In vivo (in vivo) Modelowanie chorobliwego genomu ludzkiego przy użyciu Danio rerio

- [Narrator] Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie patogenności klinicznie istotnych zmian niesynonimicznych przy użyciu komplementacji in vivo u danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez najpierw wygenerowanie zmutowanego ludzkiego mRNA w celu podsumowania zmian genetycznych u ludzi. Następnie ludzkie mRNA i zmutowane mRNA i morfoliny są wstrzykiwane do zarodków danio pręgowanego i przekształcane odpowiednio w funkcjonalne białko lub wykorzystywane do blokowania translacji. Następnie zarodki są poddawane fenotypowaniu w celu oceny wpływu zmutowanego białka na rozwój. Uzyskano wyniki, które pokazują szkodliwy wpływ mutacji na sekwencje ludzkich białek, który można potwierdzić na podstawie zdolności ratunkowej zmutowanego ludzkiego mRNA.

- Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak model mysi, jest to, że potencjalnie szkodliwe allele mogą być szybciej badane na średnim lub wysokim poziomie przepustowości, a także szeregi alleli w obrębie jednego genu mogą być oceniane w celu lepszego zrozumienia efektu kierunkowego na poziomie komórkowym, takiego jak utrata funkcji lub wzrost funkcji.

- [Narrator] Na początek ustal, czy interesujący nas ludzki gen ma ortologa danio pręgowanego, a jeśli tak, to ile kopii. Zalecamy wzajemne uderzenie BLAST ludzkiego białka w genom danio pręgowanego, a następnie BLAST w genom ludzki danio pręgowanego. Prawdziwe ortologi będą najlepszym trafieniem w każdym przypadku. Uzyskaj lub wygeneruj konstrukt przy użyciu ludzkiej otwartej ramy odczytu dla pożądanego genu o długości mniejszej niż sześć kilozasad, a także miejsca transkrypcji 5' SP6 i sygnału 3' polyA. Następnie zaprojektuj morfolino, aby zablokować splicing lub translację docelowego genu danio pręgowanego. Użycie zfin.org określenia, czy ortolog danio pręgowanego jest wyrażony w kontekście czasoprzestrzennym istotnym dla odczytu fenotypowego. Alternatywnie można przeprowadzić RT-PCR przy użyciu cDNA z całych zarodków danio pręgowanego lub hybrydyzacji in situ. Aby przeprowadzić mutagenezę ukierunkowaną na miejsce, zacznij od zaprojektowania starterów mutagenezy o długości od 25 do 45 zasad z pożądaną mutacją w środku, która będzie się wygrzewać do przeciwległych nici plazmidu. Temperatura topnienia podkładu powinna być większa lub równa 78 stopni Celsjusza. Złóż reakcję mutagenezy za pomocą polimerazy o wysokiej wierności i cyklicznie za pomocą pokazanego tutaj programu. Po zakończeniu reakcji PCR dodać jeden mikrolitr endonukleazy restrykcyjnej DpnI na reakcję, aby usunąć metylowaną matrycę matki. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Przekształć dwa mikrolitry reakcji mutagenezy w 20 mikrolitrów kompetentnych komórek zgodnie ze standardowymi protokołami. Po potwierdzeniu interesującej nas mutacji i sekwencji całego ORF z nocnych hodowli, zlinearyzuj matrycę pCS2 + i wygeneruj mRNA z czapeczką. Po określeniu stężenia mRNA i sprawdzeniu jego integralności za pomocą elektroforezy żelowej, należy przechowywać próbki w trzech lub więcej podwielokrotnościach w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza do momentu przygotowania do użycia. W przypadku eksperymentów z wariantową utratą funkcji, należy uzyskać zarodki z naturalnych krzyżówek danio pręgowanego i utrzymywać je w temperaturze 28 stopni Celsjusza w wodzie z zarodkami w sześcio- lub dziesięciocentymetrowych