Name: In vivo (in vivo) Modelowanie chorobliwego genomu ludzkiego przy użyciu Danio rerio (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Poznaj metodę oceny patogenności mutacji w genach ludzkich przy użyciu embriosów Danio rerio. Technika ta umożliwia szybką analizę wysokoprzepustową wpływu zmian genetycznych na rozwój.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy za wsparcie od stypendium Letniego Stypendium Naukowego Dziekana Uniwersytetu Duke'a (A.N.), stypendium Amerykańskiego Towarzystwa Kardiologicznego (AHA) 11POST7160006 (C.G.), National Institutes of Health (NIH) przyznaje R01-EY021872 od National Eye Institute (E.E.D.), R01HD04260 od National Institute of Child Health and Development (N.K.), R01DK072301 i R01DK075972 od National Institute of Diabetes Digestive and Kidney Disorders (N.K.), i Unii Europejskiej (finansowany przez 7. PR UE w ramach GA nr 241955, projekt SYSCILIA; E.E.D., N.K.) NK jest profesorem Jean and George W. Brumley.

1. Analiza bioinformatyczna
<ol>
	<li>Określ, czy interesujący nas ludzki gen ma ortolog danio pręgowanego, a jeśli tak, to ile kopii. Zalecamy odwrotne BLAST (<a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/</a>) ludzkiego białka przeciwko genomowi danio pręgowanego, a następnie BLAST najlepszego uderzenia danio pręgowanego w ludzki genom. Prawdziwe ortologi będą najlepszym trafieniem w każdym przypadku.</li>
	<li>Określ rozmiar otwartej ramki odczytu (ORF) ludzkiego genu. Jeśli model ten jest dłuższy niż 6 kb, jest obecnie niewykonalny ze względu na ograniczenia wysokiej jakości transkrypcji in vitro długich matryc.</li>
	<li>Uzyskaj lub wygeneruj konstrukt zawierający ludzki ORF w szkielecie wektora pCS2+ (lub równoważnym wektorze z miejscem transkrypcji 5' SP6 i sygnałem 3' poliA).</li>
	<li>Zaprojektuj MO w celu zablokowania splicingu lub translacji docelowego genu danio pręgowanego. Jeśli w genomie danio pręgowanego istnieje wiele kopii, istnieją dwie opcje: a) zaprojektowanie dodatkowych MO; lub b) identyfikacja miejsca łączenia w pełni zachowanego między kopiami, wobec którego pojedynczy MO może być skuteczny. Niektóre opublikowane sekwencje MO są dostępne pod adresem <a href="http://www.zfin.org" target="_blank">www.zfin.org</a>.</li>
</ol>
2. Analiza ekspresji w rozwijającym się zarodku danio pręgowanego
<ol>
	<li>Określ, czy ortolog danio pręgowanego jest wyrażony w kontekście czasoprzestrzennym istotnym dla odczytu fenotypowego. Jeśli nie są dostępne żadne dane dotyczące ekspresji dla interesującego genu, należy przeprowadzić odwrotną transkrypcję (RT)-PCR przy użyciu cDNA z całych zarodków danio pręgowanego lub hybrydyzacji in situ. (Patrz 2,3).</li>
</ol>
3. Mutageneza kierowana na stronę
<ol>
	<li>Zaprojektuj startery mutagenezy o długości 25-45 zasad, z pożądaną mutacją w środku. Temperatura topnienia startera powinna być większa lub równa 78 °C. Zaprojektuj starter mutagenezy do przodu i do tyłu, aby wyżarzać do przeciwległych nici plazmidu.</li>
	<li>Uzyskaj startery do potwierdzenia sekwencji ORF po mutagenezie; powinny one obejmować ~ 300 sekcji par zasad, aby pokryć cały ORF.</li>
	<li>Złóż reakcję mutagenezy z polimerazą o wysokiej wierności i cykl w następujący sposób (1: 95 °C 30 sekund, 2: 95 °C 30 sekund, 3: 55 °C 1 min, 4: 68 °C 6 min, 5: Przejdź do 2 18x, 6: 4 °C na zawsze, 7: koniec).</li>
	<li>Dodać 1 μl endonukleazy restrykcyjnej DpnI na reakcję w celu usunięcia metylowanej matrycy matki; inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Przekształć 2 μl reakcji mutagenezy w 20 μl kompetentnych komórek zgodnie ze standardowymi protokołami.</li>
	<li>Wybierz 3-4 kolonie i zaszczep 5 ml pożywki LB zawierającej odpowiedni antybiotyk. Wstrząsać w temperaturze 37 °C przez noc z prędkością 225 obr./min.</li>
	<li>Miniprzygotuj DNA i określ stężenie.</li>
	<li>Zsekwencjonuj miejsce mutacji, aby potwierdzić obecność mutacji będącej przedmiotem zainteresowania.</li>
	<li>Sekwencjonuj cały ORF, aby potwierdzić integralność sekwencji.</li>
</ol>
4. Transkrypcja mRNA in vitro
<ol>
	<li>Korzystając ze zlinearyzowanej matrycy pCS2+, wygeneruj ograniczone mRNA za pomocą zestawu mMessage mMachine SP6 (Ambion). Zalecamy użycie połowy ilości składników reakcyjnych.</li>
	<li>Oczyść próbkę RNA za pomocą wytrącania LiCl lub chloroformu fenolowego, jak opisano w instrukcji dołączonej do zestawu.</li>
	<li>Oznaczyć stężenie mRNA za pomocą absorbancji, zapewnić integralność mRNA za pomocą elektroforezy żelowej i przechowywać próbkę w trzech lub więcej podwielokrotnościach w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do użycia. Nie zalecamy wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania podwielokrotności mRNA.</li>
</ol>
5. Test in vivo wariantu utraty funkcji
<ol>
	<li>Pozyskać zarodki danio pręgowanego z naturalnych krzyżówek danio pręgowanego i utrzymywać je w temperaturze 28 °C w wodzie z zarodkami w szalkach o średnicy 6 lub 10 cm.</li>
