Name: Modelowanie kohodowli komórkowych przy użyciu wodnych systemów dwufazowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Poznaj metodę wzorowania komórek w wodnych układach dwufazowych z użyciem polimerów PEG i dextran. Technika ta umożliwia szybką organizację przestrzenną komórek dla zastosowań w inżynierii tkankowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fundację Coultera, Fundację Beyster, letni program Undergraduate Research Opportunity (UROP) dla ATA oraz stypendium badawcze National Science Foundation Graduate Student Research Fellowship (Grant nr. DGE 0718128; ID: 2010101926) dla JBW.

1. Charakterystyka systemu fazowego: Określanie progów separacji faz
<ol>
	<li>Przygotować roztwory zawierające PEG i DEX w żądanym buforze lub pożywce do hodowli komórkowych, jak pokazano na rysunku 1 (fioletowe kropki) w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml lub 50 ml. W dalszej części PEG i DEX będą odnosić się do 35 kDa PEG i 500 kDa DEX; Jednak stężenia krytyczne będą się zmieniać w zależności od dwóch użytych polimerów. Zapisać masę PEG i DEX w każdym roztworze. Roztwory polimerów o wysokim stężeniu mogą rozpuścić się po kilku godzinach. Wirowanie może być stosowane w przypadku roztworów bez surowicy. W przypadku pożywek zawierających białka lub surowicę, umieść probówki na etapie kołysania, aż oba polimery całkowicie się rozpuszczą. Zanotować masę pożywki użytej do rozpuszczenia polimerów i zanotować początkowe stężenia.</li>
	<li>Gdy polimery całkowicie się rozpuszczą, roztwory powinny wydawać się mętne. Jest to pierwsza oznaka, że nastąpiła separacja faz. Aby to potwierdzić, pozwól roztworom polimerów spoczywać w pozycji pionowej w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Wirowanie przy 1 000 x g może być wykorzystane do przyspieszenia procesu separacji faz. Gęstsza dolna faza będzie bogata w DEX, a górna faza będzie bogata w PEG.</li>
	<li>Powoli dodaj dodatkowy bufor lub pożywkę do probówek. Należy stosować małe przyrosty, aby nie przekroczyć punktu separacji faz.</li>
	<li>Gdy roztwór staje się klarowny i nie rozdziela się fazowo po odwirowaniu, próg separacji faz został osiągnięty. Zapisz ostateczną wagę rury.</li>
	<li>Korzystając z poprzednio zarejestrowanych mas dla polimerów, wraz z masą końcową po dodaniu pożywki, należy określić % wag./wag. każdego z dwóch polimerów, przy których nie zachodzi już separacja faz</li>.
	<li>Wykreśl te wartości jako % wt/wt PEG na osi y i % wt/wt DEX na osi x. Wykres ten, znany jako krzywa binodalna, może być wykorzystany do określenia stężenia progowego dla separacji faz dla różnych stężeń PEG/DEX w określonej pożywce do hodowli komórkowych.</li>
</ol>
2. Konfiguracja 1: Wzór wykluczenia (format płytki 96-dołkowej)
<ol>
	<li>Przygotować oddzielne roztwory 5,0% wag./wt PEG i 12.8% wt/wt DEX w pożywce do hodowli komórkowych. Stosować roztwory ATPS o stężeniu co najmniej dwukrotnie większym niż punkt krytyczny, aby upewnić się, że ATPS pozostaje po tym, jak polimery zrównoważą się względem siebie. Do fazy bogatej w PEG i odwrotnie dochodzi do niewielkiej ilości strumienia DEX, dlatego praca zbyt blisko stężenia krytycznego może spowodować utratę układu fazowego, ponieważ stężenia spadną poniżej punktu krytycznego. Podobnie, przeniesienie szalki do hodowli komórkowej do inkubatora o kontrolowanej wilgotności i temperaturze może zmienić właściwości dwufazowe i sprawić, że oba roztwory będą się mieszać. Uwaga: Niektóre komórki mogą działać lepiej z innymi preparatami ATPS. Dopuszczalne formuły można wybrać na podstawie krzywych obuwęzłowych określonych w części 1.</li>
	<li>Zbierz komórki, które mają być użyte do tworzenia wzorców wykluczania. Określ całkowitą liczbę/stężenie dostępnych komórek. Opcjonalnie: oznacz komórki za pomocą CellTracker lub innych niecytotoksycznych znaczników do mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
	<li>Osadzać ogniwa i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości 5,0% PEG, aby osiągnąć pożądaną liczbę komórek do wykluczenia. Na przykład jedna studzienka z 96-dołkową płytką wymaga ponownego zawieszenia 37 500 komórek fibroblastów w 200 μl PEG, aby następnego dnia wytworzyć konfluencję. Przeskaluj te liczby odpowiednio do innych typów komórek i rozmiarów substratów hodowlanych.</li>
	<li>Za pomocą mikropipetora dozować 0,5 μl kropelek DEX na suchy substrat do hodowli komórkowych. Kropelki o większej objętości tworzą większe strefy wykluczenia. Kropelki o wielkości od 0,1 do 1 μl są zalecane do mikromodelowania wykluczającego. Opcjonalnie: kropelki DEX mogą być osadzane z 24-godzinnym wyprzedzeniem i pozostawiane do odwodnienia w temperaturze pokojowej. Może to zapewnić czystsze wzory.</li>
