Name: Możliwe do leczenia infekcje komórek ssaków bakteriami zaszczepionymi przez pierwotniaki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Poznaj metodę izolacji i kwantyfikacji bakterii Legionella mala z komórek pierwotniaków do zakażenia komórek ssaków. Technika ta wykorzystuje fluorescencję GFP i cytometrię przepływową do pomiaru zakażenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Craigowi Royowi i dr Dario Zamboni za dostarczenie szablonu do infekcji komórek pierwotniaków. Dziękujemy dr Jagdeepowi Obhrai, dr Georgianie Purdy, dr Fredowi Heffronowi i Toddowi Wisnerowi za sprzęt i odczynniki; Dr Lulu Cambronne za krytyczną recenzję manuskryptu. Cytometrię przepływową wykonano w obiekcie OHSU Flow Cytometry Shared Resource. Praca ta była częściowo wspierana przez grant z Fundacji Badań Medycznych Oregonu oraz grant NIH R21 AI088275 (EDC).

1. Przygotowanie kultur Legionella pneumophila do fazy początkowej infekcji
<ol>
	<li>Przekształć wszystkie szczepy L. pneumophila użyte w teście za pomocą plazmidu pAM239, kodującego indukowane izopropylem białko zielonej fluorescencji (GFP) β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG)28. Szczepy bakterii należy umieścić na agarze z dodatkiem azotu i cysteiny N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfonowym (ACES) buforowanym ekstraktem drożdżowym z węgla drzewnego (CYEA) zawierającym 6,25 μg/ml chloramfenikolu (CM) (do utrzymania plazmidu) i inkubować przez 72 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przenieść inokulum szczepu bakteryjnego do wzbogaconego bulionu z buforowanym ekstraktem drożdżowym ACES (AYE) o stężeniu 6,25 μg/ml CM i 1 mM IPTG i hodować do fazy stacjonarnej (O/N) na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Potwierdź ekspresję GFP w hodowlach in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Przenieś 10 μl kultury na szkiełko podstawowe pod szkiełkiem nakrywkowym i zobrazuj za pomocą obiektywu 60X z kostką wzbudzenia / emisji GFP (AMG EVOS FL).</li>
	<li>Rozcieńczyć 100 μl podwielokrotności każdej kultury in vitro w stosunku 1:10 przy użyciu sterylnegoH2O. Wykonać ślepą próbę przy użyciu 100 μl pożywki AYE z 1 mM IPTG i 6,25 μg/ml cm i wodą. Wykonaj pomiary OD600 rozcieńczeń za pomocą spektrofotometru (Bio-Rad Smart Spec Plus). Obliczyć objętość niezbędną do zakażenia studzienki przy MOI = 20 dla każdej kultury in vitro: V = [(wysiewane przez amebę) x MOI]/[OD600 x (współczynnik rozcieńczenia) x (stały)] = [(1 X 106) x (20)]/[OD600 x (10) x (1 x 106)] = 2/OD600. Stężenie bakterii określa się jako OD600 = 1,0 = 1 x 109 jtk/ml.</li>
</ol>
2. Etap przygotowania infekcji za pomocą Acanthamoeba castellanii
<ol>
	<li>Utrzymuj i hoduj ameby w podłożu ATCC 712 PYG w kolbach o długości 175cm2 w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wymień pożywkę w kulturach ameb na 24 godziny przed rozpoczęciem płynnych kultur bakteryjnych. Tego samego dnia rozpoczyna się płynne hodowle bakterii, zbiera się i liczy komórki pod mikroskopem świetlnym za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Rozcieńczyć ameby świeżą pożywką do końcowego stężenia 1 x 106 komórek/ml. Zasiać 12-dołkowe płytki do hodowli komórkowych z 1 ml podwielokrotności ameb za pomocą powtórnego pipetora i inkubować w temperaturze RT O/N.</li>
	<li>Po inkubacji przemyć studzienki 12-dołkowych płytek do hodowli komórkowych 3x 1 ml sterylnego PBS za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i ręcznego przyrządu do pipetowania.</li>
	<li>Po aspiracji PBS dodać 1 ml pożywki infekcyjnej (pożywka ATCC 712 PYG minus glukoza, pepton i ekstrakt drożdżowy) z 1 mM IPTG i 6,25 μg/ml cm do każdej studzienki. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Infekuj studnie przy MOI = 20. Odwirować płytkę o sile 400 x g przez 5 minut (Eppendorf 5810R) i zanurzyć w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5 minut. Przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 18 godzin.</li>
	<li>Potwierdź infekcje za pomocą obrazowania żywych komórek pod mikroskopem fluorescencyjnym przed lizą komórek gospodarza i zbiorem bakterii.</li>
</ol>
3. Wysiewanie komórek THP-1 do infekcji w docelowym stadium komórkowym
<ol>
	<li>(Rozpocznij ten proces 24 godziny przed założeniem płynnych kultur bakterii). Hoduj komórki THP-1 w kolbach hodowlanych o powierzchni 75cm2 do prawie konfluencji w pożywce RPMI 1640 z 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS).</li>
	<li>Policz komórki zawiesiny za pomocą hemocytometru, rozcieńczyć komórki THP-1 w pożywce RPMI 1640 z 10% FBS i 100 ng/ml octanu forbolu-12-mirystynianianu 13 (PMA) do stężenia 1 x 106 komórek/ml i rozłożyć podwielokrotności 1 ml na 12-dołkowych płytkach do hodowli komórkowych. Inkubować płytki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
