Name: Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Poznaj nieukierunkowaną metabolomikę z próbek biologicznych przy użyciu ekstrakcji ciecz-ciecz oraz UPLC-HRMS. Ta metoda umożliwia kompleksowe profilowanie metabolitów i identyfikację różnic między grupami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Potwierdzamy wsparcie dla grantów NIH P30ES013508 i 5T32GM008076. Dziękujemy również firmie Thermo Scientific za dostęp do SIEVE 2.0 oraz doktorom Eugene'owi Ciccimaro i Markowi Sandersowi z Thermo Scientific za przydatne dyskusje.

1. Pobieranie próbek z komórek
<ol>
	<li>W przypadku 10-centymetrowej płytki z komórkami: zebrać 1,5 ml zawiesiny komórek podniesionych w pożywce do wstępnie oznakowanej szklanej probówki wirówkowej o pojemności 10 ml. W przypadku linii przylegających komórki należy unieść za pomocą delikatnego skrobania w 1,5 ml podłoża trzymanego na lodzie. Opcjonalnie: Jeśli używane są wzorce wewnętrzne, na tym etapie dodaj odpowiednią porcję. 
	 Komentarz: Wygaszenie metabolizmu komórkowego ma kluczowe znaczenie dla niektórych metabolitów. W przypadku analizy metabolitów wrażliwych na czas należy rozważyć takie procedury, jak ekstrakcja metanolem na zimno. 17</li>
	<li>Dodać 6 ml chloroformu (CHCl 3)/metanolu (CH3OH) (2:1, v/v) do każdej z 10 ml szklanych probówek zawierających próbki. Umieść próbki w wytrząsarce lub wielowirówce na niskich obrotach na 30 minut. Po wstrząśnięciu próbki są odwirowywane z niskim ustawieniem przyspieszenia/opóźnienia przy 1,935 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu całkowitego rozdzielenia faz. 
	Opcjonalnie: Aby uniknąć stosowania CHCl3, ekstrakcje można przeprowadzić za pomocą dichlorometanu (CH2Cl2). 18,12</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura z długim trzpieniem przenieś warstwę organiczną (dolną) do nowej, wstępnie oznakowanej szklanej probówki wirówkowej o pojemności 10 ml. Przejdź do punktu 4.1.</li>
	<li>Przenieś górną część roztworu wodnego do czystej plastikowej probówki Eppendorf o pojemności 2 ml. Odparować próbkę w atmosferze azotu gazowego. Przejść do ppkt 2.6.2 dla odsalania fazy wodnej lub do 4.1 dla analizy bezpośredniej.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja próbki z surowicy
<ol>
	<li>Przenieś 20 μl surowicy do plastikowej probówki Eppendorf o pojemności 2 ml. Opcjonalnie: Jeśli stosowane są wzorce wewnętrzne, na tym etapie należy dodać odpowiednią podwielokrotność.</li>
	<li>Dodać 190 μlCH3OH i wirować przez 10 sek.</li>
	<li>Dodać 380 μl CHCl3 i wirować przez 10 sekund.</li>
	<li>Dodać 120 μlH2O, aby wywołać separację faz. Wirować próbki przez 10 sekund i pozostawić do zrównoważenia w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu rozdzielenia faz.</li>
	<li>Przenieś dolną fazę organiczną do czystej plastikowej probówki Eppendorfa o pojemności 2 ml. Przejdź do punktu 4.1.</li>
	<li>Przenieś górną część roztworu wodnego do czystej plastikowej probówki Eppendorf o pojemności 2 ml. Odparować próbkę w atmosferze azotu gazowego.</li>
	<li>Ponownie zawiesić próbkę w 200 μl H2O. Odczynniki kwasowe lub zasadowe (0,1% kwas octowy, kwas mrówkowy lub 0,1% wodorotlenek amonu) mogą być stosowane do preferencyjnej ekstrakcji metabolitów wrażliwych na pH. Sonikować przez 20 minut na lodzie, aby ponownie całkowicie zawiesić próbkę.</li>
	<li>Aktywuj kolumny wirujące C18 za pomocą 500 μl CH3OH.</li>
	<li>Zrównoważyć kolumnę wirową dwoma płukaniami 500 μlH2O, a następnie naładować próbkę. Jeśli używane są odczynniki kwasowo-zasadowe, należy utrzymać to stężenie na etapach mycia.</li>
	<li>Przepłukać 500 μlH2Ow celu odsolenia próbki. Ponownie, jeśli używane są odczynniki kwasowo-zasadowe, utrzymuj to stężenie na etapach mycia.</li>
	<li>Elutę w dwóch objętościach po 200 μl 80% CH3OH w H2O do wstępnie oznakowanej, czystej probówki Eppendorfa o pojemności 2 ml. Ponownie, jeśli używane są odczynniki kwasowo-zasadowe, utrzymuj to stężenie na etapach mycia. Przejdź do punktu 4.1.</li>
</ol>
3. Pobieranie próbki z tkanki
<ol>
	<li>W zależności od tkanki należy użyć od 10 do 100 mg zamrożonej tkanki. Dodać cały kawałek tkanki do wstępnie oznakowanej probówki Eppendorfa o pojemności 2 ml o niskiej retencji z 1 ml PBS (1 M, pH 6,8) w łaźni lodowej. Opcjonalnie: Jeśli stosowane są wzorce wewnętrzne, dodaj go do buforu przed dodaniem tkanki.</li>
	<li>Homogenizuj tkankę w lodzie za pomocą elektrycznego młynka do tkanek przez 30 sekund w każdym Eppendorfie. Pomiędzy próbkami wyczyść młynek do tkanek w dwóch oddzielnych probówkach zawierających odpowiednioCH3OHiH2O.</li>
	<li>Przenieść homogenat tkankowy za pomocą plastikowej pipety do wstępnie oznakowanej szklanej probówki wirówkowej o pojemności 10 ml. Po przeniesieniu należy przepłukać każdą probówkę Eppendorfa 2x 1 mlCH3OH i dodać popłuczyny do homogenatu tkankowego w szklanych probówkach.</li>
	<li>Dodać 4 ml CHCl3 do każdej z 10 ml szklanych probówek zawierających homogenat tkankowy i przepłukaćCH3OH. Umieść próbki w wytrząsarce lub wielowirówce na niskich obrotach na 30 minut.</li>
	<li>Po wstrząśnięciu odwirować próbki przy niskim ustawieniu przyspieszenia/opóźnienia na poziomie 1,935 x g przez 10 minut, aby całkowicie oddzielić fazy. Opcjonalnie: Aby uniknąć stosowania chloroformu, ekstrakcje zostały opracowane z użyciem CH2Cl2.</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura z długim trzpieniem przenieś warstwę organiczną (dolną) do nowej, wstępnie oznakowanej szklanej probówki wirówkowej o pojemności 10 ml. Przejdź do punktu 4.1.</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura z długim trzpieniem przenieś warstwę wodną do nowej, wstępnie oznakowanej szklanej probówki wirówkowej o pojemności 10 ml. Przejdź do 2.6.2 w celu odsalania lub przejdź do 4.1.</li>
</ol>
4. Ponowne zawieszenie i filtracja próbek dla UPLC
<ol>
	<li>Odparować próbki w atmosferze azotu gazowego.</li>
