Name: Izolacja embrionalnych komórek śródbłonka komór (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Poznaj metodę izolacji embrionalnych komórek śródbłonka komór z mysich zarodków transgenicznych. Technika ta wykorzystuje kolagenazę, przeciwciała i separację magnetyczną do uzyskania czystych populacji komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Andrei Portbury za krytyczne przeczytanie manuskryptu, Laboratorium Serwisowemu Mikroskopu UNC za pomoc w obrazowaniu poklatkowym oraz NIH (grant # R01HL061656) za wsparcie finansowe.

1. Przygotuj koraliki sprzężone z przeciwciałami
<ol>
 <li>Na jeden dzień przed sekcją należy połączyć wybrane przeciwciało z odpowiednimi Dynabeads (np. szczurzymi IgG Dynabeads dla przeciwciała wyhodowanego u szczura, 4 x 108 kulek/ml) zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku szczurzego przeciwciała anty-CD31 BD (0,5 μg/μl, stosowanego do izolacji komórek śródbłonka) dodaje się 3 μl przeciwciała na każde 25 μl kulek, dla końcowego stężenia 1,5 μg przeciwciała anty-CD31 i 1 x 10 7 kulek/25 μl buforu.</li>
 <li>Kulki i przeciwciała inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie płytki kolagenowej
<ol>
 <li>Izolowane komórki tworzą kanaliki szybciej, gdy rosną na żelu kolagenowym, a nie tylko na płytce pokrytej kolagenem. Dlatego żele kolagenowe są wytwarzane w noc poprzedzającą sekcję, jak opisano w punkcie 6. Na lodzie w kapturze do hodowli tkankowej połącz następujące odczynniki (wystarczają na 19 dołków): 206,4 μl sterylnego H2O, 140,4 μl kolagenu typu I (4,08 mg / ml), 38,4 μl 10x M199 i 1,15 μl 5 M NaOH.</li>
 <li>Odpipetować 20 μl tego żelu kolagenowego do studzienek 384-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 30 minut.</li>
 <li>Dodać 80 μl DMEM do każdego dołka i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Usunąć pożywkę hodowlaną i powtórzyć jeszcze dwa razy.</li>
 <li>Po ostatnim płukaniu dodać 80 μl 10% FBS/DMEM do każdego dołka i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Przed dodaniem wyizolowanych komórek usunąć pożywkę hodowlaną.</li>
</ol>
3. Wyciąć i strawić serce
<ol>
 <li>Poddaj eutanazji mysz w ciąży w wybranym dniu embrionalnym przy użyciu zatwierdzonej techniki eutanazji. Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie Karoliny Północnej w Chapel Hill.</li>
 <li>Trzymając mysz w pozycji leżącej, obficie spryskaj brzuszną stronę samicy 70% etanolem przed sekcją. Używając kleszczy do uniesienia skóry i mięśni dolnej części brzucha z dala od narządów wewnętrznych, rozetnij dolną jamę brzuszną kobiety, aby uwidocznić narządy wewnętrzne.</li>
 <li>Trzymając szyjkę macicy kleszczami, ostrożnie przyciąć ogon do kleszczy i zacząć podnosić róg macicy z jamy brzusznej. Podnosząc róg macicy, odetnij tkankę łączną, która utrzymuje róg na miejscu. Aby zakończyć wycinanie rogu macicy, przetnij połączenie rogu macicy z jajowodem, aby uwolnić róg macicy.</li>