</ol>
4. Przetwarzanie bakterii w celu zakażenia w stadium komórki docelowej po infekcji w fazie początkowej
<ol>
	<li>Odessać pożywkę z zagruntowanych ameb.</li>
	<li>Poddać ameby lizie przy użyciu 500 μl lodowatego, sterylnego ultrafiltrowanego (UF)H2Oi inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Połączyć lizaty zgodnie z typem szczepu i wykonać pomiar E512 nm dla każdego z połączonych lizatów za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych (Molecular Devices Spectramax Gemini EM).</li>
	<li>Obliczyć pomiar OD600 dla zbiorczych lizatów: calcOD600 = 0,0008 (E512 - tło lizatu) + 0,0019. Wzór został wcześniej określony przez wykres bezpośredniego porównania pomiarów OD600 i E512 nm rozcieńczeń L. pneumophila typu dzikiego eksprymującego GFP z hodowli in vitro w fazie stacjonarnej (Figura 1*). Lizaty niezakażonej ameby, poddane tym samym warunkom doświadczalnym co zakażona ameba, są używane jako ślepa próba i otrzymują wartość korygującą (np. tło lizatu), która została włączona do równania. Objętość niezbędną do zakażenia studzienki przy MOI = 20 oblicza się dla każdej puli lizatu: V = [(THP-1 wysiewany) x MOI] / [calcOD600 x (stały)] = [(1 X 106) x (20)] / [calcOD600 x (1 x 106)] = 20 / calcOD600.</li>
	<li>Umyj ogniwa THP-1 3x PBS i dodaj 1 ml świeżego RPMI 1640 (10% FBS) do każdej studzienki. Inkubować komórki THP-1 przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Zainfekuj komórki THP-1 w obliczonym MOI za pomocą połączonych lizatów. Pozwól, aby zestaw studzienek pozostał niezainfekowany, służąc jako kontrola ujemna do analizy cytometrii przepływowej. Przetwarzanie etapu gruntowania powinno zostać zakończone w czasie krótszym niż 30 minut. Lizaty są trzymane na lodzie, aby ograniczyć wszelkie zmiany w ekspresji genów bakteryjnych przed zakażeniem.</li>
	<li>Odwirować płytkę, wypłynąć w celu podniesienia temperatury i inkubować jak w fazie zalewania.</li>
	<li>Godzinę po zakażeniu usuń pożywkę przez aspirację i przemyj studzienki 3x PBS w celu usunięcia bakterii zewnątrzkomórkowych.</li>
	<li>Dodać 1 ml świeżego RPMI 1640 (10% FBS) do studzienek i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze. Czas następujący bezpośrednio po wymianie nośnika służy jako czas zerowy (T0). Inkubować komórki THP-1 przez 14-16 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
</ol>
5. Analiza eksperymentalna
5.1 Obrazowanie żywych komórek
Zobrazuj zainfekowane studnie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (AMG EVOS fl) przy powiększeniu 10X lub 20X (Rysunki 1A-D). Obrazy mogą być porównywane jakościowo lub ilościowo w celu określenia poziomów infekcji zarówno w fazie priming, jak i w fazie komórek docelowych.
5.2 Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Szczyty emisji różnych zakażeń można porównać za pomocą cytometrii przepływowej (BD FACS Calibur). Trypsynizuj zainfekowane komórki THP-1 i delikatnie umyj je ze studzienek, mieszając z PBS za pomocą pipety.</li>
	<li>Połącz komórki według rodzaju szczepu w 15-mililitrowych probówkach Falcon i osadzaj w ilości 1 800 x g przez 2 minuty w wirówce stołowej.</li>
	<li>Zawiesić granulki w 1 ml PBS i przenieść do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Odwirować zawiesiny o stężeniu 1 800 x g (Eppendorf 5424) i ponownie zawiesić granulki w 1 ml PBS. Jeżeli powstałe zawiesiny są silnie mętne (OD600 ≥ 1,0), należy je rozcieńczyć w dodatkowym PBS (1:3), aby zapobiec zatykaniu się przewodów w cytometrze przepływowym.</li>
	<li>Użyć sterylnego, przefiltrowanego PBS do zrównoważenia cytometru przepływowego oraz do etapów płukania między wstrzyknięciami próbki. Wykreślić rozrzut do przodu / na boki niezakażonych komórek docelowych przed wstrzyknięciem próbek infekcji komórek docelowych.</li>
	<li>Zbierz łącznie 20 000 zdarzeń dla każdego stanu za pomocą wzbudzenia laserowego 488 nm i kanału FL1.</li>
	<li>Bramkować populacje komórek po wychwyceniu, aby wykluczyć niezakażone komórki i wykreślić intensywność fluorescencji na histogramie (FlowJo) (Figura 1E).</li>
</ol>
5.3 Poszycie CFU
<ol>
	<li>Zbadanie skuteczności infekcji poprzez posiewanie CFU komórek pobranych do cytometrii przepływowej. Przygotować seryjne rozcieńczenia próbek w ultrafiltrowanymH2Ow stężeniach 10-1, 10-2 i 10-3.</li>
	<li>Umieścić 20 μl każdego rozcieńczenia na 1/3 płytki CYEA o stężeniu 6,25 μg/ml CM.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 72 godziny.</li>
	<li>Policz kolonie za pomocą wykałaczki i licznika komórek.</li>
</ol>