	<li>Dozuj 200 μl zawiesiny komórek PEG do studzienki, aby przykryć kropelki DEX.</li>
	<li>Umieścić w nawilżanym inkubatorze na 12 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Upewnij się, że naczynie nie jest przechylone podczas przenoszenia i że jest umieszczone na równej półce inkubatora, aby uniknąć zakłócenia wzorów.</li>
	<li>Usunąć roztwór PEG i przemyć trzykrotnie 200 μl pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Dodać świeżą pożywkę hodowlaną i wrócić do inkubatora.</li>
	<li>Okresowo monitoruj kultury, aby obserwować ruch komórek do strefy wykluczenia.</li>
</ol>
3. Konfiguracja 2: Wzór wyspy (format płytki 96-dołkowej)
<ol>
	<li>Przygotować roztwory 5,0% wag./wt PEG i 12.8% wt/wt DEX w pożywce do hodowli komórkowych, jak wyżej.</li>
	<li>Zbierz komórki, które zostaną użyte do stworzenia wzoru wyspy. Określ całkowitą liczbę/stężenie dostępnych komórek.</li>
	<li>Osadzaj i ponownie zawieszaj ogniwa w odpowiedniej objętości 12,8% DEX, aby osiągnąć pożądane stężenie komórek do wzoru wyspowego. Stężenia 5 000 komórek/μl lub mniej są zalecane dla silnie przylegających typów komórek. W przypadku komórek, które mają trudności z przyczepieniem się lub komórek, które luźno przylegają, można rozważyć stężenia do 10 000 komórek/μl.</li>
	<li>Działając szybko, aby uniknąć wysuszenia, odpipetować 0,5 μl kropelek DEX na suchy substrat do hodowli komórkowych, jak opisano powyżej. Nie dopuścić do wyschnięcia kropel. Opcjonalnie: 200 μl roztworu PEG można dodać do studni z wyprzedzeniem. Kropelki DEX mogą być następnie osadzane w roztworze PEG, gdzie opadną na dno i zetkną się z powierzchnią hodowli. Może to prowadzić do powstania czystszych wzorów wysp.</li>
	<li>Przykryj kropelki DEX 200 μl PEG.</li>
	<li>Umieścić w nawilżanym inkubatorze na 12 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Upewnij się, że naczynie nie jest przechylone podczas przenoszenia i że jest umieszczone na równej półce inkubatora, aby uniknąć zakłócenia wzorów.</li>
	<li>Usunąć roztwór PEG i przemyć trzykrotnie 200 μl pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Dodać świeżą pożywkę hodowlaną i wrócić do inkubatora.</li>
	<li>Okresowo monitoruj kultury, aby obserwować ruch komórek i proliferację na zewnątrz wysp.</li>
</ol>
4. Konfiguracja 3: Wykluczenie Współkultury (96-dołkowy format płytki)
<ol>
	<li>Przygotować roztwory 5,0% wag./wt PEG i 12.8% wt/wt DEX w pożywce do hodowli komórkowych, jak wyżej.</li>
	<li>Zbierz komórki, które zostaną użyte do wykluczenia i wytworzenia wzoru wyspy. Określ całkowitą liczbę/stężenie komórek dostępnych dla każdego typu komórek. Opcjonalnie: Niektóre pary komórek mogą wykazywać znacznie różne wskaźniki proliferacji. Aby zapobiec przeludnieniu wykluczonych komórek w komórkach o wzorze wyspowym (szczególnie w przypadku długotrwałych hodowli), należy traktować komórki użyte do wykluczenia mitomycyną C przez 2 godziny lub napromieniać je przed pobraniem. Zapobiegnie to rozprzestrzenianiu się. W razie potrzeby można użyć barwników fluorescencyjnych CellTracker do rozróżnienia dwóch populacji komórek.</li>
	<li>Osadzaj ogniwa i ponownie zawieś je w celu wykluczenia w odpowiedniej objętości 5,0% PEG, aby uzyskać pożądaną liczbę komórek, jak powyżej. Ponownie zawiesić granulkę do wzoru wyspowego w odpowiedniej objętości 12,8% DEX, aby osiągnąć pożądane stężenie komórek, jak wyżej.</li>
	<li>Za pomocą mikropipetora dozować 0,5 μl kropelki zawiesiny komórek DEX na suche podłoże do hodowli komórkowych. Nie dopuścić do wyschnięcia kropel.</li>
	<li>Przykryj kropelki DEX 200 μl zawiesiny ogniw PEG.</li>
	<li>Umieścić w nawilżanym inkubatorze na 12 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Upewnij się, że naczynie nie jest przechylone podczas przenoszenia i że jest umieszczone na równej półce inkubatora, aby uniknąć zakłócenia wzorów.</li>
	<li>Usunąć roztwór PEG i przemyć trzykrotnie w 200 μl pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Dodać świeżą pożywkę hodowlaną i wrócić do inkubatora.</li>
	<li>Monitoruj kokultury, aby obserwować interakcje między populacjami komórek. Opcjonalnie: Kontrole można przygotować, wykonując indywidualne wzorce wykluczania lub wyspowe, przez wspólne hodowle komórek, które nie wchodzą ze sobą w interakcje, lub poprzez blokowanie szlaków zainteresowania w jednej lub obu populacjach komórek przed lub po wzorcu.</li>
</ol>

