Name: Pirosekwencjonowanie w celu identyfikacji i charakterystyki drobnoustrojów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Poznaj metodę pirosekwencjonowania do identyfikacji bakterii i wykrywania mutacji genetycznych oporności na antybiotyki. Technika ta umożliwia szybkie i precyzyjne sekwencjonowanie DNA mikroorganizmów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ten projekt był częściowo wspierany przez Uniwersytet Johnsa Hopkinsa, Biuro Rektora poprzez Gateway Science Initiative i Qiagen Inc.

Wprowadzenie: Pojedyncza kolonia bakteryjna powinna być użyta do zaszczepienia odpowiedniego bulionu kulturowego, który jest inkubowany przez noc. Osad bakteryjny jest następnie przetwarzany w celu oczyszczenia genomowego DNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do izolacji genomu. Oczyszczony genomowy DNA powinien mieć stosunek 260/280 (nm) >1,8, aby zapewnić, że próbka jest wolna od zanieczyszczenia białkowego. Ilość genomowego DNA potrzebna do wytworzenia matrycy do pirosekwencjonowania wynosi 10-20 ng.
A. Wzmocnienie szablonu
(Podręcznik PCR PyroMark; <a href="http://www.qiagen.com/handbooks" target="_blank">www.qiagen.com/handbooks</a>1)
Ustawianie reakcji PCR
Uwaga: Jeden starter musi być biotynylowany na końcu 5' i zaleca się, aby został oczyszczony metodą HPLC w celu przygotowania szablonu. Zalecamy oprogramowanie PyroMark Assay Design Software 2.0 do projektowania PCR i sekwencyjnego startera, które jest zoptymalizowane pod kątem sekwencjonowania z krótkim odczytem, jednak Primer-BLAST (<a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome" target="_blank">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome</a>) firmy NCBI może być również używany do projektowania starterów.
<ol>
 <li>Rozmrozić wszystkie wymagane roztwory (wymienione w tabeli 1) i dokładnie wymieszać. Ustawić reakcję zgodnie z tabelą 1. Wszystkie prace można wykonać w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
Uwaga: PCR Master Mix zawiera MgCl2 dla końcowego stężenia 1,5 mM, co zapewnia zadowalające wyniki w większości przypadków. Jeśli wymagane jest wyższe stężenieMg2+, do reakcji można dodać do 3,5 μl 25 mM MgCl2.
<ol start="2">
 <li>Dokładnie wymieszaj mieszaninę reakcyjną, delikatnie pipetując w górę i w dół, a następnie dozuj odpowiednie objętości do probówek PCR.</li>
 <li>Dodaj matrycę DNA do każdej probówki PCR. Zalecamy 10 ng genomowego DNA.</li>
 <li>Zaprogramować termocykler zgodnie z tabelą 2. Dla wygody zaleca się końcowe trzymanie w temperaturze 4 °C. W przypadku korzystania z termocyklera bez podgrzewanej pokrywy, reakcje należy nałożyć na 100 μl oleju mineralnego.</li>
 <li>Umieść probówki PCR w cyklerze i uruchom program rowerowy.</li>
</ol>
B. Protokół stacji roboczej odkurzacza
Unieruchamianie biotynylowanych produktów PCR
<ol>
 <li>Przygotuj mieszankę wzorcową zgodnie z rysunkiem 4.</li>
</ol>
Uwaga: Przed pipetowaniem delikatnie wstrząśnij butelką z kulkami Sepharose pokrytymi streptawidyną, aby zapewnić jednorodną zawiesinę.
<ol start="2">
 <li>W zależności od objętości użytego produktu PCR, dozować 60-75 μl mieszanki wzorcowej do każdego dołka płytki PCR, aby uzyskać całkowitą objętość 80 μl na dołek.</li>
 <li>Do każdej studzienki dodać 5-20 μl biotynylowanego produktu PCR.</li>
 <li>Uszczelnić studzienki nakrętkami paskowymi i mieszać płytkę PCR z prędkością 1 400 obr./min przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej (15-25 °C) za pomocą wytrząsarki orbitalnej.</li>
</ol>
Denaturacja DNA i dodanie startera sekwencjonującego
<ol>
 <li>Rozcieńczyć startery sekwencyjne do 0,3 μM buforem do wyżarzania i dozować 25 μl do każdego dołka płytki reakcyjnej. Umieść tabliczkę na stacji roboczej.</li>
 <li>Napełnij koryta stanowiska pracy zgodnie ze schematem Rysunek 5.</li>
 <li>Włącz pompę próżniową i upewnij się, że przełącznik na przyrządzie próżniowym jest ustawiony w pozycji włączonej (Rysunek 6). Przepłucz sondy filtra wodą o wysokiej czystości (Milli-Q 18.2 MW x cm lub odpowiednik) w rynnie 5 (Rysunek 5). Napełnij koryto świeżą wodą o wysokiej czystości do użycia w kroku 12.</li>
 <li>Pracując szybko, umieść płytkę PCR z koralikami na stacji roboczej. Upewnij się, że obie płytki są w tej samej orientacji, co w momencie ładowania próbek.</li>
 <li>Przy włączonym przełączniku podciśnienia opuść narzędzie próżniowe do dołków płytki PCR na 20 sekund lub do momentu, gdy cała objętość zostanie zassana. Koraliki zostaną przechwycone przez narzędzie próżniowe (Rysunek 7).</li>
 <li>Gdy próżnia jest nadal włączona, przepłukać narzędzie 70% etanolem (koryto 1) przez 20 sekund lub do momentu, gdy cała objętość zostanie zassana.</li>
 <li>Przy włączonym podciśnieniu przepłukać narzędzie roztworem denaturacyjnym (koryto 2) przez 20 sekund lub do momentu, gdy cała objętość zostanie zassana.</li>
</ol>
Uwaga: Roztwór do denaturacji zawiera wodorotlenek sodu, który działa drażniąco na oczy i skórę. Zawsze noś fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary ochronne.
<ol start="8">
 <li>Przy włączonym podciśnieniu płucz narzędzie buforem do płukania (koryto 3) przez 20 sekund lub do momentu, gdy cała objętość zostanie zassana.</li>
 <li>Przy włączonym podciśnieniu podnieś narzędzie próżniowe poza 90° w pionie na 5 sekund, aby umożliwić spływanie całego płynu z narzędzia próżniowego. Wyłącz pompę i wyrównaj narzędzie próżniowe z płytką reakcyjną. Opuść narzędzie próżniowe do studzienek i delikatnie potrząśnij z boku na bok, aby uwolnić kulki do studzienek zawierających starter sekwencyjny.</li>
 <li>W celu wyczyszczenia narzędzia próżniowego należy mieszać sondy filtrujące w wodzie o wysokiej czystości (koryto 4) przez 10 sekund.</li>
 <li>Włącz odkurzacz i przepłucz narzędzie wodą o wysokiej czystości (koryto 5) przez 20 sekund lub do momentu, gdy cała objętość zostanie zassana.</li>
 <li>Podnieś odkurzacz powyżej 90°C w pionie na 5 sekund, a następnie wyłącz odkurzacz i przechowuj w pozycji "Parking".</li>
</ol>
Wyżarzanie startera sekwencjonowania nici DNA
<ol>
 <li>Umieścić płytkę reakcyjną we wstępnie ogrzanym uchwycie na płytki.</li>