 <li>Umieść róg macicy na szalce Petriego zawierającej zimną sól fizjologiczną buforowaną 1x fosforanem (PBS) i spłucz w razie potrzeby. Rozetnij róg macicy przez linię środkową, aby odsłonić przyczepione woreczki embrionalne.</li>
 <li>Rozciąć worek embrionalny na styku łożyska i zarodka, aby uniknąć przypadkowego przecięcia zarodka i pobrania zarodka. Umieść zarodek na drugiej szalce Petriego z zimnym PBS. Umieść szalkę Petriego z rogiem macicy z lodem.</li>
 <li>Odetnij głowę zarodka, aby poprawić dostęp do ściany klatki piersiowej. Jeśli konieczne jest genotypowanie, odetnij ogon, aby go usunąć i zapisz w probówce Eppendorfa umieszczonej na lodzie.</li>
 <li>Trzymając zarodek na plecach, rozetnij ścianę klatki piersiowej, aby uwidocznić serce i płuca. Aby uniknąć przecięcia serca, wykonaj pionowe cięcie wzdłuż boku klatki piersiowej, w pobliżu kończyny przedniej, a następnie poziome cięcie w poprzek dolnej części żeber; Następnie delikatnie pociągnij ścianę klatki piersiowej do góry i usuń ją z drogi. Do około 13,5 dnia embrionalnego ściana klatki piersiowej jest przezroczysta, co pomaga w wizualizacji.</li>
 <li>Ostrożnie podnieś serce za pomocą kleszczy i przetnij naczynia poniżej. Następnie przetnij nad wielkimi naczyniami, aby uwolnić serce. Jeśli naczynia płucne nie zostaną przecięte, płuca mogą zostać usunięte wraz z sercem. W ten sposób usuń obce tkanki, takie jak płuca, jeśli to konieczne.</li>
 <li>Oddziel i odrzuć przedsionki i wielkie naczynia od komór. Za pomocą nożyczek zmielić komory na małe kawałki (około 1 mm3) i umieścić w około 500 μl kolagenazy (1 mg/ml w sterylnym PBS). Próbki należy przechowywać na lodzie, aż wszystkie komory zostaną zmielone i umieszczone w kolagenazie.</li>
 <li>Powtarzaj poprzednie kroki, aż komory zostaną wycięte ze wszystkich zarodków, zbierając każde serce do oddzielnej probówki Eppendorfa. Jeśli wszystkie zarodki mają ten sam genotyp, serca mogą być zebrane w jednej probówce Eppendorfa. Liczba próbek przetwarzanych jednorazowo może być ograniczona w zależności od magnesu używanego do izolacji; zastosowany tutaj DynaMag (123-21D) mieści maksymalnie 16 probówek Eppendorf.</li>
 <li>Ułożyć rozdrobnione komory w temperaturze 37 °C z kołysaniem przez 45 min. Co 15 minut delikatnie wyjmuj próbki i pipetuj w górę i w dół, aby mechanicznie dysocjować komórki.</li>
</ol>
4. Izolacja komórek śródbłonka
<ol>
 <li>Przepuść roztwór kolagenazy komorowej przez filtr 70 μm, aby usunąć pozostałe grudki komórek.</li>
 <li>Odwirować komórki przy 400 x g przez 10 minut. Odrzucić supernatant, zastąpić około 200 μl 10% FBS w DMEM i pipetować w górę i w dół, aby oddzielić komórki.</li>
 <li>Powtórz poprzedni krok raz. Odwirować komórki przy 400 x g przez 10 minut po drugim 10% płukaniu FBS/DMEM. Ponownie zawiesić komórki w 50 μl 10% FBS/DMEM.</li>
 <li>Podczas ostatniego etapu wirowania przygotuj kulki.