<ol><li>Mahan, M. J., Slauch, J. M., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+bacterial+virulence+genes+that+are+specifically+induced+in+host+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues.</a> Science. 259, 686-688 (1993).</li>
<li>Mahan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic-based+selection+for+bacterial+genes+that+are+specifically+induced+during+infection+of+a+host%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antibiotic-based selection for bacterial genes that are specifically induced during infection of a host.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 669-673 (1995).</li>
<li>Rankin, S., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Legionella+pneumophila+promoters+regulated+by+the+macrophage+intracellular+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Agents+Dis%22%5BJournal%5D)">Identification of Legionella pneumophila promoters regulated by the macrophage intracellular environment.</a> Infect. Agents Dis. 2, 269-271 (1993).</li>
<li>Rankin, S., Li, Z., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-induced+genes+of+Legionella+pneumophila%3A+protection+from+reactive+intermediates+and+solute+imbalance+during+intracellular+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Macrophage-induced genes of Legionella pneumophila: protection from reactive intermediates and solute imbalance during intracellular growth.</a> Infect. Immun. 70, 3637-3648 (2002).</li>
<li>Fields, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+ecology+of+legionellae%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The molecular ecology of legionellae.</a> Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).</li>
<li>Cirillo, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+growth+in+Acanthamoeba+castellanii+affects+monocyte+entry+mechanisms+and+enhances+virulence+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Intracellular growth in Acanthamoeba castellanii affects monocyte entry mechanisms and enhances virulence of Legionella pneumophila.</a> Infect. Immun. 67, 4427-4434 (1999).</li>
<li>Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Legionella+pneumophila+in+Acanthamoeba+castellanii+enhances+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii enhances invasion.</a> Infect. Immun. 62, 3254-3261 (1994).</li>
<li>Faucher, S. P., Mueller, C. A., Shuman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella+pneumophila+Transcriptome+during+Intracellular+Multiplication+in+Human+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Legionella pneumophila Transcriptome during Intracellular Multiplication in Human Macrophages.</a> Front Microbiol. 2, 60(2011).</li>
<li>Kilvington, S., Price, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+Legionella+pneumophila+within+cysts+of+Acanthamoeba+polyphaga+following+chlorine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Survival of Legionella pneumophila within cysts of Acanthamoeba polyphaga following chlorine exposure.</a> J. Appl. Bacteriol. 68, 519-525 (1990).</li>
<li>King, C. H., Shotts, E. B., Wooley, R. E., Porter, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+coliforms+and+bacterial+pathogens+within+protozoa+during+chlorination%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Survival of coliforms and bacterial pathogens within protozoa during chlorination.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 3023-3033 (1988).</li>
<li>Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+novel+phagosome+by+the+Legionnaires%27+disease+bacterium+%28Legionella+pneumophila%29+in+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Formation of a novel phagosome by the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes.</a> J. Exp. Med. 158, 1319-1331 (1983).</li>
<li>Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+of+the+Legionnaires%27+disease+bacterium+%28Legionella+pneumophila%29+occurs+by+a+novel+mechanism%3A+engulfment+within+a+pseudopod+coil%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis of the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) occurs by a novel mechanism: engulfment within a pseudopod coil.</a> Cell. 36, 27-33 (1984).</li>
<li>Horwitz, M. A., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionnaires%27+disease+bacterium+%28Legionella+pneumophila%29+multiples+intracellularly+in+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) multiples intracellularly in human monocytes.</a> J. Clin. Invest. 66, 441-450 (1980).</li>
<li>Burstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+identification+of+Legionella+pneumophila+effectors+using+a+machine+learning+approach%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach.</a> PLoS Pathog. 5, e1000508(2009).</li>
<li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+protein+substrates+of+the+Dot%2FIcm+type+IV+transporter+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila.</a> PLoS One. 6, e17638Forthcoming.</li>
