Name: Izolacja płynu mózgowo-rdzeniowego z zarodków gryzoni do stosowania z wypreparowanymi eksplantatami kory mózgowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Poznaj metodę izolacji płynu mózgowo-rdzeniowego z zarodków gryzoni do hodowli eksplantatów kory mózgowej. Ta technika pozwala badać sygnały rozwojowe CSF in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie od NIH (nagrody o numerach R00 NS072192 dla M.K.L., HD029178 dla A-S.L., oraz 2 RO1 NS032457 dla C.A.W.). M.K.L. jest laureatem stypendium Children's Hospital Boston Career Development Fellowship/Harvard Medical School Shore Fellowship oraz członkiem Fundacji Alfreda P. Sloana. C.A.W. jest badaczem w Instytucie Medycznym Howarda Hughesa.

1. Izolacja/Przygotowanie zarodka
Ta technika może być użyta dla myszy lub szczura. W tym protokole demonstrujemy technikę pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego i sekcję eksplantatu kory mózgowej za pomocą embrionalnego mózgu myszy. Skomentujemy wszelkie istotne różnice między szczurami a myszami, które istnieją w ramach ogólnych technik. W przypadku systemu oceny wieku embrionalnego E1 jest klasyfikowany jako dzień czopa u szczurów, a E0,5 jest klasyfikowany jako dzień czopa u myszy.
<ol>
 <li>Przygotuj naczynie do mikropreparacji z elastomerem silikonowym Sylgard. Elastomer silikonowy Sylgard 184 jest dostarczany w postaci dwuskładnikowego płynu, części A i części B. Część A i część B miesza się w stosunku wagowym lub objętościowym w stosunku 10:1. Po wymieszaniu płynnych składników wlać elastomer sylgard do szalki Petriego, aby pokryć całą powierzchnię naczynia. Mogą być obecne pęcherzyki powietrza, które rozproszą się podczas procesu utwardzania. Nałożyć pokrywkę na szalkę Petriego i pozwolić elastomerowi utwardzić się. Elastomer można utwardzać w temperaturze pokojowej przez 24 godziny lub w wyższych temperaturach (np. 37 °C) w celu szybszego utwardzania. Gdy płynne składniki zestalą się, naczynie do preparacji jest gotowe do użycia. Naczynie może być używane wielokrotnie do wielu eksperymentów, pod warunkiem, że zostanie dobrze wyczyszczone zgodnie z procedurą.</li>
 <li>Przygotowanie pipety mikrokapilarnej (igły). Pipety mikrokapilarne przygotowuje się poprzez podgrzanie i pociągnięcie za pomocą pionowego ściągacza do mikropipet Narishige PC-10 z następującymi ustawieniami: Pociągnięcie jednoetapowe; Grzałka #2 ustawiona na 58; Ciężarek do uciągu: 100 g. Cienka końcówka mikropipety jest ostrożnie odłamywana za pomocą cienkich kleszczyków #55. Uzyskana średnia średnica wewnętrzna igły wynosi 85 μm.</li>
 <li>Przygotuj zespół aspiratora do aspiracji płynu mózgowo-rdzeniowego. Wprowadzić mikrotłok wyposażony w pipety mikrokapilarne do igły kapilarnej. Alternatywnie należy przymocować plastikowy filtr jednorazowego użytku do końca zespołu rurki aspiratora, która jest podłączona do pipety mikrokapilarnej. Przepchnij igłę przez uszczelkę na miejsce na przeciwległym końcu zespołu aspiratora.</li>
 <li>Przenieść zarodek wyizolowany z miotu do naczynia do mikropreparacji przygotowanego z użyciem produktu Sylgard.</li>
 <li>Usunąć błony i tkanki pozazarodkowe tak, aby zarodek był wyraźnie odsłonięty. Każda warstwa tkanki - najpierw ściana macicy, a następnie decidua - może być wypreparowana za pomocą cienkich nożyczek do irydektomii (tj. Fine Science Tools # 15000-02). W każdym miejscu implantacji najpierw ścianę macicy, a następnie decidua można naciąć równolegle do długiej osi macicy, a następnie nacięcie można dalej otwierać za pomocą cienkich kleszczy. Decidua można usunąć po podobnym nacięciu, odsłaniając błony płodu. Należy zachować ostrożność, aby błony płodu nie zostały nacięte lub przebite.</li>
 <li>Przemyć sterylnym zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS) i usunąć nadmiar płynu z otaczającego zarodka za pomocą pipety oraz kimwipe lub bibuły filtracyjnej pokrojonej w trójkąty.</li>
</ol>
2. Kolekcja płynu mózgowo-rdzeniowego komorowego
<ol>
 <li>Wizualizuj zarodek pod mikroskopem preparacyjnym: w przypadku myszy zarodek powinien leżeć na boku, tak aby mieć strzałkowy widok rozwijającego się zarodka. W przypadku zarodków szczurów E16 lub starszych należy umieścić zarodek na grzbietowej kolumnie kręgosłupa, wzdłuż jego najdłuższego płaskiego wymiaru, od kierunku czaszkowego do ogonowego, tak jakby zarodek leżał na plecach. W ten sposób płyn mózgowo-rdzeniowy można pobrać zarówno z prawej, jak i lewej komory bocznej.</li>
 <li>Równomiernie wprowadzaj pipetę mikrokapilarną do komory bocznej, komory śródmózgowia lub cisterna magna, starając się nie kontaktować z komórkami nabłonka nerwowego po włożeniu pipety. W przypadku zarodków myszy E14,5 lub starszych płyn mózgowo-rdzeniowy można odessać z prawej komory, a następnie wyjąć igłę i wprowadzić do lewej komory. Ze względu na drożność komór i cewy nerwowej u zarodków młodszych niż E14,5, cała objętość płynu mózgowo-rdzeniowego może być często odessana z komór bocznych za pomocą jednej igły. Jednak nie zawsze tak jest, ponieważ czasy rozwoju i drożność komór łączących mogą się nieznacznie różnić, dlatego pipetę mikrokapilarną można również wprowadzić do cisterna magna, aby zebrać maksymalną objętość płynu mózgowo-rdzeniowego.</li>
 <li>Po wprowadzeniu pipety mikrokapilarnej do komory bocznej, komory śródmózgowia lub cisterna magna, ostrożnie i delikatnie rozpocznij zasysanie płynu mózgowo-rdzeniowego do pipety, używając mikrotłoka do wytworzenia podciśnienia i zasysania płynu mózgowo-rdzeniowego lub zapewniając delikatne podciśnienie wytwarzane przez usta, tak aby płyn mózgowo-rdzeniowy zaczął delikatnie przepływać do pipety mikrokapilarnej w powolny i kontrolowany sposób. Zalecamy, aby widz skontaktował się ze swoimi lokalnymi urzędnikami w sprawie polityki instytucjonalnej dotyczącej tych podejść.</li>
 <li>Kontynuuj stosowanie podciśnienia i zbieraj płyn mózgowo-rdzeniowy do pipety mikrokapilarnej. Zarówno u zarodków myszy, jak i szczurów o wartości E16,5/E17 lub młodszych można zaobserwować lekkie zapadnięcie się komory po pojawieniu się wgłębienia tworzącego się po stronie głowy, w której znajduje się pipeta mikrokapilarna. U starszych zarodków, ze względu na większy rozmiar mózgu, może nie być możliwe zaobserwowanie zapadania się głowy.</li>
 <li>Przestań wywierać nacisk i delikatnie wyjmij pipetę mikrokapilarną z komory bocznej.</li>