 <li>Podgrzewać płytkę na bloku grzewczym w temperaturze 80 °C przez 2 minuty.</li>
 <li>Wyjmij płytkę z uchwytu i umieść na blacie do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
</ol>
Operacja Pyromark Q24
Uwaga: Włącz instrument za pomocą przełącznika zasilania znajdującego się nad przewodem zasilającym. Uruchomienie może potrwać do 1 minuty.
<ol>
 <li>Napełnij kartusz zgodnie z instrukcjami zawartymi w Podręczniku odczynników PyroMark Gold Q24 2. Aby określić wymagane woluminy, należy skonfigurować plik uruchamiania w oprogramowaniu instrumentu, a następnie w menu Narzędzia wybierz opcję Pre Run Information (Informacje przed uruchomieniem)</li>
 <li>Jeśli instrument był już włączony, upewnij się, że nie wykonuje biegu, a następnie otwórz pokrywę. Dźwiękowy sygnał ostrzegawczy zostanie wyemitowany, jeśli pokrywa zostanie otwarta, gdy jest to niebezpieczne.</li>
 <li>Otwórz zasuwę naboju i włóż kasetę z etykietą skierowaną do przodu (Rysunek 8). Upewnij się, że wkład jest prawidłowo włożony (z przodu powinna być widoczna linia) i zamknij zasuwę.</li>
 <li>Otwórz ramkę mocującą płytkę i umieść płytkę z próbkami wewnątrz urządzenia.</li>
 <li>Zamknij ramkę przytrzymującą płytę i pokrywę instrumentu (Rysunek 9).</li>
</ol>
Rozpoczynanie biegu
<ol>
 <li>Włóż pamięć USB z plikami uruchamiania utworzonymi za pomocą oprogramowania instrumentu do portu USB z przodu instrumentu.</li>
 <li>Wybierz "Uruchom" w menu głównym i naciśnij "OK".</li>
 <li>Użyj strzałek przewijania, aby wybrać żądany plik uruchamiania i naciśnij "Wybierz".</li>
</ol>
Uwaga: Przyrząd rozpocznie dozowanie odczynników po osiągnięciu wszystkich ustawionych poziomów ciśnienia i temperatury (może to potrwać kilka minut). Podczas biegu na ekranie przyrządu wyświetlany jest pyrogram wybranego odwiertu w czasie rzeczywistym. Użyj strzałek przewijania, aby zobaczyć pirogram innych studni.
Ukończenie biegu
<ol>
 <li>Gdy przyrząd potwierdzi, że przebieg został zakończony, a przebieg file został zapisany w pamięci USB, naciśnij "Zamknij".</li>
 <li>Odłącz pamięć USB. Jeśli została usunięta przed zakończeniem biegu, włóż pamięć USB. Wybierz "Administracja", a następnie "Kopiuj niezapisane przebiegi".</li>
 <li>Plik roboczy można teraz otworzyć i przeanalizować za pomocą oprogramowania urządzenia i porównać z biblioteką znanych mikroorganizmów za pomocą oprogramowania Identifire.</li>
</ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22PyroMark+PCR+Handbook%22">PyroMark PCR Handbook</a>. , [about 27p.]. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.qiagen.com/handbooks">http://www.qiagen.com/handbooks</a> (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22PyroMark+Q24+User+Manual%22">PyroMark Q24 User Manual</a>. , [about 27p.]. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.qiagen.com/handbooks">http://www.qiagen.com/handbooks</a> (2012).</li>
<li>Elahi, E., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing%3A+a+tool+for+DNA+sequencing+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Bio%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis.</a> Methods Mol. Bio. 255, 211-219 (2004).</li>
<li>Fakhrai-Rad, H., Pourmand, N., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing%3A+and+accurate+detection+platform+for+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing: and accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms.</a> Hum. Mutat. 19 (5), 479-485 (2002).</li>
<li>Langaee, T., Ronaghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+analyses+by+pyrosequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic variation analyses by pyrosequencing.</a> Mutat. Res. 573 (1-2), 96-102 (2005).</li>
<li>Liu, Z., Lozupone, C., Hamady, M., Bushman, F. D., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+pyrosequencing+reads+suffice+for+accurate+microbial+community+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis.</a> Nucleic Acids Res. 35 (18), e120(2007).</li>
<li>Novais, R. C., Thorstenson, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+Pyrosequencing+for+microbiology%3A+From+genes+to+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">The evolution of Pyrosequencing for microbiology: From genes to genomes.</a> J. Microbiol. Methods. 86 (1), 1-7 (2011).</li>
<li>J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+pyrosequencing+and+microbial+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Metagenomic pyrosequencing and microbial identification.</a> Clin. Chem. 55 (5), 856-866 (2009).</li>
<li>Quince, C., Lanzen, A., Curtis, T. P., Davenport, R. J., Hall, N., Head, I. M., Read, L. F., Sloan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+microbial+diversity+from+454+pyrosequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data.</a> Nat. Methods. (9), 639-6341 (2009).</li>
<li>Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M., Nyren, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+DNA+sequencing+using+detection+of+pyrophosphate+release%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release.</a> Anal. Biochem. 242, 84-89 (1996).</li>
<li>King, C., Scott-Horton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing%3A+A+simple+method+for+accurate+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing: A simple method for accurate genotyping.</a> J. Vis. Exp. (11), e630(2008).</li>
<li>Rothberg, J. W., Heinz,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+semi-conductor+device+that+enabling+non-optical+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing.</a> Nature. 475, 348-352 (2011).</li>
<li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zero-Mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li>
<li>Eid, J., Fehr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li>
<li>Sequencing Technology | Sequencing by Synthesis | Illumina [Internet]. , Illumina. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.illumina.com/technology/sequencing_technology.ilmn">http://www.illumina.com/technology/sequencing_technology.ilmn</a> (2012).</li>
</ol>

