Modelowanie kohodowli komórkowych przy użyciu wodnych systemów dwufazowych

Ogólnym celem tej procedury jest bezpośrednie modelowanie komórek w całkowicie wodnym środowisku. Osiąga się to poprzez rozpuszczenie polimerów o długich łańcuchach, takich jak glikol polietylenowy i dekstryna, w oddzielnych probówkach zawierających pożywkę do hodowli komórkowych. Drugim krokiem jest próba anyżu, zebranie granulatu i ponowne zawieszenie komórek o pożądanej gęstości wysiewu w jednym lub obu roztworach polimerowych.

Następnie roztwory polimerów są dozowane na naczynie do hodowli komórkowych. Niekompatybilność tych dwóch polimerów pozwala na przestrzenne modelowanie dwóch w pełni wodnych cieczy. Komórki mogą być zawarte w roztworze polimeru lub w obu roztworach polimerowych, aby uzyskać różnorodne wzory.

Ostatnim krokiem jest usunięcie roztworów polimerowych, gdy komórki będą mogły przylegać przez cztery godziny lub dłużej, i zastąpienie ich pożywką hodowlaną. Ostatecznie mikroskopia jasnego pola lub mikroskopia fluorescencyjna mogą być wykorzystane do potwierdzenia wzorców komórkowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak druk mikrokontaktowy, jest to, że komórki są modelowane w całkowicie wodnym środowisku za pomocą prostych narzędzi, takich jak wzory mikrorurek.

Metoda ta może być wykorzystana w inżynierii tkankowej do oceny migracji komórek oraz do badania sygnalizacji perykrynnej i autokrynnej między komórkami, demonstrując procedury Abraham, studenta studiów licencjackich i Joshua White, doktoranta z laboratorium Takayama. Zacznij od rozpuszczenia dwóch różnych polimerów w określonym pożywce, która zostanie użyta w twoich eksperymentach. W tym przykładzie glikol polietylenowy, znany również jako PEG i Dextrin, znany również jako Dex, ma masę cząsteczkową odpowiednio 35 kilodaltonów i 500 kilodaltonów.

Przygotuj 16 dwumililitrowych próbek w 15-mililitrowych stożkowych probówkach, każda o innym stężeniu PEG i dex, podobnie jak w tabeli pokazanej tutaj. Aby to osiągnąć, odważ odpowiednie ilości PEG i dex zgodnie z tabelą i wymieszaj je z podłożem, delikatnie kołysząc, aż oba polimery całkowicie się rozpuszczą. Może to potrwać kilka godzin po całkowitym rozpuszczeniu polimerów.

Roztwór powinien być mętny. Potwierdzić separację faz, odwirowując próbki w temperaturze 1000 G przez pięć minut. Gęstsza faza dna będzie bogata w dex.

Górna faza będzie bogata w kołki. Następnie powoli dodaj 0,1 mililitra dodatkowego podłoża do probówek i wiruj próbki przez 20 sekund. Następnie ponownie odwirować próbki, aby sprawdzić, czy nie ma separacji faz.

Roztwór jest klarowny po dodaniu dodatkowych objętości pożywki, powtórzyć ten krok, dodając kolejne 0,1 mililitra pożywki, mieszając i odwirowując próbki, aż roztwór stanie się klarowny i nie będzie już rozdzielał faz. Oznacza to, że osiągnięto próg punktu krytycznego dla tej konkretnej mieszaniny. W tym momencie zapisz ostateczną wagę każdej probówki.

Na koniec określ procentową masę na masę dwóch polimerów w punkcie separacji twarzy. Wykreśl krzywą węzłową pojemnika, umieszczając procent masy na kołek wagowy na osi y, a procent ciężaru na pokład masy na osi X. Krzywa ta jest stężeniami progowymi dla separacji czołowej PEG i dex w tym medium.