 <li>Delikatnie wylać próbkę płynu mózgowo-rdzeniowego do probówki Eppendorfa, która została schłodzona na lodzie.</li>
 <li>Kontynuuj pobieranie płynu mózgowo-rdzeniowego z całego miotu zwierząt i umieść próbki w tej samej probówce.</li>
 <li>Wirować przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczających komórek.</li>
 <li>Przeanalizować próbki pod kątem jakichkolwiek oznak zanieczyszczenia komórek nabłonka nerwowego lub czerwonych krwinek. Oznaki zanieczyszczenia są zwykle sygnalizowane przez mętny lub czerwono-różowy płyn lub obecność granulki z plamką zabarwioną krwią. Po odwirowaniu płyn mózgowo-rdzeniowy można analizować pod mikroskopem pod kątem jakichkolwiek śladów komórek lub szczątków komórkowych. Jeśli widoczne są oznaki zanieczyszczenia, płyn należy wyrzucić. Jako dodatkowa kontrola, zawartość osadów może być również barwiona na komórki. Czysta próbka płynu mózgowo-rdzeniowego może być używana do hodowli komórkowych, hodowli korowej, spektrometrii, western blot, ELISA i innych testów. Przezroczysty płyn mózgowo-rdzeniowy należy przenieść do nowej sterylnej probówki Eppendorfa. Próbka może być teraz wykorzystana do analizy, połączona z innymi próbkami lub zamrożona w ciekłym azocie i przechowywana w temperaturze -80 °C. Zamrożenie i rozmrożenie małych próbek płynu może spowodować niewielki spadek objętości i zmiany stężenia białka. Można tego uniknąć poprzez liofilizację próbek.</li>
</ol>
3. Rozwarstwienie eksplantatu korowego
<ol>
 <li>Przenieść zarodek E14,5 wyizolowany ze ściółki na naczynie do mikropreparacji przygotowane z użyciem produktu Sylgard.</li>
 <li>Usunąć zarodek z błon i tkanek pozazarodkowych zgodnie z opisem w kroku 1.5.</li>
 <li>Przemyć sterylnym zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS) i usunąć nadmiar płynu z otaczającego zarodka za pomocą pipety.</li>
 <li>Przeprowadź sekcję przez obszar szyjki macicy oddzielający głowę od reszty zarodka (ryc. 1A).</li>
 <li>Za pomocą cienkiego skalpela (noża okulistycznego) odetnij linię środkową skóry głowy. Chwyć każdą stronę tego nacięcia cienkimi kleszczami i usuń skórę. Następnie użyj nożyczek do irydektomii, aby wykonać nacięcie biegnące wzdłuż linii środkowej rozwijającej się czaszki. Następnie wykonaj dwa dodatkowe nacięcia, około 1/3 odległości od przedniego i tylnego końca rozwijającej się czaszki. Użyj cienkich kleszczy, aby chwycić "płaty" czaszki, które powstają w wyniku tej części sekcji, i usuń rozwijającą się tkankę czaszki, odsłaniając korę (ryc. 1B).</li>
 <li>Za pomocą skalpela przetnij mózg wzdłuż linii środkowej w płaszczyźnie środkowej strzałkowej, oddzielając prawą i lewą półkulę korową (ryc. 1B, C). Pia i pajęczynówka pozostają przyczepione do kory, a opona twarda jest usuwana wraz z rozwijającą się czaszką.</li>
 <li>Przygotuj każdą półkulę korową osobno. Umieść półkulę przyśrodkową do góry, tak aby można było zobaczyć wyniosłość zwojową i rozwijającą się korę (ryc. 1C, D).</li>
 <li>Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie koronalne przez nabłonek nerwowy kory ogonowej do rozwijającej się opuszki węchowej. To nacięcie powinno zaczynać się na przedniej granicy bocznych i przyśrodkowych wypukłości zwojowych i rozciągać się przez przedni obszar zakrętu obręczy rozwijającego się zaczątka korowego (ryc. 1E).</li>
 <li>Wykonaj kolejne nacięcie koronalne tuż doogonowo do tylnej granicy bocznej wyniosłości zwojowej (ryc. 1F). To nacięcie powinno również rozciągać się od bocznej granicy wyniosłości zwojowej do przyśrodkowej ściany rozwijającego się zaczątka korowego.</li>
 <li>Wycofaj "płat" korowy utworzony przez dwa nacięcia wykonane w krokach 3.7 i 3.8, używając skalpela lub delikatnego nacisku strumienia HBSS dostarczanego pipetorem o pojemności 200 μl, aby uniknąć mechanicznego uszkodzenia kory. Następnie wykonaj poprzeczne nacięcie wzdłuż granicy oddzielającej boczne wybrzuszenie zwojowe od rozwijającej się kory (ryc. 1G, H). Następnie należy wypreparować rozwijający się hipokamp i rąbek korowy śródmózgowia przyśrodkowego, na szczycie kory nowej, gdzie boczna powierzchnia kory spotyka się ze ścianą międzypółkulową.</li>
 <li>Wykonaj poprzeczne nacięcie wzdłuż granicy oddzielającej boczną wyniosłość zwojową od rozwijającej się kory (ryc. 1H).</li>
 <li>Usunąć wszelkie dodatkowe wypreparowane tkanki, które znajdują się na płytce Sylgard z wypreparowanego eksplantatu korowego. Można użyć delikatnego pipetowania ze świeżym buforem HBSS, aby odpipetować nadmiar wypreparowanej tkanki. Wypreparowana kora mózgowa jest teraz skierowana stroną oponową skierowaną w dół (ryc. 1I).</li>
</ol>
4. Przenoszenie eksplantatu korowego
<ol>
 <li>Przygotuj pętlę z drutu platynowego podłączoną do szklanej pipety. Podgrzej szklaną pipetę za pomocą złożonego platynowego drutu włożonego na końcu szklanej pipety. Przekręcając koniec pętli z drutu platynowego, rozmiar pętli można zwiększyć lub zmniejszyć, a pętlę można ukształtować tak, aby pasowała do pożądanego rozmiaru eksplantatu. (Można to przygotować wcześniej i ponownie wykorzystać.)</li>
 <li>Podgrzej koniec drutu platynowego, aby wysterylizować pętlę.</li>
 <li>Odizolować wypreparowany eksplant korowy i usunąć dodatkowe podłoże HBSS przez delikatne pipetowanie, pozostawiając niewielką ilość do użycia z drucianą pętlą.</li>
 <li>Umieść membranę poliwęglanową o grubości 1 cm w naczyniu obrazowym o średnicy 4 cm.</li>
 <li>Używając boku pętli z drutu platynowego, delikatnie odwróć korę tak, aby strona opony mózgowej była skierowana do góry.</li>
 <li>Podnieś eksplant korowy z naczynia rozwarstwiającego, umieszczając eksplant w środku pętli i wykorzystując wewnętrzne siły hydrostatyczne do podniesienia eksplantatu na płaskiej płaszczyźnie.</li>
 <li>Delikatnie umieść eksplant na membranie poliwęglanowej i podnieś pętlę z drutu platynowego tak, aby eksplant pozostał na membranie na płaskiej płaszczyźnie z powierzchnią komory stykającą się z membraną.</li>
 <li>Delikatnie podnieść membranę i odpipetować 50 μl płynu mózgowo-rdzeniowego lub innego medium znajdującego się pod membraną.</li>
 <li>Przykryj naczynie do obrazowania, umieść je w nawilżonym pojemniku wtórnym i inkubuj w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 24 godziny, aby wspierać dalszą proliferację komórek i wzrost eksplantatów. Rysunek 2 przedstawia schemat końcowego przygotowania naczynia z eksplantatu kory mózgowej.</li>
</ol>