szalkach. Przeprowadzić krzywą odpowiedzi na dawkę morpholino, wstrzykując co najmniej trzy różne stężenia od jednego do dziesięciu nanogramów do 50 do 100 zarodków danio pręgowanego na dawkę. Skuteczne morfoliny powinny powodować zależny od dawki wzrost odsetka porażonych zarodków w partii. Podczas przeprowadzania analizy ilościowej lub jakościowej, w przypadku oceniania zarodków w 24 godziny po zapłodnieniu lub później, należy potraktować zarodki fenylotiomocznikiem w 24 godziny po zapłodnieniu, aby zmniejszyć tworzenie melanocytów. W przypadku morfinów blokujących sploty należy zbadać niedobór morfoliny, ekstrahując całkowite RNA z całych lizatów zarodków w momencie oceny fenotypowej. Wygeneruj cDNA i przeprowadź RT-PCR docelowego genu za pomocą starterów flankujących miejsce docelowe morfolino. Aby zweryfikować skuteczność supresji morfoliny blokującej translację lub TBMO, jeśli dostępne jest przeciwciało, które reaguje krzyżowo z białkiem danio pręgowanego, należy zebrać całe lizaty białkowe zarodka i przeprowadzić immunoblotting w celu porównania poziomów docelowego białka w porównaniu z kontrolą. Jeśli przeciwciało nie jest dostępne, należy jednocześnie wstrzyknąć mRNA typu dzikiego z TBMO, aby pokazać, że ratuje fenotyp lub wykazać zależność od dawki, jak opisano wcześniej. Jeśli zaobserwowano fenotyp jakościowy, należy wybrać dawkę morfolinu, która dotyczy od 50% do 75% zarodków. W przypadku fenotypów ilościowych należy wybrać dawkę, w której miara fenotypowa znacznie różni się od dawki typu dzikiego. Następnie wstrzyknąć nowe partie zarodków za pomocą koktajlu zawierającego testową dawkę morfoliny i krzywą dawkowania ludzkiego mRNA typu dzikiego. Następnie przeprowadź zamaskowaną ocenę partii iniekcji, aby określić dawkę mRNA typu dzikiego z najbardziej znaczącym ratunkiem w porównaniu z samym MO. Będzie to dawka testowa mRNA. Wstrzyknąć nowe partie zarodków z dawkami testowymi morfolina i zmutowanego ludzkiego mRNA. Fenotypuje zarodki na odpowiednim etapie i za pomocą testu chi-kwadrat lub testu t, porównuje wyniki z ratunkiem z ludzkim mRNA typu dzikiego. Jeśli nie obserwuje się utraty fenotypu funkcjonalnego w wyniku wstrzyknięcia morfoliny lub jeśli zmutowane mRNA powoduje powstanie fenotypów, które nie różnią się znacząco od samego MO, należy wstrzyknąć krzywą dawkowania ludzkiego mRNA typu dzikiego do partii zarodków. Przeprowadź ocenę fenotypową i określ najwyższą dawkę, przy której nie ma statystycznie istotnej liczby martwych i/lub dotkniętych chorobą zarodków w porównaniu z kontrolami, którym nie wstrzyknięto. To jest dawka testowa. Wstrzyknąć dawkę testową zmutowanego ludzkiego mRNA, fenotyp zarodków i porównać wyniki z punktacją z wstrzyknięcia dawki testowej ludzkiego mRNA typu dzikiego lub stężeniem morfoliny w teście. Jeśli wyniki są nie do odróżnienia od morpholino, miareczkować zmutowane mRNA za pomocą mRNA typu dzikiego i porównać z ludzkimi wstrzyknięciami mRNA typu dzikiego i zmutowanego. Poprawa fenotypów z partiami wstrzykniętego mRNA ze mutantem i dzikim typem wskazuje na dominujący wynik negatywny. Brak poprawy wskazuje na poprawę funkcji. Wreszcie, aby zintegrować dane dotyczące patogenności danio pręgowanego in vivo z innymi liniami dowodowymi, porównaj je z danymi genetycznymi w rodowodzie, danymi o częstości występowania populacji kontrolnej i badaniami białek in vitro na komórkach. Przedstawiono ilościową i jakościową ocenę ludzkich mutacji MKS1 