Name: Analiza celowanych nanocząstek białek wirusowych dostarczanych do guzów HER2+ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Poznaj analizę dostarczania nanocząstek HerDox do guzów HER2+ przy użyciu wielomodalnego obrazowania optycznego. Metoda ta umożliwia badaczom ocenę penetracji cząstek w komórkach nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantów dla LKM-K z National Institutes of Health/National Cancer Institute (R01CA129822 i R01CA140995). Dr Medina-Kauwe dziękuje C. Rey, M. M-Kauwe i D. Revetto za nieustające wsparcie.

1. Dostarczanie ogólnoustrojowe In vivo
<ol>
	<li>Wymieszaj wystarczającą ilość HerDox ze sterylną solą fizjologiczną, aby zrównać 0,2 ml dawki 0,004 mg/kg HerDox na wstrzyknięcie dla 6-8 tygodniowej myszy NU/NU z podskórnymi obustronnymi guzami ksenoprzeszczepu bocznego.</li>
	<li>Delikatnie narysuj mieszaninę HerDox do strzykawki insulinowej o pojemności 3/10 cm3 wyposażonej w igłę 29G, unikając pęcherzyków.</li>
	<li>Znieczulenie jest wywoływane przez krótką ekspozycję na izofluran w komorze indukcyjnej wyposażonej w system usuwania gazów (natężenie przepływu tlenu: 0,5-1 l/min, stężenie izofluranu: 3-4% (lub mniej).</li>
	<li>Wstrzyknąć całą mieszaninę do żyły ogonowej znieczulonej myszy (0,2 ml na wstrzyknięcie). Wstrzyknięcie dożylne można również wykonać u skrępowanej, nieznieczulonej myszy.</li>
	<li>Powtarzaj wstrzyknięcia tej samej myszy przez kolejne sześć dni, raz dziennie.</li>
</ol>
2. Obrazowanie fluorescencyjne in vivo
Nagromadzenie fluorescencji HerDox w guzach może być wykryte w ostatnim dniu iniekcji (Dzień 7) za pomocą wielomodowego imagera. Poniższe procedury zakładają zastosowanie dostosowanego do potrzeb użytkownika systemu makrooświetlenia i detekcji (rys. 1) 8.
<ol>
	<li>Włącz wielomodowy obrazownik optyczny in vivo.</li>
	<li>Wybrać filtr pasmowoprzepustowy emisji (590 nm ± 30 nm) odpowiedni do wykrywania fluorescencji doksorubicyny.</li>
	<li>Włącz laser Argon-Krypton i umieść filtr pasmowo-przepustowy wzbudzenia (488 nm ± 10 nm) na torze optycznym lasera.</li>
	<li>Włącz system znieczulający, a następnie umieść mysz w komorze anestezjologicznej (Natężenie przepływu tlenu: 0,5-1 L/min, stężenie izofluranu: 3-4% (lub niższe)wyposażone w system oczyszczania gazów.</li>
	<li>Przenieś mysz z komory anestezjologicznej do komory obrazowania wielomodowego obrazu optycznego in vivo, gdy mysz jest znieczulona.</li>
	<li>Umieść nos nad nosem myszy i otwórz przepływ, aby podać ciągłe znieczulenie podczas akwizycji obrazu (natężenie przepływu tlenu: 0,5-1 l/min, stężenie izofluranu: 2-3% (lub mniej).</li>
	<li>Uzyskuj obrazy fluorescencyjne przy czasie naświetlania 5-15 sek.</li>
	<li>Wykonuj analizę i przetwarzanie obrazu, w tym korekcję tła lub regulację kontrastu.</li>
</ol>
3. Obrazowanie fluorescencyjne ex vivo
Fluorescencję HerDox można zaobrazować w guzach i konkretnych narządach (w tym wątrobie, nerkach, śledzionie, sercu i mięśniach szkieletowych) pobranych od myszy poddanych eutanazji w ciągu 24 godzin po ostatnim (Dzień 7) wstrzyknięciu HerDox.
<ol>
	<li>Włącz wielomodowy obrazownik optyczny in vivo.</li>
	<li>Wybierz filtr pasmowoprzepustowy emisji (580 nm ± 20 nm) do wykrywania fluorescencji doksorubicyny.</li>
	<li>Włącz laser Argon-Krypton i umieść filtr pasmowo-przepustowy wzbudzenia (488 nm ±10 nm) na torze optycznym lasera.</li>
	<li>Umieść guzy i określone narządy ułożone na szalce Petriego w komorze obrazowania wielomodowego obrazowania optycznego in vivo.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy fluorescencyjne tkanek przy użyciu czasu naświetlania 5-15 sek. Przykład wstępnej akwizycji obrazu fluorescencyjnego pokazano na rysunku 2a. Powtórz to samo używając pustej szalki Petriego, która posłuży jako tło (Rysunek 2b).</li>