<ol><li>Hatti-Kaul, R. Aqueous two-phase systems : methods and protocols. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHatti-Kaul%2C+R+%22Methods+in+biotechnology%22">Methods in biotechnology</a>. xiii, Humana Press. 440(2000).</li>
<li>Albertsson, P. A. k <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlbertsson%2C+PAk+%22Partition+of+cell+particles+and+macromolecules%3A+separation+and+purification+of+biomolecules%2C+cell+organelles%2C+membranes%2C+and+cells+in+aqueous+polymer+two-phase+systems+and+their+use+in+biochemical+analysis+and+biotechnology%22">Partition of cell particles and macromolecules: separation and purification of biomolecules, cell organelles, membranes, and cells in aqueous polymer two-phase systems and their use in biochemical analysis and biotechnology</a>. , 3rd ed, Wiley. 346(1986).</li>
<li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cell+partitioning+using+an+aqueous+two-phase+flow+system+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Continuous cell partitioning using an aqueous two-phase flow system in microfluidic devices.</a> Biotechnol. Bioeng. 88 (4), 489-494 (2004).</li>
<li>Soohoo, J. R., Walker, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+aqueous+two+phase+system+for+leukocyte+concentration+from+whole+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Microfluidic aqueous two phase system for leukocyte concentration from whole blood.</a> Biomed. Microdevices. 11 (2), 323-329 (2009).</li>
<li>Hahn, T., Hardt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+size+separation+of+DNA+samples+at+liquid-liquid+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Concentration and size separation of DNA samples at liquid-liquid interfaces.</a> Anal. Chem. 83 (14), 5476-5479 (2011).</li>
<li>Hatti-Kaul, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+two-phase+systems.+A+general+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Aqueous two-phase systems. A general overview.</a> Mol. Biotechnol. 19 (3), 269-277 (2001).</li>
<li>Hustedt, H., Kroner, K. H., Menge, U., Kula, M. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+recovery+using+two-phase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein recovery using two-phase systems.</a> Trends in Biotechnology. 3 (6), 139-144 (1985).</li>
<li>Keating, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+Phase+Separation+as+a+Possible+Route+to+Compartmentalization+of+Biological+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Aqueous Phase Separation as a Possible Route to Compartmentalization of Biological Molecules.</a> Acc Chem. Res. 45 (12), 2114-2124 (2012).</li>
<li>Helfrich, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+and+assembly+of+metal+particles+and+their+bioconjugates+in+aqueous+two-phase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Partitioning and assembly of metal particles and their bioconjugates in aqueous two-phase systems.</a> Langmuir. 21 (18), 8478-8486 (2005).</li>
<li>Diamond, A. D., Hsu, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prote.+Partitioning+in+PEG%2FDextran+Aqueous+Two-Phase+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22AIChE+Journal%22%5BJournal%5D)">Prote. Partitioning in PEG/Dextran Aqueous Two-Phase Systems.</a> AIChE Journal. 36 (7), 1017-1024 (1990).</li>
<li>Y-T,, Zhu, Z. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+interfacial+tension+of+aqueous+two-phase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Engineering+Science%22%5BJournal%5D)">Modeling of interfacial tension of aqueous two-phase systems.</a> Chemical Engineering Science. 54 (4), 433-440 (1999).</li>
<li>Liu, Y., Lipowsky, R., Dimova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+dependence+of+the+interfacial+tension+for+aqueous+two-phase+polymer+solutions+of+dextran+and+polyethylene+glycol%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Concentration dependence of the interfacial tension for aqueous two-phase polymer solutions of dextran and polyethylene glycol.</a> Langmuir. 28 (8), 3831-3839 (2012).</li>
<li>Rha, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfacial+Tension+of+Polyethylene+Glycol%2FPotassium+Phosphate+Aqueous+Two-Phase+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+and+Chemistry+of+Liquids%3A+An+International+Journal%22%5BJournal%5D)">Interfacial Tension of Polyethylene Glycol/Potassium Phosphate Aqueous Two-Phase Systems.</a> Physics and Chemistry of Liquids: An International Journal. 38 (1), 25-34 (2000).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Generation+of+Multiplexed+Cell+Cocultures+Using+Acoustic+Droplet+Ejection+Followed+by+Aqueous+Two-Phase+Exclusion+Patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid Generation of Multiplexed Cell Cocultures Using Acoustic Droplet Ejection Followed by Aqueous Two-Phase Exclusion Patterning.</a> Tissue Eng. Part C. Methods. 18 (9), 647-657 (2012).</li>