	<li>Przeprowadzić krzywą odpowiedzi na dawkę morfolinu, aby ocenić swoistość fenotypu, skuteczność MO i toksyczność MO. Wstrzyknąć krzywą dawkowania o co najmniej trzech różnych stężeniach w zakresie 1-10 ng MO do 50-100 (stadium 1-4 komórek) zarodków/serii danio pręgowanego. Skuteczne MO powinny prowadzić do zależnego od dawki zwiększenia odsetka zarodków dotkniętych chorobą w partii.</li>
	<li>Fenotyp zarodków w odpowiednim stadium rozwoju w oparciu o ekspresję docelowego genu danio pręgowanego będącego przedmiotem zainteresowania i etap, na którym zaobserwuje się odpowiedni fenotyp. Może to być ilościowe (np. pomiar między strukturami anatomicznymi) lub jakościowe (w oparciu o standaryzowane kryteria fenotypowe). W przypadku wszystkich wstrzyknięć uzyskanych >24 hpf: zarodki powinny być leczone PTU (0,003% 1-fenylo-2-tiomocznika w pożywce zarodkowej) w dawce 24 hpf w celu maksymalnego zmniejszenia tworzenia melanocytów.</li>
	<li>W przypadku MO blokujących splice należy przetestować wydajność MO poprzez ekstrakcję całkowitego RNA z lizatów całego zarodka w momencie punktacji fenotypowej, wygenerować cDNA i przeprowadzić RT-PCR genu docelowego za pomocą starterów flankujących miejsce docelowe MO.</li>
	<li>Aby zweryfikować skuteczność supresji tb-MO, należy zebrać lizaty białka całego zarodka i przeprowadzić immunoblotting w celu porównania poziomów docelowego białka w porównaniu z kontrolą. Jednak to podejście nie jest podatne na wszystkie geny docelowe, ponieważ istnieje ograniczona reaktywność krzyżowa wielu komercyjnych przeciwciał przeciwko białkom danio pręgowanego. Dwie pośrednie metody wykazywania swoistości MO obejmują: a) wykazanie, że istnieje zależny od dawki wpływ na fenotyp; oraz b) pokazujące, że jednoczesna iniekcja mRNA typu dzikiego z tb-MO skutecznie ratuje fenotyp. Z tych powodów zalecamy bloker spawów, gdy tylko jest to możliwe, ponieważ wydajność można monitorować bezpośrednio.</li>
	<li>Jeśli zaobserwujesz fenotyp, przejdź do kroku 5.7, jeśli nie zaobserwujesz żadnego fenotypu, przejdź do kroku 6.1.</li>
	<li>Dla fenotypów jakościowych wybierz dawkę MO, w której dotyczy to 50-75% zarodków; dla fenotypów ilościowych wybierz dawkę MO, w której miara fenotypowa znacznie różni się od typu dzikiego (p < 0,001). Wstrzyknąć nowe partie zarodków danio pręgowanego (stadium 1-4 komórek; n = 50-100 / partię) koktajlem zawierającym "testową" dawkę MO i krzywą dawkowania ludzkiego mRNA WT (w zakresie od 10 do 200 pg mRNA; dawki te zapewniają znaczną nadekspresję powyżej linii podstawowej dowolnego pojedynczego transkryptu, co stanowi 0,25-0,5% całkowitego mRNA poliA w zarodku danio pręgowanego). 4</li>
	<li>Przeprowadź maskowaną ocenę partii iniekcji; wybierz dawkę mRNA WT o najbardziej znaczącym ratunku w porównaniu z samym MO; jest to dawka "testowa" mRNA.</li>
	<li>Wstrzyknąć nowe partie (stadium 1-4 komórek; n = 50-100/partię) z dawką testową MO i dawką testową zmutowanego ludzkiego mRNA. Fenotyp zarodków na odpowiednim etapie i porównać wyniki z ratowaniem ludzkiego mRNA WT za pomocą odpowiedniego testu statystycznego (test t lub chi-kwadrat). Zobacz rysunek 1, aby zapoznać się z wynikami i przejdź do kroku 7. Wstrzyknąć dawki testowe samego WT i zmutowanego mRNA, aby kontrolować skutki toksyczności mRNA.</li>
</ol>
6. Test in vivo wariantu dominującego negatywnego lub wzmocnienia efektów funkcji
<ol>
	<li>Jeśli nie obserwuje się utraty fenotypu funkcji (krok 5.5) lub jeśli zmutowane mRNA powoduje powstanie fenotypów, które nie różnią się znacząco od samego MO (krok 5.7), wstrzyknąć krzywą dawkowania w zakresie od 10-200 pg ludzkiego mRNA WT (zalecamy 25, 50 i 100 pg jako test wstępny) do partii zarodków (stadium 1-4 komórek; 50-100 zarodków / partię).</li>
	<li>Na odpowiednim etapie (patrz ppkt 5.3 powyżej) należy przeprowadzić ocenę fenotypową i określić najwyższą dawkę, przy której nie ma statystycznie istotnej liczby martwych i/lub dotkniętych chorobą zarodków, w porównaniu z kontrolami, którym nie wstrzyknięto. Jest to dawka "testowa".</li>
	<li>Wstrzyknąć dawkę testową zmutowanego ludzkiego mRNA (stadium 1-4 komórek; 50-100 zarodków/partię). Fenotyp zarodków i porównać wyniki z punktacją z dawki testowej wstrzyknięcia ludzkiego mRNA WT lub stężenia MO w teście. Zobacz rysunek 1, aby zapoznać się z wynikami.</li>
	<li>Jeśli wyniki są nie do odróżnienia od MO, miareczkować ludzkie zmutowane mRNA za pomocą mRNA WT i porównać z ludzkimi wstrzyknięciami WT i zmutowanego mRNA. Poprawa fenotypów z partiami wstrzykniętymi mutantem i mRNA WT wskazuje na dominujący wynik negatywny. Brak poprawy wskazuje na poprawę funkcji.</li>
</ol>
7. Odtwórz wyniki badań in vivo
<ol>
	<li>Powtórzyć testy in vivo co najmniej trzy razy.</li>
</ol>
8. Integracja danych o patogeniczności danio pręgowanego in vivo z innymi dowodami
<ol>
	<li>Porównaj dane dotyczące chorobotwórczości uzyskane z doświadczeń na danio pręgowanym z: danymi genetycznymi w obrębie rodowodu (jeśli dotyczy), danymi dotyczącymi częstości występowania populacji kontrolnej, badaniami in vitro (oparte na komórkach testy stabilności białka, lokalizacji komórkowej, wyjścia sygnalizacji lub aktywności enzymatycznej).</li>
</ol>