	<li>Wykonuj analizę i przetwarzanie obrazu, w tym korekcję tła lub regulację kontrastu. Przykład skorygowanego obrazu przedstawiono na rysunku 2c, wynikającym z odjęcia rysunku 2b od rysunku 2a.</li>
</ol>
4. Obrazowanie konfokalne in situ guzów
Obrazowanie konfokalne in situ umożliwia wykrywanie i analizę akumulacji guza HerDox na poziomie komórkowym.
<ol>
	<li>Włącz mikroskop konfokalny Leica SPE.</li>
	<li>Wybierz światło laserowe 488 nm do wzbudzenia doksorubicyny i długości fal emisji (560-620 nm) do wykrywania fluorescencji doksorubicyny.</li>
	<li>Wybierz obiektyw 40X lub 63X i upuść olejek immersyjny na soczewkę obiektywu.</li>
	<li>Ekstrakcja świeżych guzów od myszy poddanych eutanazji, które wcześniej otrzymały HerDox i pozorowane leczenie, jak opisano w procedurze 2.</li>
	<li>Umieść guzy na szalce Petriego na lodzie, aby uniknąć degradacji tkanek, a następnie przenieś guzy do komory Delta T w celu obrazowania konfokalnego.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy konfokalne guzów na sekwencyjnych głębokościach ogniskowych (wielkość kroku: 1 μm, grubość: 20 μm). Przykład sekwencyjnie uzyskanych obrazów wzdłuż osi z pokazano na rysunku 3, lewy panel.</li>
	<li>Wykonaj projekcję z obrazów o maksymalnej intensywności. Projekcja maksymalnej intensywności obrazów z ułożonymi w stos jest pokazana na rysunku 3 w prawym panelu.</li>
	<li>Obliczać średnie intensywności fluorescencji obrazów z projekcją Z o maksymalnej intensywności. Średnie intensywności fluorescencji obrazów w całym polu widzenia obliczono za pomocą ImageJ.</li>
</ol>
5. Ratiometryczne obrazowanie i analiza spektralna
Ratiometryczne obrazowanie i analiza spektralna pozwala na rozróżnienie między fluorescencją Dox a autofluorescencją.
<ol>
	<li>Włącz laserowy skaningowy fluorescencyjny mikroskop konfokalny.</li>
	<li>Uzyskaj 15 obrazów guzów leczonych i nieleczonych HerDox na określonej głębokości w zakresie widmowym 510-650 nm, z krokiem 10 nm i wzbudzeniem przy świetle 488 nm za pomocą mikroskopu konfokalnego Leica SPE.</li>
	<li>Przygotować 100 μM roztwór doksorubicyny.</li>
	<li>Wykonać obrazowanie spektralne roztworu doksorubicyny 100 μM, aby uzyskać czystą sygnaturę spektralną fluorescencji Dox (zakres widmowy: 510-650 nm, wielkość kroku: 10 nm). Typowe wyniki akwizycji obrazu z obrazowania spektralnego i wynikowe widmo fluorescencji przedstawione w postaci wykresu przedstawiono na rysunku 4.</li>
	<li>Uzyskaj sygnaturę spektralną autofluorescencji z kostki obrazu (zakres widmowy: 510-650 nm, rozmiar kroku: 10 nm) uzyskanej przez obrazowanie spektralne nieleczonych guzów. Typowe wyniki akwizycji obrazu z obrazowania spektralnego i wynikowe widmo fluorescencji przedstawione w postaci wykresu przedstawiono na rysunku 5.</li>
	<li>Wygeneruj cztery referencyjne sygnatury spektralne (czysta autofluorescencja, 0.1.doksorubina+0.9.autofluorescencja, 0.2. doksorubicyna+0.8.autofluorescencja, 0.3.doksorubina+0.7.autofluorescencja) za pomocą opracowanego przez nas programu 9. Typowa krzywa przedstawiająca cztery referencyjne sygnatury spektralne pokazano na rysunku 6.</li>
	<li>Wykonaj klasyfikację spektralną obrazów zgodnie z definicją referencyjnych sygnatur spektralnych za pomocą euklidesowego pomiaru odległości za pomocą wcześniej opracowanego przez nas programu 9.</li>
	<li>Wykonaj liniowe rozmieszanie spektralne tych obrazów za pomocą opracowanego przez nas programu do rozmieszania spektralnego (wtyczka w ImageJ), 7, 10 do porównania z ratiometrycznym obrazowaniem i analizą spektralną. Przykład oddzielenia fluorescencji HerDox od autofluorescencji za pomocą liniowego rozmieszania spektralnego pokazano na rysunku 7.</li>
</ol>