<li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanolitre+liquid+patterning+in+aqueous+environments+for+spatially+defined+reagent+delivery+to+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells.</a> Nat. Mater. 8 (9), 736-741 (2009).</li>
<li>Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+aqueous+biphasic+systems+for+non-contact+cell+printing+on+cells%3A+engineering+heterocellular+embryonic+stem+cell+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches.</a> Adv. Mater. 22 (24), 2628-2631 (2010).</li>
<li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microprinted+feeder+cells+guide+embryonic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. , (2011).</li>
<li>Tavana, H., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+biphasic+microprinting+approach+to+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Aqueous biphasic microprinting approach to tissue engineering.</a> Biomicrofluidics. 5 (1), 13404(2011).</li>
<li>Frampton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precisely+targeted+delivery+of+cells+and+biomolecules+within+microchannels+using+aqueous+two-phase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Precisely targeted delivery of cells and biomolecules within microchannels using aqueous two-phase systems.</a> Biomed. Microdevices. 13 (6), 1043-1051 (2011).</li>
<li>Hossein Tavana, K. K., Bersano-Begey, T., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rehydration+of+Polymeric%2C+Aqueous%2C+Biphasic+System+Facilitates+High+Throughput+Cell+Exclusion+Patterning+for+Cell+Migration+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Rehydration of Polymeric, Aqueous, Biphasic System Facilitates High Throughput Cell Exclusion Patterning for Cell Migration Studies.</a> Advanced Functional Materials. 21 (15), 2920-2926 (2011).</li>
<li>Falconnet, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+engineering+approaches+to+micropattern+surfaces+for+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays.</a> Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).</li>
<li>Lim, J. Y., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sensing+and+response+to+micro-+and+nanostructured+surfaces+produced+by+chemical+and+topographic+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell sensing and response to micro- and nanostructured surfaces produced by chemical and topographic patterning.</a> Tissue Eng. 13 (8), 1879-1891 (2007).</li>
<li>Ringeisen, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jet-based+methods+to+print+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Jet-based methods to print living cells.</a> Biotechnol. J. 1 (9), 930-948 (2006).</li>
<li>Wright, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+static+and+dynamic+patterned+co-cultures+using+microfabricated+parylene-C+stencils%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Generation of static and dynamic patterned co-cultures using microfabricated parylene-C stencils.</a> Lab Chip. 7 (10), 1272-1279 (2007).</li>
<li>Takayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+cells+and+their+environments+using+multiple+laminar+fluid+flows+in+capillary+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (10), 5545-5548 (1999).</li>
<li>Berthier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pipette-friendly+laminar+flow+patterning+for+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Pipette-friendly laminar flow patterning for cell-based assays.</a> Lab Chip. 11 (12), 2060-2065 (2011).</li>
<li>Davidson, R. L., O'Malley, K. A., Wheeler, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylene+glycol-induced+mammalian+cell+hybridization%3A+effect+of+polyethylene+glycol+molecular+weight+and+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Somatic+Cell+Genet%22%5BJournal%5D)">Polyethylene glycol-induced mammalian cell hybridization: effect of polyethylene glycol molecular weight and concentration.</a> Somatic Cell Genet. 2 (3), 271-280 (1976).</li>
<li>Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+Two-Dimensional+Patterned+Substrates+for+Protein+and+Cell+Confinement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement.</a> J. Vis. Exp. (55), e3164(2011).</li>
<li>Moon, S., Lin, P., Keles, H. O., Yoo, S., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Title+Cell+Encapsulation+by+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Title Cell Encapsulation by Droplets.</a> J. Vis. Exp. (8), e316(2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Metoda mikrowzorcowania komórek ATPS wymaga bardzo niewielkiej wiedzy specjalistycznej poza biegłością w technikach hodowli komórkowych i może być szybko opanowana. Zaletą tego podejścia jest to, że jest niedrogie, szybkie i kompatybilne z różnymi typami komórek i formatami hodowli. Z tych powodów nasz protokół powinien być łatwo przyjęty przez naukowców zajmujących się naukami przyrodniczymi, szczególnie tych, którzy badają proliferację komórek, migrację i chemotaksję oraz wpływ interakcji jukstakrynowych i parakrynnych...

