Name: Pozyskiwanie fluorescencyjnych filmów poklatkowych pączkujących drożdży i analiza dynamiki pojedynczych komórek za pomocą GRAFTS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 1 s
Description: Poznaj metodę pozyskiwania fluorescencyjnych filmów poklatkowych drożdży i analizy dynamiki pojedynczych komórek za pomocą oprogramowania GRAFTS. Ta technika umożliwia badanie zmian transkrypcji w cyklu komórkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Emily Jackson, Joshua Zeidman i Nicholas Wren za komentarze na temat oprogramowania. Praca ta została sfinansowana przez GM95733 (do N.M.), BBBE 103316 i fundusze startowe MIT (do N.M.).

<ol><li>Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+movies+to+analyse+gene+circuit+dynamics+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells.</a> Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).</li>
<li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Regulation+at+the+Single-Cell+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene Regulation at the Single-Cell Level.</a> Science. 307 (5717), 1962-1965 (2005).</li>
<li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li>
<li>Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling-mediated+bacterial+persister+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling-mediated bacterial persister formation.</a> Nature Chemical Biology. 8 (5), 431-433 (2012).</li>
<li>Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Observation+of+Transcription+Initiation+and+Elongation+on+an+Endogenous+Yeast+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene.</a> Science. 332 (6028), 475-478 (2011).</li>
<li>Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+kinetics+of+gene+activity+in+individual+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria.</a> Cell. 123 (6), 1025-1061 (2005).</li>
<li>Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Genes+Are+Transcribed+with+Widely+Different+Bursting+Kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics.</a> Science. 332 (6028), 472-474 (2011).</li>
<li>Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-dependent+variations+in+protein+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-dependent variations in protein concentration.</a> Nucleic Acids Research. 38 (8), 2676-2681 (2010).</li>
<li>Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle+dependence+of+transcription+dominates+noise+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression.</a> , Submitted (2013).</li>
<li>Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+stochastic+switching+revealed+by+single-cell+genealogy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy.</a> PLoS Biology. 5 (9), e239(2007).</li>
<li>Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dynamics+of+single-cell+gene+expression+over+multiple+cell+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles.</a> Molecular Systems Biology. 1 (1), 2005.0024(2005).</li>
<li>Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK-mediated+bimodal+gene+expression+and+adaptive+gradient+sensing+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast.</a> Nature. 446 (7131), 46-51 (2007).</li>
<li>Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+temporally+controlled+gene+expression+and+long-term+fluorescent+imaging+in+unperturbed+dividing+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells.</a> PloS One. 3 (1), e1468(2008).</li>
<li>Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+quantification+of+molecules+and+rates+using+open-source+microscope-based+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry.</a> Nat. Meth. 4 (2), 175-181 (2007).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Sys.+Man.+Cyber%22%5BJournal%5D)">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9 (1), 62-66 (1979).</li>
<li>Goranov, A. I., Cook, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+cell+growth+is+governed+by+cell+cycle+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The rate of cell growth is governed by cell cycle stage.</a> Genes & Development. 23 (12), 1408-1422 (2009).</li>
<li>To, T. -L., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+Can+Induce+Bimodality+in+Positive+Transcriptional+Feedback+Loops+Without+Bistability%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability.</a> Science. 327 (5969), 1142-1145 (2010).</li>
<li>O'Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+PHO4+nuclear+localization+by+the+PHO80-PHO85+cyclin-CDK+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex.</a> Science. 271 (5246), 209-212 (1996).</li>
<li>Raser, J. M., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+stochasticity+in+eukaryotic+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of stochasticity in eukaryotic gene expression.</a> Science. 304 (5678), 1811-1814 (2004).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Powyższy protokół opisuje prostą metodę uzyskiwania i analizowania danych szeregów czasowych fluorescencji z ograniczonym doświadczeniem w mikrofluidyce lub w tworzeniu oprogramowania. Pozwala na uzyskanie poklatkowych filmów fluorescencyjnych pojedynczych komórek drożdży; wyodrębnić odpowiednie pomiary wielkości i ekspresji komórek; nadzorowanie śledzenia i przypisywania pochodzenia; i analizuj zachowanie całych komórek w czasie za pomocą dostępnego na rynku urządzenia do hodowli mikroprzepływowej i wszechstronnego graf...