<ol><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+mRNA+using+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantification of mRNA using real-time RT-PCR.</a> Nat. Protoc. 1, 1559-1582 (2006).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).</li>
<li>Detrich, H. W., Westerfield, M. 3rd, Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+Zebrafish+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Overview of the Zebrafish system.</a> Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).</li>
<li>Gerdes, J. M., Davis, E. E., Katsanis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vertebrate+primary+cilium+in+development%2C+homeostasis%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The vertebrate primary cilium in development, homeostasis, and disease.</a> Cell. 137, 32-45 (2009).</li>
<li>Hildebrandt, F., Benzing, T., Katsanis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Ciliopathies.</a> N. Engl. J. Med. 364, 1533-1543 (2011).</li>
<li>Zaghloul, N. A., Katsanis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+Bardet-Biedl+syndrome%2C+a+model+ciliopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into Bardet-Biedl syndrome, a model ciliopathy.</a> J. Clin. Invest. 119, 428-437 (2009).</li>
<li>Marion, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exome+sequencing+identifies+mutations+in+LZTFL1%2C+a+BBSome+and+smoothened+trafficking+regulator%2C+in+a+family+with+Bardet-Biedl+syndrome+with+situs+inversus+and+insertional+polydactyly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Exome sequencing identifies mutations in LZTFL1, a BBSome and smoothened trafficking regulator, in a family with Bardet-Biedl syndrome with situs inversus and insertional polydactyly.</a> J. Med. Genet. 49, 317-321 (2012).</li>
<li>Otto, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candidate+exome+capture+identifies+mutation+of+SDCCAG8+as+the+cause+of+a+retinal-renal+ciliopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Candidate exome capture identifies mutation of SDCCAG8 as the cause of a retinal-renal ciliopathy.</a> Nat. Genet. 42, 840-850 (2010).</li>
<li>Schaefer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+diagnosis+reveals+genetic+heterogeneity+for+the+overlapping+MKKS+and+BBS+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular diagnosis reveals genetic heterogeneity for the overlapping MKKS and BBS phenotypes.</a> Eur. J. Med. Genet. 54, 157-160 (2011).</li>
<li>Katsanis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oligogenic+properties+of+Bardet-Biedl+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The oligogenic properties of Bardet-Biedl syndrome.</a> Hum. Mol. Genet. 13 Spec No 1, R65-R71 (2004).</li>
<li>Badano, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+epistasis+in+oligogenic+Bardet-Biedl+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dissection of epistasis in oligogenic Bardet-Biedl syndrome.</a> Nature. 439, 326-330 (1038).</li>
<li>Badano, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterozygous+mutations+in+BBS1%2C+BBS2+and+BBS6+have+a+potential+epistatic+effect+on+Bardet-Biedl+patients+with+two+mutations+at+a+second+BBS+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Heterozygous mutations in BBS1, BBS2 and BBS6 have a potential epistatic effect on Bardet-Biedl patients with two mutations at a second BBS locus.</a> Hum. Mol. Genet. 12, 1651-1659 (2003).</li>
<li>Gerdes, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+basal+body+compromises+proteasomal+function+and+perturbs+intracellular+Wnt+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Disruption of the basal body compromises proteasomal function and perturbs intracellular Wnt response.</a> Nat. Genet. 39, 1350-1360 (2007).</li>
<li>Leitch, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypomorphic+mutations+in+syndromic+encephalocele+genes+are+associated+with+Bardet-Biedl+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Hypomorphic mutations in syndromic encephalocele genes are associated with Bardet-Biedl syndrome.</a> Nat. Genet. 40, 443-448 (2008).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Zaghloul, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analyses+of+variants+reveal+a+significant+role+for+dominant+negative+and+common+alleles+in+oligogenic+Bardet-Biedl+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Functional analyses of variants reveal a significant role for dominant negative and common alleles in oligogenic Bardet-Biedl syndrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 10602-10607 (2010).</li>
<li>Davis, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTC21B+contributes+both+causal+and+modifying+alleles+across+the+ciliopathy+spectrum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">TTC21B contributes both causal and modifying alleles across the ciliopathy spectrum.</a> Nat. Genet. 43, 189-196 (2011).</li>
<li>Sarparanta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+the+cytoplasmic+functions+of+the+co-chaperone+DNAJB6+cause+limb-girdle+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting the cytoplasmic functions of the co-chaperone DNAJB6 cause limb-girdle muscular dystrophy.</a> Nat. Genet. 44, 450-455 (2012).</li>
<li>Selcen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+in+BAG3+causes+severe+dominant+childhood+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+neurology%22%5BJournal%5D)">Mutation in BAG3 causes severe dominant childhood muscular dystrophy.</a> Annals of neurology. 65, 83-89 (2009).</li>
<li>Golzio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCTD13+is+a+major+driver+of+mirrored+neuroanatomical+phenotypes+of+the+16p11.2+copy+number+variant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">KCTD13 is a major driver of mirrored neuroanatomical phenotypes of the 16p11.2 copy number variant.</a> Nature. 485, 363-367 (2012).</li>
<li>de Pontual, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epistasis+between+RET+and+BBS+mutations+modulates+enteric+innervation+and+causes+syndromic+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Epistasis between RET and BBS mutations modulates enteric innervation and causes syndromic Hirschsprung disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13921-13926 (2009).</li>
<li>Adzhubei, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+and+server+for+predicting+damaging+missense+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A method and server for predicting damaging missense mutations.</a> Nature Methods. 7, 248-249 (2010).</li>
<li>Kumar, P., Henikoff, S., Ng, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+the+effects+of+coding+non-synonymous+variants+on+protein+function+using+the+SIFT+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Predicting the effects of coding non-synonymous variants on protein function using the SIFT algorithm.</a> Nat. Protoc. 4, 1073-1081 (2009).</li>
<li>Calabrese, R., Capriotti, E., Fariselli, P., Martelli, P. L., Casadio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+annotations+improve+the+predictive+score+of+human+disease-related+mutations+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Functional annotations improve the predictive score of human disease-related mutations in proteins.</a> Hum. Mutat. 30, 1237-1244 (2009).</li>
<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+inference+of+molecular+mechanisms+of+disease+from+amino+acid+substitutions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Automated inference of molecular mechanisms of disease from amino acid substitutions.</a> Bioinformatics. 25, 2744-2750 (2009).</li>
<li>Thusberg, J., Olatubosun, A., Vihinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+mutation+pathogenicity+prediction+methods+on+missense+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Performance of mutation pathogenicity prediction methods on missense variants.</a> Hum. Mutat. 32, 358-368 (2011).</li>
<li>Summerton, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morpholino%2C+siRNA%2C+and+S-DNA+compared%3A+impact+of+structure+and+mechanism+of+action+on+off-target+effects+and+sequence+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Morpholino, siRNA, and S-DNA compared: impact of structure and mechanism of action on off-target effects and sequence specificity.</a> Curr. Top. Med. Chem. 7, 651-660 (2007).</li>
<li>Riazuddin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missense+mutations+in+TCF8+cause+late-onset+Fuchs+corneal+dystrophy+and+interact+with+FCD4+on+chromosome+9p%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Missense mutations in TCF8 cause late-onset Fuchs corneal dystrophy and interact with FCD4 on chromosome 9p.</a> Am. J. Hum. Genet. 86, 45-53 (2010).</li>
<li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+the+zebrafish+ortholog+of+the+retinitis+pigmentosa+2+%28RP2%29+gene+results+in+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Knockdown of the zebrafish ortholog of the retinitis pigmentosa 2 (RP2) gene results in retinal degeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52, 2960-2966 (2011).</li>
<li>Song, P., Pimplikar, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+amyloid+precursor+protein+in+zebrafish+causes+defects+in+motor+axon+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Knockdown of amyloid precursor protein in zebrafish causes defects in motor axon outgrowth.</a> PloS one. 7, e34209(2012).</li>
<li>Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+for+human+FKRP+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 623-633 (2010).</li>
<li>Danilova, N., Sakamoto, K. M., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+protein+S19+deficiency+in+zebrafish+leads+to+developmental+abnormalities+and+defective+erythropoiesis+through+activation+of+p53+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ribosomal protein S19 deficiency in zebrafish leads to developmental abnormalities and defective erythropoiesis through activation of p53 protein family.</a> Blood. 112, 5228-5237 (2008).</li>
<li>Bohnsack, B. L., Kasprick, D. S., Kish, P. E., Goldman, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+model+of+axenfeld-rieger+syndrome+reveals+that+pitx2+regulation+by+retinoic+acid+is+essential+for+ocular+and+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A zebrafish model of axenfeld-rieger syndrome reveals that pitx2 regulation by retinoic acid is essential for ocular and craniofacial development.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 7-22 (2012).</li>
<li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+bowel+disease+%28IBD%29+susceptibility+genes+NOD1+and+NOD2+have+conserved+anti-bacterial+roles+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">The inflammatory bowel disease (IBD) susceptibility genes NOD1 and NOD2 have conserved anti-bacterial roles in zebrafish.</a> Disease Models & Mechanisms. 4, 832-841 (2011).</li>
<li>Sheng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+the+WD40+domain+of+LRRK2+in+Zebrafish+causes+Parkinsonism-like+loss+of+neurons+and+locomotive+defect%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Deletion of the WD40 domain of LRRK2 in Zebrafish causes Parkinsonism-like loss of neurons and locomotive defect.</a> PLoS genetics. 6, e1000914(2010).</li>
<li>Teng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+zebrafish+lgi1b+leads+to+hydrocephalus+and+sensitization+to+pentylenetetrazol+induced+seizure-like+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Loss of zebrafish lgi1b leads to hydrocephalus and sensitization to pentylenetetrazol induced seizure-like behavior.</a> PloS one. 6, e24596(2011).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J. Clin. Invest. 122, 2337-2343 (2012).</li>
<li>Javidan, Y., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cartilage+and+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of cartilage and bone.</a> Methods Cell Biol. 76, 415-436 (2004).</li>
<li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev. Biol. 248, 307-318 (2002).</li>
<li>Lee, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoglin+regulates+PI3-kinase%2FAkt+trafficking+and+signaling+to+alter+endothelial+capillary+stability+during+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Endoglin regulates PI3-kinase/Akt trafficking and signaling to alter endothelial capillary stability during angiogenesis.</a> Molecular Biology of the Cell. 23, 2412-2423 (2012).</li>
<li>Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+transmission+of+a+myocardium-specific+GFP+transgene+reveals+critical+regulatory+elements+in+the+cardiac+myosin+light+chain+2+promoter+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 228, 30-40 (2003).</li>
<li>Merveille, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCDC39+is+required+for+assembly+of+inner+dynein+arms+and+the+dynein+regulatory+complex+and+for+normal+ciliary+motility+in+humans+and+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">CCDC39 is required for assembly of inner dynein arms and the dynein regulatory complex and for normal ciliary motility in humans and dogs.</a> Nat. Genet. 43, 72-78 (2011).</li>
<li>Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFT80%2C+which+encodes+a+conserved+intraflagellar+transport+protein%2C+is+mutated+in+Jeune+asphyxiating+thoracic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">IFT80, which encodes a conserved intraflagellar transport protein, is mutated in Jeune asphyxiating thoracic dystrophy.</a> Nat. Genet. 39, 727-729 (2007).</li>
<li>Drummond, I. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+kidney+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish kidney development.</a> Methods Cell Biol. 100, 233-260 (2010).</li>
<li>Tobin, J. L., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+renal+function+in+zebrafish+models+of+ciliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies.</a> Pediatr. Nephrol. 23, 2095-2099 (2008).</li>
<li>Putoux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIF7+mutations+cause+fetal+hydrolethalus+and+acrocallosal+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">KIF7 mutations cause fetal hydrolethalus and acrocallosal syndromes.</a> Nat. Genet. 43, 601-606 (2011).</li>
</ol>