<ol><li>Agadjanian, H., Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+Targeting+by+DNA+Capture+in+Viral+Protein+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy Targeting by DNA Capture in Viral Protein Particles.</a> Nanomedicine. 7 (3), 335-352 (2012).</li>
<li>Agadjanian, H., Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+detection+and+elimination+by+a+targeted+gallium+corrole%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (15), 6105-6110 (2009).</li>
<li>Agadjanian, H., Weaver, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+delivery+of+corroles+to+cells+via+noncovalent+conjugates+with+viral+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Specific delivery of corroles to cells via noncovalent conjugates with viral proteins.</a> Pharm. Res. 23 (2), 367-377 (2006).</li>
<li>Medina-Kauwe, L. K., Maguire, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+gene+delivery+to+human+breast+cancer+cells+by+targeted+Ad5+penton+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Non-viral gene delivery to human breast cancer cells by targeted Ad5 penton proteins.</a> Gene Therapy. , 81753-81761 (2001).</li>
<li>Medina-Kauwe, L. K., Kasahara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3PO%2C+a+novel+non-viral+gene+delivery+system+using+engineered+Ad5+penton+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">3PO, a novel non-viral gene delivery system using engineered Ad5 penton proteins.</a> Gene Therapy. , 8795-8803 (2001).</li>
<li>Rentsendorj, A., Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Typical+and+atypical+trafficking+pathways+of+Ad5+penton+base+recombinant+protein%3A+implications+for+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Typical and atypical trafficking pathways of Ad5 penton base recombinant protein: implications for gene transfer.</a> Gene Ther. 13 (10), 821-836 (2006).</li>
<li>Hwang, J. Y., Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodality+Imaging+In+vivo+for+Preclinical+Assessment+of+Tumor-Targeted+Doxorubicin+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Multimodality Imaging In vivo for Preclinical Assessment of Tumor-Targeted Doxorubicin Nanoparticles.</a> PLoS ONE. 7 (4), e34463(2012).</li>
<li>Hwang, J. Y., Wachsmann-Hogiu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multimode+Optical+Imaging+System+for+Preclinical+Applications+In+Vivo%3A+Technology+Development%2C+Multiscale+Imaging%2C+and+Chemotherapy+Assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">A Multimode Optical Imaging System for Preclinical Applications In Vivo: Technology Development, Multiscale Imaging, and Chemotherapy Assessment.</a> Mol. Imaging Biol. , (2011).</li>
<li>Hwang, J. Y., Gross, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+spectral+imaging+for+fast+tumor+detection+and+chemotherapy+monitoring+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo.</a> J. Biomed. Opt. 16 (6), 066007(2011).</li>
<li>Fujimoto, J. G., Farkas, D. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFujimoto%2C+JG+%22Biomedical+Optical+Imaging%22">Biomedical Optical Imaging</a>. , Oxford University Press. New York. (2009).</li>
<li>Hwang, J. Y., Moffatt-Blue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimode+optical+imaging+of+small+animals%3A+development+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+of+SPIE%22%5BJournal%5D)">Multimode optical imaging of small animals: development and applications.</a> Proc. of SPIE. 6411, (2007).</li>
<li>Ducros, M., Moreaux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+unmixing%3A+analysis+of+performance+in+the+olfactory+bulb+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spectral unmixing: analysis of performance in the olfactory bulb in vivo.</a> PLoS One. 4 (2), e4418(2009).</li>
<li>Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+and+linear+unmixing+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biochem.+Eng.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging and linear unmixing in light microscopy.</a> Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. , 95245-95265 (2005).</li>
</ol>

Autor, Daniel Farkas, jest prezesem Spectral Molecular Imaging. Pozostali autorzy nie mają sprzecznych interesów.

Fluorescencja Dox może być wykrywalna in vivo za pomocą obrazowania wielomodowego, gdy guzy są podskórne. Jednak skuteczna terapeutycznie dawka leku HerDox (0,004 mg/kg) jest niższa od progu wykrywalności po podaniu pojedynczej dawki. Natomiast po 7 codziennych iniekcjach (1x/dzień przez 7 dni) akumulacja guza i zatrzymanie cząstki jest wystarczające, aby umożliwić wizualizację fluorescencji Dox.
Podczas pracy z Dox lub innym fluoroforem do obrazowania in vivo bardzo ważne j...