Analiza ekspresji genów w pojedynczych komórkach pogłębiła nasze zrozumienie wielu aspektów regulacji genów. Statyczne migawki fluorescencyjnej ekspresji reporterowej przy użyciu cytometrii przepływowej lub mikroskopii dostarczają użytecznych informacji na temat rozkładu ekspresji pojedynczej komórki, ale brakuje historii i ewolucji danych szeregów czasowych wymaganych do bezpośredniego informowania o dynamice ekspresji genów. Fluorescencyjna mikroskopia poklatkowa stanowi sposób na uzyskanie zarówno pomiarów pojedynczych komórek, jak i ich historii. Opracowano różne techniki eksperymentalne i analityczne w celu uzyskania i ilościowego określenia filmów ekspresji fluorescencyjnego reportera, dostarczając w ten sposób wglądu w cechy regulacji genów (patrz 1 w celu przeglądu), takie jak zmienność między komórkami 2,3, tworzenie się bakteryjnych trwałych 4, inicjacja i wydłużenie transkrypcji 5, pękanie transkrypcji 6,7, zależność od cyklu komórkowego 8,9 i odziedziczalność 10. Jednak uzyskanie wysokiej jakości szeregów czasowych fluorescencji pojedynczej komórki wiąże się z poważnymi wyzwaniami technicznymi związanymi z hodowlą monowarstwy komórek w kontrolowanym środowisku oraz z wysokoprzepustową kwantyfikacją nabytych filmów fluorescencyjnych. W tym miejscu opisujemy procedurę uzyskiwania i analizowania filmów fluorescencyjnych S. cerevisiae bez wymaganego doświadczenia w produkcji urządzeń do hodowli komórkowych lub w tworzeniu oprogramowania (ryc. 1).
Po pierwsze, szczegółowo opisujemy przykładowy protokół generowania filmów z serii fluorescencyjnych dla pączkujących drożdży wyrażających jeden lub więcej fluorescencyjnych reporterów. Chociaż niestandardowe komory do hodowli mikroprzepływowych zostały zbudowane i z powodzeniem stosowane wcześniej 11-13, używamy dostępnego na rynku urządzenia mikroprzepływowego firmy CellAsic (Hayward, Kalifornia). System ogranicza komórki do wzrostu jednowarstwowego i umożliwia ciągłą kontrolę środowiska perfuzji. Przedstawiony przez nas protokół mikroskopowy jest prostym sposobem na uzyskanie filmów fluorescencyjnych pączkujących drożdży, ale każdy zmodyfikowany protokół eksperymentalny (niestandardowe urządzenie do hodowli, alternatywne warunki pożywki itp.) dający podobne dane filmu fluorescencyjnego pojedynczych komórek drożdży może zostać zastąpiony.
Następnie przedstawiamy analizę filmów za pomocą pakietu oprogramowania opartego na graficznym interfejsie użytkownika (GUI) w MATLAB (Mathworks, Natick, MA), nazwanego GUI for Rapid Analysis of Fluorescence Time Series (GRAFTS), aby wyodrębnić dane szeregów czasowych dla pojedynczych komórek. GRAFTS ma podobne funkcje do wszechstronnego pakietu oprogramowania typu open source Cell-ID 14 w zakresie segmentacji i śledzenia komórek oraz ekstrakcji intensywności fluorescencji i informacji geometrycznych. Jednak GRAFTS zapewnia ważne dodatkowe funkcje. Po pierwsze, oferuje łatwą interaktywną edycję wyników segmentacji i śledzenia w celu weryfikacji dokładności danych, a nie tylko statystycznego bramkowania śladów regionów odstających po analizie. Co więcej, rozszerza analizę, aby automatycznie wyznaczać linię i punkty zainteresowania cyklu komórkowego pączkujących drożdży. Określenie, kiedy matka i córka dzielą się, tworząc dwa niezależne regiony komórki, ma kluczowe znaczenie dla określenia pomiarów całej komórki (matki, w tym dowolnego połączonego pąka) w całym cyklu komórkowym 8. Pakiet składa się z trzech modułów do realizacji tych zadań. Pierwsza z nich segmentuje obszary komórek na podstawie kontrastu między skupionymi i nieostrymi obrazami w jasnym polu i umożliwia użytkownikowi definiowanie i wizualne testowanie parametrów segmentacji. Druga ścieżka (wykorzystująca implementację MATLAB Blaira i Dufresne'a Crockera i wsp. Procedura IDL, dostępna pod adresem: <a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/" target="_blank">http://physics.georgetown.edu/MATLAB/</a>) i mierzy regiony komórek w czasie; automatycznie przypisuje pochodzenie; i umożliwia kontrolę wzrokową i korekcję błędów. Dołączony jest prosty graficzny interfejs użytkownika do kreślenia, aby wykonywać zapytania o właściwości pojedynczej komórki. Trzeci moduł przypisuje czasy pojawiania się i podziału pąków oraz wyprowadza dane szeregów czasowych całej komórki, a także ich pochodne za pierwszym i drugim razem (jak omówiono w 9). Moduł analityczny generuje dane w postaci pliku tekstowego rozdzielanego spacjami do późniejszego badania w wybranym oprogramowaniu statystycznym. W ten sposób pakiet umożliwia użytkownikowi wyodrębnienie wysokiej jakości danych szeregów czasowych za pomocą interfejsu graficznego. Użyliśmy tej metody do oszacowania szybkości transkrypcji w czasie rzeczywistym w pojedynczych pączkujących komórkach drożdży w funkcji cyklu komórkowego 9. Chociaż moduły zostały zoptymalizowane pod kątem pączkujących drożdży, parametry lub, w razie potrzeby, swobodnie dostępny kod mogą być dostosowane do innych organizmów i typów obrazów. Algorytmy segmentacji, śledzenia i przypisywania linii mogą być specyficzne dla przypisanych typów obrazowania i danego organizmu. Istniejące algorytmy mogą zostać zastąpione, ale nadal zachowują interfejs GUI, który umożliwia przyjazną dla użytkownika kontrolę wizualną i korektę błędów segmentacji i śledzenia, które niezmiennie występują w przypadku każdego algorytmu.

