Name: Hodowla pierwotnych komórek przewodu rdzeniowego wewnętrznego rdzenia szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Poznaj metodę hodowli pierwotnych komórek IMCD szczura do badań nad mechanizmami reabsorpcji wody zależnymi od argininy-wazopresyny. Protokół obejmuje izolację rdzenia wewnętrznego, trawienie enzymatyczne i selekcję komórek głównych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; KL 1415/3-2 i KL 1415/4-2).

1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotowanie potraw z kultur
	<ol>
		<li>Rozmrozić kolagen typu IV O/N w temperaturze 4 °C i rozpuścić go w 0,1% sterylnym kwasie octowym. Objętość, której należy użyć, zależy od rodzaju i liczby naczyń, w których mają zostać wysiane komórki. Stosować 2 μg/cm2.</li>
		<li>Inkubować naczynia przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej i dwukrotnie obmyć wodą destylowaną (A. tridest).</li>
		<li>Pozostaw naczynia do prawidłowego wyschnięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Suplementacja pożywki
	<ol>
		<li>Zwiększ poziom glukozy do 4,5 g/l, dodając 1,75 g glukozy do 500 ml pożywki. Aby dostosować pożywkę do 600 mosmol, dodaj 100 mM NaCl i 100 mM mocznika, aby zwiększyć osmolarność odpowiednio o 200 mosmol i 100 mosmol.</li>
		<li>Dodać 1% aminokwasów endogennych, 1% ultrosera, 500 μM DBcAMP, 20 U/ml nystatyny i 0,25 μg/ml gentamycyny (rozcieńczenie roztworu podstawowego 1:200 o stężeniu 50 μg/ml) do 600 pożywki MOSMOL DMEM świeżo w dniu przygotowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór enzymatyczny
	<ol>
		<li>Dodać 1 mg/ml hialuronidazy i 2,2 mg/ml kolagenazy do 0,25 μg/ml gentamycyny i nystatyny zawierających DPBS. Przygotować 1 ml tego roztworu enzymatycznego do trawienia 2 rdzeni wewnętrznych nerek. Roztwór musi być wysterylizowany przez filtrację i jest przechowywany w probówkach Falcon o pojemności 50 ml.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla komórek IMCD (Root Rin) Inner Mespinary Collector Duct (IMCD)
Wszystkie procedury postępowania ze zwierzętami muszą być przeprowadzane zgodnie z lokalnymi i federalnymi przepisami.
<ol>
	<li>Znieczulać szczury w CO2 (w pudełku nasyconym CO2 ) lub izofluranem (jednostka anestezjologiczna U-400, Univentor Ltd., Malta; przepływ powietrza 350-400 ml/min z 2-2,5% izofluranem). Odciąć głowy zwierzętom w celu wykrwawienia, co pozwala na dokładne wykrycie granicy między białawym rdzeniem wewnętrznym a ciemniejszym zewnętrznym. Ponadto krwawienie minimalizuje liczbę izolowanych erytrocytów. Usunąć nerki i umyć je w sterylnych DPBS z dodatkiem gentamycyny i nystatyny (patrz wyżej) na lodzie. Wszystkie dalsze czynności należy wykonywać w sterylnych, czystych warunkach laboratoryjnych.</li>
	<li>Przenieść nerki z roztworu DPBS na sterylny kompres w celu usunięcia nadmiaru płynu. Usuń tłuszczową torebkę nerkową za pomocą sterylnych kleszczyków i nożyczek.</li>
	<li>Mając nerkę nadal zamocowaną w kompresie, przeciąć lekko obok osi podłużnej zewnętrznej (korowej) strony. Upewnij się, że nie przecinasz go całkowicie, ale pozostawiasz go w jednym kawałku, połączonym w miednicy nerkowej.</li>
	<li>Zakrzywionymi nożyczkami ostrożnie rozetnij białawe rdzeń wewnętrzny, który jest otoczony różowo połyskującym rdzeniem zewnętrznym. Zebrać je w DPBS, zawierającym gentamycynę i nystatynę, w naczyniu hodowlanym o średnicy 60 mm na lodzie.</li>
	<li>Gdy wszystkie rdzenie zostaną wyizolowane i zebrane na lodzie, zmniejsz objętość DPBS do poziomu, w którym są one po prostu pokryte buforem. Za pomocą sterylnej żyletki pokrój rdzeń w kostkę o średnicy 5 mm3.</li>
	<li>Rozpuść i zaokrąglij ostry koniec sterylnej pipety Pasteura, trzymając ją krótko w płomieniu. Zanim przejdziesz dalej, upewnij się, że pipeta jest schłodzona.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę tkankową do 50 ml probówek Falcon zawierających świeżo przygotowany sterylny roztwór enzymatyczny z hialuronidazą i kolagenazą (patrz 1.3.1) za pomocą zaokrąglonej pipety Pasteura. Zamknij szczelnie pokrywę i inkubuj w temperaturze 37 °C przy ciągłym mieszaniu (220 obr./min) w zwykłej łaźni wodnej przez 1,5 - 2 godziny.</li>
	<li>W celu rozprowadzenia zawiesiny, należy kilkakrotnie odpipetować mieszaninę w górę i w dół za pomocą okrągłej pipety Pasteura (patrz wyżej), aż zawiesina stanie się jednorodnie mętna.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę przez 5 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze 16 °C. Odrzucić supernatant, dokładnie zawiesić osad w DPBS, zawierającym gentamycynę i nystatynę, a następnie ponownie odwirować. Powtórz ten krok prania raz.</li>
	<li>Zawiesić komórki w całkowicie uzupełnionej pożywce i umieścić je w szalkach hodowlanych i/lub płytkach z mikromiareczkami. Przygotowanie 2 rdzeni (1 zwierzę) da wystarczającą ilość komórek na jedno 60 mm naczynie hodowlane.</li>
	<li>Po 24 godzinach umyj komórki dwukrotnie 600 mosmol DMEM i dodaj świeże podłoże. W ciągu następnego tygodnia komórki należy umyć 2-3 razy (ryc. 1). 6-8 dni po wysianiu komórki IMCD można wykorzystać do eksperymentów. Pamiętaj, aby inkubować je w pożywce bez DBcAMP i nystatyny przez 24 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu. W przeciwnym razie AQP2 będzie zlokalizowany wyłącznie w błonie komórkowej.</li>
</ol>

