Pirosekwencjonowanie w celu identyfikacji i charakterystyki drobnoustrojów

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest identyfikacja bakterii poprzez analizę sekwencji 16 s rybosomalnego DNA przy użyciu metodologii sekwencjonowania pirotechnicznego. Osiąga się to poprzez amplifikację docelowego DNA w drodze reakcji łańcuchowej polimerazy przy użyciu biotynylowanego startera. Biotynylowany amplikon jest następnie unieruchamiany za pomocą kulek sferologicznych pokrytych streptawidyną i oczyszczany za pomocą do płukania.

Następnie amplikon jest denaturowany, a 16-s startery sekwencjonowania rybosomalnego są ELL do pojedynczych nici DNA. Celem tego etapu jest przygotowanie DNA do sekwencjonowania. Wreszcie reakcja sekwencjonowania DNA odbywa się za pomocą sekwencjonowania pirotechnicznego, szybkiej i dokładnej metody sekwencjonowania kwasów nukleinowych opartej na zasadzie sekwencjonowania przez syntezę.

Biotynylowany alion jest używany jako matryca przez polimerazę DNA do włączania DN TPS po jednej zasadzie na raz, co prowadzi do wytworzenia pirofosforanu. Sulaza TP proporcjonalnie przekształca pirofosforan w A-T-P-A-T-P katalizuje konwersję Lucyfera do Lucyfera za pośrednictwem lucyferazy, która generuje światło proporcjonalne do ilości TP. Światło jest rejestrowane jako pik na śladzie pirotechnicznym i wskazuje na inkorporację nukleotydów. Nieinkorporowane DN NTP są degradowane przez apras przed dodaniem następnego DNTP w celu kontynuacji syntezy.

Sygnał chemiluminescencyjny zapisany na rogramie pozwala na określenie sekwencji DNA. Uzyskane wyniki to rybosomalne sekwencje 16 SDNA, które służą do identyfikacji bakterii poprzez porównanie z referencyjną bazą danych rybosomalnego DNA. Sekwencjonowanie pirologiczne jest wszechstronną techniką, która ułatwia sekwencjonowanie genomu drobnoustrojów i może być stosowana do identyfikacji gatunków bakterii, rozróżniania szczepów bakteryjnych i wykrywania mutacji genetycznych, które nadają oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe.

W tym filmie zostanie zademonstrowana procedura generowania amplikonów bakteryjnych, sekwencjonowania pirologicznego amplikonów i analizy sekwencji DNA Aby rozpocząć procedurę amplifikacji matrycy, rozmrozić wszystkie wymagane roztwory i dokładnie wymieszać każde z nich. Wszystkie prace można wykonać w temperaturze pokojowej. Ustaw reakcję PCR zgodnie z tą tabelą.

Należy pamiętać, że końcowe stężenie chlorku magnezu wynoszące 1,5 milimola zapewni zadowalające wyniki w większości przypadków. Jeśli jednak wymagane jest wyższe stężenie magnezu do 3,5 mikrolitra 25 milimolów, do reakcji można dodać chlorek magnezu. Jeden starter musi być biotynylowany na jego pięciu głównych końcach i zaleca się, aby starter został dokładnie oczyszczony HPLC.

Wymieszaj mieszaninę reakcyjną, delikatnie pipetując w górę i w dół, a następnie dozuj odpowiednie objętości do probówek PCR. Następnie dodaj matrycę DNA do każdej probówki PCR. Zalecane jest 10 nanogramów genomowego DNA na reakcję.

Umieść probówki PCR w cyklerze i rozpocznij ten program cykliczny przed przygotowaniem mieszanki głównej. Zakręć butelką paciorkowców i powlekanych perełków serio, aby zapewnić jednorodną zawiesinę. Wykonaj mieszankę wzorcową zgodnie z tym schematem blokowym.

Połączenie kulek, bufora wiążącego i wody o wysokiej czystości w mikroprobówce wirówkowej. W zależności od objętości użytego produktu PCR, dozuje się od 60 do 75 mikrolitrów mieszanki wzorcowej do każdego dołka płytki PCR, tak aby całkowita objętość wynosiła 80 mikrolitrów na studzienkę. Dodaj od pięciu do 20 mikrolitrów biotynylowanego produktu PCR do każdej studzienki.

Objętość na studzienkę powinna teraz wynosić 80 mikrolitrów. Uszczelnij studzienki nakrętkami paskowymi i mieszaj płytkę PCR przy 1 400 obr./min przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej za pomocą wytrząsarki orbitalnej. Rozpocznij tę procedurę od rozcieńczenia starterów sekwencjonowania do 0,3 mikromola za pomocą buforu klęczącego i dozowania 25 mikrolitrów do każdej studzienki płytki reakcyjnej.

Umieść płytkę na stacji roboczej odkurzacza. Napełnij koryta stanowiska pracy zgodnie z tym schematem. 50 mililitrów 70% etanolu w jednym korycie, 40 mililitrów roztworu denaturacyjnego w drugim, 50 mililitrów buforu płuczącego w trzech, 50 mililitrów wody o wysokiej czystości w korycie czwartym i 70 mililitrów wody o wysokiej czystości w korycie piątym.

Włącz pompę próżniową i upewnij się, że przełącznik na narzędziu próżniowym jest ustawiony w pozycji włączonej przepłukiwania sond filtra wodą o wysokiej czystości. W dołku piątym umieść płytkę PCR z koralikami na stacji roboczej, upewniając się, że zarówno płytki PCR, jak i płytki reakcyjne są w tej samej orientacji. Opuść narzędzie próżniowe do zagłębień płytki PCR.