 <ol>
 <li>Umieść probówkę Eppendorfa zawierającą przeciwciało i kulki na magnesie na 1 minutę.</li>
 <li>Gdy rurka jest umieszczona na magnesie, usuń supernatant. Wyjmij rurkę z magnesu i dodaj około 100 μl 10% FBS/DMEM.</li>
 <li>Umieść probówkę na magnesie na 1 minutę. Usuń supernatant i ponownie przemyj 10% FBS/DMEM. Powtórz w sumie 3 prania.</li>
 <li>Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić kulki sprzężone z przeciwciałami w 10% FBS/DMEM (5 μl na próbkę).</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Do każdej próbki komórki dodaj 5 μl kulek sprzężonych z przeciwciałami. Umieścić zawiesiny komórek perełkowych w temperaturze 4 °C z kołysaniem przez 30 minut.</li>
 <li>W okapie z przepływem laminarnym umieść probówki Eppendorfa zawierające komórki i kulki sprzężone z przeciwciałami na magnesie na 1 minutę. Usuń supernatant, wyjmij probówki z magnesu i przemyj około 100 μl 10% FBS/DMEM. Powtórz dla 5 prań.</li>
 <li>Po ostatnim praniu umieść probówki na magnesie na 1 minutę, usuń supernatant i wyjmij rurki z magnesu. Dodać około 100 μl DMEM.</li>
 <li>Umieść probówki na magnesie na 1 minutę, usuń supernatant i wyjmij rurki z magnesu. Dodaj 100-200 μl podgrzanej 0,25% trypsyny-EDTA. Próbki inkubować w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 przez 5 minut.</li>
 <li>Umieść probówki na magnesie na 2 minuty. Ostrożnie przenieś supernatant zawierający komórki do świeżych probówek Eppendorfa. Wirować przez 5 minut przy 400 x g.</li>
 <li>Usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w pożywce wzrostowej o objętości 80-100 μl i umieścić na płytce w naczyniu hodowlanym poddanym działaniu 96 lub 384 dołków, w zależności od oczekiwanej wydajności (około 450-600 komórek z komór zarodków E14,5-E16,5). W przypadku komórek śródbłonka należy użyć pożywki do hodowli wzrostu śródbłonka (zdefiniowanej poniżej).</li>
</ol>

<ol><li>Landecker, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLandecker%2C+H+%22Culturing+Life%3A+How+Cells+Became+Technologies%22">Culturing Life: How Cells Became Technologies</a>. , Presidents and Fellows of Harvard College. (2007).</li>
<li>Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+dysfunction+and+cytoskeletal+changes+associated+with+repression+of+p16%28INK4a%29+during+immortalization%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization.</a> Oncogene. , (2012).</li>
<li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+endothelium%3A+an+emphasis+on+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Thromb.+Hemost%22%5BJournal%5D)">Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity.</a> Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).</li>
<li>Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissues.+Characterization+of+two+endothelial+cell+lines+from+the+murine+lung+and+subcutaneous+sponge+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).</li>
<li>van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).</li>
<li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels%3A+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).</li>
<li>Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+angiogenesis%3A+endothelial+cell+tube+formation+on+gelled+basement+membrane+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract.</a> Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).</li>
<li>Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+kidney+fibrosis+emerge+via+endothelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology+%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition.</a> Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).</li>
<li>Chang, L., Noseda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+vascular+smooth+muscle+cells+from+local+precursors+during+embryonic+and+adult+arteriogenesis+requires+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling.</a> PNAS. 109, 5993-6998 (2012).</li>
<li>Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+lung+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine lung endothelial cells.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).</li>
<li>Frauli, M., Ludwig, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+a+culture+of+human+endometrial+stromal+cells+using+a+medium+containing+D-valine%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Gynecology+and+Obstetrics%22%5BJournal%5D)">Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).</li>
<li>Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+L-valine+reduced+selective+media%5BTitle%5D)+AND+%22Research+communications+in+chemical+pathology+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media.</a> Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).</li>
<li>Arima, S., Nishiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+morphogenesis+driven+by+dynamic+and+heterogeneous+collective+endothelial+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement.</a> Development. 138, 4763-4776 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Praca z pierwotnymi komórkami embrionalnymi pozwala na przeprowadzanie nowatorskich eksperymentów w celu zbadania krytycznych etapów rozwoju in vitro . Procedura izolacji nie jest jednak trywialna. Kluczowe kroki izolowania dowolnego rodzaju komórek obejmują upewnienie się, że komórki są dobrze oddzielone po trawieniu kolagenazy, a następnie, że są dobrze zawieszone podczas etapów mycia. Mechaniczna sekcja przez pipetowanie znacznie pomaga oddzielić komórki na etapie kolagenazy, a etap filtrowania usuwa grudki...