<table><tbody><tr><td>Y04C Płytka perfuzyjna drożdży</td><td>CellAsic</td><td>Y04C-02</td><td></td></tr><tr><td>ONIX Platforma perfuzji mikroprzepływowej</td><td>CellAsic</td><td>EV-262</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1</td><td>Mikroskop Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 63x/1.40 Olej DIC</td><td>Obiektyw Zeiss</td><td>440762-9904-000</td><td></td></tr><tr><td>Cascade II EMCCD</td><td>Kamera Fotometria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metalohalogenkowa lampa łukowa Lumen 200</td><td>PRIOR Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kostka filtra dichroicznego z potrójnym pasmem przepustowym oraz zestaw filtrów wzbudzenia i emisji</td><td>Zestaw Chroma Technology Corp</td><td>#89006</td><td>Używany do kontrolera YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato)</td></tr><tr><td>MAC 5000 i kół filtrowych</td><td>Ludl Electronic Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2011a</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Wersja 64-bitowa radzi sobie z dużymi plikami danych lepiej niż wersja 32-bitowa</td></tr></tbody></table>

pozyskiwanie fluorescencyjnych filmów poklatkowych pączkujących drożdży i analiza dynamiki pojedynczych komórek za pomocą grafts

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescencyjna mikroskopia poklatkowa stała się potężnym narzędziem w badaniu wielu procesów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki. W szczególności filmy przedstawiające czasową zależność ekspresji genów dostarczają wglądu w dynamikę jej regulacji; Istnieje jednak wiele wyzwań technicznych związanych z uzyskiwaniem i analizą filmów fluorescencyjnych pojedynczych komórek. Opisujemy tutaj prosty protokół wykorzystujący dostępne na rynku urządzenie do hodowli mikroprzepływowej do generowania takich danych oraz oparty na MATLAB, graficzny interfejs użytkownika (GUI) pakiet oprogramowania do ilościowego określania obrazów fluorescencyjnych. Oprogramowanie segmentuje i śledzi komórki, umożliwia użytkownikowi wizualne selekcjonowanie błędów w danych oraz automatycznie przypisuje pochodzenie i czasy podziału. Graficzny interfejs użytkownika dalej analizuje szeregi czasowe w celu wytworzenia całych śladów komórek, a także ich pochodnych za pierwszym i drugim razem. Chociaż oprogramowanie zostało zaprojektowane dla S. cerevisiae, jego modułowość i wszechstronność powinny pozwolić mu służyć jako platforma do badania innych typów komórek z niewielkimi modyfikacjami.