<ol><li>Stoos, B. A., Naray-Fejes-Toth, A., Carretero, O. A., Ito, S., Fejes-Toth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mouse+cortical+collecting+duct+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mouse cortical collecting duct cell line.</a> Kidney International. 39, 1168-1175 (1991).</li>
<li>Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+a+human+cell+line+transformed+by+DNA+from+human+adenovirus+type+5%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+general+virology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5.</a> The Journal of general virology. 36, 59-74 (1977).</li>
<li>Gluzman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SV40-transformed+simian+cells+support+the+replication+of+early+SV40+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants.</a> Cell. 23, 175-182 (1981).</li>
<li>Ala, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+twelve+mutant+V2+vasopressin+receptors+related+to+nephrogenic+diabetes+insipidus%3A+molecular+basis+of+a+mild+clinical+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Functional studies of twelve mutant V2 vasopressin receptors related to nephrogenic diabetes insipidus: molecular basis of a mild clinical phenotype.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 9, 1861-1872 (1998).</li>
<li>Richardson, J. C., Scalera, V., Simmons, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+strains+of+MDCK+cells+which+resemble+separate+nephron+tubule+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Identification of two strains of MDCK cells which resemble separate nephron tubule segments.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 673, 26-36 (1981).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin+2+Promotes+Cell+Migration+and+Epithelial+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Aquaporin 2 Promotes Cell Migration and Epithelial Morphogenesis.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. , (2012).</li>
<li>Perantoni, A., Berman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+Wilms%27+tumor+line+%28TuWi%29+and+pig+kidney+line+%28LLC-PK1%29+typical+of+normal+kidney+tubular+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro%22%5BJournal%5D)">Properties of Wilms' tumor line (TuWi) and pig kidney line (LLC-PK1) typical of normal kidney tubular epithelium.</a> In vitro. 15, 446-454 (1979).</li>
<li>Katsura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+and+regulated+membrane+expression+of+aquaporin+1+and+aquaporin+2+water+channels+in+stably+transfected+LLC-PK1+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7212-7216 (1995).</li>
<li>Hull, R. N., Cherry, W. R., Weaver, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+characteristics+of+a+pig+kidney+cell+strain%2C+LLC-PK%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro%22%5BJournal%5D)">The origin and characteristics of a pig kidney cell strain, LLC-PK.</a> In vitro. 12, 670-677 (1976).</li>
<li>Nedvetsky, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+regulation+of+aquaporin-2+abundance+and+degradation+by+protein+kinase+A+and+p38-MAP+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Reciprocal regulation of aquaporin-2 abundance and degradation by protein kinase A and p38-MAP kinase.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 21, 1645-1656 (2010).</li>
<li>Iolascon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Two+Novel+Missense+Mutations+in+the+AQP2+Gene+Causing+Nephrogenic+Diabetes+Insipidus%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Two Novel Missense Mutations in the AQP2 Gene Causing Nephrogenic Diabetes Insipidus.</a> Nephron Physiology. 105, p33-p41 (2007).</li>
<li>Deen, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-2+transfection+of+Madin-Darby+canine+kidney+cells+reconstitutes+vasopressin-regulated+transcellular+osmotic+water+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-2 transfection of Madin-Darby canine kidney cells reconstitutes vasopressin-regulated transcellular osmotic water transport.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 8, 1493-1501 (1997).</li>
<li>Valenti, G., Frigeri, A., Ronco, P. M., D'Ettorre, C., Svelto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+functional+analysis+of+water+channels+in+a+stably+AQP2-transfected+human+collecting+duct+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression and functional analysis of water channels in a stably AQP2-transfected human collecting duct cell line.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271, 24365-24370 (1996).</li>
<li>Steele, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+immortalization+of+principal+cells+from+mouse+collecting+duct%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Telomerase immortalization of principal cells from mouse collecting duct.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299, F1507-F1514 (2010).</li>
<li>Bens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosteroid-dependent+sodium+transport+in+a+novel+immortalized+mouse+collecting+duct+principal+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Corticosteroid-dependent sodium transport in a novel immortalized mouse collecting duct principal cell line.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 10, 923-934 (1999).</li>
<li>Hasler, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+regulation+of+aquaporin-2+expression+in+vasopressin-responsive+renal+collecting+duct+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Long term regulation of aquaporin-2 expression in vasopressin-responsive renal collecting duct principal cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277, 10379-10386 (1074).</li>
<li>Miller, R. L., Sandoval, P. C., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasopressin+inhibits+apoptosis+in+renal+collecting+duct+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Vasopressin inhibits apoptosis in renal collecting duct cells.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. , (2012).</li>