<ol><li>Dziegielewska, K. M., Evans, C. A., Lai, P. C., Lorscheider, F. L., Malinowska, D. H., Mollgard, K., Saunders, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins+in+cerebrospinal+fluid+and+plasma+of+fetal+rats+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteins in cerebrospinal fluid and plasma of fetal rats during development.</a> Developmental Biology. 83 (1), 193-200 (1981).</li>
<li>Gato, A., Martin, P., Alonso, M. I., Martin, C., Pulgar, M. A., Moro, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cerebro-spinal+fluid+protein+composition+in+early+developmental+stages+in+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology.+Part+A%2C+Comparative+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos.</a> Journal of Experimental Zoology. Part A, Comparative Experimental Biology. 301 (4), 280-289 (2004).</li>
<li>Gato, A., Moro, J. A., Alonso, M. I., Bueno, D., Mano, D. L., Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+cerebrospinal+fluid+regulates+neuroepithelial+survival%2C+proliferation%2C+and+neurogenesis+in+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record.+Part+A%2C+Discoveries+in+Molecular%2C+Cellular%2C+and+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos.</a> The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 284 (1), 475-484 (2005).</li>
<li>Parada, C., Gato, A., Aparicio, M., Bueno, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+chick+embryonic+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of chick embryonic cerebrospinal fluid.</a> Proteomics. 6 (1), 312-320 (2006).</li>
<li>Parada, C., Gato, A., Bueno, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+embryonic+cerebrospinal+fluid+proteome+has+greater+apolipoprotein+and+enzyme+pattern+complexity+than+the+avian+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome.</a> Journal of Proteome Research. 4 (6), 2420-2428 (2005).</li>
<li>Zappaterra, M. D., Lisgo, S. N., Lindsay, S., Gygi, S. P., Walsh, C. A., Ballif, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+proteomic+analysis+of+human+and+rat+embryonic+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid.</a> Journal of Proteome Research. 6 (9), 3537-3548 (2007).</li>
<li>Desmond, M. E., Jacobson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+brain+enlargement+requires+cerebrospinal+fluid+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic brain enlargement requires cerebrospinal fluid pressure.</a> Developmental Biology. 57 (1), 188-198 (1977).</li>
<li>Lehtinen, M. K., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+at+the+brain-cerebrospinal+fluid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis at the brain-cerebrospinal fluid interface.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 653-679 (2011).</li>
<li>Lehtinen, M. K., Zappaterra, M. W., Chen, X., Yang, Y. J., Hill, A. D., Lun, M., Maynard, T., Gonzalez, D., Kim, S., Ye, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cerebrospinal+fluid+provides+a+proliferative+niche+for+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells.</a> Neuron. 69 (5), 893-905 (2011).</li>
<li>Martin, C., Alonso, M. I., Santiago, C., Moro, J. A., De la Mano, A., Carretero, R., Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+embryonic+brain+development+in+rats+requires+the+trophic+influence+of+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+International+Society+for+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid.</a> International Journal of Developmental Neuroscience: The Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 27 (7), 733-7340 (2009).</li>
<li>Martin, C., Bueno, D., Alonso, M. I., Moro, J. A., Callejo, S., Parada, C., Martin, P., Carnicero, E., Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF2+plays+a+key+role+in+embryonic+cerebrospinal+fluid+trophic+properties+over+chick+embryo+neuroepithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells.</a> Developmental Biology. 297 (2), 402-416 (2006).</li>
<li>Zappaterra, M. W., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cerebrospinal+fluid%3A+regulator+of+neurogenesis%2C+behavior%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">The cerebrospinal fluid: regulator of neurogenesis, behavior, and beyond.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 69 (17), 2863-2878 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisana metoda pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego w komorach pozwoliła uzyskać stosunkowo czyste próbki embrionalnego płynu mózgowo-rdzeniowego o stabilnym składzie białkowym i stałej aktywności w wielu testach komórkowych 9 . Przy dobrej technice zbierania i wielkości miotu dziesięciu myszy E14,5 można spodziewać się zebrania 10-15 μl płynu mózgowo-rdzeniowego, a z miotu szczurów E16 można spodziewać się zebrania około 50-90 μl płynu mózgowo-rdzeniowego. Ta technika pobierania minimalizuje zanieczyszczenie ...

