdy tylko korzeń aorty będzie wyraźnie widoczny, przygotuj pompę, przepuszczając przez nią bufor perfuzyjny.Rozpocznij pompowanie z dużą prędkością, aby wypełnić przewody i sprawdzić, czy nie ma w nich pęcherzyków powietrza. Następnie pompuj z małą prędkością, aby ustawić szybkość przepływu dla perfuzji serca. Użyj łaźni wodnej z cyrkulacją, aby utrzymać temperaturę buforu perfuzyjnego na poziomie 37 °C.Za pomocą pęsety mikrodisekcyjnej nałóż aortę na igłę w sposób przypominający nakładanie skarpetki. Upewnij się, że koniec igły spoczywa w aorcie wstępującej, najlepiej w pierścieniu aorty dystalnie względem pnia ramienno-głowowego. Następnie przymocuj serce do igły, zawiązując 10 centymetrów nici jedwabnej wokół górnej części aorty.Należy upewnić się, że wiązanie znajduje się na poziomie aorty wstępującej, poniżej prawej tętnicy bezimiennej, ale jednocześnie powyżej końca igły i powyżej zastawki aortalnej. Teraz należy opuścić serce do wnętrza kolby stożkowej. Pomaga to w utrzymaniu temperatury otoczenia.Przez pięć minut przepłukuj serce buforem perfuzyjnym z prędkością 1 ml/min, zamykając odpływ z komory szklanej, aby ciecz zebrała się w stożkowej części naczynia i otoczyła serce. W tym momencie powinna być widoczna zwiększona objętość serca. Ponadto krew w tkance serca zostanie zastąpiona buforem, co spowoduje bladość tkanki.Zatrzymaj pompę, aby przenieść dren z pojemnika z buforem perfuzyjnym do pojemnika z buforem enzymatycznym. Zwolnij zacisk odpływowy, aby opróżnić PERFU eight. Uruchom pompę ponownie, aby rozpocząć perfuzję serca.Przy przepływie buforu enzymatycznego wynoszącym 1 ml/min, ponownie zacisnąć odpływ, aby bufor enzymatyczny mógł otoczyć serce. Podczas gdy enzym przepływa przez serce i trawi tkankę łączną, serce stanie się blade, a jego integralność strukturalna ulegnie zmniejszeniu. Dla osób początkujących pomocne może być podłączenie linii perfuzyjnej do manometru.Manometru można również użyć do upewnienia się, że igła znajduje się powyżej zastawki aorty, a nie w komorze. Niskie ciśnienie wskazuje, że igła znajduje się w jamie komory, natomiast wysokie ciśnienie oznacza, że igła dotyka zastawki. W miarę trawienia serca ciśnienie będzie gwałtownie spadać, ponieważ tkanka łączna przestaje stawiać opór.Aby ustalić moment wycięcia komór z trawionego serca, wyjmij serce ze szklanego stożka, delikatnie uciśnij je pęsetą i zbierz kilka kropli PERFU eight do małej płytki Petriego w celu sprawdzenia. Jeśli pojedyncze komórki zaczynają wypadać w ciągu 8 do 10 minut, oznacza to, że ciśnienie w komorach spadło i powinny być widoczne pojedyncze komórki wnikające do Perfu. Eight. Gdy tylko zaobserwujesz którykolwiek z tych efektów, wytnij komory z serca do naczynia wypełnionego buforem transferowym A, aby uzyskać bardziej jednorodny preparat.Wyciąć i usunąć prawą komorę, pozostawiając lewą komorę do rozdrobnienia i analizy. W przypadku zainteresowania prawą komorą, można ją rozdrobnić po oddzieleniu. Używając mikropincety sekcyjnej, rozdrobnić każdą komorę osobno. Prawidłowy proces trawienia sprawi, że po rozdrobnieniu nie pozostaną niemal żadne stałe fragmenty tkanki, a większość tkanki stanie się amorficzna po dysocjacji.Aby dalej rozdzielić tkankę, przepuść ją przez plastikową pipetę Pasteura z odciętą końcówką. Pod kątem 45 stopni przymocuj za pomocą zacisków kawałek kwadratowej siatki do małego lejka i umieść ten aparat filtrujący w probówce o pojemności 15 ml. Użyj zmodyfikowanej pipety Pasteura, aby pobrać zawiesinę komórkową z naczynia i przefiltrować ją do probówki o pojemności 15 ml.Pozostaw żywe komórki do czasu, aż osiądą na dnie probówki, co zajmie kilka minut. Rozdzielenie objętości do dwóch probówek przyspiesza proces. Wirowanie w celu otrzymania osadu po etapach Ali.Odmierz 2,5 ml każdego z czterech roztworów wapnia do czterech osobnych probówek o pojemności 15 ml. Za pomocą standardowej pipety ostrożnie przenieś osiadły pellet komórkowy do pierwszego z roztworów wapnia. Pozostaw