Produkcja i bezpłatny dostęp do tego artykułu są sponsorowane przez Qiagen. Autorzy Ahmed, Durocher, Jessen i Vardi są pracownikami firmy Qiagen Inc., która produkuje odczynniki i instrumenty użyte w tym artykule.

Skomercjalizowano kilka nowych metod sekwencjonowania nowej generacji. Trzy z najczęściej stosowanych metod to sekwencjonowanie półprzewodników jonowych, sekwencjonowanie pojedynczych cząsteczek w czasie rzeczywistym i sekwencjonowanie przez syntezę (SBS). 3-11 Każda z tych metod opiera się na sekwencjonowaniu przez syntezę, ale wykorzystuje nowatorskie platformy do wykrywania włączonych nukleotydów. W sekwencjonowaniu półprzewodników jonowych pojedyncza nić DNA służy jako matryca dla nici sekwencjonowania. 12 Polimerazę i nukleotydy dodaje się sekwencyjnie, tak jak w przypadku pirosekwencjonowania. Kiedy nukleotyd jest dodawany do rosnącej nici DNA, uwalniany jest jon wodorowy. Jon wodorowy jest wykrywany przez czujnik oparty na tranzystorze polowym.
Sekwencjonowanie pojedynczej cząsteczki w czasie rzeczywistym zależy od falowodu w trybie zerowym (ZMW). 13 ZMW jest małą strukturą, w której pojedyncza cząsteczka polimerazy jest przyłączona do dna studni. Jest oświetlony w taki sposób, że można wykryć cząsteczkę fluorescencyjną. Każdy nukleotyd jest oznaczony cząsteczką fluorescencyjną. Po włączeniu fluorescencyjnie znakowanego nukleotydu detektor identyfikuje nukleotyd. Po dodaniu kolejnego nukleotydu cząsteczka fluorescencyjna jest rozszczepiana. 14 
Sekwencjonowanie przez syntezę (SBS) wykorzystuje unikalną metodę amplifikacji docelowego DNA w taki sposób, że generowane są klastry unikalnych sekwencji. Generowanych jest 15 jednoniciowych szablonów, a następnie syntetyzowana jest nić komplementarna. Każdy nukleotyd jest znakowany cząsteczką fluorescencyjną, a po każdym dodaniu zasady rejestrowana jest fluorescencja dodanej zasady.

Pirosekwencjonowanie to szybka i dokładna metoda sekwencjonowania kwasów nukleinowych, która opiera się na zasadzie "sekwencjonowania przez syntezę". "Sekwencjonowanie przez syntezę" polega na użyciu pojedynczej nici matrycy DNA do syntezy nici komplementarnej po jednej zasadzie na raz i wykrywaniu włączonej zasady (A, T, G lub C) na każdym etapie poprzez detekcję sygnału chemiluminescencyjnego. Reakcja pirosekwencjonowania obejmuje matrycę DNA, dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), polimerazę DNA, sulfurylazę ATP, lucyferynę, lucyferazę i apirazę. Reakcja syntezy jest inicjowana przez dodanie jednego z czterech dNTP i polimerazy DNA do jednoniciowego biotynylowanego matrycowego DNA. Polimeraza DNA włącza komplementarny dNTP do matrycy, a następnie uwalnia pirofosforan (ryc. 1). Sulfurylaza ATP proporcjonalnie przekształca pirofosforan w ATP. ATP działa jako katalizator przemiany lucyferyny w oksylucyferynę, w której pośredniczy lucyferazy, co generuje światło (ryc. 2). Intensywność światła jest proporcjonalna do liczby włączonych nukleotydów i określa, czy jeden lub więcej specyficznych dNTP (dATP, dTTP, dGTP lub dCTP) jest kolejno obecne na nici matrycy (ryc. 3). Każdy nieinkorporowany dNTP jest degradowany przez apyrazę przed dodaniem następnego dNTP w celu kontynuacji reakcji syntezy. Tę reakcję "sekwencjonowania przez syntezę" powtarza się z dodaniem każdego z czterech dNTP, aż do określenia sekwencji DNA jednoniciowej matrycy DNA.
Aby zobaczyć animację reakcji pirosekwencjonowania <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405movie1.mov" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić film</a>.