Płyn mózgowo-rdzeniowy to złożony płyn, który obmywa rozwijający się nabłonek nerwowy 1-6 i dostarcza niezbędnego ciśnienia 7 oraz wskazówek stymulujących wzrost dla rozwijającego się mózgu 8-12. Aby zbadać płyn mózgowo-rdzeniowy w trakcie rozwoju mózgu, opracowaliśmy techniki izolowania komorowego płynu mózgowo-rdzeniowego z rozwijających się zarodków szczurów lub myszy na różnych etapach rozwoju 6,9. Poprzednie metody izolacji obejmowały użycie szklanej mikroigły i izolację płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą mikroiniektora 1,2. Nasza metoda wykorzystuje szklaną pipetę mikrokapilarną, której końcówka została pociągnięta w celu wytworzenia ultracienkiego punktu poprawiającego penetrację tkanki. Szklana pipeta mikrokapilarna jest podłączona do aspiratora, dzięki czemu pobieranie płynu mózgowo-rdzeniowego w komorze może być kontrolowane za pomocą delikatnych zmian ciśnienia. Aby zbadać wpływ sygnałów płynu mózgowo-rdzeniowego na komórki macierzyste, przeprowadzamy sekcję eksplantatów kory mózgowej, umieszczamy je na membranach poliwęglanowych i unosimy na odpowiedniej pożywce hodowlanej uzupełnionej próbkami płynu mózgowo-rdzeniowego 9. Dzięki tej technice zmniejszone objętości pożywek są wystarczające do hodowli tkanki, co pozwala na efektywne wykorzystanie płynu mózgowo-rdzeniowego 9.