Niezamówione przez autorów, opłaty za otwarty dostęp zostały uiszczone przez Gene-Tools LLC.

Opisane tutaj metody reprezentują ogólny protokół mający zastosowanie do oznaczania niesynonimicznych zmian związanych z różnymi fenotypami chorób genetycznych człowieka (Tabela 2, Rysunek 3). Nasze podejścia okazały się przydatne do oceny potencjalnego wpływu zmienności na fenotypy choroby i do pomocy w analizie mechanizmów chorobowych (takich jak udział dominujących negatywnych mutacji w zespole Bardeta-Biedla – zaburzeniu dziedziczonym głównie autosomalnie recesywnie 17). Do tej pory, poprzez opracowanie prezentowanego drzewa decyzyjnego, wymodelowaliśmy przy rozsądnym koszcie i czasie ponad 200 genów przyczynowo związanych z zaburzeniami genetycznymi, do ponad 1000 alleli.
Chociaż nie zostało to tutaj szczegółowo omówione, wykazaliśmy również, że metody te są odpowiednie do modelowania innych typów zmian genetycznych, takich jak warianty liczby kopii (CNV), a także interakcje genetyczne. Analizy takich zdarzeń wykraczają poza zakres niniejszego opisu metody, chociaż zasadniczo opierają się na tej samej zasadzie systematycznego testowania genów kandydujących (w tym par genów wstrzykiwanych równocześnie) w celu określenia indukcji lub zaostrzenia klinicznie odpowiednich fenotypów. Na przykład, aby wyjaśnić, który z 29 genów w CNV 16p11.2 może być istotny dla obserwowanej małogłowia obserwowanej u pacjentów z duplikacją segmentu genomowego o długości 660 kb, wstrzyknięto mRNA odpowiadające każdemu z 29 genów w segmencie i przeprowadzono pomiary wielkości głowy przy 2 dpf i 5 dpf, ujawniając główny wkład pojedynczego transkryptu, KCTD13.21 Ponadto wykorzystaliśmy ten model do zbadania interakcji genetycznych zmian genomowych u pacjentów zarówno z zespołem Bardeta-Biedla, jak i chorobą Hirschsprunga. 22 Porównując supresję MO genów przyczynowych dwóch tożsamości klinicznych oddzielnie i jednocześnie, byliśmy w stanie zidentyfikować wynikowy fenotyp jako synergiczną interakcję, a nie tylko nasilenie addytywne.
Pomimo ustalenia wysokiej czułości (98%) i swoistości (>82%) dla wariantów przyczyniających się do ciliopatii17, nie mamy jeszcze wystarczających danych, aby określić, czy można je uogólnić na wszystkie odczyty fenotypowe w modelach danio pręgowanego. W tym celu należy przebadać dużą liczbę alleli, które genetycznie uważa się za łagodne lub chorobotwórcze, w ramach każdej kategorii fenotypowej. Będzie to szczególnie ważne dla wdrożenia takich testów w warunkach klinicznych, w których funkcjonalna interpretacja VUS może informować o diagnozie i leczeniu tylko wtedy, gdy solidne zrozumienie wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych może towarzyszyć dostarczaniu takich wyników lekarzom i pacjentom. Niemniej jednak metody te mogą znacząco przyczynić się do lepszego zrozumienia krajobrazu chorób genetycznych człowieka. Przewidujemy, że modele te nie tylko posłużą jako podstawa do lepszej interpretacji klinicznej informacji genetycznej, ale zostaną również wykorzystane jako użyteczne modele do przeprowadzania badań przesiewowych terapeutycznych. Dane in vivo mogą być również porównywane z przewidywaniami obliczeniowymi in silico ze źródeł takich jak PolyPhen23, SIFT24, SNPs&GO25 lub MutPred26 w celu wykazania zgodności. Należy zauważyć, że w poprzednim badaniu baz danych predykcyjnych SNPs&GO i MutPred okazały się najdokładniejsze, z dokładnościami sięgającymi odpowiednio zaledwie 0,82 i 0,81. 27 Rozdział 27
Chociaż nakreśliliśmy solidność tych metod dla podzbioru pediatrycznych wad anatomicznych (Tabela 2, Ryc. 3), niektóre fenotypy są mniej podatne na leczenie tymi metodami. Poza pewnymi wyjątkami, istnieją trzy główne klasy zaburzeń, które nie podlegają naszemu protokołowi. Zaburzenia występujące w wieku dorosłym (takie jak choroba Parkinsona) stanowią wyzwanie do modelowania w systemie embrionalnym. Fenotypy zwyrodnieniowe o powolnej progresji (takie jak otępienie czołowo-skroniowe) mogą wymagać więcej czasu niż siedem okien aktywności dpf do wytworzenia fenotypu. Inne technologie knockdownu genów, takie jak RNAi i siRNA, są dostępne do zakłócania lub degradacji celu genu, ale wykazano, że żadna z nich nie jest tak specyficzna, stabilna, nietoksyczna lub długotrwała jak MO28, co również ogranicza ramy czasowe fenotypowania. Po trzecie, niektóre struktury kręgowców, takie jak płuca ssaków, nie mają wystarczająco ortologicznej struktury w zarodku danio pręgowanego. Przedstawiliśmy również sugerowany plan awaryjny do zbadania tych przypadków, w których wstrzyknięcie ludzkiego mRNA WT prowadzi do fenotypu, choć ostrzegamy, że jest to niezwykła i niepożądana sytuacja.
Niektóre fenotypy chorobowe mogą wymagać większego stopnia abstrakcji i macierzyństwa zastępczego. Możliwe, że funkcja genów rozejrzała się na tyle, aby osłabić podobieństwo fenotypowe między modelem a prawdziwym fenotypem, lub że fizjologia danio pręgowanego z natury komplikuje skutki wywołanej choroby. W takich przypadkach sugerujemy dalszą analizę wytworzonego fenotypu przed zwolnieniem. Opracowaliśmy kilka udanych przykładów, w których problematyczne fenotypy dla tego testu zostały wymodelowane w zarodkach danio pręgowanego. Na przykład mutacje w TCF8, genie związanym z dystrofią rogówki Fuchsa (FCD), zostały oznaczone przy użyciu naszego protokołu, wykorzystując defekty gastrulacji jako zastępczy odczyt fenotypowy w oparciu o znane role tego transkryptu we wczesnym rozwoju. 29 W innych przypadkach, takich jak dystrofia mięśniowa u dorosłych spowodowana mutacjami w DNAJB6, byliśmy w stanie wygenerować fenotypy włókien mięśniowych w zarodkach 5dpf, pomimo faktu, że ludzie są pozbawieni znaczącej patologii mięśni w pierwszych trzech do czterech dekadach życia. Rozdział 19
Oprócz przedstawionych tutaj przejściowych modeli mutantów, inni wykorzystali również ten przejściowy system do modelowania ludzkich chorób w różnych układach ciała. W jednym z przykładów barwnikowe zwyrodnienie siatkówki było modelowane u danio pręgowanego przez knockdown genu RP2, co spowodowało śmierć komórek siatkówki i zmniejszenie laminacji siatkówki. Ratowanie ludzkim mRNA typu dzikiego spowodowało rozwój wszystkich trzech warstw laminacji siatkówki, podczas gdy cztery z pięciu zmutowanych mRNA nie zdołały uratować. 30 Chociaż ten model zaburzeń czucia u ludzi opiera się na fenotypie morfologicznym, możliwe jest również określenie reakcji na bodźce, takie jak przerażenie akustyczne lub zahamowanie impulsu wstępnego. Rozdział 47
Niedawno wykorzystano model danio pręgowanego do zbadania patogenezy choroby Alzheimera za pomocą białka prekursorowego amyloidu. 31 Autorzy wykazali, że knockdown genu spowodował upośledzony rozrost aksonów neuronów ruchowych, który można uratować za pomocą ludzkiego mRNA. Model ten okazał się szczególnie pouczający, ponieważ modele myszy wykazują tylko subtelne fenotypy (pojedynczy nokdaun) lub letalność poporodową (podwójny nokdaun). Możliwość oceny zarodków danio pręgowanego in vivo w trakcie rozwoju pomogła dostrzec patogenny wpływ zredukowanego białka prekursorowego amyloidu, a także dostarczyła bezpośrednich dowodów na to, że białko wymaga zarówno domeny zewnątrzkomórkowej, jak i wewnątrzkomórkowej do prawidłowego funkcjonowania. Inne godne uwagi modele obejmują dodatkowe dystrofie mięśniowe32, niedokrwistość Diamonda Blackfana33, zespół Axenfelda-Reigera (rozwój oka i twarzoczaszki)34, nieswoiste zapalenie jelit35 (aktywność przeciwbakteryjna), choroba Parkinsona36 (utrata neuronów i lokomocji) oraz napad37 (wodogłowie i nadpobudliwość).
Bardziej powszechne są zmutowane linie danio pręgowanego, które, jak wykazano, również podsumowują fenotyp choroby ludzkiej. Recenzowane w 1,38, modele obejmują białaczkę, czerniaka, kardiomiopatie rozstrzeniowe, dystrofię mięśniową Duchenne'a i wiele innych.