<li>Kleinman, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+complexes+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Basement membrane complexes with biological activity.</a> Biochemistry. 25, 312-318 (1986).</li>
<li>Storm, R., Klussmann, E., Geelhaar, A., Rosenthal, W., Maric, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmolality+and+solute+composition+are+strong+regulators+of+AQP2+expression+in+renal+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Osmolality and solute composition are strong regulators of AQP2 expression in renal principal cells.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 284, 189-198 (2003).</li>
<li>Maric, K., Oksche, A., Rosenthal, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-2+expression+in+primary+cultured+rat+inner+medullary+collecting+duct+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-2 expression in primary cultured rat inner medullary collecting duct cells.</a> Am. J. Physiol. 275, 796-801 (1998).</li>
<li>Liebenhoff, U., Rosenthal, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Rab3-%2C+Rab5a-+and+synaptobrevin+II-like+proteins+in+a+preparation+of+rat+kidney+vesicles+containing+the+vasopressin-regulated+water+channel%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of Rab3-, Rab5a- and synaptobrevin II-like proteins in a preparation of rat kidney vesicles containing the vasopressin-regulated water channel.</a> FEBS Lett. 365, 209-213 (1995).</li>
<li>Lorenz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+is+sufficient+for+triggering+the+exocytic+recruitment+of+aquaporin-2+in+renal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP is sufficient for triggering the exocytic recruitment of aquaporin-2 in renal epithelial cells.</a> EMBO Rep. 4, 88-93 (2003).</li>
<li>Tamma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prostaglandin+E2+analogue+sulprostone+antagonizes+vasopressin-induced+antidiuresis+through+activation+of+Rho%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The prostaglandin E2 analogue sulprostone antagonizes vasopressin-induced antidiuresis through activation of Rho.</a> J. Cell Sci. 116, 3285-3294 (2003).</li>
<li>Maric, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+volume+kinetics+of+adherent+epithelial+cells+measured+by+laser+scanning+reflection+microscopy%3A+determination+of+water+permeability+changes+of+renal+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cell volume kinetics of adherent epithelial cells measured by laser scanning reflection microscopy: determination of water permeability changes of renal principal cells.</a> Biophys. J. 80, 1783-1790 (2001).</li>
<li>Gonzalez, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+stimulates+renin+in+inner+medullary+collecting+duct+cells+via+protein+kinase+C+and+independent+of+epithelial+sodium+channel+and+mineralocorticoid+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II stimulates renin in inner medullary collecting duct cells via protein kinase C and independent of epithelial sodium channel and mineralocorticoid receptor activity.</a> Hypertension. 57, 594-599 (2011).</li>
<li>Chou, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aquaporin-2+trafficking+by+vasopressin+in+the+renal+collecting+duct.+Roles+of+ryanodine-sensitive+Ca2%2B+stores+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of aquaporin-2 trafficking by vasopressin in the renal collecting duct. Roles of ryanodine-sensitive Ca2+ stores and calmodulin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 36839-36846 (2000).</li>
<li>Uawithya, P., Pisitkun, T., Ruttenberg, B. E., Knepper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+native+inner+medullary+collecting+duct+cells+from+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of native inner medullary collecting duct cells from rat kidney.</a> Physiological Genomics. 32, 229-253 (2008).</li>
<li>Tchapyjnikov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+nuclei+from+native+renal+inner+medullary+collecting+duct+cells+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of nuclei from native renal inner medullary collecting duct cells using LC-MS/MS.</a> Physiological Genomics. 40, 167-183 (2010).</li>
<li>Stefan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+cAMP-dependent+signaling+by+phosphodiesterase-4D+is+involved+in+the+regulation+of+vasopressin-mediated+water+reabsorption+in+renal+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of cAMP-dependent signaling by phosphodiesterase-4D is involved in the regulation of vasopressin-mediated water reabsorption in renal principal cells.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 18, 199-212 (2007).</li>
<li>Klussmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitory+role+of+Rho+in+the+vasopressin-mediated+translocation+of+aquaporin-2+into+cell+membranes+of+renal+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An inhibitory role of Rho in the vasopressin-mediated translocation of aquaporin-2 into cell membranes of renal principal cells.</a> J. Biol. Chem. 276, 20451-20457 (2001).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania i hodowli pierwotnych komórek IMCD szczurów. Podejście daje do 21cm2 komórek od jednego szczura20. Eksperyment wymaga standardowego sprzętu do hodowli komórkowej i może być przeprowadzony przez jedną osobę w ciągu około 6 godzin. Dlatego podejście to jest odpowiednie jako standardowa metoda laboratoryjna.
Pierwotne komórki IMCD szczura można wysiewać w szalkach hodowlanych o różnej wielkości, od płytek 96-dołkowych do szale...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/50366">Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells</a>. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to: Enno Klussmann instead of: Enno Klussman