<li>Nagai, H., Kubori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IVB+Secretion+Systems+of+Legionella+and+Other+Gram-Negative+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria.</a> Front Microbiol. 2, 136(2011).</li>
<li>Hubber, A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+host+cell+function+by+Legionella+pneumophila+type+IV+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).</li>
<li>Shin, S., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell+processes+that+influence+the+intracellular+survival+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Host cell processes that influence the intracellular survival of Legionella pneumophila.</a> Cell Microbiol. 10, 1209-1220 (2008).</li>
<li>Berger, K. H., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+defects+in+intracellular+growth+complemented+by+a+single+genetic+locus+in+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila.</a> Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).</li>
<li>Marra, A., Blander, S. J., Horwitz, M. A., Shuman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Legionella+pneumophila+locus+required+for+intracellular+multiplication+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of a Legionella pneumophila locus required for intracellular multiplication in human macrophages.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 9607-9611 (1992).</li>
<li>Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell+killing+and+bacterial+conjugation+require+overlapping+sets+of+genes+within+a+22-kb+region+of+the+Legionella+pneumophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).</li>
<li>Segal, G., Shuman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+new+region+required+for+macrophage+killing+by+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Characterization of a new region required for macrophage killing by Legionella pneumophila.</a> Infect Immun. 65, 5057-5066 (1997).</li>
<li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279, 873-876 (1998).</li>
<li>Haghjoo, E., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+transcriptional+regulator+that+controls+intracellular+gene+expression+in+Salmonella+Typhi%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a transcriptional regulator that controls intracellular gene expression in Salmonella Typhi.</a> Mol. Microbiol. 64, 1549-1561 (2007).</li>
<li>Molofsky, A. B., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiate+to+thrive%3A+lessons+from+the+Legionella+pneumophila+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle.</a> Mol. Microbiol. 53, 29-40 (2004).</li>
<li>Hammer, B. K., Tateda, E. S., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-component+regulator+induces+the+transmission+phenotype+of+stationary-phase+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A two-component regulator induces the transmission phenotype of stationary-phase Legionella pneumophila.</a> Mol. Microbiol. 44, 107-118 (2002).</li>
<li>Ninio, S., Zuckman-Cholon, D. M., Cambronne, E. D., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Legionella+IcmS-IcmW+protein+complex+is+important+for+Dot%2FIcm-mediated+protein+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Legionella IcmS-IcmW protein complex is important for Dot/Icm-mediated protein translocation.</a> Mol. Microbiol. 55, 912-926 (2005).</li>
<li>Neild, A. L., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella+reveal+dendritic+cell+functions+that+facilitate+selection+of+antigens+for+MHC+class+II+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Legionella reveal dendritic cell functions that facilitate selection of antigens for MHC class II presentation.</a> Immunity. 18, 813-823 (2003).</li>
<li>Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amoebae+as+training+grounds+for+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).</li>
<li>Huws, S. A., Smith, A. W., Enright, M. C., Wood, P. J., Brown, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amoebae+promote+persistence+of+epidemic+strains+of+MRSA%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Amoebae promote persistence of epidemic strains of MRSA.</a> Environ. Microbiol. 8, 1130-1133 (2006).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Ekspresja genów bakteryjnych jest ściśle kontrolowana poprzez połączenie progresji cyklu życiowego i odpowiedzi na sygnały w otaczającym mikrośrodowisku. Patogeny wakuolarne, takie jak L. pneumophila, reagują na wiele sygnałów pochodzących z komórek gospodarza, gdy są podzielone na przedziały w fagosomie. W wyniku zbiorowego wyczerpania składników odżywczych w komórce gospodarza, bakteria kompensuje się poprzez ekspresję czynników wymaganych do pomyślnego rozprzestrzenienia się do kolejnej komórki gospodarza<sup...