Prawidłowo przeprowadzony i przeanalizowany eksperyment pozwoli na uzyskanie głównie ciągłych szeregów czasowych dla pojedynczych, całych komórek z realistycznie przypisanymi czasami pojawienia się pączka oraz podziału. Przykładowo, wykonaliśmy powyższy protokół z użyciem haploidalnego szczepu drożdży wykazującego ekspresję zintegrowanej kopii białka fluorescencyjnego Cerulean (CFP) pod kontrolą konstytutywnego promotora ADH1, aby zaobserwować, jak wzrost i globalna ekspresja mogą zmieniać się w czasie ...

Prezentujemy prosty protokół do uzyskiwania filmów z mikroskopii fluorescencyjnej rosnących komórek drożdży, oraz pakiet oprogramowania oparty na graficznym interfejsie użytkownika do ekstrakcji danych szeregów czasowych pojedynczych komórek. Analiza obejmuje automatyczne przypisywanie czasu pochodzenia i podziału zintegrowane z inspekcją wizualną i ręczną selekcją śledzonych danych.

Pozyskiwanie fluorescencyjnych filmów poklatkowych pączkujących drożdży i analiza dynamiki pojedynczych komórek za pomocą GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie filmów fluorescencyjnych rosnących pojedynczych komórek drożdży oraz wyodrębnienie serii czasowych ekspresji reporterów dla każdej komórki. Osiąga się to poprzez uprzednie wyhodowanie monowarstwy komórek w komorze mikrofluidycznej. Drugim krokiem jest przeprowadzenie mikroksopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse dla jednego lub więcej reporterów.Następnie filmy są przetwarzane przy użyciu pakietu oprogramowania graft w celu śledzenia i pomiaru komórek w czasie. Ostatnim krokiem jest analiza pomiarów komórkowych oraz przypisania linii komórkowych, a także eksport serii czasowych ekspresji reportera dla każdej pełnej komórki. Ostatecznie chwilowa szybkość transkrypcji, wywnioskowana z serii czasowych ekspresji, służy do wykazania zmian w transkrypcji zarówno w cyklu komórkowym, jak i w odpowiedzi na zmieniające się poziomy czynników transkrypcyjnych.Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny regulacji genów, takie jak: jak szybko różne promotory reagują na nagłe dodanie lub usunięcie aktywnego czynnika transkrypcyjnego? Jak zmienna jest ta odpowiedź w populacji komórek i w jaki sposób różne cechy komórkowe, w tym morfologia i faza cyklu komórkowego, wpływają na tę reakcję? Co więcej, metoda ta pozwala badać efekty wielokrotnego dodawania i usuwania aktywnego czynnika transkrypcyjnego na ekspresję genów.Przygotować komórki drożdży rosnące w bogatym w składniki odżywcze stanie stacjonarnym, przy gęstości odpowiedniej do załadowania do urządzenia mikroprzepływowego, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie przygotować płytkę do hodowli mikroprzepływowej Y zero four C firmy cell ASIC, płucząc dołki sterylną wodą po usunięciu roztworu transportowego; używając systemu perfuzji onyx, przepłukać dołki od jednego do szóstego wodą pod ciśnieniem 6 PSI przez pięć minut w celu oczyszczenia kanałów, a następnie przepuścić wodę z dołka załadowczego osiem pod ciśnieniem 6 PSI przez 10 sekund. Usunąć wodę ze wszystkich dołków i zastąpić ją 250 µL pożywki SC w dołkach wlotowych od jednego do szóstego oraz 50 µL przygotowanej hodowli komórkowej w dołku załadowczym.Uszczelnij onykswy kolektor do płytki za pomocą ośmiu uszczelek, a następnie rozpocznij przygotowanie kanałów i komory hodowlanej, przepływając z otworów wlotowych od jednego do sześciu pod ciśnieniem 6 PSI przez dwie minuty. Następnie przepływaj wyłącznie z otworu wlotowego zawierającego medium startowe przez co najmniej pięć minut. Przy ciśnieniu 6 PSI kontynuuj przepływ nieprzerwanie aż do etapu z mikroskopem. Przymocuj płytkę do uchwytu stolika taśmą, aby zapobiec jej przesunięciu podczas eksperymentu i usprawnić śledzenie komórek podczas analizy danych. Po przygotowaniu mikroskopu