A correction to author list has been made for article Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells.

Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

W głównych komórkach przewodu zbiorczego nerki, arginina-wazopresyna (AVP) kontroluje reabsorpcję wody poprzez stymulację wprowadzania kanału wodnego akwaporyna-2 (AQP2) do błony plazmatycznej. AVP wiąże się z receptorem wazopresyny typu 2 sprzężonym z białkiem G (V2R), stymulując cyklazę adenylową, a tym samym tworzenie cAMP. Zainicjowanie tej kaskady sygnalizacyjnej prowadzi do aktywacji kinazy białkowej A (PKA). PKA fosforyluje AQP2 w serynie 256 (S256), co jest kluczowym czynnikiem wyzwalającym jego redystrybucję z pęcherzyków wewnątrzkomórkowych do błony komórkowej. Wprowadzenie membrany ułatwia reabsorpcję wody wzdłuż gradientu osmotycznego i precyzyjnie dostraja homeostazę wody w organizmie.
Dysregulacja reabsorpcji wody za pośrednictwem AVP, spowodowana aberracjami wydzielania AVP lub sygnalizacją aktywowaną przez AVP, powoduje lub jest związana z poważnymi chorobami. Zmniejszona absorpcja zwrotna wody spowodowana mutacjami V2R lub AQP2 prowadzi do moczówki prostej nerkopochodnej, podczas gdy podwyższony poziom AVP w osoczu krwi wiąże się z nadmiernym wchłanianiem zwrotnym wody w chorobach sercowo-naczyniowych, takich jak przewlekła niewydolność serca i zespół nieprawidłowego wydzielania hormonu antydiuretycznego (SIADH).
Znaczenie reabsorpcji wody za pośrednictwem AVP wynika nie tylko z jej wpływu na chorobę. Indukowana przez AVP translokacja pęcherzyków zawierających AQP2 do błony plazmatycznej i fuzja z nią stanowi ściśle zależny od cAMP proces egzocytarny, który obecnie nie jest dobrze poznany. Innymi przykładami egzocytozy zależnej od cAMP są wydzielanie reniny w nerkach i wydzielanie H+ w żołądku. W związku z tym wyjaśnienie mechanizmów molekularnych rządzących translokacją AQP2 w głównych komórkach nerek nie tylko pomaga zrozumieć podobne procesy molekularne w innych typach komórek, ale może również utorować drogę do nowych terapii w leczeniu chorób związanych z zaburzeniami reabsorpcji wody za pośrednictwem AVP.
Wyjaśnienie mechanizmów kontrolujących AQP2 wymaga zebrania modeli głównych komórek kanału. W tym celu dostępnych jest wiele różnych linii komórkowych nerek ssaków. Modele te mają jednak kilka wad. W wielu układach komórkowych poziom białka AQP2 jest niski (Tabela 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1)1-10, inne ektopowo nadekspresja ludzka (MCD4, WT10)11,12 lub szczurza (CD8)13 AQP2. W komórkach MCD4 i COS-7 receptor V2 nie ulega ekspresji. O ile nam wiadomo, nie ma stałej linii komórkowej jako dostępnego modelu, która wywodzi się z wewnętrznego przewodu zbiorczego rdzenia nerkowego, tej części nerki, w której ekspresja AQP2 jest najobfitsza, ale z korowego przewodu zbiorczego1,11,13-16. Takimi modelami komórkowymi są na przykład szeroko stosowane uwiecznione linie komórkowe mpkCCD (np. 17) lub niedawno powstałe linie komórkowe mTERT-CCD14. Obie linie komórkowe endogennie wyrażają AQP2 i V2R, ale ponieważ pochodzą z korowego przewodu zbiorczego, najprawdopodobniej zawierają inny proteom w porównaniu z komórkami wewnętrznego rdzeniowego przewodu zbiorczego (IMCD). Muszą one na przykład wyrażać różne systemy transportowe Na+.