komórki do czasu, aż osiądą na dnie probówki, a następnie powtórz tę procedurę.Przenieś osadzone komórki przez każdą z kolejnych roztworów wapnia. Po przeniesieniu komórek do czwartego roztworu wapnia, zakręć probówkę i połóż ją na boku. Włącz system MM SIS, upewniając się, że w pierwszej kolejności uruchomiono lampę łukową.Następnie przygotuj system, przepuszczając przez niego bufor wapniowy B. Podłącz rurki z pompy do odpowiednich wlotów i wylotów komory MM cis. Zamocuj w komorze szkiełko cover slip o odpowiednim rozmiarze, zazwyczaj 20 by 25 mm. Przenieś 500 µL zawiesiny komórek do małej probówki typu eend orph.Dodaj 0,5 µL PHE 2:00 AM do komórek i inkubuj je w ciemności w temperaturze pokojowej przez pięć do siedmiu minut po zaciemnieniu pomieszczenia. Następnie ostrożnie rozpocznij przepływ buforu wapniowego B przez komorę. Dopiero po zainicjowaniu przepływu zacznij zwiększać temperaturę w komorze do 37 °C.Używając zmodyfikowanej pipety, nanieś jedną lub dwie krople zawiesiny komórkowej na szkiełko nakrywkę, w zależności od stężenia komórek, i poczekaj, aż komórki opadną. Gęstość komórek w komorze powinna być taka, aby pojedyncze, nie nakładające się na siebie komórki mogły być łatwo zidentyfikowane w systemie akwizycji danych.Upewnij się, że komora jest połączona z myo Pacerem za pomocą przewodów połączeniowych, a następnie zacznij ustawiać napięcie i częstotliwość dla eksperymentu. Wybierz komórkę bijącą z odpowiednią częstotliwością i przesuń ją do otworu kadrującego. Dostosuj kamerę oraz wymiary otworu kadrującego tak, aby cała komórka znajdowała się w centrum okna, była skierowana poziomo, a lustra sarkomeryczne były widoczne.Następnie umieść ramkę w obszarze komórki zawierającym wyraźnie zarysowane sarkomery i dostrój ostrość, aby zoptymalizować szczyt widma mocy. Dostosuj również jasność mikroskopu, aby zoptymalizować niebieskie okno wygładzania oraz czarną informację o kontraście. Włącz fotomnożnik i rozpocznij rejestrację.Po zarejestrowaniu odpowiedniej ilości danych kliknij pauzę, aby tymczasowo wstrzymać nagrywanie. Nie klikaj stop. Spowoduje to zakończenie nagrywania i uniemożliwi zarejestrowanie tła dla tej komórki.Teraz, nie zmieniając ostrości ani wymiarów okna obserwacyjnego, przesuń stolik mikroskopu w obszar szkiełka nakrywki, w którym nie widać komórek ani materiału komórkowego. Następnie kliknij resume, aby zarejestrować pomiar tła. Po zarejestrowaniu odpowiedniego tła kliknij stop, aby zakończyć nagrywanie.Następnie kliknij zapisz plik, aby zapisać wszystkie ślady dla tej komórki w jednym pliku ZPT. Izolacja dorosłych kardiomiocytów skutkuje uzyskaniem prętowatych, prążkowanych i spoczynkowych komórek, które nie wykazują spontanicznych skurczów; grotem strzałki wskazano zaokrąglone, martwe komórki bez prążkowania. Komórki spoczynkowe można hodować i transfekować adenowirusem w celu manipulacji ekspresją genów. Po 24 godzinach hodowli morfologia żywych komórek nie ulega zmianie.Zachowują one nadal tolerancję na wapń i mogą być stymulowane polem elektrycznym. Możliwe jest uzyskanie wydajności od 85 do 90% żywych komórek. System MM SIS został wykorzystany do pomiaru kurczliwości i przejściowych zmian stężenia wapnia w miocytach pobranych z myszy szczepu C 57 black six typu dzikiego. Jednocześnie.Pomiar kurczliwości i gospodarki wapniowej przeprowadzono poprzez pomiar stosunku form związanej do niezwiązanej fira 2:00 AM; pomiary stosunku mogą się nieznacznie różnić w zależności od układu, jednak zdrowe komórki zazwyczaj osiągają wartości między 1,5 a 2,5. W celu analizy danych z zapisów kurczliwości i wapnia, zapisy te uśredniono, aby stworzyć charakterystyczny zapis dla każdej komórki. Przy użyciu algorytmu analizy danych przejściowych mono znajdującego się w oprogramowaniu sys, z charakterystycznych zapisów wygenerowano parametry funkcji skurczowej i rozkurczowej.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować pojedyncze kardiomiocyty dorosłych organizmów morskich.