Chemioterapia ukierunkowana na nowotwory ma potencjał do eliminacji komórek rakowych przy niższych dawkach w porównaniu do leków niecelowanych, ponieważ więcej dostarczonej terapii może zgromadzić się w zamierzonym miejscu docelowym, zamiast rozprowadzać się do tkanki nienowotworowej. Ponieważ ta ostatnia sytuacja osłabiłaby skuteczność leku, a tym samym wymagałaby większych dawek, aby była skuteczna, celowanie w nowotwór ma zarówno korzyści terapeutyczne, jak i bezpieczeństwa w porównaniu ze standardowym leczeniem niecelowanym.
Ukierunkowanie chemioterapii poprzez enkapsulację w samoorganizujących się nanocząstkach pozwala lekowi pozostać chemicznie niezmodyfikowanym, w przeciwieństwie do leków, które są kowalencyjnie powiązane z cząsteczkami docelowymi. W związku z tym powiązanie może potencjalnie zmienić aktywność zarówno leku, jak i cząsteczki docelowej; Montaż niekowalencyjny pozwala na zachowanie siły działania leku.
Wcześniej pokazaliśmy, że nowy trzyskładnikowy, samoorganizujący się kompleks, HerDox, atakuje guzy HER2+ in vivo i wywołuje ablację wzrostu guza, oszczędzając normalną tkankę, w tym serce 1. HerDox powstaje w wyniku niekowalencyjnych oddziaływań między białkiem penetrującym komórki, wiążącym receptor, HerPBK10, a środkiem chemioterapeutycznym, doksorubicyną (Dox), za pośrednictwem małego łącznika kwasu nukleinowego. HerPBK10 wiąże receptor ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (HER) i wyzwala endocytozę za pośrednictwem receptora 2-4, podczas gdy penetracja błony endosomalnej odbywa się poprzez włączenie białka kapsydu 4-6 pochodzącego z adenowirusa pentonowego. Dodatnio naładowana domena na białku umożliwia wiązanie kwasów nukleinowych 4, 5, przez które Interkalowany DNA Dox może być transportowany w celu docelowego dostarczenia. Oddziaływania elektrofilowe, interkalacyjne i ewentualnie oligomeryzacja białek ułatwiają samoorganizację w okrągłe cząstki o długości fali 10-20 nm, które są stabilne we krwi i przechowywane przez dłuższy czas w różnych temperaturach 1. Preferencyjne celowanie w komórki nowotworowe HER2 + jest ułatwione dzięki zwiększonemu powinowactwu ligandów, gdy HER2 jest podwyższony.
Nasze poprzednie badania wykazały, że systemowe dostarczanie HerDox daje preferencyjne akumulację w guzach w porównaniu z tkankami nienowotworowymi i w porównaniu do nieukierunkowanej Dox 1 i penetracji komórek nowotworowych in vivo 7. Zaobserwowaliśmy, że HerDox uwalnia Dox po wniknięciu do komórki nowotworowej, umożliwiając akumulację Dox do jądra 1. Akumulacja guza wydaje się korelować z poziomem receptora, ponieważ stosunkowo niskie guzy wykazujące ekspresję HER2 gromadzą mniej HerDox w porównaniu z tymi ze stosunkowo wyższymi poziomami HER2 1. Co więcej, efektywne stężenie śmierci komórki wykazuje odwrotną korelację z wyświetlaniem HER2 na liniach komórek nowotworowych wyrażających różne poziomy HER2 na powierzchni komórki 1. HerDox wykazuje przewagę terapeutyczną i bezpieczeństwa nad nieukierunkowanym Dox, ponieważ zabijanie guza następuje przy ponad 10 razy niższej dawce w porównaniu z lekiem niecelowanym i nie ma wykrywalnego negatywnego wpływu na tkankę serca (wykrywaną przez echokardiografię i barwienie histologiczne) lub wątrobę (wykrywaną przez barwienie TUNEL), w przeciwieństwie do nieukierunkowanego Dox 1. Pomimo pochodzenia z białka kapsydu wirusa, HerPBK10 nie wykazuje wykrywalnej immunogenności na poziomie terapeutycznym 2. Podczas gdy istniejące wcześniej przeciwciała przeciwko całemu adenowirusowi mogą rozpoznać HerPBK10, nie są w stanie zapobiec wiązaniu komórek 2.
Objętość guza mierzona w czasie jest standardową metodą oceny skuteczności terapeutycznej celowanych terapii i została wykorzystana do oceny skuteczności terapeutycznej HerDox. Uzupełnienie tego podejścia o obrazowanie intensywności fluorescencji in vivo i ex vivo pozwoliło nam lepiej ocenić skuteczność celowania 7. Specjalnie zintegrowaliśmy obrazowanie konfokalne in situ wyciętych guzów z analizą spektralną fluorescencji Dox, aby sprawdzić, czy HerDox nie tylko gromadził się w guzach in vivo, ale przenikał do komórek nowotworowych i dostarczał Dox do cytoplazmy i jądra 7. Analiza spektralna pozwoliła nam ponadto odróżnić fluorescencję Dox od autofluorescencji 7.
Tutaj demonstrujemy bardziej szczegółowo nasze podejście do oceny HerDox in vivo po dostarczeniu ogólnoustrojowym, a co najważniejsze, do oceny celowania za pomocą metod obrazowania wielomodowego i analiz.