Tutaj prezentujemy protokół hodowli pierwotnych komórek IMCD wykazujących endogenną ekspresję V2R i AQP2. Model ten zatem najwierniej odwzorowuje sytuację fizjologiczną w nerkowym przewodzie zbiorczym. Ponieważ założenie hodowli wymaga tylko standardowego sprzętu laboratoryjnego, inne laboratoria mogą z łatwością przyjąć to podejście.

<table><tbody><tr><td>Kolagen typu IV Mysz</td><td>BD Biosciences</td><td>356233</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>SIGMA</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu CLS-II</td><td>Biochrom AG</td><td>C2-22</td><td></td></tr><tr><td>DMEM + GlutMAX</td><td>Invitrogen GIBCO</td><td>21885108</td><td></td></tr><tr><td>Nystatyna</td><td>SIGMA</td><td>N4014</td><td></td></tr><tr><td>Ultroser G</td><td>Cytogen</td><td>15950-017</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne (NEA)</td><td>Biochrom AG</td><td>K0293</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Invitrogen GIBCO</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>DBcAMP</td><td>BIOLOG</td><td>D009</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla pierwotnych komórek przewodu rdzeniowego wewnętrznego rdzenia szczura

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Arginina-wazopresyna (AVP) ułatwia reabsorpcję wody przez główne komórki przewodu nerkowego, a tym samym precyzyjnie dostraja homeostazę wody w organizmie. AVP wiąże się z receptorami wazopresyny V2 (V2R) na powierzchni komórek i w ten sposób indukuje syntezę cAMP. Stymuluje to procesy sygnalizacji komórkowej prowadzące do zmian w fosforylacji kanału wodnego akwaporyny-2 (AQP2). Kinaza białkowa A fosforyluje AQP2, a tym samym wyzwala translokację AQP2 z pęcherzyków wewnątrzkomórkowych do błony plazmatycznej, ułatwiając reabsorpcję wody z moczu pierwotnego. Aberracje w uwalnianiu AVP z przysadki lub sygnalizacji aktywowanej przez AVP w głównych komórkach mogą powodować odpowiednio moczówkę prostą centralną lub nerkopochodną; podwyższony poziom AVP w osoczu krwi jest związany z chorobami sercowo-naczyniowymi, takimi jak przewlekła niewydolność serca i zespół nieprawidłowego wydzielania hormonu antydiuretycznego.
Tutaj prezentujemy protokół hodowli komórek IMCD (ang. primary mespinary collector duct) szczura, które endogenicznie wyrażają V2R i AQP2. Komórki te nadają się do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw kontroli AQP2, a tym samym do odkrycia nowych celów leków w leczeniu chorób związanych z rozregulowaniem reabsorpcji wody za pośrednictwem AVP. Komórki IMCD są pozyskiwane z wewnętrznych rdzeni nerkowych szczurów i są używane do eksperymentów sześć do ośmiu dni po wysiewie. Komórki IMCD mogą być hodowane w zwykłych szalkach do hodowli komórkowych, kolbach i płytkach do mikromiareczkowania o różnych formatach, procedura trwa tylko kilka godzin i jest odpowiednia dla standardowych laboratoriów hodowli komórkowych.