Funkcjonalna interpretacja informacji genetycznej i przypisywanie predykcyjnej wartości klinicznej genotypowi stanowi główny problem w genetyce medycznej i staje się coraz bardziej przejmujące wraz z coraz większą techniczną i ekonomiczną wykonalnością sekwencjonowania całego genomu. W związku z tym konieczne jest opracowanie i wdrożenie nowych paradygmatów badania patogenności wariantów o nieznanym znaczeniu (VUS) wykrywanych u pacjentów. Testy te muszą być zatem dokładne, efektywne czasowo i kosztowo oraz mieć potencjał katalizowania przejścia do użyteczności klinicznej.
Podczas gdy mysz była tradycyjnie wybieranym narzędziem w dziedzinie modelowania chorób ludzkich, danio pręgowany staje się naukowo i ekonomicznie korzystnym substytutem. W przeciwieństwie do myszy, biologia danio pręgowanego umożliwia łatwy i szybki dostęp do wszystkich etapów rozwoju, wspomagana przez przejrzystość optyczną zarodków, która pozwala na obrazowanie w czasie rzeczywistym rozwijających się patologii. 1 Stosunkowo nowa generacja zmutowanych linii do danio pręgowanego zapewniła dodatkowe opcje testowania i modelowania, wykorzystywane przez wiele osób w badaniach funkcjonalnych, ale technologia ta jest nadal ograniczona (przegląd w 1,38 ). Mutacje genetyczne z efektami specyficznych mutacji są nie tylko pracochłonne do osiągnięcia, ale także nie są podatne na analizę średnio- lub wysokoprzepustową w celu przetestowania szeregu mutacji w obrębie jednego genu. Co ważne, pojedynczy zestaw testów może dostarczyć informacji nie tylko na temat potencjału chorobotwórczego alleli, ale także na temat kierunku działania na poziomie komórkowym (np. utrata funkcji vs. zysk funkcji), co ma kluczowe znaczenie dla informowania o sposobie dziedziczenia w rodzinach, zwłaszcza gdy małe ludzkie rodowody zawierają ograniczone informacje na temat sposobu przekazywania genów. W celu dokładniejszego porównania zastosowań dostępnych modeli myszy i danio pręgowanego przedstawiono w tabeli 1.
Zauważamy również, że istnieją nieodłączne ograniczenia systemu modeli danio pręgowanego. Chociaż D. rerio mają szybki początkowy rozwój układów narządów, dojrzałość płciowa wymaga około trzech miesięcy. Z tego powodu zaburzenia prenatalne i dziecięce są najbardziej podatne na ten przejściowy model ekspresji. Chociaż idealnie nadaje się do przeprowadzania dużych badań przesiewowych związków chemicznych, użycie mutantów genetycznych nie jest możliwe do systematycznego testowania tysięcy niesynonimicznych wariantów, które przyczyniają się do zaburzeń dziecięcych i nadal są wykrywane.
Opisane tutaj testy komplementacji wykorzystują tę eksperymentalną wykonalność, wysoki stopień homologii i zachowanie funkcji między białkami ludzkimi i danio pręgowanymi, szczególnie w przypadku cząsteczek niezbędnych do zachowania procesów rozwojowych. Rysunek 1 przedstawia strategię testowania i identyfikacji dla różnych efektów alleli. Można przeprowadzić zarówno testy utraty funkcji (LOF), jak i dominujące. W przypadku LOF eksperyment rozpoczyna się od supresji genu będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą knockdownu morfoliny i oznaczenia fenotypów, które mogą być istotne dla badanego fenotypu klinicznego. Supresję można osiągnąć albo poprzez blokowanie translacji poprzez celowanie w MO w miejscu rozpoczęcia translacji locus danio pręgowanego (morpholino blokujący translację; tbMO), albo przez zakłócanie splicingu poprzez umieszczenie MO na złączu splicingowym, zwykle indukując włączenie intronu lub nieprawidłowe pomijanie eksonów (splice blocking morpholino; sbMO).
Następnie, wprowadzane jest ograniczone mRNA z ortologicznego ludzkiego transkryptu i mierzone jest mierzone ratowanie fenotypu. Po ustaleniu testu, mutacje kandydujące w ludzkim przekazie mogą być wprowadzane i testowane pod kątem ich zdolności do ratowania fenotypu indukowanego przez MO z taką samą wydajnością, jak ludzkie mRNA WT. I odwrotnie, w przypadku kandydujących alleli dominujących, ludzkie mRNA (ale nie MO) wprowadza się z oczekiwaniem, że ludzkie mRNA WT nie wpłynie rażąco na anatomię i fizjologię danio pręgowanego, podczas gdy wprowadzenie mutacji testowych, które mają dominujący efekt, wywoła fenotypy analogiczne do tych obserwowanych w ludzkim stanie klinicznym. Eksperyment ten można dokładniej przeanalizować, aby zbadać, czy dominujący efekt występuje w wyniku wzmocnienia funkcji (GOF), czy też w wyniku połączenia WT i zmutowanego ludzkiego mRNA; w przypadku zdarzeń GOF oczekuje się, że dodanie ludzkiego mRNA WT będzie nieistotne, podczas gdy w przypadku alleli dominująco-ujemnych mieszanie WT i zmutowanego mRNA powinno zmienić nasilenie fenotypu indukowanego przez zmutowaną wiadomość. We wszystkich przypadkach zalecamy wykonanie wszystkich kombinacji wstrzyknięć (MO z ludzkim mRNA WT vs. morpholino ze zmutowanym ludzkim mRNA itp.), najlepiej w tym samym lęgu zarodków (patrz ryc. 1). Interpretacja jest następująca:
Dla testów LOF:
<ul>
	<li>Jeśli knockdown wytwarza fenotyp, który może być uratowany w równoważny sposób przez mutant i mRNA WT, allel jest prawdopodobnie łagodny.</li>
	<li>Jeśli uratowanie zmutowanego fenotypu knockdown jest nie do odróżnienia od samego fenotypu knockdown, allel jest prawdopodobnym funkcjonalnym zerem. Eksperyment nie jest w stanie rozróżnić między prawdziwymi zerami (brak funkcjonalnego białka) a ultraniskimi poziomami aktywności białka, które nie mają zdolności ratunkowej.</li>
	<li>Jeśli uratowanie zmutowanego fenotypu knockdown jest statystycznie lepsze niż MO, ale gorsze niż WT, allel jest prawdopodobnie hipomorfią, ponieważ wynik ten wskazuje na częściową utratę funkcji.</li>
</ul>
Dla testów dominujących:
<ul>
	<li>Jeśli nie ma fenotypu knockdown, ale wstrzyknięcie mRNA WT daje fenotyp, należy zastosować plan awaryjny, jeśli eksperyment ma być kontynuowany (patrz poniżej).</li>
	<li>Jeśli nie ma fenotypu knockdown, a wstrzyknięcie mRNA WT nie daje fenotypu, eksperyment przebiega jak zwykle.</li>
	<li>Jeśli wstrzyknięcie zmutowanego mRNA jest równoważne wstrzyknięciu mRNA typu dzikiego, allel może być łagodny lub utracić funkcję lub test mógł się nie powieść. Wymaga to dalszych eksperymentów w celu rozróżnienia między tymi opcjami.</li>
	<li>Jeśli wstrzyknięcie zmutowanego mRNA jest nie do odróżnienia od knockdownu MO, funkcja produktu genu jest prawdopodobnie w jakiś sposób zmieniona. Aby dostrzec zmianę funkcji, należy przeprowadzić miareczkowanie zmutowanego mRNA za pomocą mRNA typu dzikiego.</li>
	<li>Jeśli wynik tego miareczkowania jest nie do odróżnienia od samego mRNA typu dzikiego, wykazano, że zmutowany produkt białkowy wykorzystuje białko typu dzikiego jako substrat, ponieważ jego działanie zmienia się wraz z ilością miareczkowania. Wskazuje to na dominujący fenotyp negatywny.</li>
	<li>Jeśli wynik tego miareczkowania jest nie do odróżnienia od samego zmutowanego mRNA, wykazano, że zmutowany produkt białkowy nie pełni już takiej samej funkcji jak typ dziki, a zatem nie ma na niego wpływu ilość obecnego produktu białkowego typu dzikiego. To pokazuje, że allel jest prawdopodobnym przyrostem funkcji.</li>
</ul>
Plan awaryjny:
<ul>
	<li>Jeśli żaden fenotyp nie występuje w wyniku knockdownu MO, ale występuje z mRNA WT, mogą wystąpić dalsze eksperymenty, chociaż podkreślamy, że ta sytuacja nie jest idealna. Ludzkie mRNA WT powinno być miareczkowane w celu zminimalizowania fenotypu, a także może być używane jako nowa nastawa. Dalsze współwstrzykiwanie WT i zmutowanego ludzkiego mRNA można ocenić na podstawie zdolności ratowniczej mutanta.</li>
</ul>