	<li>Odtworzyć wysuszone próbki w odpowiedniej objętości roztworu wyjściowego dla pożądanej metody UPLC (patrz tabela 1). 50-100 μl to zwykle pożądana objętość do refuzji. Delikatnie przetrząsnąć próbkę i/lub pipetować ją w górę iw dół, aby pomóc w rozpuszczeniu analitów.</li>
	<li>Przenieść próbkę do filtra z rurką nylonową o grubości 0,22 μm i wirować z prędkością do 14 000 x g, aż próbka całkowicie przejdzie przez filtr (~5 min). Upewnij się, że w próbce nie pozostały żadne widoczne osady.</li>
	<li>Przenieść supernatant przefiltrowanej próbki do wstępnie znakowanej fiolki z UPLC z wkładką. Założyć nakrętkę na fiolkę, a następnie przesunąć fiolkę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki z dna fiolki z próbką. Umieścić próbkę w schłodzonym automatycznym podajniku próbek (4-5 °C).</li>
</ol>
5. Konfiguracja UPLC
<ol>
	<li>Korzystając z oprogramowania sterującego chromatografem cieczowym, należy utworzyć serię dla próbki organicznej w oparciu o warunki wymienione w tabeli 1. Następnie należy utworzyć metodę dla fazy wodnej w warunkach wymienionych w tabeli 1. Opcjonalnie: Jeśli znany zestaw docelowych analitów cieszy się dużym zainteresowaniem, zoptymalizuj warunki UPLC przy użyciu ciężko znakowanego analogu tych związków i wygeneruj metodę przy użyciu tych warunków.</li>
	<li>Pozwól, aby UPLC odpowiednio się zrównoważył. Powinno to obejmować pełne zalewanie rozpuszczalnikami przed dołączeniem kolumny i postępowanie zgodnie ze wskazówkami producenta dotyczącymi objętości równoważenia nowej kolumny (zwykle 3-5 objętości kolumny). Prowadź dziennik początkowych ciśnień wstecznych, aby pomóc w diagnozowaniu przyszłych problemów.</li>
</ol>
6. Ustawienia spektrometru masowego
<ol>
	<li>Korzystając z oprogramowania sterującego spektrometrem mas o wysokiej rozdzielczości, utwórz metodę w trybie dodatnim, stosując warunki wymienione w tabeli 2. Następnie, używając tych samych warunków, utwórz metodę trybu ujemnego. Opcjonalnie: Jeśli znany zestaw docelowych analitów cieszy się dużym zainteresowaniem, zoptymalizuj warunki źródła i optyki przy użyciu mocno znakowanego analogu tych związków i wygeneruj metodę przy użyciu tych warunków.</li>
	<li>Wyczyść i skalibruj przyrząd, umieść stabilny spray w spektrometrze i poczekaj, aż roztwór kalibracyjny odpowiednio rozproszy się od źródła i optyki. Akceptowalna stabilność rozpylonej cieczy powinna dawać 3-5% RSD intensywności przez co najmniej 100 skanów z wstrzyknięciem roztworu kalibracyjnego przy tym samym natężeniu przepływu, co stosowana metoda LC.</li>
	<li>Ustaw sekwencję dla wszystkich próbek, ustaw odpowiednią objętość wstrzyknięcia i uruchom ślepą próbę przed pierwszą próbką. W przypadku podejrzenia przeniesienia lub efektów matrycy między próbkami, należy przeprowadzić odpowiednie ślepe próby/płukania. Próbki powinny być ustawiane w sposób losowy przy użyciu generatora liczb losowych i klucza, aby uniknąć jakichkolwiek efektów wsadowych wprowadzanych przez analizę. 
	Komentarz: Próbki do kontroli jakości, w tym wzorce stabilnych izotopów lub wzorce analityczne prawdopodobnych celów, mogą być niezwykle cenne w rozwiązywaniu problemów i zapewnianiu wiarygodnych, odtwarzalnych i ważnych wyników. Techniczna replika próbki wzorcowej, po której następuje ślepa próba rozpuszczalnikowa, może być wykorzystana do uzyskania informacji o odchyleniach intensywności sygnału i czasu retencji, a także przeniesienia do serii ślepej próby.</li>
	<li>Rozpocznij sekwencję i okresowo monitoruj problemy, w tym wahania ciśnienia lub utratę intensywności sygnału w całym przebiegu. Jeśli zostaną wykryte poważne problemy, zatrzymaj bieg i powtórz od 6.2.</li>
</ol>
7. Analiza różnicowa
<ol>
	<li>Dla tego protokołu przedstawiono dwa przepływy pracy. Pierwszym z nich jest SIEVE 2.0, zastrzeżone oprogramowanie do analizy różnicowej bez etykiet, sprzedawane przez firmę Thermo Fisher. Drugi przepływ pracy odbywa się za pośrednictwem XCMS Online, bezpłatnej platformy udostępnianej przez Scripps Research Institute. 11 Przed rozpoczęciem analizy różnicowej należy ręcznie sprawdzić TIC lub spojrzeć na przefiltrowane chromatogramy dla dowolnego znanego związku w próbce, aby zapewnić odtwarzalność przebiegów i stabilność wtrysku/UPLC/rozpylania we wszystkich próbkach.</li>
	<li>sito
	<ol>
		<li>Przenieś .raw pliki danych ze spektrometru mas na dysk twardy stacji roboczej, na której zainstalowany jest SIEVE. (Uwaga: uruchamianie SIEVE z danymi przechowywanymi na dysku podłączonym do sieci lub przez port USB nie jest zalecane, ponieważ może to ograniczyć szybkość analizy).</li>
		<li>Otwórz SIEVE i rozpocznij nowy eksperyment.</li>
		<li>Załaduj odpowiednie pliki do SIEVE.</li>
		<li>Przypisz grupy porównań i wybierz pojedynczy plik referencyjny, aby umożliwić SIEVE wygenerowanie parametrów do analizy.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami i dostosuj dowolne parametry zgodnie z wymaganiami danego eksperymentu. Często zaleca się rozpoczęcie od rygorystycznych parametrów, a następnie powrót i poluzowanie parametrów, ponieważ bardziej hojne ustawienia mogą wydłużyć czas analizy.</li>
		<li>Załaduj poprawną listę adduktów dla trybu dodatniego lub ujemnego w parametrach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>XCMS w Internecie
	<ol>
		<li>Konwertuj pliki do formatu akceptowalnego dla XCMS Online. W naszym przypadku konwertujemy do formatu mzXML. Rozdział 19</li>
		<li>Otwórz XCMS Online i utwórz zadanie.</li>
		<li>Przekazywanie i nazywanie zestawów danych. Można przesłać tylko dwa zestawy danych (np. Kontrola i Leczenie), ponieważ samodzielny XCMS ogranicza się do bezpośrednich porównań.</li>
		<li>Wybierz żądane ustawienia z listy rozwijanej. Wstępnie wypełnione parametry są dostępne dla różnych konfiguracji oprzyrządowania i mogą być dalej modyfikowane na potrzeby eksperymentalne. W naszym przypadku używamy ustawień HPLC-Orbi2.</li>
		<li>Prześlij i potwierdź zadanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>analiza danych
	<ol>
