Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest porównanie migawek profili metabolicznych różnych grup próbek biologicznych. Osiąga się to poprzez zastosowanie ekstrakcji cieczą, cieczą w celu oddzielenia cząsteczek organicznych i polarnych. W drugim etapie cząsteczki są dalej rozdzielane za pomocą chromatografii cieczowej i analizowane za pomocą spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości, która dostarcza danych o czasie retencji, stosunku masy do ładunku i intensywności do dalszej analizy.

Następnie przebiegi chromatografii cieczowej są wyrównywane, a cechy są wykrywane, określane ilościowo i sortowane. W celu zidentyfikowania zróżnicowanych cech obfitości między grupami. Wyniki pokazują różnice w cechach w różnych warunkach leczenia w oparciu o zróżnicowaną obfitość analitów wykrytych za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości.

Chociaż metoda ta może być stosowana do badania metabolizmu komórkowego, może również zapewnić wgląd w odkrywanie biomarkerów lub metabolizm biotyczny zenona. W przypadku linii przylegających dodaj 1,5 mililitra pożywki do komórek na 10-centymetrowej płytce. Umieść talerz na lodzie i delikatnie zeskrob, aby podnieść komórki.

Przenieś 1,5 mililitra zawiesiny podniesionych komórek do wstępnie oznakowanej szklanej probówki wirówkowej o pojemności 10 mililitrów. Następnie dodaj sześć mililitrów metanolu chloroformowego do każdego z 10-mililitrowych szklanych probówek zawierających próbki. Potrząsać próbkami z małą prędkością przez 30 minut Po wstrząśnięciu odwirować próbki z niskim stopniem zwalniania przyspieszenia na poziomie 1 935 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby całkowicie oddzielić fazy za pomocą pipety do pastwiska z długim trzpieniem.

Przenieś warstwę organiczną do nowej, wstępnie oznakowanej szklanej probówki wirówkowej o pojemności 10 mililitrów. Następnie przenieś warstwę wodną do czystej plastikowej dwumililitrowej rurki einor. W tym momencie odparować próbki organiczne i wodne w gazowym azocie.

Rozpuść wysuszone próbki w 50 do 100 mikrolitrach roztworu wyjściowego dla żądanej metody UPLC. Delikatnie pipetować próbkę w górę i w dół, aby pomóc w rozpuszczeniu analitów. Następnie przenieś każdą próbkę do filtra z rurką nylonową o grubości 0,22 mikrona i wiruj do 14 000 razy G przez około pięć minut, aż próbka całkowicie przejdzie przez filtr.

Sprawdzić próbkę, aby upewnić się, że nie pozostały w niej żadne widoczne osady. Przenieść supernatant przefiltrowanej próbki do wstępnie znakowanej fiolki z UPLC z nakrętką umieszczoną w fiolce. Następnie strzepnij go, aby usunąć wszelkie pęcherzyki z dna fiolki z próbką.

Umieścić próbkę w próbniku schłodzonych automatów. Teraz utwórz serię dla próbki organicznej za pomocą oprogramowania sterującego chromatografem cieczowym. Następnie utwórz serię dla próbki organicznej w oparciu o zoptymalizowane warunki UPLC.

Użyj zoptymalizowanych warunków UPLC, aby stworzyć metodę również dla fazy wodnej. Jeśli znany zestaw docelowych analitów cieszy się dużym zainteresowaniem, zoptymalizuj warunki UPLC za pomocą mocno znakowanego analogu tych związków i wygeneruj metodę. Korzystając z tych warunków, pozwól UPLC na odpowiednią równowagę.

Powinno to obejmować pełne zalewanie rozpuszczalników Przed podłączeniem kolumny i postępowaniem zgodnie ze wskazówkami producenta dotyczącymi objętości równoważącej nowej kolumny, należy prowadzić dziennik początkowych ciśnień wstecznych, aby pomóc zdiagnozować przyszłe problemy za pomocą oprogramowania sterującego spektrometrem mas o wysokiej rozdzielczości. Utwórz metodę trybu pozytywnego. Następnie, używając tych samych warunków, utwórz metodę trybu ujemnego.

Wyczyść i skalibruj przyrząd. Wprowadzić stabilny strumień do spektrometru i dać czas na odpowiednie rozproszenie roztworu kalibracyjnego ze źródła i układu optycznego. Akceptowalna stabilność rozpylonej cieczy powinna dawać od trzech do 5% względnego odchylenia standardowego intensywności w ciągu co najmniej 100 skanów z wstrzyknięciem roztworu kalibracyjnego przy tym samym natężeniu przepływu, co stosowana metoda lc.