Wodne układy dwufazowe (ATPS) powstają, gdy roztwory dwóch niekompatybilnych polimerów są mieszane ze sobą w wystarczająco wysokich stężeniach. Na separację faz ma wpływ wiele czynników, w tym masa cząsteczkowa i polarność polimerów, temperatura roztworów, pH i zawartość jonów w wodnym rozpuszczalniku 1, 2. Punkt, w którym dwa roztwory polimerowe rozdzielają się, jest określany przez właściwości fizykochemiczne wybranego układu fazowego, ale na ogół występuje przy niskich stężeniach polimerów (mniej niż 20% wag./wag.) w warunkach niedenaturujących, co pozwala na stosowanie ATPS do zastosowań biotechnologicznych 3-9.
Zdecydowanie najszerzej badanym ATPS jest system glikolu polietylenowego (PEG)/dekstranu (DEX). ATPS utworzony przez te niedrogie i biokompatybilne polimery został pierwotnie opisany do oczyszczania biomolekuł za pomocą partycjonowania molekularnego 2, 10. Partycjonowanie następuje, gdy dodatkowe cząsteczki lub cząstki, które nie przyczyniają się do układu fazowego, są mieszane z PEG i DEX. W oparciu o ich względne powinowactwo do DEX lub PEG, cząsteczki lub cząstki będą preferencyjnie znajdować się w jednej z dwóch faz lub na granicy faz. Kolejną właściwością PEG/DEX ATPS jest istnienie napięcia międzyfazowego między dwiema fazami polimeru. ATPS utworzone przez PEG i DEX na ogół wykazują napięcia międzyfazowe, które są znacznie niższe niż w innych dwufazowych układach ciecz-ciecz, takich jak olej i woda; Jednak międzyfazowe siły napięcia nadal wywierają wpływ na małe cząsteczki, takie jak wirusy, komórki i agregaty białkowe 2, 11-13. Wreszcie, ponieważ PEG i DEX o wyższej masie cząsteczkowej rozdzielają się w niskich stężeniach (mniej niż 5% wag./wt dla odmian polimerów o wysokiej masie cząsteczkowej) w obecności fizjologicznych stężeń soli, istnieje niewiele, jeśli w ogóle, szkodliwy wpływ na komórki ssaków włączone do tych systemów 14-16.
Ostatnio, właściwości międzyfazowe i efekty podziału ATPS zostały zastosowane przez nasze laboratorium do modelowania komórek 14, 16-20. Udało się to osiągnąć poprzez mikrowzorzec gęstszego roztworu DEX na podłożach hodowli komórkowych w obecności PEG. Kiedy komórki są włączane do fazy PEG, są wykluczone z przedostania się do kropelek DEX ze względu na napięcie międzyfazowe PEG/DEX 20. Kiedy komórki są wzorzyste w fazie DEX, są zatrzymywane na powierzchni substratu hodowli komórkowej przez napięcie międzyfazowe i partycjonowanie 16, 17, 19.
W przeciwieństwie do innych metod tworzenia wzorów komórkowych, tworzenie wzorów komórkowych ATPS jest łatwe do nauczenia i wymaga jedynie podstawowej wiedzy na temat samych polimerów, a także umiejętności przeprowadzenia hodowli komórkowej i użycia mikropipetatora. Inne metody tworzenia wzorców komórkowych często wymagają specjalistycznego sprzętu i szkolenia, które nie są łatwe do przełożenia na nauki przyrodnicze. Na przykład niektóre metody (druk mikrokontaktowy lub druk atramentowy) modelują komórki pośrednio, nakładając wzory biomolekuł adhezyjnych komórek na podłoże hodowlane, które następnie służą jako miejsca przyczepiania komórek 21, 22. Chociaż podejścia pośrednie są przydatne w przypadku niektórych typów komórek, wymagają one wysokiego stopnia umiejętności użytkownika i specjalistycznego sprzętu do wytworzenia narzędzia do tworzenia wzorów i mogą nie mieć specyficzności w zależności od konkretnego typu komórki / wzoru biomolekuły. Alternatywnie, komórki mogą być osadzane z wysoką specyficznością wzoru za pomocą bezpośrednich metod modelowania, które obejmują modelowanie przepływu laminarnego, szablony i druk atramentowy 23-26. Jednak techniki te wymagają również wiedzy użytkownika i specjalistycznego sprzętu oraz mogą uszkodzić ogniwa podczas procesu drukowania. Chociaż podejścia te na ogół tworzą precyzyjne wzorce komórek, aby wzorce komórek były użytecznym narzędziem w naukach przyrodniczych, muszą być opłacalne i proste do wdrożenia.
Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół generowania wzorcowych kultur komórkowych przy użyciu ATPS opisanych w naszych poprzednio opublikowanych aplikacjach. Korzystając wyłącznie z mikropipetatorów, użytkownicy mogą generować strefy wykluczenia komórek lub wyspy komórkowe do testów migracji. Osiąga się to za pomocą napięcia międzyfazowego PEG/DEX, które albo zatrzymuje komórki w fazie DEX, albo wyklucza komórki zdeponowane w fazie PEG z DEX. Łącząc te dwie podstawowe techniki modelowania, możliwe jest szybkie generowanie kokultur komórek, takich jak kokultury komórek wątroby i fibroblastów. Szczegółowo opisano metody tworzenia wzorców, parametry ATPS i oczekiwane wyniki.