		<li>W przypadku SIEVE i XCMS lista odpowiednio ramek i elementów zostanie wypełniona po zakończeniu analizy. Upewnij się, że wyrównanie LC nakłada się na wszystkie szczyty punktów orientacyjnych. Jeśli którykolwiek z niewyrównanych ciągów LC wykazuje duże odchylenie szczytów punktów orientacyjnych, może to wskazywać na problem z próbką. 
		Opcjonalnie: W przypadku SIEVE, jeśli stosowane są wzorce wewnętrzne, zlokalizuj odpowiednią grupę pików i znormalizuj do wybranej ramki. W przypadku XCMS On-line normalizację można przeprowadzić w arkuszu kalkulacyjnym po wyeksportowaniu.</li>
		<li>Należy wykreślić dane według współczynnika zmienności (CV) w obrębie podobnej populacji próby (np. prób kontrolnych). Wszelkie duże wartości CV mogą wskazywać na problem z jedną lub kilkoma próbkami. Posortuj listę na podstawie pożądanych cech (np. wartość p<0,05, zmiana krotności>1,5, niskie odchylenie standardowe w grupie itp.).</li>
		<li>Zbadaj każdy pik pod kątem odpowiedniego wyrównania pików w grupach, integracji pików, kształtu piku Gaussa, intensywności sygnału, izotopów i przypisania adduktów.</li>
		<li>Eksportuj dane zgodnie z potrzebami do dalszej analizy lub do generowania docelowych list masowych w celu potwierdzenia i eksperymentów MSn.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Pluskal, T., Nakamura, T., Villar-Briones, A., Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profiling+of+the+fission+yeast+S.+pombe%3A+quantification+of+compounds+under+different+temperatures+and+genetic+perturbation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Metabolic profiling of the fission yeast S. pombe: quantification of compounds under different temperatures and genetic perturbation.</a> Mol. Biosyst. 6 (1), 182-198 (2010).</li>
<li>Makarov, A., Denisov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+Evaluation+of+a+Hybrid+Linear+Ion+Trap%2FOrbitrap+Mass+Spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Performance Evaluation of a Hybrid Linear Ion Trap/Orbitrap Mass Spectrometer.</a> Analytical Chemistry. 78 (7), 2113-2120 (2006).</li>
<li>Timischl, B., Dettmer, K., Kaspar, H., Thieme, M., Oefner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative%2C+validated+capillary+electrophoresis-time+of+flight-mass+spectrometry+method+with+integrated+high-confidence+analyte+identification+for+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative, validated capillary electrophoresis-time of flight-mass spectrometry method with integrated high-confidence analyte identification for metabolomics.</a> Electrophoresis. 29 (10), 2203-2214 (2008).</li>
<li>Katajamaa, M., Oresic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+processing+for+mass+spectrometry-based+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Data processing for mass spectrometry-based metabolomics.</a> J. Chromatogr. A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).</li>
<li>Katajamaa, M., Oresic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+methods+for+differential+analysis+of+LC%2FMS+profile+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Processing methods for differential analysis of LC/MS profile data.</a> BMC Bioinformatics. 6, 179(2005).</li>
<li>Wilson, I. D., Nicholson, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+ultra+performance+liquid+chromatography+coupled+to+q-TOF+mass+spectrometry+as+a+tool+for+differential+metabolic+pathway+profiling+in+functional+genomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">High resolution ultra performance liquid chromatography coupled to q-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies.</a> Journal of Proteome Research. 4 (2), 591-598 (2005).</li>
<li>Benton, H. P., Wong, D. M., Trauger, S. A., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XCMS2%3A+processing+tandem+mass+spectrometry+data+for+metabolite+identification+and+structural+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">XCMS2: processing tandem mass spectrometry data for metabolite identification and structural characterization.</a> Anal. Chem. 80 (16), 6382-6389 (2008).</li>
<li>Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MZmine%3A+toolbox+for+processing+and+visualization+of+mass+spectrometry+based+molecular+profile+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data.</a> Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).</li>
<li>Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MZmine+2%3A+Modular+framework+for+processing%2C+visualizing%2C+and+analyzing+mass+spectrometry-based+molecular+profile+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data.</a> BMC Bioinformatics. 11 (1), 395(2010).</li>
<li>Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XCMS%3A+Processing+Mass+Spectrometry+Data+for+Metabolite+Profiling+Using+Nonlinear+Peak+Alignment%2C+Matching%2C+and+Identification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">XCMS: Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak Alignment, Matching, and Identification.</a> Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).</li>
<li>Tautenhahn, R., Patti, G. J., Rinehart, D., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XCMS+Online%3A+A+Web-Based+Platform+to+Process+Untargeted+Metabolomic+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 5035-5039 (2012).</li>
<li>Gelhaus, S. L., Mesaros, A. C., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Lipid+Extraction+for+Targeted+Stable+Isotope+Dilution+Liquid+Chromatography-Mass+Spectrometry+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis.</a> J. Vis. Exp. (57), e3399(2011).</li>
<li>Want, E. J., Wilson, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+metabolic+profiling+procedures+for+urine+using+UPLCG%C3%87%C3%B4MS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Global metabolic profiling procedures for urine using UPLCGÇôMS.</a> Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).</li>
<li>Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+extraction+from+suspension-cultured+mammalian+cells+for+global+metabolite+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling.</a> Nature Protocols. 6 (8), 1241-1249 (2011).</li>