zgodnie z opisem w protokole tekstowym, nanieś kilka kropel olejku imersyjnego na obiektyw i bezpiecznie zamontuj urządzenie mikroprzepływowe.W stoliku mikroskopu odwróconego ustaw ostrość na lewymą trzecią część pierwszej komory hodowlanej, korzystając z jednego z wbudowanych znaczników pozycji. Wyłącz przepływ z otworu wlotowego medium oraz przepływ z otworu ładowania komórek numer osiem pod ciśnieniem 6 PSI w pięciosekundowych impulsach. Przesuń stolik, aby przeszukać komorę hodowlaną w poszukiwaniu komórek.Zwiększ czas i ciśnienie przepływu załadunku, aż do uzyskania pożądanej gęstości komórek, unikając jednak nadmiernego obciążenia i zapchania lewej bariery, przez którą świeże medium wpływa do komory. Rozpocznij przepływ z otworu wlotowego medium zawierającego medium startowe przy ciśnieniu 6 PSI. W programie Metamorph lub innym oprogramowaniu do automatyzacji i sterowania mikroskopią.Skonfiguruj wielowymiarową akwizycję, aby wykonać wiele obrazów w wielu pozycjach stolika w czasie. Ustaw liczbę punktów czasowych oraz odstęp między nimi. Następnie wybierz kilka pozycji stolika, w których znajduje się około 10 komórek każda.Skonfiguruj akwizycję w taki sposób, aby w każdej pozycji stolika i w każdym punkcie czasowym program ustawiał ostrość obrazu jasnego pola w świetle przechodzącym, korzystając z wbudowanej metody autofokusa programu Metamorph; autofokus należy zaimplementować jako niestandardowy dziennik (journal) uruchamiany na początku każdej pozycji stolika. Takie rozwiązanie zapewnia większą kontrolę nad precyzją ustawienia ostrości. Ponadto ustaw program tak, aby pozyskiwał obraz jasnego pola w odległości +1 µm od płaszczyzny ogniskowej oraz obraz jasnego pola poza ogniskiem w odległości -4 µm od płaszczyzny ogniskowej.Użyj niestandardowych dzienników w celu zmiany ogniska między obrazami zgodnie z potrzebami. Na koniec skonfiguruj program. Uzyskaj jeden obraz w skali szarości dla każdego reportera fluorescencyjnego w płaszczyźnie ogniskowej.Należy zastosować ustawienia zoptymalizowane pod kątem szybkiej akwizycji przy minimalnym fotobleachingu. Przygotuj program przepływu dla eksperymentu w oprogramowaniu sterującym Onyx. Następnie jednocześnie rozpocznij program akwizycji w Metamorph oraz program przepływu w oprogramowaniu sterującym Onyx.Uruchom plik M format data w programie MATLAB, aby otworzyć graficzny interfejs użytkownika (GUI) wprowadzania danych. Na górze określ lub przejrzyj folder zawierający pliki obrazów, aby ustawić katalog danych, a następnie użyj GUI do określenia typów danych i plików obrazów zarejestrowanych podczas eksperymentu. Następnie wybierz parametry segmentacji zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Wybór odpowiednich parametrów segmentacji obrazów w polu jasnym może być trudny i ma istotny wpływ na jakość wynikających z niej danych z serii czasowych. Skupiamy się na identyfikacji wszystkich obszarów komórek, przyjmując zasadę, że nadmierna segmentacja obszarów jest preferowana nad ich niedostateczną segmentacją. Podczas wizualnej inspekcji danych obszary nadmiernie podzielone mogą zostać połączone w celu utworzenia całych obszarów komórek, natomiast obszary niedostatecznie podzielone nie mogą zostać rozdzielone w późniejszym etapie.Ustaw różne parametry segmentacji i sprawdź jakość segmentacji, klikając test Successfully. Poprawnie wysegmentowane obszary zostaną zaznaczone na zielono z purpurowymi obramowaniami. Należy użyć suwaka, aby sprawdzić wiele punktów czasowych w filmie, w których segmentacja jest satysfakcjonująca.Wybierz opcję „done”, aby powrócić do interfejsu graficznego danych formatu parametrów segmentacji. Po wybraniu parametrów kolorów zgodnie z opisem w tekście, naciśnij przycisk „auto threshold”, aby automatycznie wyznaczyć próg. Z zastosowaniem metody