<table><tbody><tr><td>Fluorescencyjny laserowy skaningowy mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>SPE</td><td></td></tr><<tr><td>em>In Vivo Optical Imager</td><td>Spektralne obrazowanie molekularne</td><td>wielomodowe In Vivo Obrazowanie</td><td></td>optyczne</tr><tr><td>Doxorubicin-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4035</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Nude (NU/NU), samica, 6-8 tygodni</td><td>Charles River</td><td>Kod szczepu 088</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-435 ludzkie komórki nowotworowe HER2 +</td><td>NCI-Frederick Cancer DCTD Repozytorium guzów/linii komórkowych</td><td>0507292</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa 3/10 cc U-100 z igłą 29G x 1/2" Ultra-FineIV przymocowaną na stałe BD</td><td></td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>komorą Delta T </td><td>Bioptechs</td><td>04200417B</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza celowanych nanocząstek białek wirusowych dostarczanych do guzów her2+

Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

Nanocząstka ukierunkowana na nowotwór HER2+, HerDox, wykazuje akumulację preferencyjną dla guza i ablację wzrostu guza w zwierzęcym modelu raka HER2+. HerDox powstaje w wyniku niekowalencyjnej samoorganizacji białka penetrującego komórki ukierunkowane na nowotwór ze środkiem chemioterapeutycznym, doksorubicyną, za pośrednictwem małego łącznika kwasu nukleinowego. Połączenie oddziaływań elektrofilowych, interkalacyjnych i oligomeryzacyjnych ułatwia samoorganizację w okrągłe cząstki o długości 10-20 nm. HerDox wykazuje stabilność we krwi, a także w długotrwałym przechowywaniu w różnych temperaturach. Ogólnoustrojowe dostarczanie HerDox myszom z nowotworem powoduje śmierć komórek nowotworowych bez wykrywalnych działań niepożądanych dla tkanek nienowotworowych, w tym serca i wątroby (które ulegają znacznemu uszkodzeniu przez nieukierunkowaną doksorubicynę). Zwiększenie poziomu HER2 ułatwia celowanie w komórki wykazujące ekspresję receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu, stąd nowotwory wykazujące podwyższony poziom HER2 wykazują większą akumulację HerDox w porównaniu z komórkami wykazującymi niższą ekspresję, zarówno in vitro, jak i in vivo. Obrazowanie intensywności fluorescencji w połączeniu z analizą konfokalną i spektralną in situ pozwoliło nam zweryfikować in vivo celowanie w guz i penetrację komórek nowotworowych HerDox po dostarczeniu ogólnoustrojowym. W tym miejscu szczegółowo opisujemy nasze metody oceny celowania w guz za pomocą obrazowania wielomodowego po dostarczeniu ogólnoustrojowym.

Rycina 1 przedstawia prototyp obrazownika optycznego in vivo, który został zbudowany w celu pozyskiwania obrazów w wielu modalnościach, w tym obrazowania intensywności fluorescencji, obrazowania spektralnego, czasu życia, dwufotonowego, konfokalnego intravitalnego oraz bioluminescencji. Ponadto chłodzona kamera o wysokiej czułości i linie laserowe o wysokiej mocy wbudowane w ten system pozwalają na uzyskanie obrazów fluorescencji o wyższym kontraście w porównaniu z komercyjnymi systemami obrazow...

Ten artykuł szczegółowo opisuje procedury analizy obrazowania optycznego nanocząsteczki HerDox, ukierunkowanej na nowotwór. W szczególności opisano tutaj szczegółowe zastosowanie wielomodowego urządzenia do obrazowania do wykrywania celowania w guz i oceny penetracji guza.