<table><tbody><tr><td>Igły kapilarne Wiretrop II</td><td>Drummond Scientific</td><td>#5-000-2020</td><td></td></tr><tr><td>Kleje Sylgard</td><td>Ellsworth</td><td>#184 Zestaw</td><td></td>SIL ELAST</tr><tr><td>Zespół rurki aspiratora</td><td>Sigma</td><td>#A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Filtr jednorazowy</td><td>Venturiego lub lokalna apteka</td><td>niedostępna</td><td>Standardowy filtr papierosowy</td></tr><tr><td>Okrągły nóż optyczny (nóż kłujący 15 stopni)</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne, Inc.</td><td>#500250</td><td></td></tr><tr><td>35mm naczynie hodowlane ze szklanym dnem</td><td>MatTek Corp.</td><td>#P35G-1,5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Drut platynowo-irydowy</td><td>Tritech Research</td><td>#PT-9010-010-3FT</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nukleporowa</td><td>Whatman</td><td>#09-300-57</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Zrównoważony roztwór soli</td><td>Fisher Scientific</td><td>#SH30031. </td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do irydektomii</td> FS <td>Narzędzia do nauki pięknej</td><td>#15000-02</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja płynu mózgowo-rdzeniowego z zarodków gryzoni do stosowania z wypreparowanymi eksplantatami kory mózgowej

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Płyn mózgowo-rdzeniowy to złożony płyn z dynamicznie zmieniającym się proteomem w trakcie rozwoju i w wieku dorosłym. Podczas rozwoju embrionalnego powstający płyn mózgowo-rdzeniowy różnicuje się od płynu owodniowego po zamknięciu przedniej cewy nerwowej. Objętość płynu mózgowo-rdzeniowego zwiększa się następnie w kolejnych dniach, ponieważ neuroepitelialne komórki progenitorowe wyściełające komory i splot naczyniówkowy wytwarzają płyn mózgowo-rdzeniowy. Zarodek płynu mózgowo-rdzeniowego styka się z wierzchołkową, komorową powierzchnią nerwowych komórek macierzystych rozwijającego się mózgu i rdzenia kręgowego. Płyn mózgowo-rdzeniowy zapewnia kluczowe ciśnienie płynu dla ekspansji rozwijającego się mózgu i rozprowadza ważne czynniki stymulujące wzrost do nerwowych komórek progenitorowych w sposób specyficzny dla czasu. Aby zbadać funkcję płynu mózgowo-rdzeniowego, ważne jest, aby wyizolować czyste próbki embrionalnego płynu mózgowo-rdzeniowego bez zanieczyszczenia krwią lub rozwijającą się tkanką kresomózgowia. W tym miejscu opisujemy technikę izolowania stosunkowo czystych próbek embrionalnego płynu mózgowo-rdzeniowego komorowego, które można wykorzystać do szerokiego zakresu testów eksperymentalnych, w tym spektrometrii mas, elektroforezy białek oraz hodowli komórek i pierwotnych eksplantatów. Pokazujemy, jak preparować i hodować eksplantaty korowe na porowatych membranach poliwęglanowych w celu wzrostu rozwijającej się tkanki korowej ze zmniejszoną objętością pożywki lub płynu mózgowo-rdzeniowego. Dzięki tej metodzie można przeprowadzać eksperymenty z użyciem płynu mózgowo-rdzeniowego w różnym wieku lub w różnych warunkach, aby zbadać aktywność biologiczną proteomu płynu mózgowo-rdzeniowego na komórkach docelowych.

Pobrany płyn mózgowo-rdzeniowy powinien być klarowny i przezroczysty. Nie powinno być śladów zanieczyszczenia krwią, co objawiałoby się czerwoną lub żółtą barwą aspiratu oraz zawartości probówki Eppendorf. W aspiracie i probówce Eppendorf nie powinno być również obecnych fragmentów tkanek. Po odwirowaniu płynu mózgowo-rdzeniowego można przeprowadzić jego ocenę mikroskopową, aby upewnić się, że nie doszło do zanieczyszczenia. W przypadku stwierdzenia zanieczyszczeń próbkę należy utylizować. Z jednego miotu myszy w stadium...

Płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) kąpie komórki progenitorowe neuroepitelialu i kory mózgowej podczas wczesnego rozwoju mózgu w zarodku. W tym miejscu opisujemy metodę opracowaną w celu izolacji komorowego płynu mózgowo-rdzeniowego z zarodków gryzoni w różnym wieku w celu zbadania jego funkcji biologicznej. Ponadto demonstrujemy naszą technikę rozwarstwiania i hodowli eksplantatów kory mózgowej, która pozwala na wzrost eksplantatów przy minimalnych ilościach pożywki hodowlanej lub płynu mózgowo-rdzeniowego.

Izolacja płynu mózgowo-rdzeniowego z zarodków gryzoni do stosowania z wypreparowanymi eksplantatami kory mózgowej

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest obserwacja roli sygnałów wydzielanych do embrionalnego płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) w rozwoju kory mózgowia. Osiąga się to poprzez wstępne wyizolowanie embrionalnego CSF w celu wykorzystania go jako pożywki hodowlanej. W kolejnych krokach wycinana jest rozwijająca się ściana kory mózgowej, umieszczana na membranie poliwęglanowej i zawieszana w CSF.Wyniki analizy eksplantów z zastosowaniem barwienia immunocytochemicznego wskazują, że embrionalny CSF dostarcza sygnałów instrukcyjnych dla rozwijającej się kory mózgowej. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad CSF. Przykładowo: jakie są składniki CSF, jaka jest jego funkcja na różnych etapach rozwoju, a w przyszłości może pomóc w ustaleniu, w jaki sposób można go wykorzystać jako nośnik terapeutyczny w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych.Kluczowe jest, aby płyn mózgowo-rdzeniowy został pobrany bez zanieczyszczeń, a uszkodzenia eksplantu korowego zostały ograniczone do minimum. Procedury te mogą wymagać znacznej wprawy, ponieważ wiążą się z manipulowaniem małymi fragmentami tkanek przy użyciu bardzo precyzyjnych narzędzi sekcyjnych. Rozpocznij od przygotowania igieł mikropipet.Na przykład, używając pionowej mikro-wyrzynarki kapilar Orica PC 10, wyciągnij mikrokapilary o objętości od 10 do 20 µL, stosując następujące ustawienia: jednowykroczny cykl wyciągania (one step pull), grzałka nr 2 ustawiona na 58 oraz obciążenie 100 g. Odłam cienką końcówkę mikrokapilary za pomocą precyzyjnej pęsety nr 55. Średnica wewnętrzna otrzymanej igły wyniesie średnio 85 µm.Następnie należy przygotować zestaw aspiracyjny. W celu aspiracji CSF należy włożyć mikro tłok dołączony do mikro pipet kapilarnych do igły kapilarnej. Alternatywnie można przymocować jednorazowy filtr plastikowy do końca zestawu rurki aspiracyjnej połączonej z mikro pipetą kapilarną.Następnie, po przeciwnej stronie zespołu aspiratora, wsuń igłę przez uszczelkę w odpowiednią pozycję. Teraz przenieś izolowany embrion myszy lub szczura do szalki do mikrodysekcji przygotowanej z syl guard. Przemyj embrion sterylnym HBSS i usuń płyn otaczający embrion poprzez aspirację oraz osuszanie papierem chłonnym.Obserwuj embrion pod mikroskopem sekcyjnym. W przypadku embrionu myszy powinien on leżeć na boku, zapewniając widok strzałkowy. Następnie powoli wprowadź mikrokapilarę do komory bocznej lub komory przedniej, komory mezocefalicznej lub do CI sternum.Magna stara się nie kontaktować z komórkami neuroepitelialnymi. Po wprowadzeniu pipety należy wsuwać igłę tylko do momentu przebicia tkanki. Teraz należy ostrożnie i delikatnie rozpocząć aspirację CSF do pipety, wykorzystując łagodne podciśnienie wytworzone przez mikro tłok lub ssanie ustne.Płyn mózgowo-rdzeniowy powinien zacząć łagodnie i w sposób kontrolowany wpływać do mikrokapilary. Należy kontynuować przykładanie podciśnienia aż do całkowitego pobrania próbki. Kluczowe jest, aby pobrany płyn był klarowny i przejrzysty.Jeśli wystąpią jakiekolwiek oznaki zanieczyszczenia krwią, takie jak czerwony lub żółty odcień roztworu, należy zutylizować próbkę w przypadku zarówno zarodków myszy, jak i szczura. W stadium od E 16.5 do E 17 lub wcześniej można zaobserwować lekkie zapadnięcie się komory w miejscu umieszczenia mikrokapilary. Przepływ płynu mózgowo-rdzeniowego zostanie w tym momencie zatrzymany; po ustaniu przepływu należy delikatnie usunąć mikrokapilarę.Następnie ostrożnie przenieś zebraną próbkę CSF do schłodzonej w lodzie probówki do mikrocentryfugi, pobranej z miotu myszy w stadium E 14.5. Po zakończeniu wszystkich etapów pobierania należy spodziewać się uzyskania od 10 do 15 µL CSF. Centryfuguj probówkę przy 10 000 G i temperaturze 4 °C przez 10 minut.Aby usunąć wszelkie zanieczyszczone komórki, należy przenieść klarowny CSF do nowej probówki. Jeśli płyn zostanie uznany za czysty, można teraz przeprowadzić badanie mikroskopowe w celu wykrycia zanieczyszczeń. Próbkę można wykorzystać do analizy, połączyć z