<li>Dunn, W. B., Broadhurst, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+large-scale+metabolic+profiling+of+serum+and+plasma+using+gas+chromatography+and+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nature protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).</li>
<li>Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+evaluation+of+metabolite+extraction+protocols+for+untargeted+metabolic+profiling+of+liver+samples+by+UPLC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS.</a> Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).</li>
<li>Shaham, O., Slate, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasma+signature+of+human+mitochondrial+disease+revealed+through+metabolic+profiling+of+spent+media+from+cultured+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A plasma signature of human mitochondrial disease revealed through metabolic profiling of spent media from cultured muscle cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (4), 1571-1575 (2010).</li>
<li>Cequier-Saünchez, E., Rodriüguez, C., Ravelo, A. G., Zaürate, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dichloromethane+as+a+Solvent+for+Lipid+Extraction+and+Assessment+of+Lipid+Classes+and+Fatty+Acids+from+Samples+of+Different+Natures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dichloromethane as a Solvent for Lipid Extraction and Assessment of Lipid Classes and Fatty Acids from Samples of Different Natures.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (12), 4297-4303 (2008).</li>
<li>Keller, A., Eng, J., Zhang, N., Li, X. J., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+uniform+proteomics+MS%2FMS+analysis+platform+utilizing+open+XML+file+formats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">A uniform proteomics MS/MS analysis platform utilizing open XML file formats.</a> Mol. Syst. Biol. 1, (2005).</li>
<li>Cleveland, W. S., Devlin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locally+weighted+regression+-+an+approach+to+regression-analysis+by+local+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Stat.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Locally weighted regression - an approach to regression-analysis by local fitting.</a> J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 596-610 (1988).</li>
<li>Lange, E., Tautenhahn, R., Neumann, S., Gropl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+assessment+of+alignment+procedures+for+LC-MS+proteomics+and+metabolomics+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Critical assessment of alignment procedures for LC-MS proteomics and metabolomics measurements.</a> BMC Bioinformatics. 9 (1), 375(2008).</li>
<li>Tautenhahn, R., Bottcher, C., Neumann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+feature+detection+for+high+resolution+LC%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS.</a> BMC Bioinformatics. 9 (1), 504(2008).</li>
<li>Kuhl, C., Tautenhahn, R., Bottcher, C., Larson, T. R., Neumann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAMERA%3A+An+Integrated+Strategy+for+Compound+Spectra+Extraction+and+Annotation+of+Liquid+Chromatography%2FMass+Spectrometry+Data+Sets%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">CAMERA: An Integrated Strategy for Compound Spectra Extraction and Annotation of Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Data Sets.</a> Analytical Chemistry. 84 (1), 283-289 (2012).</li>
<li>Kanehisa, M., Goto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KEGG%3A+kyoto+encyclopedia+of+genes+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes.</a> Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).</li>
<li>Smith, C. A., O'Maille, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((METLIN%3A+a+metabolite+mass+spectral+database%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Drug+Monit%22%5BJournal%5D)">METLIN: a metabolite mass spectral database.</a> Ther. Drug Monit. 27 (6), 747-751 (2005).</li>
<li>Wang, Y., Xiao, J., Suzek, T. O., Zhang, J., Wang, J., Bryant, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PubChem%3A+a+public+information+system+for+analyzing+bioactivities+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PubChem: a public information system for analyzing bioactivities of small molecules.</a> Nucleic Acids Res. 37 Web Server, W623-W633 (2009).</li>
<li>Wishart, D. S., Knox, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HMDB%3A+a+knowledgebase+for+the+human+metabolome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">HMDB: a knowledgebase for the human metabolome.</a> Nucleic Acids Res. 37 Database, D603-D610 (2009).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li>
<li>Folch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipids+from+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues.</a> J. Biol. Chem. 226, 497-509 (1957).</li>
<li>Avery, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+differential+ion+suppression+on+liquid+chromatography%2Fatmospheric+pressure+ionization+mass+spectrometric+bioanalytical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of differential ion suppression on liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometric bioanalytical methods.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (3), 197-201 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nieukierunkowana metabolomika stanowi potężne narzędzie do badania biotransformacji endogennych lub ksenobiotycznych lub przechwytywania profilu metabolicznego z próbki będącej przedmiotem zainteresowania. Dane wyjściowe techniki skalują się wraz z rozdzielczością i czułością technologii użytej do separacji i analizy próbki, zdolnością do radzenia sobie z generowanymi dużymi zbiorami danych oraz zdolnością do eksploracji zbioru danych w celu uzyskania przydatnych informacji (np. dokładne masowe przeszukiwanie ba...