tzu’a, na obrazie zostaną wyróżnione obszary zachowane powyżej progu.Próg można dostosować ręcznie za pomocą pola edycji. Należy użyć paska przewijania, aby potwierdzić, że próg jest odpowiedni dla wszystkich punktów czasowych. Po uzyskaniu satysfakcjonującego wyniku należy kliknąć gotowe.Aby przywrócić próg do interfejsu formatowania danych (format data gui), należy nacisnąć „add”, a następnie „segment”. Aby utworzyć maskę kolorów, należy nacisnąć „format data”, co spowoduje odczytanie plików obrazów, przetworzenie danych i utworzenie pliku dot mat w wskazanym folderze. Plik ten będzie służył jako dane wejściowe dla interfejsu przetwarzania szeregów czasowych (process time series gui).Uruchom plik M serii czasowej procesu w programie MATLAB, aby otworzyć interfejs graficzny (GUI) śledzenia. Po otwarciu GUI ustaw najpierw wysokość komory. Określa ona wysokość komory, w której uwięzione są komórki.Służy jako ograniczenie przy przybliżaniu objętości komórki w formie elipsoidy 3D na podstawie osi głównej i pomocniczej obszaru komórki. Następnie ustaw wartość mikrometrów na piksel. Jest to współczynnik konwersji używany do kalibracji odległości z pikseli na mikrometry w obrazach, aby powierzchnia przekroju poprzecznego i objętość mogły zostać skalibrowane odpowiednio w mikrometrach kwadratowych i mikrometrach sześciennych.Następnie należy użyć panelu filtrów, aby ustawić parametry minimalne i maksymalne w celu odfiltrowania niepożądanych obszarów w masce. Area to powierzchnia obszaru wyrażona w pikselach. ECC to współczynnik ekscentryczności, przy czym wartość zbliżająca się do zera oznacza kształt bardziej kolisty.SF to współczynnik kształtu, który wskazuje na większą kolistość, gdy wartość zbliża się do jedności. Należy kliknąć obraz ładunku w panelu wejścia/wyjścia plików i wybrać odpowiedni plik danych dot mat wygenerowany przez interfejs GUI formatowania danych. Maska regionu zostanie zastosowana do każdego kanału kolorów i wykonanych zostanie szereg różnych pomiarów. Plik danych zostaje następnie zapisany po wybraniu parametru śledzenia komórek (track cells), zgodnie z opisem w tekście.Kliknij komórki śledzenia, aby śledzić regiony z jednej klatki do następnej, używając identyfikatorów OID regionów w celu przypisania linii dla nowo pojawiających się pączków; aby zapisać dane, zmień w razie potrzeby parametry w oknach wyskakujących. Linie są przypisywane automatycznie poprzez minimalizację odległości między domniemanymi pączkami a potencjalnymi organizmami macierzystymi w każdej klatce.Kliknij przycisk znajdujący się nad panelem informacji o wybranej komórce i popraw błędnie wysegmentowane obszary oraz pomyłki w przypisaniach identyfikatorów (ID) lub linii komórkowych, korzystając z dostępnych narzędzi gooey lub klawiszy skrótów opisanych w protokole tekstowym, aby właściwie opracować dane. Połącz nadmiarowo wysegmentowane obszary, usuń wszelkie obszary, które nie obejmują całej komórki i upewnij się, że relacje matka-pączek są przypisane prawidłowo. Wyeliminuj również wszelkie zielone identyfikatory poprzez łączenie obszarów.Poprawa identyfikatora, przypisanie regionu do rośliny macierzystej, brak przypisania do rośliny macierzystej lub usunięcie regionu. Ponieważ dane dotyczące pąków zostaną dodane do danych rośliny macierzystej podczas końcowej analizy. Nie należy łączyć regionu pąka z rośliną macierzystą.Przeprowadź wizualną inspekcję danych dla każdej klatki do ostatniego interesującego przedziału czasowego. Nie jest wymagane sprawdzanie całej serii czasowej. Jeśli nie używasz późniejszych klatek, upewnij się, że zapisałeś zmiany po tym, jak wszystkie obszary komórkowe zostały sprawdzone w interesującym przedziale czasowym dla wszystkich kanałów fluorescencji i gdy dane dotyczące ich zmian w czasie są gotowe do eksportu.Uruchom