Korzystając z generatora liczb losowych i klucza, należy ustawić próbki w sposób losowy, aby uniknąć jakichkolwiek efektów wsadowych spowodowanych analizą. Ustaw sekwencję dla wszystkich próbek. Ustawić odpowiednią objętość iniekcji i uruchomić ślepą próbę przed pierwszą próbką.

Jeśli podejrzewa się przenoszenie lub efekty matrycy między próbkami, należy przeprowadzić odpowiednie ślepe próby lub płukania, rozpocząć sekwencję i okresowo monitorować problemy, w tym wahania ciśnienia lub utratę intensywności sygnału w całym przebiegu. Jeśli zostaną wykryte poważne problemy, przerwij bieg. Wyczyść i skalibruj przyrząd.

Wprowadzić stabilny strumień do spektrometru i dać czas na odpowiednie rozproszenie roztworu kalibracyjnego ze źródła i układu optycznego. Przed rozpoczęciem analizy różnicowej należy ręcznie sprawdzić całkowite prądy jonowe lub spojrzeć na przefiltrowane chromatogramy dla dowolnego znanego związku w próbce. Aby zapewnić powtarzalność przebiegów i stabilność rozpylania UPLC po ukośnieniu we wszystkich próbkach, należy przenieść pliki danych RAW ze spektrometru masowego na dysk twardy stacji roboczej, na której zainstalowane jest sito.

Otwórz sito. Rozpocznij nowy eksperyment i załaduj odpowiednie pliki do sita. Przypisz grupy porównań i wybierz pojedynczy plik referencyjny, aby umożliwić SIE V wygenerowanie parametrów do analizy.

Postępuj zgodnie z instrukcjami i dostosuj dowolne parametry zgodnie z wymaganiami danego eksperymentu. Załaduj poprawną listę adduktów dla trybu dodatniego lub ujemnego w parametrach. Po zakończeniu analizy sprawdź, czy na ekranie została wypełniona lista klatek.

Upewnij się, że wyrównanie lc nakłada się na wszystkie szczyty punktów orientacyjnych. Jeśli którykolwiek z niewyrównanych przebiegów lc wykazuje duże odchylenie szczytów punktów orientacyjnych. Może to wskazywać na problem z próbką.

Wykreśl dane według współczynnika zmienności w podobnej populacji próby. Posortuj listę na podstawie pożądanych cech. Następnie sprawdź każdy pik pod kątem odpowiedniego wyrównania pików w grupach.

Całkowanie pików, Gauss, natężenie sygnału kształtu piku, izotopy i przypisanie adduktów. Eksportuj dane zgodnie z potrzebami do dalszej analizy lub do wygenerowania docelowych list masowych w celu potwierdzenia i MS do końca eksperymentów. Duża liczba trafień została zidentyfikowana przez dwa programy używane do różnicowania zielonych kropek, które są cechami bardziej obfitymi w kontroli, podczas gdy czerwone kropki są bardziej obfite w leczeniu.

Większy rozmiar kropki wskazuje na zwiększoną wielkość zmiany zagięcia między grupami, a intensywność koloru wykazuje malejącą wartość P wraz ze wzrostem nasycenia obrazu. Oto chromatogramy przedstawiające tryb jonów dodatnich w fazie organicznej, UPLC MS Okno analizy A pokazuje całkowity prąd jonowy z S Civ 2.0. Chromatogram jonów wyekstrahowanych dla cechy zidentyfikowanej przez XCMS jako D paneth jest wyświetlany w oknie B. W oknie C wyświetlany jest chromatogram jonów wyekstrahowanych dla cechy zidentyfikowanej jako zgnilizna znana z sve.

Okno D pokazuje wyekstrahowany chromatogram jonowy dla cechy zidentyfikowanej jako zgnilizna znana z sve znormalizowanej do całkowitego prądu jonowego. Różnorodnie występująca cecha zmniejszona w grupie leczonej zgnilizną została wstępnie zidentyfikowana jako d panadine przez dokładne masowe przeszukiwanie bazy danych. Tożsamość analitu potwierdzono za pomocą tandemowej spektrometrii mas U-P-L-C-H-R.

Pokazano tutaj porównanie chromatogramów i widm masowych próbki i czystego związku. Nie zapominaj, że praca z chloroformem może być bardzo niebezpieczna i należy przestrzegać odpowiednich środków ostrożności, takich jak dobrze wentylowany wyciąg.