<table><tbody><tr><td>Dekstran 500 000 kDa</td><td>Pharmacosmos, Dania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 35 000 kDa</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hela</td><td>ATCC, Manassas, VA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HepG2 C3A</td><td>ATCC, Manassas, VA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3</td><td>ATCC, Manassas, VA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco, Karlowe Wary, Kalifornia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco, Karlowe Wary, Kalifornia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Gibco, Karlowe Wary, Kalifornia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco, Karlowe Wary, Kalifornia</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modelowanie kohodowli komórkowych przy użyciu wodnych systemów dwufazowych

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Technologie tworzenia wzorców komórkowych, które są szybkie, łatwe w użyciu i przystępne cenowo, będą potrzebne do przyszłego rozwoju wysokoprzepustowych testów komórkowych, platform do badania interakcji komórka-komórka i systemów inżynierii tkankowej. Ten szczegółowy protokół opisuje metodę generowania kokultur komórek przy użyciu biokompatybilnych roztworów dekstranu (DEX) i glikolu polietylenowego (PEG), które rozdzielają się fazowo po połączeniu powyżej stężeń progowych. Za pomocą tej metody komórki mogą być wzorowane w różnych konfiguracjach. Wzorzec wykluczenia komórek można przeprowadzić poprzez drukowanie kropelek DEX na podłożu i pokrycie ich roztworem komórek zawierających PEG. Napięcie międzyfazowe powstające między dwoma roztworami polimerowymi powoduje, że komórki opadają na zewnątrz kropli DEX i tworzą okrągłe oczyszczanie, które można wykorzystać do testów migracji. Wyspy komórkowe można modelować poprzez dozowanie bogatej w komórki fazy DEX do roztworu PEG lub przez pokrycie kropli DEX roztworem PEG. Kokultury mogą być tworzone bezpośrednio przez połączenie wykluczania komórek z modelowaniem wysp DEX. Metody te są kompatybilne z różnymi podejściami do obchodzenia się z cieczami, w tym z ręcznym mikropipetowaniem, i mogą być stosowane z praktycznie każdym typem komórek przylegających.