Pomywna hodowla pierwotnych komórek IMCD szczura skutkuje powstaniem konfluentnej warstwy jednowarstwowej 6-8 dni po wysianiu (Rycina 2). W szalce hodowlanej o średnicy 60 mm znajduje się około 6 x 106 komórek. Komórki ściśle przylegają do szalek hodowlanych, ponieważ zostały one pokryte kolagenem typu IV, składnikiem błony podstawnej18. W związku z tym komórki IMCD nie odrywają się nawet podczas kilku dokładnych procedur płukania. Do 80% hodowanych komórek wykazuje endogenną ekspre...

Arginina-wazopresyna (AVP) kontroluje precyzyjne dostrojenie homeostazy wody w organizmie poprzez ułatwienie reabsorpcji wody przez główne komórki nerkowe. W tym miejscu przedstawiamy protokół hodowli pierwotnych komórek przewodu zbiorczego rdzenia wewnętrznego rdzenia szczura, odpowiednich do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw reabsorpcji wody za pośrednictwem AVP.

Hodowla pierwotnych komórek przewodu rdzeniowego wewnętrznego rdzenia szczura

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie pierwotnych komórek rdzenia wewnętrznego cewek zbiorczych szczura, czyli komórek IMCD, odpowiednich do badania reabsorpcji wody pośredniczonej przez VP. Jest to realizowane poprzez najpierw usunięcie nerek szczura. Drugim krokiem jest wyizolowanie rdzenia wewnętrznego z otaczającego go rdzenia zewnętrznego i kory.Następnie wewnętrzne meli są trawione enzymatycznie w celu uwolnienia pojedynczych komórek. Ostatnim etapem jest zawieszenie i wyselekcjonowanie komórek głównych, a następnie ich wysianie do naczyń hodowlanych. Ostatecznie, od sześciu do ośmiu dni po wysianiu komórki są gotowe do wykorzystania w eksperymentach.System hodowli komórkowej jest odpowiedni do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zależnego od VP reabsorpcji wody, a być może także innych zależnych od CAP procesów TIC. Ponadto system ten może być wykorzystany do odkrywania nowych kandydatów na leki oraz celów terapeutycznych w leczeniu chorób związanych z zaburzeniami zależnej od VP reabsorpcji wody. Procedura zostanie zaprezentowana przez doktoranta z naszego laboratorium oraz przez Beatę Eman i Andreę Giller, dwie techniczki z naszego laboratorium.Zgodnie z przedstawionym harmonogramem, pokryj szalki hodowlane kolagenem typu IV dzień przed planowanym zabiegiem. Następnie przygotuj pożywkę oraz roztwory enzymów. W pierwszej kolejności dodaj suplementy do świeżo przygotowanej pożywki DMEM.Aby przygotować roztwór enzymów, należy dodać do filtrowanego DPBS hialuronidazę w stężeniu 1 mg/mL oraz kolagenazę w stężeniu 2,2 mg/mL. Roztwór należy wysterylizować i przechowywać w probówce Falcon o pojemności 50 mL.Przygotuj jeden mililitr roztworu enzymu na każde dwie trawione wewnętrzne warstwy rdzenia nerki. Najtrudniejszym etapem tego protokołu jest wypreparowanie wewnętrznych warstw rdzenia. Aby zapewnić sukces, przed sekcją należy odprowadzić krew z organizmów zwierząt. Ułatwia to wykrycie błyszczącej granicy między rdzeniem wewnętrznym a zewnętrznym po eutanazji.Usunąć nerki i przechowywać je w sterylnym DPBS przygotowanym wcześniej. Pracując w warunkach sterylnych, przenieść nerki z roztworu DPBS uzupełnionego o Gentamycynę i Nystatynę na sterylną gazę, aby usunąć nadmiar płynu.Następnie, za pomocą sterylnego skalpela, usuń tłuszczową torebkę nerkową, gdy narząd jest wciąż przymocowany do kompresu. Wykonaj nacięcie w pobliżu osi podłużnej strony