Wiele patogenów bakteryjnych przystosowało uogólnione strategie, aby wykorzystać komórki gospodarza do przetrwania i replikacji w przedziale wewnątrzkomórkowym. W wielu przypadkach mechanizmy chorobotwórcze są podobne między komórkami pierwotniaków i metazoanów. Jednak te dwa mikrośrodowiska są bardzo różne i mogą powodować zróżnicowaną ekspresję czynników wirulencji1-4. Bakteria Legionella pneumophila jest powszechnie związana ze środowiskiem słodkowodnym na całym świecie5. Co ważne, L. pneumophila hodowana w komórkach pierwotniaków przed zakażeniem ludzkich monocytów zyskuje przewagę patogenną, co sugeruje, że globalne profile ekspresji genów bakterii opuszczającej komórkę pierwotniaka są inne niż w organizmie hodowanym in vitro 6-8. W naturze ameby słodkowodne zapewniają bogate w składniki odżywcze ograniczenia do szybkiej amplifikacji atakującej bakterii. Nabycie L. pneumophila przez człowieka najczęściej przypisuje się wdychaniu zanieczyszczonych kropelek wody, które zawierają bakterię. Jest prawdopodobne, że te kropelki zawierają bakterie związane z komórkami pierwotniaków; gdzie komórki pierwotniaków są bardziej odporne na konwencjonalne praktyki uzdatniania wody9,10. Zakażenie makrofagów pęcherzyków płucnych przebiega w sposób niemal identyczny jak wewnątrzkomórkowy cykl życiowy bakterii w komórkach gospodarza pierwotniaków11-13.
Aby przetrwać i replikować się w komórkach eukariotycznych, L. pneumophila używa wyspecjalizowanego systemu wydzielania typu IVb, zwanego Dot/Icm, aby dostarczyć prawie 300 białek 'efektorowych' do cytozolu komórki gospodarza14-16. Te białka efektorowe wspólnie działają w celu obalenia procesów komórkowych w celu wytworzenia przedziału permisywnego replikacji dla bakterii17,18. Delecje w którymkolwiek z 26 genów, które składają się na transporter Dot/ICM, skutkują wadliwymi szczepami do namnażania wewnątrzkomórkowego19-23. Historycznie rzecz biorąc, delecja poszczególnych genów kodujących efektory rzadko powodowała osłabienie szczepów do wzrostu wewnątrzkomórkowego. Zjawisko to przypisuje się kilku hipotezom, w tym nadmiarowym funkcjom i paralogicznym kopiom efektorów.
Niektóre czynniki wirulencji są wyrażane tylko w kontekście wzrostu wewnątrzkomórkowego związanego z komórką gospodarza24. Zracjonalizowaliśmy, że jeśli dany efektor był wyrażany tylko w kontekście infekcji pierwotniakami, to wkład efektora nie mógł być porównany ze szczepem typu dzikiego, gdy oba były hodowane in vitro. L. pneumophila przechodzi z fazy replikacyjnej do transmisyjnej, gdy wchodzi w fazę stacjonarną w hodowli25. Fenotyp przełączania faz reprezentuje wyczerpanie składników odżywczych napotkane podczas wzrostu wewnątrzkomórkowego i jest zilustrowany przez składanie wici dla ruchliwości26. Ponieważ L. pneumophila jest bardziej inwazyjna i zjadliwa, gdy jest zbierana z komórek pierwotniaków, staraliśmy się opracować test, który wierniej reprezentowałby stan patogenny bakterii w momencie napotkania makrofagów gospodarza.
W tym celu opracowaliśmy wszechstronny test na pierwotniaki, który może dostosować się do każdego odpowiedniego gospodarza zarówno dla pierwszego (komórka początkowa), jak i drugiego (komórka docelowa) infekcji. Proces infekcji jest możliwy do opanowania dzięki zastosowaniu bakterii wykazujących stabilną ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP). Model infekcji pierwotniaka Acanthamoeba castellanii jest zgodny z metodologią szeroko stosowaną w tej dziedzinie27. Na etapie kondycjonowania szczepy L. pneumophila są hodowane in vitro do fazy stacjonarnej w płynnych pożywkach w celu wytworzenia oznakowanych bakterii "transmisyjnych" (ryc. 1A). Bakterie są następnie wykorzystywane do infekowania monowarstw A. castellanii przez 18 godzin, aby osiągnąć późny etap wewnątrzkomórkowego cyklu życia. Duże wakuole zawierające bakterie można uwidocznić w tym punkcie czasowym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (ryc. 1A). Komórki pierwotniaków są następnie poddawane lizie, a bakterie odzyskane z lizatu są mierzone pod kątem emisji przy długości fali 512 nm za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Fluorescencja jest skorelowana z gęstością optyczną w celu obliczenia wielokrotności infekcji (MOI) dla infekcji komórek docelowych (ryc. 1, *krzywa korelacji). Po inwazji (T0) i 18 godzinach po inwazji (T18) komórki docelowe są oznaczane ilościowo pod kątem fluorescencji, reprezentując bakterie wewnątrzkomórkowe. Fluorescencję można monitorować za pomocą mikroskopii i cytometrii przepływowej, a liczbę żywotnych można mierzyć za pomocą posiewu kolonii. Testowi wstępnemu zawsze towarzyszą zakażenia L. pneumophila typu dzikiego i szczepem wadliwym w systemie wydzielania Dot / Icm typu IV (ΔdotA) (Figura 1A). Co ważne, zapewnia to wewnętrzną kontrolę nad bezpośrednimi porównaniami między szczepami typu dzikiego a dowolnymi izogenicznymi zmutowanymi szczepami stosowanymi w procesie infekcji. Włączenie awirulentnego szczepuΔ dotA na etapie kondycjonowania wyznacza próg obserwacji osłabionych fenotypów wzrostu związanych z izogenicznymi zmutowanymi szczepami, które są hodowane in vitro.