Aby dobrać odpowiednią kombinację PEG i DEX do wzorowania komórek, istotne jest wyznaczenie krzywej binodalu. Krzywa ta wyznacza punkty, w których może powstać ATPS, a jej przebieg dla danego zestawu polimerów może się różnić w zależności od temperatury, pH i zawartości jonów. W przypadku hodowli komórek wymagających spersonalizowanych składów pożywki konieczne może być eksperymentalne wyznaczenie krzywej binodalu. Osiąga się to poprzez generowanie serii układów ATPS, które znajdują się daleko od binodalu i różnią się za...

Wodne systemy dwufazowe były używane do jednoczesnego modelowania wielu populacji komórek. Ta szybka i łatwa metoda modelowania komórek wykorzystuje separację faz wodnych roztworów dekstranu i glikolu polietylenowego oraz napięcie międzyfazowe, które istnieje między tymi dwoma roztworami polimerów.

Modelowanie kohodowli komórkowych przy użyciu wodnych systemów dwufazowych

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Ogólnym celem tej procedury jest bezpośrednie wzorowanie komórek w całkowicie wodnych środowiskach. Jest to osiągane poprzez uprzednie rozpuszczenie długołańcuchowych polimerów, takich jak glikol polietylenowy i dekstryna, w oddzielnych probówkach zawierających pożywkę do hodowli komórek. Drugim krokiem jest trypsynizacja, zebranie osadu oraz resuspensja komórek z pożądaną gęstością zasiewu w jednym lub obu roztworach polimeru.Następnie roztwory polimerów nanosi się na szalkę do hodowli komórek. Niekompatybilność obu polimerów umożliwia przestrzenne wzorowanie tych dwóch w pełni wodnych cieczy. Komórki można zawrzeć w jednym z roztworów polimerowych lub w obu, aby uzyskać różnorodne wzory.Ostatnim krokiem jest usunięcie roztworów polimerowych po tym, jak komórki miały czas na adhezję przez cztery godziny lub dłużej, i zastąpienie ich pożywką hodowlaną. Ostatecznie do potwierdzenia wzoru rozmieszczenia komórek można wykorzystać mikroskopię w świetle przechodzącym lub fluorescencyjną. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak mikrokontaktowy druk, jest fakt, że komórki są rozmieszczane we w pełni wodnym środowisku przy użyciu prostych narzędzi, takich ja

cell-co-culture-patterning-using-aqueous-two-phase-systems

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przetłumacz na język polski. Zachowaj dokładnie wszystkie tagi HTML i formatowanie. Wypisz tylko tłumaczenie.

Modelowanie współkultury komórkowej za pomocą wodnych systemów dwufazowych

Przedstawiono protokół do zrobotyzowanego drukowania sferoid komórek rakowych na wysokoprzepustowej 96-dołkowej płytce przy użyciu wodnego systemu dwufazowego.

Zrobotyzowana produkcja sferoid komórek rakowych z wodnym dwufazowym systemem do testowania leków

Opisujemy protokół modyfikacji powinowactwa komórek powierzchni rusztowania w środowisku wodnym. Metoda wykorzystuje fotokatalizę dwutlenku tytanu do rozkładu filmu organicznego w obszarze napromieniowanym światłem. Pokazujemy, że można go wykorzystać do tworzenia mikrodomen białek rusztowań, zarówno ex situ, jak i in situ.