Ze względu na niedawny postęp technologiczny w dziedzinie HRMS, nieukierunkowane, generujące hipotezy podejścia metabolomiczne stały się wykonalnym podejściem do analizy złożonych próbek. 1 Spektrometry masowe o rozdzielczości 100 000 mm, co ułatwia rutynowe uzyskiwanie niskiej dokładności masy części na milion (ppm), stały się powszechnie dostępne u wielu dostawców. 2,3 Ta dokładność masy pozwala na większą specyficzność i pewność wstępnego przypisania tożsamości analitu, rozpoznawania wzorców izotopowych i identyfikacji adduktów. 4 W połączeniu z odpowiednią procedurą ekstrakcji i wysokowydajnym LC lub UPLC, złożone mieszaniny mogą być analizowane z dodatkową specyficznością wynikającą z danych dotyczących czasu retencji. 5 UPLC ma większą wydajność chromatograficzną i pozwala na większą czułość, rozdzielczość i czas analizy, co umożliwia większe pokrycie metabolomu. 6 Uzyskane w ten sposób duże zbiory danych można zintegrować z dowolnym oprogramowaniem do analizy różnicowej i wydobyć w celu uzyskania użytecznych wzorców lub pojedynczych analitów będących przedmiotem zainteresowania. 7,8,9,10,11 Przypuszczalne trafienia można wstępnie zidentyfikować za pomocą kombinacji algorytmów wykrywania pików, dokładnego przewidywania wzorów chemicznych na podstawie masy, przewidywania fragmentacji i przeszukiwania chemicznych baz danych. Podejście to pozwala na priorytetyzację celów w celu czasochłonnej, pełnej identyfikacji strukturalnej lub opracowania bardziej czułych i bardziej szczegółowych badań rozcieńczania izotopów stabilnych UPLC/wybranych lub wielokrotnych reakcji monitorowania/MS, które są obecnie złotym standardem w oznaczaniu ilościowym. 12
Różnorodny charakter próbek biologicznych doprowadził do optymalizacji protokołów ekstrakcji moczu13, komórek14, surowicy15 lub tkanek16. Protokół ten obejmuje ekstrakcje komórek, surowicy i tkanek. Tam, gdzie jest to właściwe, dołączono uwagi i dodatkowe odniesienia dotyczące modyfikacji procedury w celu uwzględnienia włączenia izotopów stabilnych lub włączenia metabolitów szczególnie niestabilnych.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Odczynnik</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Mediatech</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>Woda (H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W7-4</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>Acetonitryl (CH3CN)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A996-4</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>Metanol (CH3OH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A464-4</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>Chloroform (CH3Cl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366927</td><td>Hazard</td></tr><tr><td>Dichlorometan (CH2Cl2)</td><td>Acros Organics</td><td>61030-1000</td><td>Do zastąpienia chloroformu</td></tr><tr><td>Eter dietylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>346136</td><td>Do zastąpienia chloroformu</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy (FA)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>(optima)</td></tr><tr><td>NH4OH</td><td>Fisher Scientific</td><td>A470-250</td><td>(optima)</td></tr><tr><td>Mrówczan amonu (HCOONH4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78314</td><td></td></tr><tr><td>MicroSpin C18 Columns</td><td>Nest Group Inc</td><td>SS18V</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipety</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Szklane probówki wirówkowe</td><td>Kimble Chase</td><td>73785-10</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Plastikowe probówki</td><td>wirówkowe CellTreat</td><td>CLS-4301-015</td><td></td></tr><tr><td>LC Fiolki (szkło)</td><td>Wody</td><td>60000751CV</td><td></td></tr><tr><td>LC Wkładki (szkło)</td><td>Wody</td><td>WAT094171</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki LC (plastikowe)</td><td>Wody</td><td></td><td></td>186002640</tr><tr><td>0,22 &mu; m</td><td>Filtry Corning</td><td>8169</td><td>nylon</td></tr><tr><td>2 ml Eppendorf Probówki</td><td>BioExpress</td><td>C-3229-1</td><td>Niska retencja</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Spektrometr masowy o wysokiej rozdzielczości</td><td>Thermo Scientific</td><td>LTQ XL-Orbitrap</td><td></td></tr><tr><td>HPLC/UPLC</td><td>Wody</td><td>nanoACQUITY UPLC</td><td></td></tr><tr><td>Źródło</td><td>Michrom</td><td>Thermo Oprogramowanie</td> do analizy różnicowej Advance Source <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>SITO 2.0</td><td></td></tr><tr><td>nanoACQUITY C18 BEH130</td><td>Wody</td><td>186003546</td><td>1,7 i mu; Wielkość cząstek M, 150 mm x 100 &mu; m</td></tr><tr><td>Acentis Express C8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54262</td><td>2.7 &mu; m Wielkość cząstek, 15 cm x 200 &mu; mln</td></tr></tbody></table>

nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (uplc-hrms)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Tutaj prezentujemy proces analizy profili metabolicznych dla interesujących próbek biologicznych, w tym; komórek, surowicy lub tkanki. Próbka jest najpierw rozdzielana na frakcje polarne i niepolarne przez ekstrakcję w fazie ciecz-ciecz i częściowo oczyszczana w celu ułatwienia dalszej analizy. Zarówno faza wodna (metabolity polarne), jak i organiczna (metabolity niepolarne) początkowej ekstrakcji jest przetwarzana w celu zbadania szerokiego zakresu metabolitów. Metabolity rozdziela się różnymi metodami chromatografii cieczowej w oparciu o ich właściwości podziałowe. W tej metodzie prezentujemy ultra-wydajne metody mikroprzepływowe (UP)LC, ale protokół jest skalowalny do wyższych przepływów i niższych ciśnień. Wprowadzenie do spektrometru mas może odbywać się poprzez ogólne lub zoptymalizowane warunki źródłowe. Detekcja szerokiego zakresu jonów odbywa się w trybie pełnego skanowania, zarówno w trybie dodatnim, jak i ujemnym, w szerokim zakresie m/z przy użyciu wysokiej rozdzielczości na niedawno skalibrowanym instrumencie. Bezznacznikowa analiza różnicowa jest przeprowadzana na platformach bioinformatycznych. Zastosowania tego podejścia obejmują badania przesiewowe szlaków metabolicznych, odkrywanie biomarkerów i opracowywanie leków.