<table><tr><tbody><td colspan="4">odczynnik</td></tr><tr><td>chloramfenikol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td>antybiotyk</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td> ACES Sigma A9758-1KG <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>składnik podłoża</td></tr><tr><td>ATCC: 712 PYG</td><td>Pożywka wzrostowa ATCC</td><td></td><td>dla pierwotniaków</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30256FS</td> Węgiel aktywny z <td>buforem fosforanowym soli fizjologicznej</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>C272-212</td><td>składnik pożywki</td></tr><tr><td>ekstrakt drożdżowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-500</td><td>składnik pożywki</td></tr><tr><td>pepton</td><td>BD Diagnostics</td><td>211677</td><td>składnik podłoża</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-2</td><td>składnik</td></tr> <tr><td>podłożaL-cysteina, 99%+</td>Suplement <td></td><td>173601000 podłoża</td> <td>organicznego Acros</td></tr> Spektrofotometr <tr><td>bezwodny azotanu żelaza</td><td>Fisher Scientific</td><td>I110-100</td><td>suplement</td></tr><tr> do pożywki<td colspan="4">Sprzęt</td></tr><tr><td>EVOS fl</td><td>AMG</td><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>EVOS</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Smart Spec Plus</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td></tr><tr><td>5810 R </td><td>wirówka Eppendorf</td><td>22627023</td><td>wirówka stołowa</td></tr><tr><td>Repeater plus</td><td>Eppendorf</td><td>22230201</td><td>pipeta powtarzalna</td></tr><tr><td>SpectraMax Gemini EM</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>czytnik mikropłytek</td></tr><tr><td>Softmax Pro 5.3</td><td>Molecular Devices</td><td>0200-310</td><td>oprogramowanie do czytnika mikropłytek</td></tr><tr><td>5424 microfuge</td><td>Blat stołu Eppendorf</td><td>22620401</td><td> mikrowirówka</td></tr><tr><td>Szybkozłączka do pipet II</td><td>Scienceware</td><td>379111010</td><td>pomoc do pipet</td></tr><tr><td>FACS Calibur</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td>cytometr przepływowy</td></tr><tr><td>FlowJo 7.6.1</td><td>Licencja FlowJo</td><td></td> Probówka do <td>cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>polipropylenowa rurka stożkowa</td></tr><tr><td>1,6 ml</td><td>Neptun</td><td>3745.X</td><td>probówki do mikrowirówek</td></tr></tbody></table>