modelowanych w zarodkach danio pręgowanego. W zależności od nasilenia fenotypy dzieli się na 3 grupy: Zarodki, którym wstrzyknięto morfolino z fenotypami klasy I, miały całkowicie normalną morfologię, ale były niższe z nadmiarem tkanki embrionalnej na żółtku w porównaniu z zarodkami kontrolnymi, którym wstrzyknięto zarodki. Morfanty klasy II były przerzedzone, krótkie, miały słabo rozwiniętą budowę głowy i ogona, a dodatkowo brakowało im definicji i symetrii somitycznej. Zarodki klasy III były poważnie opóźnione ze słabo rozwiniętymi i zniekształconymi somitami, pofałdowanymi strunami grzbietowymi i zazwyczaj nie przeżywały dłużej niż stadium 10=somit. Jednoczesna iniekcja ludzkiego mRNA i KS1 uratowała każdą z tych defektów, wykazując specyficzność fenotypów wobec supresji MKS1. Fenotypy określono ilościowo, mierząc odległość od pierwszego do ostatniego znaczącego somitu w zarodkach barwionych rybosondami krox20, pax2 i myoD w stadium 11-somitowym. Na zdjęciu widać model danio pręgowanego z ludzką dysmorfologią twarzoczaszki. Zarodki kontrolne i zmutowane, którym wstrzyknięto mRNA, barwiono błękitem Alcian po pięciu dniach od zapłodnienia. Zmutowane zarodki wykazywały znacznie mniejsze i zniekształcone głowy oraz ogólną dezorganizację chrzęstnego szkieletu twarzoczaszki, w tym rozchylone łuki skrzelowe i brakujące lub zniekształcone struktury. Po pięciu dniach od zapłodnienia zarodek, któremu wstrzyknięto morfant makrocefalii, wykazuje poszerzenie głowy, co widać w przestrzeni między oczami. W tym przykładzie zmniejszonej integralności naczyń krwionośnych po dwóch dniach od zapłodnienia, morfanty wykazują upośledzone kiełkowanie naczyń międzysegmentowych i innych struktur naczyniowych. Hybrydyzacja in situ niewstrzykniętych zarodków typu dzikiego wykazuje ekspresję spaw w mezodermie lewej płytki bocznej, co jest kontrolą prawidłowego zapętlenia serca. Zarodki morfantu Ccdc39 wykazywały obustronną lub w większości przypadków niewykrywalną ekspresję spaw. Pokazany tutaj jest przykład morfantu Ift80, który rozwija duże torbiele nerek, obrzęk osierdzia i zwinięty ogon. Aby uwidocznić zmniejszoną filtrację kłębuszkową, dekstran rodaminy wstrzyknięto do serca, a fluorescencję uwidoczniono 24 godziny później. Fluorescencja jest nieobecna w zarodku kontrolnym, gdzie rozprasza się w całym układzie naczyniowym i jest prawie całkowicie ewakuowana przez nerkę. Zarodek morfantu Ift80 wykazuje trwały fluorescencyjny sygnał dekstranu, co sugeruje zmniejszoną filtrację kłębuszkową. W tym modelu dystrofii mięśniowej zarodki wstrzyknięte do typu dzikiego wykazują normalne, powolne włókna mięśniowe obejmujące somity między sąsiednimi mioseptami, jak określono przez barwienie immunologiczne przy użyciu przeciwciała przeciwko powolnej miozynie. Zmutowane zarodki, którym wstrzyknięto zarodki, wykazywały częściowe lub całkowite oderwanie włókien mięśniowych od miosepty w jednym lub wielu somitach. Pokazane tutaj są boczne widoki na żywo niewstrzykniętej kontroli i morfantu Kif7 po 30 godzinach od zapłodnienia. Jak widać przez porównanie kąta somitowego, morfanty wykazują somity o nieprawidłowym kształcie, co można przypisać ektopowej sygnalizacji Hedgehog w miotomii danio pręgowanego.

- Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł na to, jak opracować fizjologicznie istotne, czułe i specyficzne testy in vivo do interpretacji ludzkiej zmienności patologii przy użyciu danio pręgowanego jako modelu organizmu.