Przez 20 sekund lub do momentu, gdy cała objętość zostanie zassana, kulki będą przechwytywane przez narzędzie próżniowe, gdy próżnia jest nadal włączona. Przepłucz narzędzie 70% etanolem przez 20 sekund lub do momentu, gdy cała objętość zostanie zassana. Następnie przepłucz narzędzie roztworem denaturacyjnym przez 20 sekund lub do momentu, gdy cała objętość zostanie zassana.

Następnie przepłucz narzędzie buforem myjącym przez 20 sekund lub do momentu, gdy cała objętość zostanie zassana, gdy próżnia jest nadal włączona. Podnieś narzędzie próżniowe powyżej 90 stopni w pionie na pięć sekund, aby umożliwić spuszczenie całego płynu z narzędzia próżniowego. Teraz wyłącz pompę i wyrównaj narzędzie próżniowe z trzema płytkami reakcyjnymi.

Opuść narzędzie próżniowe do studzienek. Następnie delikatnie potrząsaj z boku na bok przez około 10 sekund, aby uwolnić kulki do studzienek zawierających starter sekwencyjny. Umieść narzędzie próżniowe w korycie wodnym w celu oczyszczenia, aby zneutralizować starter sekwencjonujący do DNA.

Umieścić płytkę reakcyjną w uchwycie na rozgrzaną płytkę. Podgrzej talerz w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Wyjmij talerz z uchwytu i umieść go na blacie, aby schłodził go w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Rozpocznij tę procedurę od włączenia przyrządu za pomocą wyłącznika zasilania znajdującego się nad przewodem zasilającym, aby określić potrzebne głośności. Skonfiguruj plik uruchamiania w oprogramowaniu instrumentu i w menu narzędzi wybierz informacje przed uruchomieniem. Napełnij kasetę zgodnie z instrukcjami podanymi na stronie informacyjnej przed uruchomieniem.

Umieść końcówkę pipety w rogu każdej studzienki tak głęboko, jak to możliwe, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Otwórz zasuwę naboju i włóż wkład etykietą skierowaną do przodu. Upewnij się, że wkład jest prawidłowo włożony i zamknij drzwiczek.

Otwórz ramkę mocującą płytkę i umieść płytkę reakcyjną wewnątrz instrumentu. Zamknij ramkę mocującą płytę i pokrywę instrumentu. Włóż pamięć USB z plikami uruchamiania utworzonymi za pomocą oprogramowania urządzenia do portu USB z przodu prasy do przyrządu.

W porządku, aby zobaczyć menu żądanych plików uruchamiania. Użyj strzałek przewijania, aby wybrać żądany plik uruchamiania i naciśnij przycisk Wybierz. Po osiągnięciu wszystkich ustawionych poziomów ciśnienia i temperatury, przyrząd rozpocznie dozowanie odczynników podczas pracy.

Ekran przyrządów wyświetla pirotechnikę wybranego odwiertu w czasie rzeczywistym. Użyj strzałek przewijania, aby zobaczyć Pyro z innych studni. Gdy przyrząd potwierdzi, że przebieg został zakończony, a plik przebiegu został zapisany na pamięci USB, naciśnij przycisk Zamknij.

Odłącz pamięć USB. Wyniki typowego sekwencjonowania pirotechniki są pokazane tutaj. Startery PCR do przodu i do tyłu są przeznaczone dla konserwatywnych regionów matrycy DNA, którą jest sekwencja rybosomalna 16 s.

W tym przykładzie starter sekwencjonowania jest umieszczony bezpośrednio przed dobrze scharakteryzowaną identyfikującą hiperzmienną sekwencją DNA w amplikonie pokazanym na niebiesko. Ta hiperzmienna sekwencja pozwala na identyfikację dużej liczby gatunków bakterii przy użyciu konserwatywnego startera sekwencjonowania jako wewnętrznej kontroli jakości, sekwencja DNA obejmująca zmienny region może być sprawdzona, aby upewnić się, że przeanalizowano właściwy region DNA. Oprogramowanie do sekwencjonowania pirotechnicznego pozwala na porównanie i dopasowanie wygenerowanej sekwencji do wewnętrznej bazy danych sekwencji rybosomalnych bakterii w celu identyfikacji bakterii.

Ponadto sekwencja może być analizowana w celu określenia mutacji, które nadają oporność na antybiotyki. Na przykład analiza mutacji w 23 genach rybosomalnych Helicobacter pylori ujawnia dwa wzorce mutacji, GAA lub GA, które nadają oporność na antybiotyki. Sekwencjonowanie pirologiczne to wszechstronna technika, która ułatwia sekwencjonowanie genomu drobnoustrojów.

Zalety sekwencjonowania pirologicznego w zastosowaniach mikrobiologicznych obejmują szybkie i niezawodne badania przesiewowe o wysokiej przepustowości oraz dokładną identyfikację drobnoustrojów i mutacji genomu drobnoustrojów. Ponadto metodologia sekwencjonowania pirologicznego może analizować pełną różnorodność genetyczną oporności na leki przeciwdrobnoustrojowe, w tym typowanie mutacji punktowych SNP, insercji i delecji, a także kwantyfikację wielu kopii genów, które mogą wystąpić w niektórych wzorcach oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Dziękujemy za obejrzenie tego filmu i życzymy powodzenia w eksperymentach sekwencjonowania.