możliwe do leczenia infekcje komórek ssaków bakteriami zaszczepionymi przez pierwotniaki

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Wiele wewnątrzkomórkowych patogenów bakteryjnych wykorzystuje słodkowodne pierwotniaki jako naturalny rezerwuar do namnażania się w środowisku. Legionella pneumophila, czynnik wywołujący zapalenie płuc u legionistów, zyskuje patogenną przewagę nad bakteriami hodowanymi in vitro, gdy po raz pierwszy zostanie zebrany z komórek pierwotniaków przed zakażeniem makrofagów ssaków. Sugeruje to, że ważne czynniki wirulencji mogą nie być prawidłowo wyrażane in vitro. Opracowaliśmy elastyczny system do konfekcjonowania L. pneumophila przez jego naturalnego żywiciela pierwotniaka Acanthamoeba castellanii przed zakażeniem komórek ssaków. Udział dowolnego czynnika wirulencji można zbadać, porównując wewnątrzkomórkowy wzrost zmutowanego szczepu z bakteriami typu dzikiego po pobudzeniu pierwotniaków. Zmutowane szczepy L. pneumophila z ekspresją GFP typu dzikiego są wykorzystywane do infekowania monowarstw pierwotniaków w etapie wstępowania i pozwalają osiągnąć późne etapy wzrostu wewnątrzkomórkowego. Bakterie fluorescencyjne są następnie zbierane z tych zakażonych komórek i normalizowane za pomocą spektrofotometrii w celu wygenerowania porównywalnej liczby bakterii do późniejszej infekcji makrofagami ssaków. W celu oceny ilościowej żywe bakterie są monitorowane po zakażeniu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, cytometrii przepływowej i posiewu kolonii. Technika ta podkreśla i opiera się na udziale ekspresji genów zależnej od komórki gospodarza poprzez naśladowanie środowiska, które można napotkać na naturalnej drodze pozyskiwania. Podejście to można zmodyfikować, aby uwzględnić każdą bakterię, która wykorzystuje żywiciela pośredniego jako sposób na uzyskanie przewagi patogennej.

Typowy wynik dla całego procesu infekcji przedstawiono na Rysunku 1. Mikrografie fluorescencyjne żywych komórek przedstawiające monowarstwy A.castellanii zainfekowanych szczepem dzikim L. pneumophila podczas etapu primingu pokazano na Rysunku 1A. Prawidłowy przebieg etapu primingu powinien prowadzić do uzyskania populacji, w której około 90% komórek gospodarza zawiera duże wakuole wypełnione bakteriami znakowanymi GFP przy tym MOI. W 18 godzinie po infekcji większość ko...

Ta technika dostarcza metody zbierania, normalizacji i ilościowego określania wzrostu wewnątrzkomórkowego patogenów bakteryjnych, które są wstępnie hodowane w naturalnych komórkach gospodarza pierwotniaków przed infekcjami komórek ssaków. Metodę tę można zmodyfikować w celu uwzględnienia szerokiej gamy komórek gospodarza na etapie zasysania, a także typów komórek docelowych.

Możliwe do leczenia infekcje komórek ssaków bakteriami zaszczepionymi przez pierwotniaki

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest odzyskanie i ilościowe oznaczenie bakterii znakowanych fluorescencyjnie z gospodarza pośredniego w celu późniejszego zakażenia komórek ssaków. W tej metodzie Legionella mala wykazująca ekspresję GFP jest wykorzystywana do zakażenia jednowarstw pierwotniaków, będących naturalnym gospodarzem, tj. ameby castellani. Następnie bakterie L. mala są odzyskiwane poprzez selektywną lizę, a stężenie bakterii jest obliczane przy użyciu wzoru opartego na rozcieńczeniu emisji fluorescencji pierwotniaków.Następnie bakterie poddane primingowi są wykorzystywane do zakażenia monowarstw komórek ssaków. Na koniec liczbę zakaźnych bakterii w komórkach ssaków określa się, stosując kombinację mikroskopii fluorescencyjnej, cytometrii przepływowej oraz wysiewu lizatów w celu odzyskania jednostek tworzących kolonie. Uzyskane dane wykazują przewagę patogenną bakterii, które w fazie primingowej były hodowane w komórkach pierwotniaków, w porównaniu z tym samym szczepem hodowanym w pożywce sztucznej.Opracowaliśmy tę technikę, zauważając, że ekspresja określonych czynników wirulencji u bakterii nie mogła zostać indukowana wyłącznie poprzez hodowlę in vitro. Typowe modele i

tractable-mammalian-cell-infections-with-protozoan-primed-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zakażenia komórek ssaków bakteriami otoczonego pierwotniakiem

Toxoplasma gondii przekształca się w formę cysty w odpowiedzi na stres środowiskowy, co można odtworzyć w modelach kultur tkankowych. W niniejszym materiale wideo zaprezentowano techniki badania tworzenia się ściany cysty poprzez aktywację makrofagów pochodzących z szpiku kostnego lub zmianę pH pożywki wzrostowej w komórkach fibroblastów.

Toxoplasma gondii Formowanie ściany cysty w aktywowanych makrofagach pochodzących z szpiku kostnego oraz w warunkach sprzyjających bradyzoitom

Krzyżowanie genetyczne pasożytów malarii gryzoni przeprowadza się poprzez podanie dwóch genetycznie odmiennych pasożytów komarom. Potomstwo rekombinacyjne jest klonowane z krwi mysiej po tym, jak komary ukąsiły zainfekowane myszy. Niniejszy film pokazuje, jak przeprowadzić krzyżowanie genetyczne Plasmodium yoelii; metoda ta ma zastosowanie również do innych pasożytów malarii gryzoni.