Aby rozpocząć tworzenie wzorca wykluczenia komórek, należy przygotować oddzielne roztwory PEG i dex o dwukrotnie wyższych wartościach punktu krytycznego, określonych przez próg węzłowy pojemnika. W tych eksperymentach 5% wagi na wagę PEG i 12,8% wagi na wagę pokłady są dodawane do DMEM z 10% FBS i 1% antybiotykami. Rurki umieszcza się na kołysce, aby mogły się całkowicie rozpuścić.

Następnie zbierz komórki, które mają być użyte do wzorca wykluczenia w tym eksperymencie, komórki hela przy 80% konfluencji są trypsowane przy użyciu 0,5% tripsyny przez trzy minuty. Po zebraniu policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru, a następnie osadź i ponownie zawieś komórki w 375 000 komórek na mililitr w pożywce z dodatkiem 5% PEG. To stężenie spowoduje powstanie próbek, które po wyhodowaniu staną się zlewające następnego dnia.

Następnie, za pomocą mikropipetera, dozuj 0,5 mikrolitra kropelki 12,8% roztworu pokładowego na suchą 96-dołkową płytkę w celu wykluczenia. Kropelki dex można pozostawić do wyschnięcia w sterylnych warunkach do późniejszego wykorzystania. Następnie powoli dozuj 200 mikrolitrów zawiesiny ogniw PEG hela do studzienki.

Aby przykryć kropelki D, ważne jest, aby najpierw pokryć kroplę D roztworem PEG przed wypełnieniem otaczających obszarów, ponieważ zapobiega to zakłóceniu kropli, gdy rozprzestrzenia się ona po studzience. Gdy wszystkie studzienki zostaną starannie wyprofilowane i wysiane, umieść płytkę do hodowli komórkowej w nawilżonym inkubatorze. Upewnij się, że naczynie nie jest przechylone podczas przenoszenia i że jest umieszczone na równej półce inkubatora, aby uniknąć zakłócenia wzorów po pozostawieniu komórek do przylegania przez 12 godzin.

Usuń roztwór PEG i przemyj trzykrotnie 200 mikrolitrami pożywki hodowlanej, aby usunąć wszelkie pozostałości polimerów. Następnie dodaj 200 mikrolitrów świeżej pożywki hodowlanej i włóż płytkę z powrotem do inkubatora. Okresowo monitoruj kultury, aby obserwować proliferację komórek i migrację do stref wykluczenia, aby rozpocząć tworzenie wzorów wyspowych.

Przygotuj roztwory o zawartości 5% wagowo PEG i 12,8% wagowo na wagę w pożywce do hodowli komórkowych. Zbierz również komórki hela, które mają być użyte do tworzenia wzorów wyspowych i ponownie określ całkowitą liczbę dostępnych komórek za pomocą hemocytometru. Następnie pellet i resus.

Zakręć komórki z prędkością 5 milionów komórek na mililitr w podłożu. Kontynuując 12,8% dex, może być potrzebne wyższe stężenie komórek, aby osiągnąć konfluencję w ciągu 24 godzin, jeśli komórki nie przylegają tak dobrze jak komórki heela. Następnie odpipetuj 200 mikrolitrów roztworu PEG do każdego dołka na 96-dołkowej płytce.

Następnie powoli dodać 0,5 mikrolitra kropli zawiesiny komórek pokładowych do każdej studzienki zawierającej roztwór PEG. Kropelki opadną na dno i zetkną się z powierzchnią kultury. Następnie ostrożnie przenieś płytkę do inkubatora, uważając, aby w żadnym miejscu nie przechylić naczynia, co może zakłócić wzory po 12 godzinach.

Usuń roztwór PEG i przemyj trzy razy 200 mikrolitrami pożywki hodowlanej. Następnie dodaj 200 mikrolitrów świeżej pożywki hodowlanej i włóż płytkę z powrotem do inkubatora. Okresowo monitoruj kultury, aby obserwować proliferację komórek i migrację na zewnątrz wysp.