analizę szeregów czasowych, aby przeanalizować szeregi czasowe dla całych komórek w czasie. Oblicz informacje o cyklu komórkowym i wyznacz pochodne. Otworzy się okno umożliwiające wybór interesujących pomiarów oraz wprowadzenie parametrów analizy. Wprowadź ostatni punkt czasowy opracowany w interfejsie graficznym.Domyślne parametry wygładzania i przypisywania faz cyklu komórkowego sprawdzają się w przypadku szczepów haploidalnych i diploidalnych obrazowanych w pięciominutowych odstępach czasu, jednak w celu uzyskania najlepszych wyników może być konieczna ich zmiana. Po ustawieniu wszystkich parametrów należy wybrać opcję „analyze”, aby wyeksportować dane szeregów czasowych dla pojedynczych komórek, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Prawidłowo przeprowadzony i przeanalizowany eksperyment dostarczy głównie ciągłych szeregów czasowych dla pojedynczych, całych komórek z realistycznie przypisanymi czasami pojawienia się i podziału dla haploidalnego szczepu drożdży eksponującego zintegrowaną kopię białka fluorescencyjnego CFP pod kontrolą konstytutywnego promotora DH1. Pomiary całych komórek w czasie uzyskano z analizy szeregów czasowych.Obrazy w polu jasnym przedstawiają posegmentowaną komórkę macierzystą w kolorze niebieskim oraz jej pączki w kolorze zielonym. Przy zaznaczonej czerwoną linią ciągłej całości komórki, wyłania się zależność zarówno objętości, jak i ekspresji od cyklu komórkowego. Tutaj obszary prążkowane wskazują, kiedy komórka znajduje się w fazie G2 M i posiada pączek; pączkowanie rozpoczyna się w przejściu z G1 do S, przejście to zaznaczono kolorem od białego do szarego.Zacienienie i podział komórki występują podczas przejścia z fazy M do G1, gdzie przejście od cieniowania szarego do białego następuje po utworzeniu pączka. Całkowita objętość połączona zwiększa się szybciej niż wcześniej, natomiast podczas wyłaniania się stężenie białek lub średnia intensywność nieznacznie spada. Wzrost połączonego zintegrowanego poziomu białka również przyspiesza po pączkowaniu w porównaniu z samym obszarem matki.Wyniki te demonstrują znaczenie właściwego uwzględnienia wkładu pączków w pomiar całej komórki i podkreślają potrzebę prawidłowego przypisania czasu formowania oraz podziału pączka. Zróżnicowane szeregi czasowe mogą być wykorzystane do obliczenia chwilowego względnego poziomu mRNA oraz tempa transkrypcji, z których oba zwiększają się po pączkowaniu, co umożliwia generowanie stabilnych przedziałów czasowych. Pochodne szeregów czasowych pomiarów są również przydatne w badaniach kinetycznych z wykorzystaniem opisanego w protokole tekstu systemu ekspresji przełączalnej.Analiza szeregów czasowych pokazuje, kiedy czynnik transkrypcyjny lokalizuje się w jądrze oraz kiedy rozpoczyna się i kończy transkrypcja genu docelowego. Przedstawiona tutaj transkrypcja to mikrografie z czterech wskazanych kanałów akwizycji dla komórki z przełączalnym YFP połączonym z transaktywatorem PHO four Tet R. Transaktywator lokalizuje się w zaznaczonym RFP jądrze w odpowiedzi na niski poziom fosforanu i napędza ekspresję reportera CFP z promotorem seven X Tet O.Wnioskowana szybkość transkrypcji zmienia się w zależności od lokalizacji średnio oraz na poziomie pojedynczej komórki. Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać inne analizy wielowymiarowych szeregów czasowych danych z pojedynczych komórek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, m.in. w jaki sposób ekspresja zmienia się w populacji w czasie? Czy efekty fluktuacji zewnętrznych są dziedziczone przez wiele pokoleń?Czy kinetyka aktywacji genów ulega zmianie podczas reaktywacji? Czy cykl komórkowy odgrywa w tym procesie jakąś rolę? To jedne z wielu pytań wymagających analizy wzrostu ekspresji genów oraz trajektorii linii komórkowych pojedynczych komórek.