Pojawienie się nieśmiertelnych linii komórkowych zrewolucjonizowało podstawową biologię komórki1. Obecnie dostępne linie komórkowe pochodzą z szerokiej gamy narządów i obejmują wszystkie główne typy komórek. Jednak ustalone linie komórkowe mają pewne ograniczenia. Proces nieśmiertelności oczywiście zmienia zachowanie komórek, szczególnie w odniesieniu do długości życia i proliferacji, ale może również wpływać na ekspresję nieoczekiwanych białek, takich jak białka cytoszkieletu 2. Ponadto, chociaż dostępnych jest wiele różnych linii komórkowych, istnieje znaczna różnorodność nawet wśród jednego typu komórek w całym organizmie. W szczególności komórki śródbłonka wykazują różne zachowania w zależności od tego, czy wyściełają tętnice czy żyły i jaki rodzaj przepływu jest obecny w naczyniu 3. Jeszcze bardziej palące z punktu widzenia rozwoju jest jednak to, że zdecydowana większość dostępnych linii komórkowych pochodzi z tkanek dorosłych (patrz np. kolekcja dostępna za pośrednictwem ATCC). Te dorosłe linie komórkowe prawdopodobnie nie oddają dynamicznej natury swoich embrionalnych prekursorów. Szybko zmieniające się czasoprzestrzenne wzorce ekspresji genów obserwowane podczas rozwoju sugerują również, że komórka śródbłonka z jednego narządu na danym etapie rozwoju może nie zachowywać się tak samo, jak komórka śródbłonka z tego samego narządu na innym etapie rozwoju.
Jako alternatywa dla korzystania z komercyjnie dostępnych nieśmiertelnych linii komórkowych, komórki pierwotne mogą być izolowane z konkretnej tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Jedną z zalet tej techniki jest to, że te pierwotne komórki można wyizolować z określonego narządu lub nawet części narządu na dowolnym określonym etapie rozwoju. Co więcej, te pierwotne komórki można wyizolować z szerokiej gamy dostępnych zwierząt transgenicznych, co pozwala na badanie in vitro nokautu genów i knock-in, unikając jednocześnie innych problemów, takich jak wydajność transfekcji. Nic dziwnego, że opublikowano wiele technik szczegółowo opisujących, jak izolować określone typy komórek 4,5. Ogólnie rzecz biorąc, techniki te obejmują zbieranie obszaru zainteresowania, dysocjację komórek, oznaczanie określonego typu komórek zainteresowania i izolowanie tych komórek do dalszej analizy.
Aby zbadać wczesną populację embrionalną komórek śródbłonka wieńcowego, zmniejszyliśmy wcześniej opublikowaną technikę4 do użycia z mniejszym organem. Dzięki tej zmniejszonej procedurze możemy wyizolować komórki śródbłonka naczyń wieńcowych z serca embrionalnego w określonych stadiach embrionalnych. Komórki te można następnie wykorzystać w tradycyjnych testach śródbłonka, takich jak analizy migracji. Dopóki wczesne linie komórkowe embrionalne nie staną się bardziej rozpowszechnione, praca z komórkami pierwotnymi jest nieocenioną techniką.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silne>ODCZYNNIKI</td></tr> <tr><td>myszy w ciąży</td><td></td><td></td> w ciąży w czasie <td>Do przeprowadzenia na etapie embrionalnym będącym przedmiotem zainteresowania</td></tr><tr><td>Anty-mysie CD31</td><td>BD Bioscience</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG Dynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>110-35</td><td></td></tr><tr><td>Collagen</td><td>BD Bioscience</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza, typ I</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka</td> <td>(wykonana w laboratorium, jak opisano w notatkach)</td><td></td> <td>DMEM zawierający 20% FBS, 5 i mu; M &#946;-mercapt&#8211; Tanol, 50 &mu; g/ml EKG i 1x penicylina/streptomycyna</td></tr><tr><td>&#946;-mercapt&#8211; tanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>EKG</td><td>Technologie biomedyczne, Inc.</td><td>BT-203</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>384-dołkowa płytka hodowlana</td><td>Greiner</td><td>T-3037-6</td><td>Płytka została przygotowana z cienkim żelem kolagenowym, zgodnie z opisem w 6; powierzchnia robocza 10 mm2</td></tr><tr><td>Kolagen typu I</td><td>BD</td><td>354236</td><td>Stosować w momencie końcowym stężenie 1,5 mg/ml</td></tr><tr><td>M199, 10x</td><td>Invitrogen</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>Syto-16</td><td>Invitrogen</td><td>S7578</td><td>Używany zgodnie z zaleceniami w 13 </td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator kultur komórkowych</td><td>Thermo</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Thermo</td><td>75002430</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja embrionalnych komórek śródbłonka komór