innymi próbkami lub zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80°C w celu późniejszego pobrania eksplantów korowych do eksperymentów z użyciem mediów uzupełnionych o CSF.W szalce pokrytej powłoką typu cigar odsłonić korę zarodka w stadium E 14.5. Za pomocą skalpela usunąć oponę twardą wraz z rozwijającą się czaszką, pozostawiając oponę miękką i pajęczyniczą przytwierdzone do kory. Przeciąć mózg wzdłuż linii środkowej w płaszczyźnie pośrodkowej, rozdzielając prawą i lewą półkulę kory.Każdą półkulę korową należy przygotować osobno. Półkulę należy ułożyć stroną przyśrodkową do góry, aby widoczna była eminencja zwojowa oraz rozwijająca się kora. Za pomocą skalpela należy wykonać cięcie wieńcowe przez neuroepitel korowy w kierunku rozwijającej się opuszki węchowej.Nacięcie to powinno rozpocząć się na przedniej granicy bocznych i przyśrodkowych wyniosłości zwojowych i przechodzić przez przedni region zakrętu obręczy rozwijającego się zrębu kory. Wykonaj kolejne nacięcie czołowe tuż przy tylnej granicy bocznej wyniosłości zwojowej. Nacięcie to powinno rozciągać się od bocznej granicy wyniosłości zwojowej do przyśrodkowej ściany rozwijającego się zrębu kory.Użyj skalpela, aby odsunąć płat korowy utworzony przez dwa nacięcia. Ogranicza to ryzyko uszkodzenia kory. Następnie wypreparuj rozwijający się hipokamp oraz brzeg korowy przyśrodkowej części głowy.Należy wykonać to od wierzchołka neocortex, w miejscu, gdzie boczna powierzchnia kory styka się ze ścianą między półkulami. Następnie należy wykonać cięcie poprzeczne wzdłuż granicy oddzielającej lateral ganglionic eminence od rozwijającej się kory. Z płytki należy usunąć wszelkie nadmiarowe, wycięte tkanki.Wypreparowana kora jest teraz przygotowana stroną oponową skierowaną w dół. Aby przenieść korę, należy przygotować pętlę z drutu platynowego połączoną z szklaną pipetą, używając palnika Bunsena do stopienia końca pipety na drucie platynowym. Po zmontowaniu należy wysterylizować pętlę z drutu platynowego i odczekać, aż ostygnie.Usunąć nadmiar pożywki z okolic X za pomocą delikatnej aspiracji. Pozostawić niewielką ilość roztworu do użycia z pętlą z drutu. Następnie umieścić jednocentymetrową membranę poliwęglanową w szalce obrazowej o średnicy czterech centymetrów.Teraz, używając boku pętelki z drutu platynowego, delikatnie odwróć korę tak, aby strona oponowa była skierowana do góry. Następnie umieść eksplant X wewnątrz pętelki i wykorzystując wewnętrzne siły hydrostatyczne, podnieś korowy eksplant X z naczynia. Następnie delikatnie umieść eksplant na membranie poliwęglanowej i podnieś pętelkę z drutu platynowego.Następnie pobierz do pipety 50 µL CSF lub innego medium. Delikatnie unieś membranę i nanieś medium poniżej. Przykryj naczynie do obrazowania.Umieść go w nawilżonym pojemniku wtórnym i inkubuj w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 24 godziny. Aby zapewnić dalszą proliferację i wzrost eksplantatów, obliczono objętości pobieranego CSF dla średniej liczby młodych w miocie zarówno dla myszy, jak i szczurów z różnych etapów rozwoju embrionalnego. Po pobraniu czystych próbek CSF można je analizować za pomocą wielu różnych technik, takich jak barwienie srebrem kilku µg.Ten płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) pochodzi od myszy w stadium E 14.5. Eksplanty w wieku 24 godzin, które namnażały się w 100%CSF, wykazują histologię tkanki podobną do embrionów gryzoni w tym samym wieku gestationnym, co wykazano za pomocą barwienia immunologicznego. pH trzy.Marker podziału komórek jest eksprymowany wzdłuż powierzchni komorowej. Marker syntezy DNA BrdU wykazuje również wbudowanie w strefie komorowej. Natomiast Tuj1, marker neuronalny, jest eksprymowany w rozwijającej się płytce kory.Przed przystąpieniem do tych procedur należy zapoznać się z polityką swojej instytucji dotyczącą zaprezentowanych technik. Metoda ta otworzyła badaczom drogę do analizy sygnałów wydzielanych do płynu mózgowo-rdzeniowego, które pełnią rolę instrukcyjną dla kory mózgowej podczas rozwoju in vitro.

isolation-cerebrospinal-fluid-from-rodent-embryos-for-use-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Izolacja płynu mózgowo-rdzeniowego od zarodków gryzoni do użytku z rozciętymi wycinkami kory mózgowej

W niniejszym filmie przedstawiono protokół izolacji i hodowli eksplantów przedmózgowia myszy z embrionów w 12. dniu rozwoju (E12). Opisano procedury usuwania macicy, wyjmowania embrionów z macicy oraz sekcji embrionów. Ponadto zaprezentowano metodologię przenoszenia tych eksplantów na specjalistyczne membrany, na których są one hodowane. Dzięki tym preparatom możliwe jest badanie rozwoju przedmózgowia in vitro, a także zmian w ekspresji genów.