Fotowzorcowanie białek i komórek w środowisku wodnym za pomocą fotokatalizy TiO2

Przedstawiamy protokół do wykonywania subtraktywnego wzorcowania monowarstw żywych komórek na powierzchni. Osiąga się to poprzez miejscową i selektywną lizę przylegających komórek za pomocą sondy mikroprzepływowej (MFP). Lizat komórkowy pobrany z lokalnych regionów może być wykorzystany do dalszej analizy, umożliwiając badania profilowania molekularnego.

Szybkie subtraktywne modelowanie warstw żywych komórek za pomocą sondy mikroprzepływowej

Opisujemy sekwencyjny proces tworzenia za pośrednictwem światła i późniejszego biochemicznego wzorcowania syntetycznych matryc hydrożelowych do zastosowań w trójwymiarowych hodowlach komórkowych. Przedstawiono budowę i modyfikację hydrożeli za pomocą cytokompatybilnej chemii photoclick. Ponadto przedstawiono łatwe techniki ilościowego określania i obserwacji wzorców oraz określania żywotności komórek w tych hydrożelach.

Tworzenie i modelowanie hydrożeli za pośrednictwem światła do zastosowań w hodowlach komórkowych

Ten raport opisuje prostą, łatwą do wykonania technikę, wykorzystującą próżnię niskociśnieniową, do wypełniania kanałów mikroprzepływowych komórkami i substratami do badań biologicznych.

Wszechstronna metoda modelowania białek i komórek

Tutaj prezentujemy protokół do mikrowzorcowania komórek w rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą adhezji programowanej przez DNA. Protokół ten wykorzystuje laboratoryjną platformę fotolitograficzną do tworzenia wzorów oligonukleotydów DNA na szkiełku szkiełkowym, a następnie znakuje błony komórkowe dostępnymi na rynku komplementarnymi oligonukleotydami. Hybrydyzacja oligonukleotydów powoduje zaprogramowaną adhezję komórek.

Proste, niedrogie i modułowe modelowanie komórek za pomocą DNA

Tradycyjnie, hodowla komórkowa jest przeprowadzana na płaskich podłożach, które słabo naśladują naturalne środowisko komórek in vivo. W tym miejscu opisujemy metodę wytwarzania substratów do hodowli komórkowych o fizjologicznie istotnych zakrzywionych geometriach i mikrowzorach białek zewnątrzkomórkowych, co pozwala na systematyczne badania nad komórkowym wykrywaniem tych zewnątrzkomórkowych sygnałów.

Generowanie wielokierunkowych mikrośrodowisk komórkowych za pomocą fotomodelingu UV trójwymiarowych substratów do hodowli komórkowych

Ten protokół opisuje metodę tworzenia wzorców komórkowych bez tuszu, bez etykiet, niezależną od podłoża, opartą na efekcie magnetycznym Archimedesa.

Wzorcowanie komórek przy użyciu strategii magnetyczno-archimedesowej

Protokół pokazuje nowatorski model eksperymentalny in vitro, który może podsumować biologię dwóch rodzajów przylegających linii komórkowych za pomocą trójwymiarowego (3D) wydrukowanego rusztowania. Opisano budowę tego modelu i procedury operacyjne, od przygotowania komórek i hodowli komórek po analizę i ocenę.

Model kohodowli z wykorzystaniem dwóch typów przylegających linii komórkowych

Opracowano wszechstronną technikę litografii plazmowej do tworzenia stabilnych wzorów powierzchniowych służących do kierowania adhezją komórkową. Technika ta może być stosowana do tworzenia sieci komórkowych, w tym takich, które naśladują naturalne tkanki, i była wykorzystywana do badania kilku odrębnych typów komórek.

Wzornictwo powierzchni metodą litografii plazmowej do tworzenia sieci komórkowych

Poznaj metodę wzorowania komórek w wodnych układach dwufazowych z użyciem polimerów PEG i dextran. Technika ta umożliwia szybką organizację przestrzenną komórek dla zastosowań w inżynierii tkankowej.

Modelowanie kohodowli komórkowych przy użyciu wodnych systemów dwufazowych

Przeglądaj więcej filmów