Przedstawione wyniki ukazują wybrane dane z 6-godzinnej inkubacji komórek glejaka SH-SY5Y z rotenonem, który jest pestycydem i inhibitorem kompleksu I mitochondriów. Dla zwięzłości zaprezentowano wyłącznie dane z fazy organicznej w trybie pozytywnym. Próbki zostały przetworzone i przeanalizowane zgodnie z powyższym opisem (Rysunek 1, Tabela 1, Tabela 2), a następnie wprowadzone do dwóch platform analizy różnicowej do ilościowego oznaczenia bez użycia znaczników: SIEVE oraz XCMS online. Chociaż oba progra...

Nieukierunkowana metabolomika dostarcza hipotezy generującej migawkę profilu metabolicznego. Protokół ten zademonstruje ekstrakcję i analizę metabolitów z komórek, surowicy lub tkanki. Szereg metabolitów jest badany za pomocą ekstrakcji ciecz-faza cieczowa, ultraprzepływowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) w połączeniu z oprogramowaniem do analizy różnicowej.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest porównanie migawek profilów metabolicznych różnych grup próbek biologicznych. Jest to osiągane poprzez zastosowanie ekstrakcji ciecz-ciecz w celu oddzielenia cząsteczek organicznych i polarnych. W drugim kroku cząsteczki są dalej rozdzielane za pomocą chromatografii cieczowej i analizowane metodą spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości, która dostarcza dane dotyczące czasu retencji, stosunku masy do ładunku oraz intensywności do dalszej analizy.Następnie przeprowadzono wyrównanie przebiegów chromatografii cieczowej, a następnie wykryto, wykwantyfikowano i posortowano cechy w celu zidentyfikowania cech o różnej obfitości pomiędzy grupami. Wyniki obrazują różnice w cechach w zależności od warunków traktowania, w oparciu o różną obfitość analitów wykrytą za pomocą chromatografii cieczowej i wysokorozdzielczej spektrometrii mas.Chociaż tę metodę można wykorzystać do badania metabolizmu komórkowego, może ona również dostarczyć informacji przydatnych przy odkrywaniu biomarkerów lub badaniu metabolizmu ksenobiotyków. W przypadku linii adherentnych, do komórek w płytce 10 cm dodać 1,5 mililitra pożywki. Płytkę umieścić na lodzie i delikatnie zeskrobć, aby odseparować komórki.Przenieś 1,5 ml pobranej zawiesiny komórkowej do wcześniej opisanej szklanej probówki wiriówkowej o pojemności 10 ml. Następnie do każdej szklanej probówki 10 ml zawierającej próbki dodaj 6 ml mieszaniny chloroformu i metanolu w stosunku dwa do jednego. Wstrząsaj próbki z niską prędkością przez 30 minut. Po wstrząsaniu odwiruj próbki przy niskim ustawieniu przyspieszenia i opóźnienia przy 1 935 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby całkowicie rozdzielić fazy, używając pipety Pasteura z długim końcem.Przenieś warstwę organiczną do nowej, wcześniej oznakowanej szklanej probówki wirówkowej o pojemności 10 milliliter. Następnie przenieś warstwę wodną do czystej plastikowej probówki typu einor o pojemności two milliliter. Na tym etapie odparuj próbki organiczne i wodne w strumieniu azotu.Przeskaluj wysuszone próbki w 50 do 100 µL roztworu początkowego dla wybranej metody UPLC. Delikatnie pipetuj próbkę w górę i w dół, aby wspomóc rozpuszczanie analitów. Następnie przenieś każdą próbkę do nylonowego filtra probówkowego o oczkach 0,22 µm i wiruj z prędkością do 14 000 ×g przez około pięć minut, aż próbka całkowicie przejdzie przez filtr.Obejrzyj próbkę, aby upewnić się, że nie pozostały w niej żadne widoczne osady. Przenieś nadfiltr przefiltrowanej próbki do wcześniej oznakowanej fiolki do UPLC i zamknij ją dopasowaną zakrętką. Następnie lekko stuknij fiolką, aby usunąć pęcherzyki powietrza z dna naczynia z próbką.Umieść próbkę w schłodzonym autopobieraczu. Następnie, korzystając z oprogramowania sterującego chromatografem cieczowym, utwórz analizę dla próbki organicznej. Po tym kroku utwórz analizę dla próbki organicznej w oparciu o zoptymalizowane warunki UPLC.Wykorzystaj zoptymalizowane warunki UPLC do opracowania metody również dla fazy wodnej. Jeśli szczególnie interesuje znany zestaw analityków docelowych, zoptymalizuj warunki UPLC, używając ciężko znakowanych analogów tych związków, i opracuj metodę. Stosując te warunki, pozwól układowi UPLC na odpowiednie ustabilizowanie się.Należy przeprowadzić pełne odgazowanie i nasycenie rozpuszczalników przed podłączeniem kolumny. Zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi objętości ekwilibracji nowej kolumny, należy prowadzić rejestr początkowych ciśnień wstecznych, aby ułatwić diagnozowanie przyszłych problemów przy użyciu oprogramowania sterującego spektrometrem mas o wysokiej rozdzielczości. Należy stworzyć metodę dla trybu dodatniego, a następnie, stosując te same warunki, stworzyć metodę dla trybu ujemnego.Oczyść i skalibruj instrument. Ustabilizuj strumień rozpylania do spektrometru i odczekaj, aż roztwór kalibracyjny zostanie całkowicie usunięty ze źródła i optyki. Akceptowalna stabilność rozpylania powinna zapewniać względne odchylenie standardowe intensywności na poziomie od 3% do 5% w ciągu co najmniej 100 skanów przy wtryskiwaniu roztworu kalibracyjnego z taką samą prędkością przepływu, jak w stosowanej metodzie lc.Używając generatora liczb losowych i klucza, przygotuj próbki w sposób zrandomizowany, aby uniknąć efektów seryjnych wprowadzonych podczas analizy. Ustal sekwencję dla wszystkich próbek. Ustaw odpowiednią objętość wtrysku i przeprowadź pomiar próbki ślepej przed pierwszą próbką.W przypadku podejrzenia przeniesienia próbki lub efektów macierzy pomiędzy próbkami, należy przeprowadzić odpowiednie pomiary ślepe lub płukanie, rozpocząć sekwencję i okresowo monitorować występowanie problemów, w tym wahań ciśnienia lub spadku intensywności sygnału w trakcie analizy. Jeśli zostaną wykryte poważne problemy, należy przerwać pomiar. Następnie należy wyczyścić i skalibrować instrument.Ustanów stabilny rozpylony strumień w spektrometrze i odczekaj czas niezbędny do całkowitego usunięcia roztworu kalibracyjnego ze źródła i optyki. Przed rozpoczęciem analizy różnicowej ręcznie sprawdź całkowite prądy jonowe lub przejrzyj filtrowane chromatogramy w poszukiwaniu znanych związków w próbce. Aby zapewnić powtarzalność pomiarów oraz stabilność wstrzykiwania/UPLC/rozpyłu we wszystkich próbkach, przenieś pliki danych RAW ze spektrometru mas na dysk twardy stacji roboczej, na której zainstalowane jest oprogramowanie sieve.Otwórz program sieve. Rozpocznij nowy eksperyment i załaduj odpowiednie pliki do programu sieve. Przypisz grupy porównawcze i wybierz jeden plik referencyjny, aby umożliwić programowi SIE V wygenerowanie parametrów analizy.Postępuj zgodnie z komunikatami i dostosuj parametry zgodnie z wymaganiami dla każdego konkretnego eksperymentu. W parametrach wczytaj odpowiednią listę adduktów dla trybu dodatniego lub ujemnego. Po zakończeniu analizy upewnij się, że na ekranie pojawiła się lista klatek.Należy upewnić się, że nakładki wyrównania lc pokrywają się z wszelkimi szczytami charakterystycznymi. Jeśli którekolwiek z niewyrównanych przebiegów lc wykazują duże odchylenia w szczytach charakterystycznych, może to wskazywać na problem z próbką.Nanieś dane na wykres według współczynnika zmienności w obrębie podobnej populacji próbek. Posortuj listę na podstawie pożądanych cech. Następnie sprawdź każdy pik pod kątem odpowiedniego dopasowania pików pomiędzy grupami.Integracja piku, model Gaussa, intensywność sygnału kształtu piku, przypisanie izotopów i adduktów. Eksport danych zgodnie z potrzebami do dalszej analizy lub w celu wygenerowania ukierunkowanych list mas do potwierdzenia i końcowych eksperymentów MS. Duża liczba trafień została zidentyfikowana przez dwa programy użyte do analizy różnicowej; zielone kropki oznaczają cechy występujące częściej w grupie kontrolnej, natomiast czerwone kropki oznaczają cechy występujące częściej w grupie badanej.Większy rozmiar kropki wskazuje na zwiększoną wielkość zmiany krotności (fold change) pomiędzy grupami, a intensywność koloru obrazuje malejącą wartość P wraz ze wzrostem nasycenia przedstawionego koloru. Przedstawiono tu chromatogramy z analizy UPLC MS w trybie jonów dodatnich fazy organicznej; okno A pokazuje całkowity prąd jonowy dla S Civ 2.0. W oknie B wyświetlono wyekstrahowany chromatogram jonowy dla cechy zidentyfikowanej przez XCMS jako D paneth. Okno C przedstawia wyekstrahowany chromatogram jonowy dla cechy zidentyfikowanej jako rot znanej z sve.Okno D przedstawia chromatogram wyekstrahowanych jonów dla cechy zidentyfikowanej jako rot known z sve, znormalizowanej do całkowitego prądu jonowego. Cecha o różnej obfitości, której poziom był obniżony w grupie traktowanej rot known, została wstępnie zidentyfikowana jako d panadine na podstawie przeszukiwania bazy danych dokładnych mas. Tożsamość analityku została potwierdzona za pomocą tandemowej spektrometrii mas U-P-L-C-H-R.Przedstawiono tutaj porównanie chromatogramów i widm masowych próbki oraz czystego związku. Należy pamiętać, że praca z chloroformem może być niezwykle niebezpieczna i należy przestrzegać odpowiednich środków ostrożności, takich jak korzystanie z dobrze wentylowanego wyciągu.