<table><tbody><tr><td>PyroMark PCR Master Mix, 2x</td><td>Qiagen</td><td>978703</td><td></td></tr><tr><td>CoralLoad Concentrate, 10x</td><td>Qiagen</td><td>978703, 978705</td><td></td></tr><tr><td>Q-Solution, 5x</td><td>Qiagen</td><td>978703, 978705</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2, 25 mM</td><td>Qiagen</td><td>978703, 978705</td><td></td></tr><tr><td>Woda bez RNaz</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td>Startery Qiagen</td><td>978776 lub 978777</td><td>należy zakupić od uznanego producenta oligonukleotydów (tj. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT itp.). Liofilizowane startery należy rozpuścić w TE, aby uzyskać roztwór podstawowy 100 &mu;M.</td></tr><tr><td>Odczynniki Pyromark Gold Q24</td><td>Qiagen</td><td>970802</td><td></td></tr><tr><td>Woda o wysokiej czystości (Milli-Q 18,2 M&Omega; x cm lub odpowiednik)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna Sepharose Wysokowydajne kulki</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5113-07</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Bufor do wyżarzania</td><td>Qiagen</td><td>979009</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do denaturacji PyroMark</td><td>Qiagen</td><td>979007</td><td></td></tr><tr><td>Bufor myjący PyroMark</td><td>Qiagen</td><td>979008</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q24</td><td>Qiagen</td><td>9001514</td><td></td></tr><tr><td>Wkład PyroMark Q24</td><td>Qiagen</td><td>979202</td><td></td></tr><tr><td>PyroMark Q96 HS Skrzynka z uchwytem na końcówki</td><td>Qiagen</td><td>979105</td><td></td></tr><tr><td>Stacja robocza PyroMark Q24</td><td>Qiagen</td><td>9001516</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na płytę PyroMark Q24</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td>9022273</tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>Fisher</td><td>11-675-297</td><td></td></tr><tr><td>Blok grzewczy</td><td>Fisher</td><td>11-718Q</td><td></td></tr></tbody></table>