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530S, M0530L</td><td></td></tr><tr><td>Endonukleaza restrykcyjna DpnI</td><td>NEB</td><td>R0176L, R0176S</td><td></td></tr><tr><td>Max Efficiency DH5&alpha; kompetentne komórki</td><td>Invitrogen</td><td>18258-012</td><td></td></tr><tr><td>Big Dye Terminator</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE Kit </td><td>Invitrogen</td><td>AM1340, AM1344, AM1348</td><td></td></tr><tr><td>Morpholino</td><td>Gene-Tools</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>1-fenylo-2-tiomocznik (PTU) </td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td>Przygotuj jako 0,003% PTU w pożywce zarodkowej </td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Dla zarodków, które muszą być utrwalone przed fenotypowaniem, przygotuj jako 4%</td></tr> <tr><td>metan trikainy sulfonian</td><td>Western Chemical</td><td>N/A</td><td>Do znieczulenia i eutanazji </td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>PTC-225 Tetrad Thermal Cycler</td><td>BioRad</td><td>Dowolny równoważny termocykler</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr Nano Drop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SMZ 745T</td><td>Stereomikroskop Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AZ100 Mikroskop stereoskopowy</td><td>Aparat cyfrowy Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DS Fi1 Nikon</td><td></td><td>Do obrazowania</td><td></td>kolorowego/fluorescencyjnego</tr><tr><td>Aparat cyfrowy DS QiMC Nikon</td><td>Do</td><td>obrazowania</td><td></td>czarno-białego</tr><tr><td>Zaawansowane oprogramowanie do obrazowania Resarch 3.2 NIS-Elements</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) modelowanie chorobliwego genomu ludzkiego przy użyciu danio rerio

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Tutaj prezentujemy metody opracowywania testów do badania potencjalnie klinicznie istotnych zmian niesynonimicznych za pomocą komplementacji in vivo u danio pręgowanego. Danio pręgowany (Danio rerio) jest użytecznym systemem zwierzęcym ze względu na ich eksperymentalną podatność; Zarodki są przezroczyste, aby umożliwić łatwe oglądanie, ulegają szybkiemu rozwojowi ex vivo i mogą być modyfikowane genetycznie. 1 Aspekty te pozwoliły na znaczne postępy w analizie embriogenezy, procesów molekularnych i sygnalizacji morfogenetycznej. Podsumowując, zalety tego modelu kręgowców sprawiają, że danio pręgowany jest bardzo podatny na modelowanie wad rozwojowych w chorobach dziecięcych, a w niektórych przypadkach zaburzeń o początku w wieku dorosłym. Ponieważ genom danio pręgowanego jest wysoce konserwatywny z genomem człowieka (~ 70% ortologiczny), możliwe jest odtworzenie stanów chorobowych człowieka u danio młodego. Osiąga się to poprzez wstrzyknięcie zmutowanego ludzkiego mRNA w celu wywołania dominujących alleli ujemnych lub alleli wzmocnienia funkcji, lub wykorzystanie oligonukleotydów antysensownych morfolino (MO) do tłumienia genów w celu naśladowania utraty wariantów funkcji. Poprzez uzupełnienie fenotypów indukowanych przez MO o ograniczone ludzkie mRNA, nasze podejście umożliwia interpretację szkodliwego wpływu mutacji na sekwencję ludzkiego białka w oparciu o zdolność zmutowanego mRNA do ratowania mierzalnego, fizjologicznie istotnego fenotypu. Modelowanie ludzkich alleli chorobowych odbywa się poprzez mikroiniekcję zarodków danio pręgowanego MO i/lub ludzkim mRNA w fazie 1-4 komórek oraz fenotypowanie do siedmiu dni po zapłodnieniu (dpf). Ta ogólna strategia może być rozszerzona na szeroki zakres fenotypów choroby, jak wykazano w poniższym protokole. Przedstawiamy nasze sprawdzone modele sygnalizacji morfogenetycznej, fenotypów czaszkowo-twarzowych, sercowych, integralności naczyniowej, funkcji nerek i zaburzeń mięśni szkieletowych, a także inne.

Tutaj prezentujemy systematyczne podejście do opracowywania fizjologicznie istotnych, czułych i specyficznych testów in vivo do interpretacji zmienności w ludzkiej patologii. Przejściowa manipulacja genetyczna poprzez mikrowstrzyknięcie WT i zmutowanych ludzkich oligonukleotydów antysensownych mRNA i morfoliny (MO) wykorzystuje podatność rozwijającego się zarodka danio pręgowanego do szybkiego oznaczania mutacji patogennych, zwłaszcza, ale nie wyłącznie, w kontekście zaburzeń rozwojowych człowieka.

