Nowatorska metoda hodowli ex vivo embrionalnego serca myszy

Ogólnym celem tej procedury jest wycięcie serca zarodka do hodowli ex vivo. Osiąga się to poprzez pobranie najpierw rogu macicy od ciężarnej samicy myszy. Następnie pobiera się zarodek i przygotowuje go do sekcji.

Następnie otwiera się zarodkową ścianę klatki piersiowej, aby uwidocznić serce. Na koniec serce jest wycinane i umieszczane w kulturze zawierającej rozcieńczony matrigel. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują zdrowe żywe serce, oglądając je pod mikroskopem jasnego pola.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak hodowle kołysania, jest to, że serce można leczyć zarówno środkami miejscowymi, takimi jak białko sprzężone z kulkami, jak i środkami globalnymi, takimi jak dodanie małej cząsteczki do matrycy. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób sercowo-naczyniowych, ponieważ pozwala na badanie zdarzeń w wyspecjalizowanych segmentach serca w kontekście całego nienaruszonego narządu. Po eutanazji ciężarnej myszy w pożądanym dniu embrionalnym, stosując technikę zatwierdzoną przez Twój instytut, obficie spryskaj samicę 70% etanolem przed otwarciem jamy brzusznej oraz pobraniem i wycięciem rogu macicy.

Umieść róg macicy na szalce Petriego zawierającej zimny XPBS i opłucz go. Umieść naczynie na lodzie, aż będzie gotowe do sekcji. Następnie rozetnij róg macicy przez linię środkową, aby odsłonić przyczepione worki embrionalne.

Rozciąć worek embrionalny i umieścić zarodek na drugiej szalce Petriego z zimnym PBS. Umieść naczynie z rogiem macicy na lodzie. Po odcięciu zarodka należy położyć zarodek na plecach i pokroić.

Otwórz ścianę klatki piersiowej, aby uwidocznić serce i płuca. W zależności od etapu, ściana klatki piersiowej może być przezroczysta. Jeśli ma być wykonane genotypowanie, należy zachować ogon zarodka.

Za pomocą kleszczy ostrożnie podnieś serce i przetnij naczynia poniżej. Następnie przetnij nad wielkimi naczyniami, aby uwolnić serce. W razie potrzeby usuń obce tkanki.

Umieść serce w jednym dołku w 24-dołkowym naczyniu wypełnionym zimnym PBS i siedząc na lodzie. Powtórz sekcję, aby wyizolować wszystkie serca embrionalne. W okapie z przepływem laminarnym połącz zimny żel matri i żądaną pożywkę hodowlaną w stosunku jeden do jednego, utrzymując rozcieńczony żel matri na lodzie.

Odpipetować od 500 do 1000 mikrolitrów roztworu do studzienek 24-dołkowej hodowli. Połóż to na lodzie. Ostrożnie wybierz i umieść wycięte serca w poszczególnych dołkach naczynia z matrycą zawierającą kulturę.

Jeśli orientacja osadzonego serca ma kluczowe znaczenie, użyj 70% etanolu, aby obficie spryskać odwrócony mikroskop i otaczającą go przestrzeń. Następnie, po pracy w kapturze, umieść serce w dołku maty żelowej na lodzie. Umieść płytkę na stoliku mikroskopu i szybko ustaw serce, gdy żel matowy zacznie krzepnąć.

Umieść naczynie hodowlane w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pozwól żelowi matri zestalić się przez około 30 minut. Dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanej kultury, pożywki do każdej studzienki zawierającej serce. Serca mogą pozostać w kulturze przez co najmniej cztery dni.

W razie potrzeby dodaj fluorescencyjną matrycę do żywych komórek, taką jak cyto 16. Aby zobrazować żywe serce, fotografia będzie ograniczona do tej strony serca, która jest widoczna na podstawie pozycji, w której zostało osadzone. Jeśli ma być wykonane obrazowanie całego mocowania lub cięcie, usuń pożywkę hodowlaną.

Zastąp go zimnym 4% formaldehydem i umieść naczynie na lodzie na 30 minut. Po rozpuszczeniu matrigelu zastąp utrwalacz i matrigel świeżym formaldehydem i utrwal serca na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyj serca PBS lub Triss i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu dalszych analiz.

Podczas hodowli ex vivo przez 24 godziny naczynia wieńcowe wyglądają podobnie do serca wyciętego z zarodka w porównywalnym wieku, który był utrzymywany w macicy, jak pokazano tutaj. Analiza hematów, toiny i eoiny serc wyciętych w grupie E 16,5 i hodowanych ex vivo przez cztery dni wykazuje, że ogólna morfologia, w tym ściany wielkich tętnic oraz mięśnia sercowego przegrody międzykomorowej i międzykomorowej serca pozostaje nienaruszona pomimo braku krążenia. Choroba wieńcowa jest widoczna, jak wskazuje grot strzałki.

Jednak fragmentacja DNA oznaczona strzałkami i obserwowana zarówno za pomocą h, jak i d oraz DAPI jest widoczna w zwartym mięśniu sercowym i wokół wielkich naczyń. Co więcej, mięsień sercowy jest mniej gęsty w porównaniu z sercem z zarodka E 18,5, które rozwinęło się w macicy, mimo że serce wyhodowane ex vivo nadal biło. W związku z tym istnieją ograniczenia co do długości czasu lub etapu, na którym te serca mogą być utrzymane.

Ta technika hodowli może być również stosowana do fluorescencyjnego znakowania serc, podczas gdy w hodowli, po inkubacji za pomocą barwnika fluorescencyjnego specyficznego dla śródbłonka, serca są hodowane przez 48 godzin. W tym przypadku wizualizacja jest ograniczona w zależności od orientacji serca i zmętnienia tkanki. Kolejne odcinki histologiczne przez mięsień sercowy komory potwierdzają, że cyto 16 może przenikać do zewnętrznych warstw komórek, aby oznaczyć naczynia podnasierdziowe w komorach i kolokalizuje się z selektyną, jak pokazano tutaj Po hodowli ex vivo przez 30 godzin, serce wycięte z zarodka E 14,5 wykazuje stałą kurczliwość i stymulację między przedsionkami a komorami.

Podczas wykonywania tej techniki ważne jest, aby być delikatnym i ostrożnym podczas wycinania serca. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wycinać i hodować embrionalne serce myszy.