pirosekwencjonowanie w celu identyfikacji i charakterystyki drobnoustrojów

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pirosekwencjonowanie to wszechstronna technika, która ułatwia sekwencjonowanie genomu drobnoustrojów, które może być wykorzystane do identyfikacji gatunków bakterii, rozróżniania szczepów bakteryjnych i wykrywania mutacji genetycznych, które nadają odporność na środki przeciwdrobnoustrojowe. Do zalet pirosekwencjonowania w zastosowaniach mikrobiologicznych należą szybkie i niezawodne badania przesiewowe o wysokiej przepustowości oraz dokładna identyfikacja drobnoustrojów i mutacji genomu drobnoustrojów. Pirosekwencjonowanie polega na sekwencjonowaniu DNA poprzez syntezę komplementarnej nici pojedynczej zasady na raz, przy jednoczesnym określeniu specyficznego nukleotydu włączanego podczas reakcji syntezy. Reakcja zachodzi na unieruchomionym jednoniciowym matrycowym DNA, w którym cztery dezoksyrybonukleotydy (dNTP) są dodawane sekwencyjnie, a niewłączone dNTP są enzymatycznie degradowane przed dodaniem następnego dNTP do reakcji syntezy. Wykrywanie określonej zasady wbudowanej w matrycę jest monitorowane poprzez generowanie sygnałów chemiluminescencyjnych. Kolejność dNTP, które wytwarzają sygnały chemiluminescencyjne, określa sekwencję DNA matrycy. Zdolność sekwencjonowania w czasie rzeczywistym w technologii pirosekwencjonowania umożliwia szybką identyfikację drobnoustrojów w jednym teście. Ponadto przyrząd do sekwencjonowania pirologicznego może analizować pełną różnorodność genetyczną oporności na leki przeciwdrobnoustrojowe, w tym typowanie SNP, mutacje punktowe, insercje i delecje, a także kwantyfikację wielu kopii genów, które mogą wystąpić w niektórych wzorcach oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Wyniki typowego przebiegu pirosekwencjonowania z wykorzystaniem oprogramowania pokazują położenie starterów forward i reverse użytych do generowania amplikonu oraz startera sekwencyjnego użytego w reakcji pirosekwencjonowania w obrębie konserwowanej sekwencji rybosomalnej 16S (Rysunek 10). Sekwencja hiperzmienna między miejscami wiązania starterów umożliwia identyfikację wielu gatunków bakterii przy użyciu konserwatywnego startera sekwencyjnego (5'-TACATGCAAGTCGA). Jako wewnętrzną kontrolę jakości można sprawdzić sekwencję DNA otaczającą region zmienny, aby upewnić się, że przeanalizowano prawidłowy region DNA. Oprogramowanie do pirosekwencjonowania umożliwia porównanie i dopasowanie wygenerowanej sekwencji do wewnętrznej bazy danych rybosomalnych sekwencji bakteryjnych w celu identyfikacji bakterii. Ponadto sekwencję można przeanalizować w celu wykrycia mutacji warunkujących oporność na antybiotyki. Na przykład analiza mutacji w genach rybosomalnych 23S Helicobacter pylori wykazuje dwa wzorce mutacji (GAA lub AGA), które nadają oporność na antybiotyki (Rysunek 11). Można jednocześnie badać wiele izolatów od tego samego pacjenta, aby śledzić pojawianie się oporności na leki w czasie, co wspomaga dochodzenia epidemiologiczne w przypadku ognisk oporności drobnoustrojów na leki.
<img alt="Schemat PCR: aktywność polimerazy DNA podczas replikacji DNA z użyciem biotynylowanych starterów i matrycy." src="/files/ftp_upload/50405/50405fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Biotynylowany produkt PCR służy jako matryca do inkorporacji dNTP przez polimerazę DNA, co prowadzi do powstania pirofosforanu (PPi).
<img alt="Schemat procesu pirosekwencjonowania; przedstawia wbudowywanie DNA; emisję światła; analizę piku pyrogramu." src="/files/ftp_upload/50405/50405fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. ATP sulfurylaza proporcjonalnie przekształca pirofosforan w ATP. ATP działa jako katalizator w reakcji przekształcania lucyferyny w oksylucyferynę za pośrednictwem lucyferazy, co generuje światło proporcjonalne do ilości ATP. Światło jest rejestrowane jako pik na zapisie pyrogramu i wskazuje na wbudowanie nukleotydu. Newbudowane dNTP są degradowane przez apirazę przed dodaniem kolejnego dNTP w celu kontynuacji syntezy.
<img alt="Analiza sekwencji nukleotydowej; wykres sekwencjonowania DNA; piki wskazują kolejność przyłączania nukleotydów." src="/files/ftp_upload/50405/50405fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Intensywność generowanego światła wskazuje, czy jeden lub więcej konkretnych dNTP (dATP, dTTP, dGTP lub dCTP) zostało sekwencyjnie wbudowane w nić matrycową.
<img alt="Schemat przygotowania PCR; przygotowanie master mixu z kuleczkami, buforem wiążącym i wodą wysokiej czystości." src="/files/ftp_upload/50405/50405fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Schemat blokowy przygotowania master mixu do unieruchomienia biotynylowanego produktu PCR.
<img alt="Schemat stanowiska PCR z buforem, denaturacją, etanolem i wodą rozmieszczonymi w opisanych korytkach." src="/files/ftp_upload/50405/50405fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5">
Rysunek 5. Stacja robocza PyroMark z zaznaczonymi miejscami na płytkę PCR, płytkę PyroMark oraz korytko.
<img alt="Układ równowagi statycznej, przełącznik elektryczny, element obwodu, laboratorium fizyczne, analiza przepływu energii." src="/files/ftp_upload/50405/50405fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Położenia włączone (ON) i wyłączone (OFF) przełącznika próżniowego.
<img alt="Sprzęt laboratoryjny do pipetowania; dłoń w rękawiczce trzymająca pipetę wielokanałową do przenoszenia cieczy." src="/files/ftp_upload/50405/50405fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Narzędzie próżniowe. Prawidłowa obsługa narzędzia próżniowego.
<img alt="Zautomatyzowany system elektroforezy do analizy DNA, pokazujący tackę na próbki i interfejs instrumentu." src="/files/ftp_upload/50405/50405fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8. Otwarta bramka kartridża z włożonym kartridżem.
<img alt="Konfiguracja czytnika płytek do analizy mikropłytek w badaniach biochemicznych, ze szczególnym uwzględnieniem badań absorpcyjnych." src="/files/ftp_upload/50405/50405fig9.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 9"> 
Rycina 9. Wkład prawidłowo włożony przy zamkniętej bramce.
<img alt="Porównanie sekwencjonowania DNA; adnotacje starterów PCR, diagram dopasowania dla analizy genomicznej." src="/files/ftp_upload/50405/50405fig10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 10"> 
Rysunek 10. Wyniki identyfikacji bakterii metodą pirosekwencjonowania. Startery PCR są zaprojektowane dla konserwatywnych regionów matrycy DNA, a starter sekwencyjny znajduje się bezpośrednio przed dobrze scharakteryzowaną, identyfikacyjną hiperzmienną sekwencją DNA w obrębie amplikonu (zaznaczono na niebiesko).
<img alt="Analiza mutacji genu 23S; chromatogramy; oporność genetyczna; dane sekwencjonowania DNA." src="/files/ftp_upload/50405/50405fig11.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 11"> 
Rysunek 11. Wykrywanie oporności na antybiotyki u Helicobacter pylori z wykorzystaniem pirosekwencjonowania. Analiza mutacji w genach 23S, które nadają oporność na środki przeciwbakteryjne u Helicobacter pylori zawierających sekwencje GAA lub AGA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50405/50405fig11large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Składnik</td>
 <td>Objętość na reakcję</td>
 <td>Stężenie końcowe</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pyro PCR Master Mix, 2x</td>
 <td>12.5 μl</td>
 <td>1x</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoralLoad Concentrate, 10x</td>
 <td>2.5 μl</td>
 <td>1x</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 mM MgCl2 (opcjonalnie)</td>
 <td>Zmienna</td>
 <td>≥1.5 mM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Q-Solution, 5x (opcjonalnie)</td>
 <td>5 μl</td>
 <td>1x</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Starter A/Starter B</td>
 <td>Zmienna/Zmienna</td>
 <td>0.2 μM/0.2 μM</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Woda wolna od RNaz</td>
 <td>Zmienna</td>
 <td>-</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objętość całkowita (po dodaniu matrycy DNA)</td>
 <td>25 μl</td>
 <td> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Mieszanina reakcyjna PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="always"> 
 <tbody>
 <tr>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 <td>Dodatkowe uwagi</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wstępny etap aktywacji PCR</td>
 <td>15 min</td>
 <td>95 °C</td>
 <td>Aktywacja HotStartTaq DNA Polymerase</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cykl 3-etapowy: Denaturacja</td>
 <td>30 sec</td>
 <td>94 °C</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Przyłączanie (Annealing)</td>
 <td>30 sec</td>
 <td>60 °C 
 56 °C</td>
 <td>Dla DNA genomowego 
 Dla DNA konwertowanego siarczynem</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Elongacja</td>
 <td>30 sec</td>
 <td>72 °C</td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liczba cykli</td>
 <td>45</td>
 <td> </td>
 <td> </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Elongacja końcowa</td>
 <td>10 min</td>
 <td>72 °C</td>
 <td> </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 2. Specyfikacje cyklu PCR.