Analiza celowanych nanocząstek białek wirusowych dostarczanych do guzów HER2+

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykrycie i analiza układowego dostarczania in vivo nanocząsteczek HeroX ukierunkowanych na guz za pomocą wielomodalnego obrazowania optycznego. W pierwszej kolejności nanocząsteczki wstrzykuje się do żyły ogonowej myszy z nowotworem, a następnie wykonuje się obrazy fluorescencyjne przy użyciu wielomodalnego systemu obrazowania optycznego. Po eutanazji pobiera się guz oraz organy, które są ponownie obrazowane w celu wykrycia cząsteczek fluorescencyjnych wewnątrz komórek nowotworowych.Następnie wykonuje się obrazowanie konfokalne in situ. Analiza uzyskanych obrazów wykazuje mierzalne targetowanie i penetrację her docs do guzów po podaniu systemowym. Przewaga technik obrazowania multimodalnego nad istniejącymi metodami, takimi jak pojedynczy tryb obrazowania, polega na dostarczaniu wielu komplementarnych informacji, które mogą usprawnić analizę i kwantyfikację dostarczania do guza.Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie dostarczania leków, takie jak to, czy lek celowany nie tylko dociera do guzów, ale faktycznie przenika do komórek nowotworowych. Procedurę w tym protokole zaprezentują dr J Yun Wang, były stażysta podoktorski w moim laboratorium, oraz Janet Markman, obecna studentka studiów doktoranckich. W wieku od sześciu do ośmiu tygodni.Wykorzystuje się nowe myszy z bilateralnymi ksenoprzeszczepami guzów podskórnych w okolicy boku. Do podania ogólnoustrojowego należy przygotować mieszaninę HeroX i jałowej soli fizjologicznej w takiej ilości, aby każda iniekcja o objętości 0,2 mililitra zawierała dawkę HeroX wynoszącą 0,004 miligrama na kilogram masy ciała. Ostrożnie pobrać 0,2 mililitra mieszaniny HeroX do strzykawki insulinowej o pojemności 0,3 cc z igłą o rozmiarze 29 G.Należy upewnić się, że po znieczuleniu w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza. Wstrzyknąć całą mieszaninę do żyły ogonowej. Uciskać ogon, aby zapobiec utracie krwi z miejsca wkłucia.Po ustąpieniu krwawienia oczyścić miejsce iniekcji sterylnym tamponem i umieścić mysz z powrotem w klatce. Powtarzać iniekcje u tej samej myszy przez kolejne sześć dni. Raz dziennie, aż do ostatniego dnia iniekcji, można monitorować akumulację fluorescencji HeroX w guzach.Dzień siódmy, z wykorzystaniem obrazownika wielomodalnego. Przedstawione procedury wykorzystują system obrazowania optycznego z możliwością pomiaru intensywności fluorescencji, fluorescencji spektralnej, czasu życia oraz obrazowania konfokalnego in vivo. Poniżej przedstawiono prototyp optycznego obrazownika in vivo.Chłodzona kamera o wysokiej czułości oraz linie lasera o wysokiej mocy zintegrowane w tym systemie pozwalają na uzyskanie obrazów fluorescencji o wyższym kontraście w porównaniu do komercyjnych systemów obrazowania optycznego, szczególnie w przypadku detekcji fluorescencji doksorubicyny in vivo. Włącz tryb multimodalnego obrazowania optycznego in vivo w oprogramowaniu. Wybierz filtr pasmowy emisji odpowiedni do detekcji fluorescencji doksorubicyny.Włącz laser i umieść filtr pasmowy wzbudzenia na drodze optycznej lasera. Po znieczuleniu myszy izofluranem w komorze znieczulającej, przenieś ją do komory obrazowania wielomodalnego obrazowca optycznego in vivo. Nałóż stożek nosowy na nos myszy i otwórz przepływ, aby podawać znieczulenie w sposób ciągły.Podczas akwizycji obrazów należy rejestrować obrazy fluorescencyjne, stosując czas ekspozycji od 5 do 15 sekund. Fluorescencję Her doc można obrazować w guzach oraz w konkretnych narządach, w tym w wątrobie, nerkach, śledzionie, sercu i mięśniach szkieletowych pobranych od uśpionych myszy 24 godziny po ostatnim dniu iniekcji. Włącz tryb wielomodułowy w obrazowniku optycznym in vivo.Następnie, podobnie jak wcześniej, umieść guzy i wybrane organy na szalce Petriego. W komorze obrazowania wielomodalnego obrazownika optycznego in vivo wykonaj obrazy fluorescencyjne tkanek, stosując czas naświetlania od 5 do 15 sekund. Następnie powtórz te same pomiary, używając pustej szalki Petriego, która posłuży do późniejszego odjęcia tła.Przeprowadzić analizę i przetwarzanie obrazów, w tym korekcję tła lub regulację kontrastu. Obrazowanie konfokalne in situ umożliwia detekcję i analizę akumulacji guza w stadzie na poziomie komórkowym. Wykorzystując mikroskop konfokalny.Wybierz światło lasera o długości fali 488 nanometrów do wzbudzenia doksorubicyny oraz długości fali emisji od 560 nanometrów do 620 nanometrów. Do detekcji fluorescencji doksorubicyny wybierz obiektyw 40x lub 63x i nanieś na niego kroplę olejku imersyjnego. Umieść guzy