In vivo (in vivo) Modelowanie chorobliwego genomu ludzkiego przy użyciu Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

- [Narrator] Ogólnym celem następnego eksperymentu jest ocena patogenności klinicznie istotnych zmian niesynonimicznych z wykorzystaniem komplementacji in vivo u danio pręgowanych. Osiąga się to najpierw poprzez wytworzenie zmutowanego ludzkiego mRNA w celu odtworzenia ludzkich uszkodzeń genetycznych. Następnie ludzkie mRNA typu dzikiego i zmutowane oraz morfolino wstrzykuje się do embrionów danio pręgowanych, gdzie są one odpowiednio tłumaczone na funkcjonalne białko lub wykorzystywane do blokowania translacji. Następnie przeprowadza się fenotypowanie embrionów w celu oceny wpływu zmutowanego białka na rozwój. Uzyskane wyniki wykazują szkodliwe efekty mutacji w sekwencjach ludzkich białek, co można potwierdzić na podstawie zdolności naprawczej zmutowanego ludzkiego mRNA.- Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak model mysi, jest możliwość szybszego badania potencjalnie uszkadzających alleli przy średniej lub wysokiej przepustowości; ponadto można ocenić serie alleliczne w obrębie jednego genu, aby lepiej zrozumieć efekt kierunkowy na poziomie komórkowym, taki jak utrata funkcji lub nabycie funkcji.- [Narrator] Na początek należy ustalić, czy badany ludzki gen posiada ortolog u danio pręgowanego, a jeśli tak, to w ilu kopiach. Zalecamy przeprowadzenie wzajemnego BLAST-owania ludzkiego białka względem genomu danio pręgowanego, a następnie BLAST-owania uzyskanego trafienia z danio pręgowanego względem genomu ludzkiego. Prawdziwe ortologi będą najlepszymi trafieniami w każdym z tych przypadków. Należy pozyskać lub przygotować konstrukt wykorzystujący ludzką otwartą ramkę odczytu (ORF) dla pożądanego genu o długości mniejszej niż 6 kb, a także 5' miejsce transkrypcji SP6 oraz 3' sygnał polyA. Następnie należy zaprojektować morpholino w celu zablokowania splicingu lub translacji docelowego genu danio pręgowanego. Korzystając ze strony zfin.org, należy ustalić, czy ortolog danio pręgowanego wykazuje ekspresję w kontekście czasowo-przestrzennym istotnym dla odczytu fenotypowego. Alternatywnie można przeprowadzić RT-PCR z wykorzystaniem cDNA z całych embrionów danio pręgowanego lub hybrydyzację in situ. Aby przeprowadzić mutogenezę celowaną, należy rozpocząć od zaprojektowania starterów do mutogenezy o długości od 25 do 45 zasad z pożądaną mutacją w centrum, które będą przyłączać się do przeciwległych nici plazmidu. Temperatura topnienia startera powinna być większa lub równa 78 °C. Należy przygotować reakcję mutogenezy z użyciem polimerazy o wysokiej wierności i przeprowadzić cykle zgodnie z przedstawionym tutaj programem. Po zakończeniu reakcji PCR do każdej reakcji należy dodać 1 µL endonukleazy restrykcyjnej DpnI, aby usunąć matrycę zmetylowaną przez dam. Inkubować w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. 2 µL reakcji mutogenezy należy przetransformować do 20 µL kompetentnych komórek zgodnie ze standardowymi protokołami. Po potwierdzeniu interesującej mutacji oraz sekwencji całej ORF w kulturach nocnych, należy zlinearyzować matrycę pCS2+ i wygenerować mRNA z czapką. Po oznaczeniu stężenia mRNA i zweryfikowaniu jego integralności za pomocą elektroforezy żelowej, próbki należy przechowywać w trzech lub więcej aliquotach w temperaturze -80 °C do momentu użycia. W przypadku eksperymentów nad utratą funkcji wariantu, należy pozyskać embriony z naturalnych tarła danio pręgowanego i utrzymywać je w temperaturze 28 °C w wodzie do embrionów w szalkach o średnicy 6 lub 10 cm. Należy przeprowadzić krzywą odpowiedzi na dawkę morpholino, wstrzykując co najmniej trzy różne stężenia w zakresie od 1 do 10 ng do 50–100 embrionów danio pręgowanego na dawkę. Efektywne morpholino powinny powodować zależny od dawki wzrost proporcji dotkniętych embrionów w danej partii. Podczas przeprowadzania analizy ilościowej lub jakościowej, jeśli ocena embrionów odbywa się w 24 h po zapłodnieniu lub później, należy potraktować embriony fenylotiomocznikiem w 24 h po zapłodnieniu, aby ograniczyć tworzenie się melanocytów. W przypadku morpholino blokujących splicing, niedobór wywołany przez morpholino należy przetestować poprzez ekstrakcję całkowitego RNA z lizatów całych embrionów w punkcie czasowym oceny fenotypowej. Należy wygenerować cDNA i przeprowadzić RT-PCR docelowego genu przy użyciu starterów flankujących miejsce docelowe morpholino. Aby zweryfikować wydajność supresji morpholino blokującego translację (TBMO), jeśli dostępne jest przeciwciało wykazujące reakcję krzyżową z białkiem danio pręgowanego, należy zebrać lizaty białkowe z całych embrionów i przeprowadzić immunoblotting w celu porównania poziomów docelowego białka względem kontroli. Jeśli przeciwciało nie jest dostępne, należy współwstrzyknąć mRNA typu dzikiego wraz z TBMO, aby wykazać, że ratuje ono fenotyp, lub zademonstrować zależność od dawki, jak opisano wcześniej. Jeśli zaobserwowano fenotyp jakościowy, należy wybrać dawkę morpholino, przy której dotkniętych jest 50% do 75% embrionów. W przypadku fenotypów ilościowych należy wybrać dawkę, przy której pomiar fenotypowy różni się znacząco od typu dzikiego. Następnie nowe partie embrionów należy wstrzyknąć koktajlem zawierającym dawkę assay morpholino oraz krzywą dawek ludzkiego mRNA typu dzikiego. Następnie należy przeprowadzić ślepą ocenę partii wstrzyknięć, aby określić dawkę ludzkiego mRNA typu dzikiego z najbardziej znaczącym ratowaniem w porównaniu do samego MO. Będzie to dawka assay mRNA. Nowe partie embrionów należy wstrzyknąć dawkami assay morpholino oraz zmutowanym ludzkim mRNA. Fenotyp embrionów należy ocenić na odpowiednim etapie i, używając testu chi-kwadrat lub testu t, porównać wyniki z ratowaniem za pomocą ludzkiego mRNA typu dzikiego. Jeśli po wstrzyknięciu morpholino nie zaobserwowano fenotypu utraty funkcji lub jeśli zmutowane mRNA daje fenotypy nieznacząco różniące się od samego MO, należy wstrzyknąć krzywą dawek ludzkiego mRNA typu dzikiego do partii embrionów. Należy przeprowadzić ocenę fenotypową i określić najwyższą dawkę, przy której liczba martwych i/lub dotkniętych embrionów nie jest statystycznie istotna w porównaniu z kontrolami niewstrzykniętymi. Jest to dawka assay. Należy wstrzyknąć dawkę assay zmutowanego ludzkiego mRNA, ocenić fenotyp embrionów i porównać wyniki z oceną po wstrzyknięciu dawki assay ludzkiego mRNA typu dzikiego lub assay stężenia morpholino. Jeśli wyniki są nieodróżnialne od morpholino, należy miareczkować zmutowane mRNA za pomocą mRNA typu dzikiego i porównać z wstrzyknięciami ludzkiego mRNA typu dzikiego i zmutowanego. Poprawa fenotypów w partiach wstrzykniętych zmutowanym i dzikim mRNA wskazuje na efekt dominant-negative. Brak poprawy wskazuje na nabycie funkcji (gain of function). Na koniec, aby zintegrować dane o patogenności in vivo u danio pręgowanego z innymi dowodami, należy porównać je z danymi genetycznymi w obrębie rodowodu, danymi o częstości występowania w populacji kontrolnej oraz badaniami białek in vitro na komórkach. Przedstawiono tutaj ilościową i jakościową ocenę ludzkich mutacji MKS1 modelowanych w embrionach danio pręgowanego. W zależności od nasilenia fenotypy podzielono na 3 grupy: embriony wstrzyknięte morpholino z fenotypami klasy I miały ogólnie prawidłową morfologię, ale były krótsze z nadmiarem tkanki embrionalnej na żółtku w porównaniu z embrionami wstrzykniętymi kontrolnie. Morfanty klasy II były cieńsze, krótkie, miały słabo rozwinięte struktury głowy i ogona, a ponadto brakowało im definicji i symetrii somitów. Embriony klasy III wykazywały silne opóźnienie rozwoju ze słabo rozwiniętymi i zdeformowanymi somitami, pofalowanymi notochordami i zazwyczaj nie przeżywały etapu 10 somitów. Współwstrzyknięcie ludzkiego mRNA MKS1 uratowało każdy z tych defektów, wykazując swoistość fenotypów dla supresji MKS1. Fenotypy ilościowo określono poprzez pomiar odległości od pierwszego do ostatniego widocznego somitu w embrionach barwionych ryboprobenami krox20, pax2 i myoD w etapie 11 somitów. Przedstawiono tutaj model danio pręgowanego dla ludzkiej dysmorfologii kraniofacjalnej. Embriony wstrzyknięte kontrolnie i zmutowanym mRNA zabarwiono błękitem Alcyjany w piątym dniu po zapłodnieniu. Embriony zmutowane wykazywały wyraźnie mniejsze i zdeformowane głowy oraz ogólną dezorganizację chrzęstnego szkieletu kraniofacjalnego, w tym rozszerzone łuki skrzelowe oraz brakujące lub zdeformowane struktury. W piątym dniu po zapłodnieniu embrion morfanta z makrocefalią wykazuje poszerzenie głowy, co widać po odległości między oczami. W tym przykładzie zmniejszonej integralności naczyniowej w drugim dniu po zapłodnieniu, morfanty wykazują upośledzone wypuszczanie naczyń intersegmentalnych i innych struktur naczyniowych. Hybrydyzacja in situ niewstrzykniętych embrionów typu dzikiego wykazuje ekspresję spaw w lewym mezodermie płytki bocznej, co stanowi kontrolę prawidłowego zapętlenia serca. Embriony morfantów Ccdc39 wykazywały obustronną lub w większości przypadków niewykrywalną ekspresję spaw. Przedstawiono tutaj przykład morfanta Ift80, u którego rozwijają się duże torbiele nerkowe, obrzęk osierdziowy i zakręcony ogon. Aby zwizualizować zmniejszone filtrowanie kłębuszkowe, do serca wstrzyknięto dekstran rodaminy, a fluorescencję zwizualizowano 24 godziny później. Fluorescencja jest nieobecna w embrionie kontrolnym, gdzie rozprzestrzenia się w całym układzie naczyniowym i jest prawie całkowicie usuwana przez nerkę. Embrion morfanta Ift80 wykazuje trwały sygnał fluorescencyjnego dekstranu, co sugeruje zmniejszone filtrowanie kłębuszkowe. W tym modelu dystrofii mięśniowej, wstrzyknięte embriony typu dzikiego wykazują prawidłowe wolne włókna mięśniowe rozciągające się przez somity między sąsiednimi myoseptami, co określono za pomocą immunobarwienia z użyciem przeciwciała przeciwko wolnej miozynie. Wstrzyknięte embriony zmutowane wykazywały częściowe lub całkowite odłączenie włókien mięśniowych od myoseptów w jednym lub wielu somitach. Przedstawiono tutaj widoki boczne na żywo kontroli niewstrzykniętej i morfanta Kif7 w 30 godzinach po zapłodnieniu. Jak widać z porównania kąta somitów, morfanty wykazują nieprawidłowo ukształtowane somity, co przypisuje się ektopowej sygnalizacji Hedgehog w miotomie danio pręgowanego.- Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne wyobrażenie o tym, jak opracowywać fizjologicznie istotne, czułe i specyficzne testy in vivo do interpretacji ludzkiej zmienności w patologii, wykorzystując danio pręgowanego jako model organizmu.