Pirosekwencjonowanie to wszechstronna technika, która ułatwia sekwencjonowanie genomu drobnoustrojów, które może być używane do identyfikacji gatunków bakterii, rozróżniania szczepów bakteryjnych i wykrywania mutacji genetycznych, które nadają odporność na środki przeciwdrobnoustrojowe. W tym filmie zostanie zademonstrowana procedura generowania amplikonów drobnoustrojów, pirosekwencjonowania amplikonów i analizy sekwencji DNA.

Pirosekwencjonowanie w celu identyfikacji i charakterystyki drobnoustrojów

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest identyfikacja bakterii poprzez analizę sekwencji 16 s rybosomalnego DNA z wykorzystaniem metody pirosekwencjonowania. Osiąga się to najpierw poprzez amplifikację docelowego DNA w reakcji łańcuchowej polimerazy z użyciem biotynilowanego primera. Następnie biotynilowany amplikon jest unieruchamiany za pomocą kulek spheros pokrytych streptawidyną i oczyszczany przy użyciu buforów płuczących.Następnie amplikon poddawany jest denaturacji, a do pojedynczych nici DNA przyłączane są primery do sekwencjonowania 16 s rRNA. Celem tego etapu jest przygotowanie DNA do sekwencjonowania. W ostatnim kroku zachodzi reakcja sekwencjonowania DNA metodą pirosekwencjonowania, która jest szybką i dokładną metodą sekwencjonowania kwasów nukleinowych opartą na zasadzie sekwencjonowania poprzez syntezę.Biotynilowany alikon służy jako matryca dla polimerazy DNA do włączania dNTPs po jednej zasadzie na raz, co prowadzi do powstania pirofosforanu. ATP sulfurylaza proporcjonalnie przekształca pirofosforan w ATP; ATP katalizuje konwersję lucyferyny do lucyferazy za pośrednictwem lucyferazy, co generuje światło proporcjonalne do ilości ATP. Światło jest rejestrowane jako pik na wykresie pirosekwencjonowania i wskazuje na włączenie nukleotydu. Niewłączone dNTPs są degradowane przez apirazy przed dodaniem kolejnego dNTP w celu kontynuacji syntezy.Sygnał chemiluminescencyjny rejestrowany przez program pozwala na wyznaczenie sekwencji DNA. Otrzymane wyniki to sekwencje rybosomalnego 16S DNA, które są wykorzystywane do identyfikacji bakterii poprzez porównanie z referencyjną bazą danych rybosomalnego DNA. Sekwencjonowanie pirosekwencyjne jest wszechstronną techniką, która ułatwia sekwencjonowanie genomów mikrobiologicznych i może być stosowana do identyfikacji gatunków bakterii, rozróżniania szczepów bakteryjnych oraz wykrywania mutacji genetycznych nadających oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe.W niniejszym filmie zostanie zaprezentowana procedura generowania amplikonów bakteryjnych, pirosekwencjonowania amplikonów oraz analizy sekwencji DNA. Aby rozpocząć procedurę amplifikacji matrycy, należy rozmrozić wszystkie wymagane roztwory i dokładnie je wymieszać. Wszystkie czynności można wykonywać w temperaturze pokojowej. Przygotować reakcję PCR zgodnie z poniższą tabelą.Należy pamiętać, że końcowe stężenie chlorku magnezu wynoszące 1,5 millimolar zapewni satysfakcjonujące wyniki w większości przypadków. Jeśli jednak wymagane jest wyższe stężenie magnezu, do reakcji można dodać do 3,5 mikrolitrów 25 millimolarnego chlorku magnezu. Jeden starter musi być biotynilowany na końcu pięć prim, a zaleca się, aby starter był dokładnie oczyszczony metodą HPLC.Wymieszać mieszaninę reakcyjną, delikatnie pipetując ją w górę i w dół, a następnie rozdzielić odpowiednie objętości do probówek PCR. Następnie do każdej probówki PCR dodać matrycowe DNA. Zaleca się użycie 10 nanograms DNA genomicznego na reakcję.Umieść probówki PCR w termocyklerze i uruchom program cykli przed przygotowaniem mieszaniny głównej (master mix). Zamieszaj butelkę z kuleczkami strep avid oraz kuleczkami powleczonymi seros, aby zapewnić jednorodną zawiesinę. Przygotuj mieszaninę główną zgodnie z tym schematem.Łączenie kulek, buforu wiążącego i wody o wysokiej czystości w probówce do mikrocentryfugi. W zależności od objętości użytego produktu PCR, do każdej studzienki płytki PCR należy odmierzyć od 60 do 75 µL master mixu, tak aby całkowita objętość wynosiła 80 µL na studzienkę. Do każdej studzienki należy dodać od 5 do 20 µL biotynilowanego produktu PCR.Objętość w każdej studzience powinna teraz wynosić 80 µL. Zamknij studzienki zakrętkami paskowymi i inkubuj płytkę PCR przy 1 400 RPM przez 5 do 10 minut w temperaturze pokojowej, używając wytrząsarki orbitalnej. Rozpocznij tę procedurę od rozcieńczenia starterów sekwencyjnych do stężenia 0,3 µM w buforze annealingowym i naniesienia 25 µL do każdej studzienki płytki reakcyjnej.Umieść płytkę na stacji próżniowej. Napełnij korytka stacji zgodnie z poniższym schematem: 50 milliliters 70% ethanol w pierwszym korytku, 40 milliliters roztworu denaturującego w drugim korytku, 50 milliliters buforu płuczącego w trzecim korytku, 50 milliliters wody wysokiej czystości w czwartym korytku oraz 70 milliliters wody wysokiej czystości w piątym korytku.Włącz pompę próżniową i upewnij się, że przełącznik na narzędziu próżniowym jest ustawiony w pozycji włączonej, a następnie przepłucz sondy filtra wodą o wysokiej czystości. W korycie pięć umieść na stacji roboczej płytkę PCR z kuleczkami, dbając o to, aby zarówno płytka PCR, jak i płytka reakcyjna były ustawione