pobrane z uśpionej myszy na szalce Petriego, aby zapobiec degradacji tkanki.Następnie przenieś guzy do komory delta T w celu obrazowania konfokalnego. Wykonaj obrazy konfokalne guzów na kolejnych głębokościach ogniskowych z krokiem 1 µm i grubością warstwy 20 µm. Przykład sekwencyjnie uzyskanych obrazów wzdłuż osi Z przedstawiono tutaj.Wygeneruj projekcje Z o maksymalnej intensywności obrazów. Następnie, korzystając z programu ImageJ lub podobnego oprogramowania, oblicz średnią intensywność fluorescencji obrazów z projekcji Z o maksymalnej intensywności dla ogólnego stosunku pola widzenia. Metryczne obrazowanie spektralne i analiza pozwalają na rozróżnienie doxorubycyny, fluorescencji i autofluorescencji.Za pomocą laserowego skaningowego konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego Leica SPE wykonaj 15 obrazów guzów traktowanych i nietraktowanych HeroX na określonej głębokości w zakresie widmowym od 510 do 650 nanometrów z krokiem 10 nanometrów i wzbudzeniem światłem o długości 488 nanometrów. Następnie przygotuj 100 mikromolarny roztwór doksorubicyny w soli fizjologicznej. Przeprowadź obrazowanie widmowe 100 mikromolarnego roztworu doksorubicyny.Aby uzyskać czysty sygnaturę spektralną fluorescencji doksorubicyny, należy pozyskać sygnaturę spektralną autofluorescencji z kostki obrazowej poprzez obrazowanie nieleczonych guzów. Po zebraniu wszystkich danych należy wygenerować referencyjne sygnatury spektralne, przeprowadzić klasyfikację spektralną obrazów oraz wykonać liniowe rozdzielanie spektralne tych obrazów, aby uzyskać ilościową ocenę akumulacji doksorubicyny w guzach.Konfokalne obrazy fluorescencyjne uzyskano na różnych głębokościach ogniskowania in situ, a następnie wykonano projekcję maksymalnej intensywności (Z projection) obrazów i zmierzono średnią intensywność fluorescencji obrazu rzutowanego. Wysoka fluorescencja guza widoczna na tym obrazie jest typowa po systemowym podaniu her docs i wskazuje na preferencyjne celowanie w tkankę nowotworową. Fluorescencja wykryta w mięśniach szkieletowych jest nietypowa i może wynikać z nieprawidłowości w procedurze iniekcji.Pod względem jakościowym obraz ten charakteryzuje się niskim tłem. W celu przeprowadzenia analizy ilościowej wykonuje się korekcję tła przy użyciu pustej szalki, jak pokazano tutaj. Wynikowy obraz po korekcie tła wykazuje silniejszy sygnał tła przy krawędzi w porównaniu z oryginałem, ponieważ obraz tła posiada niższe intensywności na krawędziach.Zdjęcia składowe pokazane po lewej stronie są reprezentatywne dla skanów konfokalnych tkanki nowotworowej uzyskanych w sekwencyjnych odstępach jednego mikrona. Obraz po prawej stronie przedstawia kompilację obrazów składowych widocznych po lewej stronie. Obraz kompilacyjny zawiera informacje o akumulacji HeroX w określonych głębokościach Z dla każdego piksela, zatem średnia intensywności fluorescencji ilościowo odzwierciedla całkowitą akumulację herd doc w nowotworach na różnych głębokościach.W celu odróżnienia fluorescencji herd doc od autofluorescencji w guzach oraz ilościowego rozróżnienia obu zjawisk za pomocą wskaźników wysokiego stosunku specyficzności, przeprowadzono obrazowanie i analizę spektralną. Na tym obrazie przedstawiono czyste sygnatury spektralne doxorubicin.Intensywność fluorescencji wyznaczonego obszaru zaznaczonego linią przerywaną przy wskazanych długościach fal emisji generuje histogram przedstawiający profil doksorubicyny w spektrum długości fal od 510 do 650 nanometrów. Tutaj przedstawiono czyste sygnatury spektralne autofluorescencji. Fluorescencja emitowana przez nieleczony guz przy wskazanych długościach fal emisji tworzy nachylenie reprezentujące profil emisji autofluorescencji.Referencja.Sygnatury widmowe utworzono również poprzez mieszanie czystych sygnatur widmowych w różnych proporcjach. Za pomocą programu opracowano każdy wzorzec. Sygnatura widmowa reprezentuje tutaj względną fluorescencję her docks nagromadzonych w guzach w stosunku do autofluorescencji.Po uzyskaniu sygnatur spektralnych doków i autofluorescencji, sygnały doków są rozdzielane przy użyciu liniowego rozdzielania spektralnego. Rysunek przedstawia obraz mieszany autofluorescencji i jej doków przed rozdzielaniem spektralnym oraz obraz rozdzielonych jej doków po rozdzielaniu spektralnym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak łączyć modalności intensywności fluorescencji, comfort car i obrazowania spektralnego, aby usprawnić analizę i kwantyfikację dostarczania do guza.Należy pamiętać, że praca z doksorubicyną może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie podwójnych rękawiczek i ich częsta wymiana.