zewnętrznej lub korowej. Należy upewnić się, że nacięcie nie przechodzi całkowicie przez tkankę, lecz pozostawia ją w jednym kawałku, wciąż połączoną w obrębie miedniczki nerkowej.Następnie należy zidentyfikować mieniący się różowy rdzeń zewnętrzny oraz białawy rdzeń wewnętrzny. Za pomocą zakrzywionych nożyczek ostrożnie oddzielić rdzeń wewnętrzny od otaczającego go rdzenia zewnętrznego. Tkankę umieścić w wcześniej przygotowanym roztworze DPBS.Po wyizolowaniu i zebraniu wszystkich Meli na lodzie, należy zmniejszyć objętość roztworu DPBS z dodatkiem Gentamycyny i Nystatyny do poziomu, w którym tkanki będą zaledwie przykryte buforem. Za pomocą sterylnej żyletki należy pociąć Meli na sześciany o boku około 5 mm. Następnie należy stopić i zaokrąglić ostry koniec sterylnej pipety Pasteura, trzymając ją przez krótką chwilę w płomieniu.Po ochłodzeniu za pomocą pipety przenieś zawiesinę tkankową do probówki Falcon o pojemności 50 ml zawierającej świeży, sterylny roztwór enzymów przygotowany wcześniej. Umieść probówkę w kąpieli wodnej i inkubuj w temperaturze 37 °C przy ciągłym mieszaniu przez od półtorej do dwóch godzin.Po tym czasie pipetuj mieszaninę kilkakrotnie w górę i w dół za pomocą pipety, aż zawiesina stanie się jednorodnie mętna. Po dokładnym wymieszaniu odwiruj zawiesinę przez pięć minut. Następnie odlej nadsącz.Resuspender osad i ponownie odwirować. Powtórzyć ten etap płukania jeszcze raz. Ponownie resuspender komórki w pełnej pożywce i wysiać je do naczyń hodowlanych lub płytek mikrotitracyjnych bezpośrednio po wysianiu; odizolowane komórki IMCD, a także erytrocyty i szczątki komórkowe, można ocenić pod mikroskopem.Pozwoli to na wstępne oszacowanie liczby wyizolowanych komórek po 24 godzinach. Przemyj komórki DMEM o wartości 600 mOsm i dodaj świeżą pożywkę. W ciągu następnego tygodnia komórki należy przemywać dwa do trzech razy.Komórki IMCD powinny być gotowe do eksperymentów od sześciu do ośmiu dni po wysianiu, gdy osiągną konfluencję, co widać tutaj. Należy pamiętać o inkubacji komórek w medium bez DBC MP i INE przez 24 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu. W przeciwnym razie akwaporyna 2 będzie zlokalizowana głównie w błonie plazmatycznej.Pomyślna hodowla pierwotnych komórek IMCD szczura prowadzi do powstania konfluencyjnej warstwy jednowarstwowej od sześciu do ośmiu dni po wysianiu; po stymulacji argininą, wazopresyną lub forskoliną, AQP2 przemieszcza się z pęcherzyków wewnątrzkomórkowych do błony plazmatycznej, co pokazano tutaj. Ponadto ekspresja AQP2 w komórkach IMCD wzrasta po 30-minutowej ekspozycji na VP lub forskolinę, co wykazano w tym western blocie. Następnie przeprowadza się izolację DNA/RNA, RT-PCR oraz eksperymenty z immunoprecypitacją.W celu analizy genów oraz produktów genowych komórek cewek zbiorczych nerek można przeprowadzić analizę Western blot oraz mikroskopię immunofluorescencyjną. Ten system hodowli komórkowych, w którym ekspresjonowane są białka endogenne, jest szczególnie atrakcyjny do zastosowania w niespecyficznych podejściach przesiewowych.

culturing-primary-rat-inner-medullary-collecting-duct-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kultywowanie komórek pierwotnych szczurów kanałów zrazików rdzeniowych rdzenia nerkowego

Niniejszy protokół opisuje sposób izolacji i hodowli pierwotnych neuronów współczulnych z zwojów szyjnych górnych (SCG) nowo narodzonych szczurów.