w tej samej orientacji. Opuść narzędzie próżniowe do dołków płytki PCR.Przez 20 sekund lub do czasu odessania całej objętości, koraliki zostaną uwięzione przez narzędzie próżniowe przy wciąż włączonej próżni. Przepłucz narzędzie 70% etanolem przez 20 sekund lub do czasu odessania całej objętości. Następnie przepłucz narzędzie roztworem do denaturacji przez 20 sekund lub do czasu odessania całej objętości.Następnie płucz narzędzie buforem do płukania przez 20 sekund lub do momentu odessania całej objętości przy wciąż włączonej pompie próżniowej. Unieś narzędzie próżniowe powyżej 90 stopni pionowo na pięć sekund, aby umożliwić całkowite spłynięcie cieczy z narzędzia. Teraz wyłącz pompę i ustaw narzędzie próżniowe w linii z trzecią płytką reakcyjną.Opuść narzędzie próżniowe do dołków. Następnie delikatnie potrząśnij nim z boku na bok przez około 10 sekund, aby uwolnić kuleczki do dołków zawierających starter sekwencjonujący. Umieść narzędzie próżniowe w kuwecie z wodą w celu oczyszczenia, aby umożliwić przyłączenie startera sekwencjonującego do DNA.Umieść płytkę reakcyjną w podgrzewaczu do płytek. Podgrzewaj płytkę w temperaturze 80°C przez dwie minuty. Wyjmij płytkę z uchwytu i odstaw ją na blat, aby schłodziła się do temperatury pokojowej przez pięć minut.Rozpocznij tę procedurę od włączenia instrumentu za pomocą przełącznika zasilania znajdującego się nad kablem zasilającym, aby określić wymagane objętości. Utwórz plik pomiaru w oprogramowaniu instrumentu, a następnie w menu narzędzi wybierz informacje przed uruchomieniem. Napełnij kartridż zgodnie z instrukcjami podanymi na stronie informacji przed uruchomieniem.Wprowadź końcówkę pipety w róg każdego dołka tak głęboko, jak to możliwe, upewniając się, że nie powstały pęcherzyki powietrza. Otwórz bramkę kasety i włóż kasetę etykietą skierowaną do przodu. Upewnij się, że kaseta została prawidłowo włożona, a następnie zamknij bramkę.Otwórz ramkę mocującą płytkę i umieść płytkę reakcyjną wewnątrz instrumentu. Zamknij ramkę mocującą płytkę oraz pokrywę instrumentu. Włóż do portu USB z przodu urządzenia pamięć USB z plikami serii stworzonymi w oprogramowaniu instrumentu.Należy zatwierdzić menu z wybranymi plikami uruchamiającymi. Użyj strzałek przewijania, aby wybrać odpowiedni plik uruchamiający, a następnie naciśnij przycisk wyboru. Po osiągnięciu wszystkich zaprogramowanych poziomów ciśnienia i temperatury, instrument rozpocznie dozowanie odczynników w trakcie cyklu.Ekran urządzenia wyświetla w czasie rzeczywistym pirogram wybranej studzienki. Aby przejrzeć pirogramy innych studzienek, należy użyć strzałek przewijania. Gdy urządzenie potwierdzi zakończenie analizy i zapisanie pliku z wynikami na pamięci USB, należy nacisnąć przycisk zamknięcia.Wyjmij pendrive. Tutaj przedstawiono wyniki typowego przebiegu sekwencjonowania piro. Forwardowe i reverse'owe primery PCR są zaprojektowane dla konserwowanych regionów matrycy DNA, którą jest sekwencja rybosomalna 16 s.W tym przykładzie starter sekwencyjny jest umieszczony bezpośrednio powyżej dobrze scharakteryzowanej, identyfikującej, hiperzmiennej sekwencji DNA w obrębie amplikonu zaznaczonego na niebiesko. Ta hiperzmienna sekwencja umożliwia identyfikację bakterii dla dużej liczby gatunków bakteryjnych; wykorzystując konserwatywny starter sekwencyjny jako wewnętrzną kontrolę jakości, można sprawdzić sekwencję DNA otaczającą region zmienny, aby upewnić się, że przeanalizowano prawidłowy region DNA. Oprogramowanie do sekwencjonowania pirosequencing umożliwia porównanie i dopasowanie wygenerowanej sekwencji do wewnętrznej bazy danych bakteryjnych sekwencji rybosomalnych w celu identyfikacji bakterii.Ponadto sekwencję można poddać analizie w celu zidentyfikowania mutacji nadających oporność na leki antybiotykowe. Na przykład analiza mutacji w genach rybosomalnych 23 s Helicobacter pylori ujawnia dwa wzorce mutacji, GAA lub GA, które nadają oporność na antybiotyki. Sekwencjonowanie pirosekwencyjne jest wszechstronną techniką, która ułatwia sekwencjonowanie genomów drobnoustrojów.Zalety sekwencjonowania pirochemicznego w zastosowaniach mikrobiologicznych obejmują szybki i niezawodny screening wysokoprzepustowy oraz dokładną identyfikację drobnoustrojów i mutacji w ich genomach. Ponadto metodologia sekwencjonowania pirochemicznego umożliwia analizę pełnej różnorodności genetycznej oporności na leki przeciwdrobnoustrojowe, w tym typowanie mutacji punktowych SNP, insercji i delecji, a także kwantyfikację wielu kopii genów, które mogą występować w niektórych wzorach oporności przeciwdrobnoustrojowej. Dziękujemy za obejrzenie tego filmu i życzymy powodzenia w eksperymentach z sekwencjonowania.

pyrosequencing-for-microbial-identification-and-characterization

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pyrosekwencja do identyfikacji i charakteryzacji drobnoustrojów

Pyrosequencing(R) jest jedną z najbardziej szczegółowych, a zarazem prostych metod stosowanych obecnie do analizy polimorfizmów. Metoda ta umożliwiła szybką i efektywną ocenę polimorfizmów pojedynczego nukleotydu, w tym wielu polimorfizmów o istotnym znaczeniu klinicznym. W materiale wyjaśniono technikę oraz metodologię Pyrosequencing.