analysis-targeted-viral-protein-nanoparticles-delivered-to-her2

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Analiza ukierunkowanych wirusowych nanocząstek białkowych dostarczanych do guzów HER2+

Przedstawiamy nowatorskie podejście do ilościowego określania lokalizacji nanocząsteczek w naczyniach krwionośnych ludzkich guzów ksenoprzeszczepionych z wykorzystaniem dynamicznego obrazowania intravitalnego w czasie rzeczywistym w modelu zarodka ptaka.

Ocena wychwytu nanocząsteczek w guzach w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem obrazowania intravitalnego

Nanocząstki wirusowe pochodzenia roślinnego (VNPs) stanowią obiecujące platformy do zastosowań w biomedycynie. W niniejszym materiale opisujemy procedury propagacji, oczyszczania, charakteryzacji oraz biokoniugacji roślinnych VNP. Na koniec przedstawiamy zastosowanie VNP w celowanym dostarczaniu do guzów oraz obrazowaniu z wykorzystaniem modelu ksenoprzeszczepu u myszy i obrazowania fluorescencyjnego.

Nanocząsteczki wirusowe do obrazowania guzów in vivo

Opisano protokół analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej do oceny nanocząstek dostarczających geny polimerowe. NTA wykorzystuje się do scharakteryzowania rozkładu wielkości cząstek nanocząstek i rozkładu plazmidu na cząstkę. Wysokoprzepustowa cytometria przepływowa umożliwia ilościową ocenę skuteczności transfekcji dla biblioteki biomateriałów dostarczających geny.

Ocena nanocząstek dostarczających geny polimerowe za pomocą analizy śledzenia nanocząstek i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej

Przedstawiono przykład nanoleku opartego na kwasie polimalowym w kierunku racjonalnego projektowania medycyny spersonalizowanej, która ma zastosowanie w leczeniu raka. Opisuje syntezę nanoleku do leczenia Her2-dodatniego ludzkiego raka piersi u nagiej myszy.

Nanobiopolimery na bazie kwasu polimalowego do celowania w wiele markerów nowotworowych: szansa dla medycyny spersonalizowanej?

Tutaj opisujemy protokół syntezy magneto-plazmonicznych nanocząstek o silnym momencie magnetycznym i silnej absorbancji bliskiej podczerwieni (NIR). Protokół obejmuje również koniugację przeciwciał z nanocząstkami za pomocą ugrupowania Fc do różnych zastosowań biomedycznych, które wymagają specyficznego celowania molekularnego.

Synteza immunoukierunkowanych magnetoplazmonicznych nanoklastrów

Peptydy pochodzenia wirusowego sprzężone z koniugatami przeciwciał (AC) to podejście, które nabiera rozpędu ze względu na potencjał dostarczania ładunków molekularnych ze zwiększoną akumulacją komórek nowotworowych. Wykorzystując powszechne metody oceny koniugacji peptydów, akumulacji wewnątrzkomórkowej AC i ładunku oraz celowania w guz, protokół ten pomaga naukowcom w kluczowych początkowych fazach rozwoju.

Wstępna ocena koniugatów przeciwciał zmodyfikowanych peptydami pochodzącymi z wirusów w celu zwiększenia akumulacji komórkowej i poprawy celowania w guz

Tutaj prezentujemy protokół do testowania skuteczności terapii celowanych, wybranych na podstawie składu genomowego guza. Protokół opisuje identyfikację i walidację strukturalnych rearanżacji DNA, wszczepianie guzów pacjentów myszom oraz testowanie odpowiedzi na odpowiednie leki.

Testowanie terapii celowanych w nowotworach z wykorzystaniem analizy zmian strukturalnych DNA i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów

Tutaj prezentujemy protokół do badania lokalizacji in vivo przeciwciał w modelach ksenoprzeszczepów guza myszy.

Analiza rozmieszczenia nowotworów i tkanek przeciwciała terapeutycznego specyficznego dla antygenu docelowego

Ten artykuł ma na celu dostarczenie protokołu izolacji i hodowli pierwotnych fibroblastów związanych z rakiem z syngenicznego mysiego modelu potrójnie ujemnego raka piersi oraz ich zastosowanie w badaniach przedklinicznych nowych nanocząstek zaprojektowanych do celowania w mikrośrodowisko guza.

Izolacja pierwotnych fibroblastów związanych z rakiem z syngenicznego mysiego modelu raka piersi w celu zbadania celowanych nanocząstek

Tutaj opisujemy protokół dostarczania in vivo magnetycznych nanocząstek tlenku żelaza przenoszących oligomery RNA do przerzutowego raka piersi w modelach zwierzęcych, zapewniając klinicznie realne podejście do terapeutycznego wyciszania onkogennych kwasów nukleinowych.

Monitorowanie akumulacji nanoleków w przerzutach mysiego raka piersi

Bariera krew-mózg jest znaczącą przeszkodą w dostarczaniu terapii glejaka, choroby, na którą nie ma lekarstwa. W tym miejscu przedstawiamy sterowaną obrazem in vivo terapeutyczną platformę nano tlenku żelaza, która może ominąć tę fizjologiczną barierę ze względu na rozmiar i gromadzić się w guzie.

Dostarczanie nanocząstek ładunku oligonukleotydowego w modelu zwierzęcym glejaka wielopostaciowego

Poznaj analizę dostarczania nanocząstek HerDox do guzów HER2+ przy użyciu wielomodalnego obrazowania optycznego. Metoda ta umożliwia badaczom ocenę penetracji cząstek w komórkach nowotworowych.

Analiza celowanych nanocząstek białek wirusowych dostarczanych do guzów HER2+

Przeglądaj więcej filmów