isolation-culture-functional-characterization-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja, hodowlą i charakterystyka funkcjonalna dorosłych mysich kardiomiocytów

Pierwotne hodowle kardiomiocytów myszy są jednym z kluczowych narzędzi do badania organizacji i funkcji miofibrylarów. Poniższy protokół opisuje izolację i hodowlę pierwotnych kardiomiocytów z serca noworodków myszy. Uzyskane w ten sposób kultury kardiomiocytów mogą być następnie wykorzystane do różnych testów biomechanicznych, biochemicznych i biologicznych.

Izolacja i hodowla nowonarodzonych kardiomiocytów myszy

Pojedyncze kardiomiocyty od myszy typu dzikiego i zmutowanych mogą być izolowane z serca w celu zbadania ich kurczliwości i przejściowych stanów wapnia. Pozwala to na scharakteryzowanie udziału dysfunkcji komórkowej w dysfunkcji serca z dowolnej przyczyny.

Izolacja i analiza fizjologiczna kardiomiocytów myszy

Opisujemy niezawodną metodę izolacji kardiomiocytów dorosłych myszy. Protokół ten daje spójny wynik dla hodowli funkcjonalnych dorosłych kardiomiocytów od różnych genetycznie zmodyfikowanych myszy.

Izolacja i hodowla kardiomiocytów dorosłych myszy do sygnalizacji komórkowej i przerostu serca in vitro

Ten protokół opisuje krok po kroku metodę powtarzalnej izolacji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy o wysokiej wydajności, czystości i żywotności.

Izolacja, hodowla i transdukcja kardiomiocytów dorosłych myszy

Metody izolacji miocytów węzła zatokowo-przedsionkowego (SAM) od dorosłych myszy do elektrofizjologii lub badań obrazowych. Wyizolowane komórki mogą być wykorzystywane bezpośrednio lub mogą być utrzymywane w hodowli, aby umożliwić ekspresję interesujących białek, takich jak genetycznie kodowane reportery.

Metody izolacji, hodowli i charakterystyki funkcjonalnej miocytów węzłów zatokowo-przedsionkowych od dorosłych myszy

Ogólnym celem tego artykułu jest ujednolicenie protokołu izolacji, charakterystyki i różnicowania komórek macierzystych serca (CSC) od serca dorosłej myszy. W tym miejscu opisujemy metodę wirowania w gradimencie gęstości w celu wyizolowania mysich CSC oraz opracowane metody hodowli CSC, proliferacji i różnicowania do kardiomiocytów.

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie sercowych komórek macierzystych z serca dorosłej myszy

Ten protokół jest używany do izolowania pojedynczych kardiomiocytów przedsionkowych z serca dorosłej myszy za pomocą metody trawienia fragmentów. Podejście to stosuje się do izolacji miocytów prawego lub lewego przedsionka, które można wykorzystać do scharakteryzowania elektrofizjologii miocytów przedsionków w badaniach typu patch-clamp.

Izolacja miocytów przedsionkowych od dorosłych myszy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji, transfekcji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy i szczurów.

Izolacja, transfekcja i długotrwała hodowla dorosłych kardiomiocytów myszy i szczurów

Opisano metodę jednoczesnej izolacji miocytów i nie-miocytów zarówno z przedsionków, jak i komór serca pojedynczej dorosłej myszy. Protokół ten zapewnia stałą wydajność wysoce żywotnych miocytów serca i niemiocytów oraz szczegółowo opisuje optymalne warunki hodowli specyficzne dla komórek do fenotypowania i analizy in vitro.

Jednoczesna izolacja i hodowla miocytów przedsionkowych, miocytów komorowych i niemiocytów z serca dorosłej myszy

Złotym standardem w kardiologii dla komórkowych i molekularnych eksperymentów funkcjonalnych są kardiomiocyty. W artykule opisano adaptacje techniki innej niż Langendorff do izolowania kardiomiocytów myszy.

Prosta i skuteczna metoda konsekwentnego izolowania kardiomiocytów myszy

Poznaj metodę izolacji kardiomiocytów dorosłych myszy za pomocą systemu perfuzji Langendorffa. Technika ta umożliwia hodowlę, transfekcję wirusową oraz analizę funkcjonalną komórek sercowych w badaniach kardiologii.

Izolacja, hodowla i charakterystyka funkcjonalna kardiomioktaków dorosłych myszy

Przeglądaj więcej filmów