Rozpocznij wzorcowanie wspólnej hodowli, przygotowując roztwory 5% wagi na wagę PEG i 12,8% wagi na wagę pokłady w DMEM z 10% FPS i 1% Antybiotyki również rosną w dwóch typach komórek, które mają być używane w wykluczeniu i wzorcu wyspowym, tak aby były bliskie zbiegu. W tym samym czasie użyjemy wysp hepatocytów Hep G dwóch C3 a z otaczającymi je NIH trzema T trzema fibroblastami. Następnie zbierz dwa typy komórek i policz je osobno za pomocą hemocytometru.

Te dwa typy komórek można łatwo odróżnić za pomocą granulek mikroskopii jasnego pola, hepatocyty Hep G dwa C3 A do tworzenia wzorów wyspowych i resus w 12,8% pokładach. Następnie zagnieździć fibroblasty w celu wykluczenia, wzoru i zawieszenia resus w 5% peg. Następnie dozuj 0,5 mikrolitra kropelki zawiesiny komórek D na suchą 96-dołkową płytkę i delikatnie przykryj kropelki dex 200 mikrolitrami zawiesiny komórek PEG.

Następnie po 12 godzinach przenieś płytkę do inkubatora. Usuń pożywkę i spłucz trzykrotnie 200 mikrolitrami pożywki hodowlanej. Następnie dodaj 200 mikrolitrów świeżej pożywki hodowlanej i włóż płytkę z powrotem do inkubatora.

Wreszcie, monitorowanie intensywności barwienia albuminy kultur co można wykorzystać do oceny korzystnych skutków hodowli fibroblastów. Stężenia polimerów wymagane do wytworzenia różnych wodnych układów dwufazowych są tutaj opisane za pomocą krzywych węzłowych przedziału przy stężeniach powyżej krzywej węzłowej bin. System tworzy dwie fazy poniżej krzywej węzłowej pojemnika.

Rozwiązaniem są przezroczyste jednofazowe systemy dwufazowe co najmniej dwukrotne. Stężenia tych znajdujących się na krzywej binarnej są wystarczające do stosowania w wodnych układach dwufazowych opisanych w tym filmie. Pierwszym przykładem ich zastosowania jest wzorzec wykluczenia, w którym małe obszary mogą pozostać pozbawione komórek.

Wzorzec wyspowy tworzy dokładne przeciwieństwo wzorca wykluczeń, w którym małe regiony mogą być osadzone z komórkami. Połączenie tych dwóch procedur można wykorzystać do stworzenia unikalnej kokultury, w której wyspa komórek może być otoczona innym typem komórek, jak pokazano tutaj. Komórki Hela posiane przy użyciu wzorca wykluczenia będą się namnażać i migrować, aby wypełnić pustkę.

Z biegiem czasu. Wielkość pustki może być monitorowana, aby dostarczyć cennych informacji na temat migracji i wzrostu komórek w różnych warunkach. Z drugiej strony wzorzec wyspowy można wykorzystać do pomiaru wzrostu komórek.

Połączenie wzorca wyspiarskiego i wykluczonego tworzy dobrze zdefiniowane regiony kokultury. Pokazane tutaj są wyspy hepatocytów otoczone komórkami fibroblastów. Stwierdzono, że kolonie te utrzymują swoją organizację przez co najmniej cztery dni w kulturze.

Za pomocą tego systemu można hodować wiele wysp komórek na tej samej płytce. Hepatocyty hodowane jako same wyspy wytwarzały nieco mniej albuminy niż wtedy, gdy były hodowane w kokulturze z fibroblastami. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby używać stężeń polimerów dwukrotnie przekraczających stężenie krytyczne, aby utworzyć roztwory dwufazowe.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak sformułować wodny układ dwufazowy i używać go do tworzenia wzorów komórek i definiowania geometrii.