in-vivo-modeling-of-the-morbid-human-genome-using-danio-rerio

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

In Vivo modelowanie wadliwego ludzkiego genomu przy użyciu Danio rerio

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

Wielkoskalowa mikroskopia elektronowa 2D (EM), czyli nanotomia, to ogólnotkankowe zastosowanie nanoskalowej rozdzielczości EM. W tym miejscu opisujemy uniwersalną metodę nanotomii stosowaną do badania mózgu larw danio pręgowanego w zdrowiu i po nieinwazyjnym uszkodzeniu mózgu.

Wielkoskalowa skaningowa transmisyjna mikroskopia elektronowa (nanotomia) mózgu zdrowego i uszkodzonego danio pręgowanego

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Tutaj prezentujemy protokół umożliwiający efektywny dostęp i analizę wielu baz danych organizmów ludzkich i modelowych. Protokół ten demonstruje wykorzystanie MARRVEL do analizy potencjalnych wariantów wywołujących chorobę zidentyfikowanych w wyniku sekwencjonowania nowej generacji.

Poruszanie się po MARRVEL, narzędziu internetowym, które integruje informacje z genomiki człowieka i genetyki organizmów modelowych

Celem tego protokołu jest przedstawienie projektu i wydajności eksperymentów in vivo na Drosophila melanogaster w celu oceny funkcjonalnych konsekwencji rzadkich wariantów genów związanych z chorobami ludzkimi.

Badanie funkcjonalne in vivo rzadkich wariantów ludzkich związanych z chorobą przy użyciu Drosophila

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych jest najcenniejszym narzędziem w biologii rozwoju. Głównym problemem w badaniach porównawczych jest wariancja otoczenia. Nasz protokół opisuje eksperymentalne ramy do jednoczesnego obrazowania na żywo wielu próbek i dlatego aktywnie rozwiązuje ten problem.

Jednoczesne obrazowanie na żywo wielu zarodków owadów w mikroskopach fluorescencyjnych z arkuszami świetlnymi w komorze na próbki

Ten protokół opisuje mikroiniekcję i elektroporację in vivo dla regionalnie ograniczonej edycji genomu za pośrednictwem CRISPR w jajowodzie myszy.

Somatyczne modele myszy z inżynierią genomu przy użyciu mikroiniekcji in vivo i elektroporacji

RASopatie to wielosystemowe zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją szlaku RAS-MAPUK. Potencjalnie patogenne warianty oczekujące na walidację pojawiają się nieustannie, podczas gdy słabe dowody przedkliniczne ograniczają terapię. Tutaj opisujemy nasz protokół in vivo polegający na testowaniu i krzyżowej weryfikacji poziomów aktywacji ERK związanych z RASopatią oraz jego modulacji farmakologicznej podczas embrigenezy za pomocą obrazowania FRET na żywo u danio danio młodego typu Teen-reporter.

Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji

Tutaj przedstawiamy instrukcje dotyczące skutecznego wykorzystania SegElegans, systemu głębokiego uczenia, który opracowaliśmy do automatycznego segmentowania pojedynczych robaków na mikroskopii szerokopolowej, do późniejszego wykorzystania w oprogramowaniu do analizy obrazów, takiego jak ImageJ. Oferujemy możliwości korzystania z systemu zarówno online, jak i offline.

Automatyczna analiza obrazów fluorescencyjnych C. elegans z użyciem SegElegans

Poznaj metodę oceny patogenności mutacji w genach ludzkich przy użyciu embriosów Danio rerio. Technika ta umożliwia szybką analizę wysokoprzepustową wpływu zmian genetycznych na rozwój.

In vivo (in vivo) Modelowanie chorobliwego genomu ludzkiego przy użyciu Danio rerio

Przeglądaj więcej filmów