acquiring-fluorescence-time-lapse-movies-budding-yeast-analyzing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Rejestrowanie zdjęć fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym drożdży pączkujących i analiza dynamiki pojedynczych komórek przy użyciu GRAFTS

Delecja genów oraz nadekspresja białek to powszechnie stosowane metody badania funkcji białek. W niniejszym artykule opisujemy protokół analizy rozwoju fenotypu w zależności od stężenia białka na poziomie populacyjnym i pojedynczych komórek u Saccharomyces cerevisiae.

Analiza rozwoju fenotypu morfologicznego w funkcji stężenia białka u drożdży pączkujących

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Zapewniamy powtarzalną podstawową metodę długoterminowej mikroskopii cyklu życia płciowego drożdży rozszczepialnych. Z niewielkimi korektami, przedstawiony protokół pozwala na skupienie badań na różnych etapach procesu rozrodczego.

Mikroskopia płciowego cyklu życiowego drożdży rozszczepialnych

Dokładna kwantyfikacja zdarzeń związanych z transportem pęcherzykowym często dostarcza kluczowych informacji na temat ról poszczególnych białek i skutków mutacji. W pracy przedstawiono metody wykorzystania superekliptycznej pHluoryny, wrażliwego na pH wariantu GFP, jako narzędzia do ilościowego oznaczania zdarzeń endocytarnych w żywych komórkach za pomocą ilościowej mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej.

Zastosowania pHluorin do ilościowej, kinetycznej i wysokoprzepustowej analizy endocytozy u pączkujących drożdży

Ten artykuł przedstawia protokół zoptymalizowany pod kątem produkcji chipów mikroprzepływowych oraz konfiguracji eksperymentów mikroprzepływowych do pomiaru długości życia i fenotypów komórkowych pojedynczych komórek drożdży.

Wykorzystanie urządzeń mikroprzepływowych do pomiaru długości życia i fenotypów komórkowych w pojedynczych pączkujących komórkach drożdży

Drożdże pączkujące są korzystnym modelem do badania dynamiki mikrotubul in vivo ze względu na ich potężną genetykę i prostotę cytoszkieletu mikrotubul. Poniższy protokół opisuje, w jaki sposób przekształcać i hodować komórki drożdży, uzyskiwać obrazy mikroskopii konfokalnej i ilościowo analizować dynamikę mikrotubul w żywych komórkach drożdży.

Obrazowanie i analiza w wysokiej rozdzielczości dynamiki poszczególnych mikrotubul astralnych u pączkujących drożdży

Ten protokół opisuje analizę fluorescencyjnie znakowanych przedziałów wewnątrzkomórkowych w pączkujących drożdżach za pomocą wielokolorowej mikroskopii konfokalnej 4D (time-lapse 3D). Parametry obrazowania dobierane są tak, aby wychwycić odpowiednie sygnały przy jednoczesnym ograniczeniu fotouszkodzeń. Niestandardowe wtyczki ImageJ umożliwiają śledzenie oznaczonych struktur i analizę ilościową.

Mikroskopia 4D drożdży

Tutaj prezentujemy obrazowanie żywych komórek, które jest nietoksyczną metodą mikroskopii, która pozwala badaczom badać zachowanie białek i dynamikę jądrową w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych podczas mitozy i mejozy.

Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Drożdże rozszczepienia są tutaj używane jako heterologiczne gospodarze do ekspresji bakteryjnych białek cytoszkieletu, takich jak FtsZ i MreB, jako translacyjnych białek fuzyjnych z GFP, aby uwidocznić ich polimeryzację. Również związki, które wpływają na polimeryzację, są identyfikowane przez obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Drożdże rozszczepieniowe jako platforma do badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego

Protokół ten opisuje dwie metody zatrzymania cyklu komórkowego drożdży oraz opcjonalnego uwalniania oraz rozwija zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania procesów zależnych od cyklu komórkowego u S. cerevisiae.

Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

Poznaj metodę pozyskiwania fluorescencyjnych filmów poklatkowych drożdży i analizy dynamiki pojedynczych komórek za pomocą oprogramowania GRAFTS. Ta technika umożliwia badanie zmian transkrypcji w cyklu komórkowym.

Pozyskiwanie fluorescencyjnych filmów poklatkowych pączkujących drożdży i analiza dynamiki pojedynczych komórek za pomocą GRAFTS (Wideo) | JoVE Journal

Pozyskiwanie fluorescencyjnych filmów poklatkowych pączkujących drożdży i analiza dynamiki pojedynczych komórek za pomocą GRAFTS

Przeglądaj więcej filmów