untargeted-metabolomics-from-biological-sources-using

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Niecelowy metabolomika źródeł biologicznych przy użyciu ultrawydajnej chromatografii cieczowej o wysokiej rozdzielczości spektrometria masowa (UPLC-HRMS)

Profilowanie metabolitów nieukierunkowanych za pomocą ultra wydajnej chromatografii cieczowej w połączeniu ze spektrometrią mas (UPLC-MS) jest potężną techniką badania metabolizmu.  W tym artykule przedstawiono typowy przepływ pracy wykorzystywany do nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy, w tym organizację i przygotowanie próbki, pozyskiwanie danych, analizę danych, kontrolę jakości i identyfikację metabolitów.

Wielkoskalowe, nieukierunkowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS)

Profilowanie metabolitów było cennym atutem w badaniach nad metabolizmem w zdrowiu i chorobie. Wykorzystując chromatografię cieczową z fazami normalnymi sprzężoną ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości ze zmianą polaryzacji i szybkim cyklem pracy, opisujemy protokół analizy polarnego składu metabolicznego materiału biologicznego z wysoką czułością, dokładnością i rozdzielczością.

Strategia dla wrażliwej, wielkoskalowej metabolomiki ilościowej

Przedstawiono protokół kompleksowej ekstrakcji lipidów, metabolitów i białek z tkanek biologicznych przy użyciu jednej próbki.

Prosta metoda ekstrakcji frakcjonowanej do kompleksowej analizy metabolitów, lipidów i białek z pojedynczej próbki

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Interakcje białko-białko i białko-metabolit są kluczowe dla wszystkich funkcji komórkowych. W niniejszym artykule opisujemy protokół, który umożliwia równoległą analizę tych interakcji z wybranym białkiem. Nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem hodowli komórek roślinnych i łączy oczyszczanie powinowactwa z wykrywaniem białek i metabolitów opartym na spektrometrii mas.

2 w 1: Jednoetapowe oczyszczanie powinowactwa do równoległej analizy kompleksów białko-białko i białko-metabolit

Przedstawiono metodę nieukierunkowanej analizy metabolitów i lipidów w ziarnie pszenicy. Protokół obejmuje metodę ekstrakcji metabolitu acetonitrylu oraz metodologię chromatografii cieczowej z odwróconą fazą i spektrometrią mas, z akwizycją w dodatnich i ujemnych trybach jonizacji elektrorozpylanej.

Nieukierunkowana chromatografia cieczowa i analiza metabolomiczna ziarna pszenicy oparta na spektrometrii mas

Przedstawiamy protokół identyfikacji i oceny ilościowej głównych klas rozpuszczalnych w wodzie metabolitów w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda jest wszechstronna, solidna i czuła. Pozwala na oddzielenie od siebie izomerów strukturalnych i stereoizomerycznych form metabolitów rozpuszczalnych w wodzie.

Ilościowa metabolomika Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

Celem tego protokołu jest wykrywanie metabolitów fenolowych w osoczu za pomocą metody częściowo ukierunkowanej chromatografii i spektrometrii mas.

Częściowo ukierunkowana ultrawysokosprawna chromatografia sprzężona ze spektrometrią mas Analiza metabolitów fenolowych w osoczu osób w podeszłym wieku

Skonstruowaliśmy nieukierunkowany przepływ metabolomiczny, który zintegrował XY-Meta i metaX razem. W tym protokole pokazaliśmy, jak używać XY-Meta do generowania wabikowej biblioteki spektralnej na podstawie odniesienia do widm w otwartym dostępie, a następnie przeprowadziliśmy kontrolę FDR i użyliśmy metaX do ilościowego określenia metabolitów po zidentyfikowaniu widm metabolomicznych.

Zintegrowany proces identyfikacji i kwantyfikacji nieukierunkowanego metabolomu opartego na kontroli FDR

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego i niezawodnego pomiaru metabolitów w rzadkich typach komórek. Udoskonalenia techniczne, w tym zmodyfikowany płyn osłonkowy do sortowania komórek i generowanie odpowiednich próbek ślepych, umożliwiają kompleksową ocenę ilościową metabolitów przy wkładzie zaledwie 5000 komórek na próbkę.

Ukierunkowana metabolomika rzadkich komórek pierwotnych

Poznaj nieukierunkowaną metabolomikę z próbek biologicznych przy użyciu ekstrakcji ciecz-ciecz oraz UPLC-HRMS. Ta metoda umożliwia kompleksowe profilowanie metabolitów i identyfikację różnic między grupami.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) (Wideo) | JoVE Journal

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Przeglądaj więcej filmów