Izolacja eksplantów grzbietowej części przedmózgowia myszy

Opisujemy szybką metodologię izolacji i hodowli neuronów hipokampa i kory mózgowej z embrionów gryzoni. Protokół ten umożliwia przeprowadzanie eksperymentów wymagających niemal czystych kultur neuronalnych.

Izolacja i hodowla embrionalnych komórek neuronalnych szczura: szybki protokół

Opisano metodę, która pozwala na specyficzne dla typu komórek i możliwe do śledzenia obniżenie ekspresji genów w rurce nerwowej. Wykazujemy, w jaki sposób elektroporacja in ovo plazmidów opartych na mikroRNA, które wywołują kontrolowaną przestrzennie i czasowo interferencję RNA, może być wykorzystana do badania prowadzenia aksonów komisuralnych w rozwijającej się rurce nerwowej.

In ovo elektroporacja plazmidów opartych na miRNA w rozwijającej się rurze neuronalnej i ocena fenotypów poprzez wstrzykiwanie DiI w preparatach typu open-book

Film pokazuje prostą metodę hodowli mysich astrocytów w izolacji od innych komórek mózgowych. Podczas hodowli, przy użyciu pożywek specyficznych dla astrocytów i hamowaniu przylegania komórek nieastrocytowych, metoda selektywnie hoduje astrocyty. Te hodowane astrocyty wykazują gwiaździstą morfologię z drobnymi wyrostkami.

Prosta technika izolacji i hodowli mysich astrocytów

Ten film demonstruje protokół izolacji i hodowli pierwotnych komórek kory mózgowej z grzbietowo-bocznego kresomózgowia embrionów myszy.

Izolacja i hodowla komórek z zarodka myszy Grzbietowo-boczne kresomózgowie

Ten protokół opisuje ulepszoną procedurę eksplantacji, która obejmuje elektroporację ex utero, sekcję i hodowlę całych półkul mózgowych od embrionalnej myszy. Preparat ułatwia badania farmakologiczne i testy funkcji genów we wczesnym okresie rozwoju kory mózgowej.

Ex utero Elektroporacja i eksplantaty całej półkuli: prosta metoda eksperymentalna do badań nad wczesnym rozwojem kory mózgowej

Ten film demonstruje łatwą i niezawodną strategię przygotowania czystych kultur komórek śródbłonka z embrionalnej przodomózgowia w ciągu 10-12 dni i będzie przydatny do badań skoncentrowanych na wielu aspektach angiogenezy mózgowej.

Izolacja i hodowla komórek śródbłonka z zarodka przodomózgowia

Progenitorzy wyrażający nestynę to nowo zidentyfikowana populacja neuronalnych komórek progenitorowych w rozwijającym się móżdżku. Korzystając z przedstawionej tutaj techniki mikrodysekcji w połączeniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencyjnie, ta populacja komórek może zostać oczyszczona bez zanieczyszczenia innymi obszarami móżdżku i może być hodowana do dalszych badań.

Izolacja odrębnych populacji komórek od rozwijającego się móżdżku za pomocą mikrodysekcji

Opisano protokół generowania systemu kokulturowego składającego się z neuronów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), pierwotnych neuronów korowych i astrocytów. Ten system kohodowli umożliwia wykrycie powstawania kontaktów i obwodów synaptycznych między nowymi neuronami pochodzącymi z iPSC a istniejącymi wcześniej neuronami korowymi wykazującymi ekspresję rodopsyny kanałowej-2.

Optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym

Tutaj prezentujemy protokół hydraulicznego wytłaczania rdzenia kręgowego, jak również identyfikacji i izolacji specyficznych zwojów korzenia grzbietowego (DRG) u tego samego gryzonia. W porównaniu ze standardowymi metodami izolacji rdzenia kręgowego, metoda ta jest znacznie szybsza i zmniejsza ryzyko uszkodzenia tkanek.

Hydrauliczne wytłaczanie rdzenia kręgowego i izolacja zwojów korzenia grzbietowego u gryzoni

Metoda izolacji nerwowych komórek macierzystych i komórek progenitorowych oligodendrocytów z mózgów żywych szczurów jest tutaj przedstawiona w szczegółach eksperymentalnych. Pozwala to na wielokrotne pobieranie tych komórek od tych samych zwierząt bez uszczerbku dla ich dobrostanu.

Metoda "dojenia mózgu" do izolacji nerwowych komórek macierzystych i komórek progenitorowych oligodendrocytów od żywych szczurów

Poznaj metodę izolacji płynu mózgowo-rdzeniowego z zarodków gryzoni do hodowli eksplantatów kory mózgowej. Ta technika pozwala badać sygnały rozwojowe CSF in vitro.

Izolacja płynu mózgowo-rdzeniowego z zarodków gryzoni do stosowania z wypreparowanymi eksplantatami kory mózgowej

Przeglądaj więcej filmów