Protokół hodowli neuronów współczulnych z zwojów szyjnych górnych (SCG) szczura

Opisujemy szybką metodologię izolacji i hodowli neuronów hipokampa i kory mózgowej z embrionów gryzoni. Protokół ten umożliwia przeprowadzanie eksperymentów wymagających niemal czystych kultur neuronalnych.

Izolacja i hodowla embrionalnych komórek neuronalnych szczura: szybki protokół

W tym filmie pokazujemy kroki izolacji i oczyszczania komórek nabłonka kanalików nerkowych dla szerokiego zakresu badań biologii molekularnej i hodowli komórkowych.

Izolacja mysich komórek nerkowych: technika izolowania i generowania pierwotnej kultury komórek nabłonka kanalików nerkowych

Ten film demonstruje technikę izolowania i hodowli komórek zwojów korzenia grzbietowego (DRG) z kręgosłupa szczura. DRG wycięte z kręgosłupa są traktowane enzymami i mechanicznie dysocjowane w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej. Komórki są hodowane w pożywce zawierającej inhibitory i czynniki wzrostu, które odpowiednio ograniczają proliferację komórek glejowych i promują wzrost neuronów.

Ustanowienie pierwotnej hodowli komórek zwojów korzenia grzbietowego z kręgosłupa szczura

Ten protokół opisuje izolację, hodowlę i zwapnienie komórek śródmiąższowych zastawki pochodzących od szczurów, wysoce fizjologiczny model in vitro zwapnienia zastawki aortalnej (CAVD). Wykorzystanie tego szczurzego modelu ułatwia badania nad CAVD w badaniu mechanizmów komórkowych i molekularnych, które leżą u podstaw tego złożonego procesu patologicznego.

Izolacja i charakterystyka pierwotnych komórek śródmiąższowych zastawki szczura: nowy model do badania zwapnienia zastawki aortalnej

Ten protokół zapewnia efektywne kosztowo podejście do izolowania i charakteryzowania pierwotnych komórek kanalików nerkowych myszy, które następnie mogą być subhodowane w celu oceny funkcji biologicznych nerek ex vivo, w tym bioenergetyki mitochondrialnej.

Izolacja, charakterystyka i wysokoprzepustowa analiza strumienia zewnątrzkomórkowego pierwotnych komórek nabłonka kanalików nerkowych myszy

Hormon wydzielany przez korę nadnerczy jest niezbędny dla zwierząt w walce ze stresem i chorobami. Tutaj przedstawiamy protokół hodowli pierwotnych komórek nadnerczy szczura. Może to być dobra platforma in vitro do badania mechanizmów działania odczynnika będącego przedmiotem zainteresowania w steroidogenezie nadnerczy i biosyntezie lipidów.

Pierwotna hodowla komórek kory nadnerczy szczura i oznaczanie funkcji steroidogennych

Ten protokół próbuje ustalić powtarzalny protokół dla pierwotnych neuronów i izolacji gleju z pęcherza szczura dla dalszych eksperymentów komórkowych.

Izolacja i hodowla pierwotnych neuronów i gleju z pęcherza moczowego dorosłego szczura

Ten artykuł opisuje izolację i hodowlę embrionalnych neuronów współczulnych szczurów z górnych zwojów szyjnych. Zawiera również szczegółowe protokoły barwienia immunocytochemicznego i przygotowywania ekstraktów neuronalnych do analizy spektrometrii mas.

Hodowla neuronów współczulnych szczurów z embrionalnych górnych zwojów szyjnych do analizy morfologicznej i proteomicznej

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół izolacji pierwotnych komórek Müllera siatkówki od noworodków szczurów Sprague-Dawley (SD). Procedura obejmuje wyłuszczenie gałek ocznych, wypreparowanie tkanki siatkówki, ekstrakcję i identyfikację komórek oraz kluczowe kwestie dotyczące późniejszej hodowli komórek.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek Müllera siatkówki od szczurów Sprague-Dawley (SD)

Poznaj metodę hodowli pierwotnych komórek IMCD szczura do badań nad mechanizmami reabsorpcji wody zależnymi od argininy-wazopresyny. Protokół obejmuje izolację rdzenia wewnętrznego, trawienie enzymatyczne i selekcję komórek głównych.

Hodowla pierwotnych komórek przewodu rdzeniowego wewnętrznego rdzenia szczura

Przeglądaj więcej filmów