Protokół otrzymywania krzyżówki genetycznej pasożytów malarii gryzoni

Tutaj przedstawiamy metodę wykorzystania szczepów Δku80 typu I i II Toxoplasma gondii do efektywnego generowania docelowych delecji genów i zamienników genów do funkcjonalnej analizy genomowej.

Manipulacja genetyczna w szczepach Δku80 do funkcjonalnej analizy genomowej Toxoplasma gondii

Korzystając z tego protokołu, byliśmy w stanie zobrazować odcinki mózgu myszy zainfekowane pasożytem Toxoplasma gondii o grubości 160 μm, co umożliwia wizualizację i analizę przestrzennego związku między pasożytem otorbiającym a zainfekowanym neuronem.

Obrazowanie 3D i analiza neuronów zakażonych in vivo Toxoplasma gondii

Podobne do prionów rozprzestrzenianie się agregatów białkowych pojawiło się ostatnio jako związane z wieloma chorobami neurodegeneracyjnymi. Celem tego protokołu jest opisanie sposobu wykorzystania nicienia C. elegans jako systemu modelowego do monitorowania rozprzestrzeniania się białek i badania zjawisk podobnych do prionów.

Badanie rozprzestrzeniania się i toksyczności białek priopodobnych przy użyciu metazoańskiego organizmu modelowego C. elegans

Tutaj przedstawiono protokół pomiaru wychwytywania bakterii przez limfocyty T CD4+, które następuje podczas prezentacji antygenu poprzez transinfekcję z wcześniej zainfekowanych komórek dendrytycznych (DC). Pokazujemy, jak wykonać niezbędne kroki: izolację komórek pierwotnych, zakażenie DC, tworzenie koniugatu limfocytów DC/T oraz pomiar transfekcji bakteryjnych limfocytów T.

Limfocyty T wychwytują bakterie przez transinfekcję z komórek dendrytycznych

Tutaj dostarczyliśmy metodę osiągnięcia stabilnej transfekcji pasożytów Eimeria kurczaka poprzez nukleofektyczne sporozoity lub merozoity drugiej generacji. Genetycznie zmodyfikowane pasożyty eimeriańskie wykazujące ekspresję heterologicznych genów antygenowych mogą być wykorzystywane jako nośniki szczepionek.

Nukleofekcja i rozmnażanie in vivo pasożytów Eimeria kurczaka

Ogólnym celem tego protokołu jest instrukcja, jak wydobywać, utrzymywać i oddzielać mysie komórki astrocytów i mikrogleju od ośrodkowego układu nerwowego, a następnie infekować pasożytami pierwotniaków.

Jednoczesna izolacja pierwotnych astrocytów i mikrogleju w celu zakażenia pasożytami pierwotniaków

Malaria jest przenoszona przez inokulację stadium sporozoitu Plasmodium przez zakażone komary. Transgeniczne zarodźce pozwoliły nam lepiej zrozumieć biologię malarii i bezpośrednio przyczyniły się do opracowania szczepionki przeciwko malarii. W tym miejscu opisujemy uproszczoną metodologię generowania transgenicznych sporozoitów Plasmodium berghei.

Wytwarzanie genetycznie zmodyfikowanych sporozoitów Plasmodium berghei

Ten protokół opisuje metodologię transfekcji trofozoitów Naegleria gruberi za pomocą konstruktu, który jest utrzymywany przez cały okres pasowania trofozoitów in vitro, jak również poprzez torbienie i ekscystację.

Transfekcja molekularnego klonu rDNA Naegleria gruberi do trofozoitów N. gruberi

Tutaj przedstawiono protokół projektowania, konstruowania i dostarczania sterowanego tetracykliną indukowalnego obwodu syntetycznego. Wpływ obwodów syntetycznych na eliminację pasożytów i ekspresję cytokin można badać poprzez kanalizację prezentowanego rurociągu. Protokół ten jest istotny dla naukowców badających syntetyczne terapie oparte na obwodach w chorobach zakaźnych.

Obwody immunometaboliczne w zakażeniach w celu rozwoju terapii ukierunkowanych na gospodarza

Poznaj metodę izolacji i kwantyfikacji bakterii Legionella mala z komórek pierwotniaków do zakażenia komórek ssaków. Technika ta wykorzystuje fluorescencję GFP i cytometrię przepływową do pomiaru zakażenia.

Możliwe do leczenia infekcje komórek ssaków bakteriami zaszczepionymi przez pierwotniaki

Przeglądaj więcej filmów