Pirosekwencjonowanie: prosta metoda dokładnego genotypowania

Aktywna społeczność bakteryjna związana z jelitami Spodoptera littoralis, została określona przez sondowanie stabilnymi izotopami (SIP) sprzężone z pirosekwencjonowaniem. Korzystając z tej metodologii, identyfikacja metabolicznie aktywnych gatunków bakterii w społeczności została przeprowadzona z wysoką rozdzielczością i precyzją.

Identyfikacja metabolicznie aktywnych bakterii w jelicie ogólnego Spodoptera littoralis za pomocą sondowania stabilnych izotopów DNA przy użyciu 13C-glukozy

Scharakteryzowanie społeczności mikrobiologicznej było od dawna celem w mikrobiologii środowiskowej. Metody sekwencjonowania nowej generacji pozwalają obecnie na scharakteryzowanie społeczności drobnoustrojów na niespotykanej dotąd głębokości przy minimalnych kosztach i nakładzie pracy. Szczegółowo opisujemy tutaj nasze podejście do sekwencjonowania bakteryjnych genów rybosomalnego RNA 16S za pomocą sekwenatora laboratoryjnego.

Sekwencjonowanie nowej generacji amplikonów genu rybosomalnego RNA 16S

Laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana matrycą spektrometria mas lotu (MALDI-TOF MS) oraz techniki molekularne (sekwencjonowanie genów 16S rRNA) pozwalają na identyfikację rzadkich patogenów bakteryjnych w rutynowej diagnostyce. Celem tego protokołu jest połączenie obu technik, co prowadzi do dokładniejszych i bardziej wiarygodnych danych.

Identyfikacja rzadkich patogenów bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA i MALDI-TOF MS

Opisujemy wydajną, solidną i opłacalną metodę ekstrakcji kwasu nukleinowego z wymazów w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania amplikonów genu 16S rRNA. Metoda ta pozwala na zastosowanie wspólnego podejścia do przetwarzania wielu typów próbek i uwzględnia szereg dalszych procesów analitycznych.

Wydajna ekstrakcja kwasów nukleinowych i sekwencjonowanie genu 16S rRNA w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy, ustandaryzowany protokół wysokoprzepustowego sekwencjonowania 16S rRNA-amplikon. Protokół wprowadza zintegrowany, ujednolicony, wykonalny i niedrogi protokół, począwszy od pobierania próbek kału poprzez analizę danych. Protokół ten umożliwia analizę dużej liczby próbek z zachowaniem rygorystycznych norm i kilkoma kontrolami.

Protokół z przewodnikiem do charakterystyki drobnoustrojów kałowych za pomocą sekwencjonowania amplikonów 16S rRNA

Przedstawiamy proces izolacji, rozmnażania i charakteryzowania bakterii rozkładających węglowodory z siedlisk wodnych. W protokole opisano izolację bakterii, identyfikację metodą 16S rRNA oraz badanie ich potencjału degradacji węglowodorów. Ten artykuł pomoże naukowcom w scharakteryzowaniu różnorodności biologicznej drobnoustrojów w próbkach środowiskowych, a w szczególności w badaniach przesiewowych pod kątem drobnoustrojów o potencjale bioremediacji.

Izolacja, rozmnażanie i identyfikacja gatunków bakterii o właściwościach metabolizowania węglowodorów z siedlisk wodnych

Testy pirosekwencjonowania umożliwiają solidne i szybkie genotypowanie polimorfizmów pojedynczego nukleotydu mitochondrialnego DNA w heteroplazmatycznych komórkach lub tkankach.

Genotypowanie polimorfizmów pojedynczych nukleotydów w genomie mitochondrialnym metodą pirosekwencjonowania

Obecny artykuł ma na celu dostarczenie szczegółowych i adekwatnych protokołów do izolacji grzybów endofitycznych związanych z roślinami, długoterminowego przechowywania izolatów, charakterystyki morfologicznej i całkowitej ekstrakcji DNA w celu późniejszej identyfikacji molekularnej i analiz metagenomicznych.

Izolacja, charakterystyka i całkowita ekstrakcja DNA w celu identyfikacji grzybów endofitycznych w roślinach mykoheterotroficznych

Użycie specyficznych glikozydaz do usuwania cukrów z glikoprotein, a następnie przeprowadzenie elektroforezy SDS-PAGE, jest cenną metodą wykrywania modyfikacji glikanowych w próbkach białek i stanowi dobry wybór do wstępnych badań z zakresu glikobiologii. Zmiany występujące po deglikozylacji można wykryć jako przesunięcia w mobilności w żelu lub poprzez barwienie odczynnikami wrażliwymi na glikany.

Identyfikacja i charakterystyka glikozylacji białek przy użyciu specyficznych endo- i egzoglikozydaz

Poznaj metodę pirosekwencjonowania do identyfikacji bakterii i wykrywania mutacji genetycznych oporności na antybiotyki. Technika ta umożliwia szybkie i precyzyjne sekwencjonowanie DNA mikroorganizmów.

Pirosekwencjonowanie w celu identyfikacji i charakterystyki drobnoustrojów

Przeglądaj więcej filmów