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Hodowla komórkowa znacznie zwiększyła naszą zdolność do oceny poszczególnych populacji komórek w niezliczonych warunkach hodowli. Podczas gdy unieśmiertelnione linie komórkowe oferują znaczące korzyści ze względu na łatwość użycia, te linie komórkowe są niedostępne dla wszystkich potencjalnych typów komórek. Izolując komórki pierwotne z określonego regionu zainteresowania, w szczególności od myszy transgenicznej, można przeprowadzić bardziej zniuansowane badania. Podstawowa technika polega na rozbiorze narządu lub części narządu będącego przedmiotem zainteresowania (np. serca lub określonego obszaru serca) i dysocjacji narządu na pojedyncze komórki. Komórki te są następnie inkubowane z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z przeciwciałem, które rozpoznaje typ komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Interesujące komórki można następnie wyizolować za pomocą magnesu, z krótką inkubacją trypsyny oddzielającą komórki od kulek. Te izolowane komórki mogą być następnie hodowane i analizowane zgodnie z potrzebami. Technika ta została pierwotnie zaprojektowana dla dorosłych narządów myszy, ale można ją łatwo zmniejszyć do użytku z narządami embrionalnymi, jak pokazano tutaj. Ponieważ interesuje nas rozwijające się naczynia wieńcowe, chcieliśmy zbadać tę populację komórek w określonych stadiach embrionalnych. W związku z tym pierwotny protokół musiał zostać zmodyfikowany, aby był zgodny z małymi rozmiarami komór embrionalnych i niską potencjalną wydajnością komórek śródbłonka na tych etapach rozwoju. Wykorzystując to zmniejszone podejście, oceniliśmy przebudowę splotu wieńcowego w transgenicznych embrionalnych komórkach śródbłonka komór.

Przy użyciu przeciwciała specyficznego dla śródbłonka rozpoznającego CD31 wyizolowano komórki śródbłonka z komór przybrzusznymi zarodków w dniach embrionalnych (E) 13,5 (Ryc. 1A) i 18,5 (Ryc. 1B-1D). Podczas hodowli na nieprzetraktowanej płytce hodowlanej komórki te pozostają okrągłe i tworzyłyby wzór brukowany w stanie bliskim konfluencji (Ryc. 1A). Do pokrycia dołków stosowano również rozcieńczony kolagen; choć komórki śródbłonka przylegają do niego (Ryc. 1B</s...

Pierwotna hodowla komórkowa jest użyteczną techniką do analizy określonych populacji komórek, szczególnie z transgenicznych zarodków myszy w określonych stadiach rozwoju. W tym przypadku komory embrionalne są preparowane i dysocjowane, a kulki sprzężone z przeciwciałami rozpoznają i oddzielają komórki śródbłonka do dalszej analizy.

Izolacja embrionalnych komórek śródbłonka komór

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Ogólnym celem tej procedury jest izolacja embrionalnych komórek śródbłonka komór serca. Jest to realizowane poprzez najpierw pobranie embrionu do sekcji. Następnie wycina się serce.Usunięte przedsionki oraz rozdrobnione komory przenosi się do roztworu kolagenu. Zawiesinę pojedynczych komórek inkubuje się następnie z przeciwciałem rozpoznającym komórki śródbłonka. Na koniec, za pomocą magnesu izoluje się komórki śródbłonka związane z przeciwciałami.Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące tworzenie się łańcuchów śródbłonka za pomocą mikroskopii w świetle przechodzącym. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny rozwoju układu sercowo-naczyniowego, takie jak to, jakie czynniki promują migrację śródbłonka wieńcowego. Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w zachowanie komórek śródbłonka, można ją również zastosować do innych typów komórek, takich jak miocyty i fibroblasty. Dzień przed przeprowadzeniem sekcji, pracując w komorze do hodowli tkanek, należy połączyć wybrane przeciwciało z odpowiednimi kuleczkami dyna beads, zgodnie z instrukcjami producenta dla zastosowanego tutaj przeciwciała szczurzego anty-CD 31.Do 25 µL kulek dodaje się 3 µL przeciwciała, aby uzyskać końcowe stężenie 1,5 µg na 10⁷ kulek; kulki inkubuje się w przeciwciele przez noc w temperaturze 4 °C. Aby przygotować żele kolagenowe do szybkiego tworzenia cewek z wyizolowanych komórek, w komorze laminarnej na lodzie łączy się kolagen typu I, sterylną wodę, 10× M199 oraz 5 M wodorotlenek sodu. Zgodnie z protokołem tekstowym, do studzienek płytki hodowlanej 384-dołkowej pipetuje się 20 µL żelu kolagenowego.Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37 °C na 30 minut. Do każdego dołka dodaj 80 µL DMM i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Usuń pożywkę hodowlaną i powtórz płukanie jeszcze dwa razy; po ostatnim płukaniu dodaj do każdego dołka 80 µL 10%FBS DM i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C.Po uśmierceniu myszy w określonym dniu ciąży, stosując zatwierdzoną technikę i usuwając róg macicy zgodnie z protokołem tekstowym, należy umieścić go w szalce Petriego z roztworem XPBS i wypłukać. Po odsłonięciu pęcherzyków zarodkowych poprzez nacięcie w linii środkowej na złączeniu łożyska z zarodkiem, należy rozciąć pęcherzyk zarodkowy i wyłowić zarodek.Umieść embrion w drugiej szalce Petriego z zimnym PBS, a róg macicy przenieś z powrotem na lód, aby ułatwić dostęp do ściany klatki piersiowej i zdekapitować embrion. W przypadku genotypowania odetnij ogon i przechowuj go w probówce na lodzie. Połóż embrion na plecach i wykonaj nacięcie.Otwórz klatkę piersiową, aby uwidocznić serce i płuca i uniknąć przecięcia serca. Wykonaj cięcie pionowe wzdłuż klatki piersiowej w pobliżu kończyny, a następnie cięcie poziome u podstawy żeber. Następnie delikatnie odciągnij ścianę klatki piersiowej do góry i na bok, stosując tę metodę do około 13,5 dnia embrionalnego.Ściana klatki piersiowej jest przezroczysta, co ułatwia wizualizację. Za pomocą pęsety ostrożnie unieś serce i przetnij naczynia poniżej. W razie potrzeby przenieś serce do czystego naczynia, aby oddzielić je od płuc, przecinając naczynia powyżej wielkich naczyń krwionośnych.Następnie oddzielić i usunąć przedsionki oraz główne naczynia od komór. Potem, za pomocą nożyczek, posiekać komory na małe kawałki i umieścić je w około 500 µL kolagenazy w lodzie. Wyciąć i przetworzyć komory z pozostałych embrionów, zbierając każde serce do osobnej probówki.Umieścić rozdrobnione komory w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez 45 minut. Co 15 minut delikatnie wyjmować próbki i pipetować je w górę i w dół, aby mechanicznie dysocjować komórki. Po inkubacji przefiltrować roztwór komór z kolagenazą przez filtr 70 µm w celu usunięcia pozostałych grudek komórek, odwirować komórki z prędkością 400 G przez 10 minut, odlać nadsącz i zastąpić go około 200 µL 10% FBS w DMEM. Pipetować w górę i w dół, aby resuspendować komórki, ponownie odwirować je, a następnie po drugim przemyciu i wirowaniu resuspendować komórki w 50 µL 10% FBS w DMEM.Następnie przygotuj kuleczki, umieszczając najpierw probówkę z przeciwciałem i kuleczkami na magnesie przez jedną minutę, a następnie odsysając nadsącz. Po tym zdejmij probówkę z magnesu i dodaj około 100 µL 10% FBS w dmm. Ponownie umieść probówkę na magnesie na jedną minutę, a następnie usuń nadsącz.Powtórz płukanie łącznie trzy razy po ostatnim przemyciu. Resuspenduj koraliki sprzężone z przeciwciałem w 10% FBS w DMM do każdej próbki komórek, dodając pięć µL koralików sprzężonych z przeciwciałem. Umieść zawiesiny koralików z komórkami w temperaturze 4 °C na wytrząsarce przez 30 minut w komorze z laminarnym przepływem powietrza, następnie umieść próbki na magnesie na jedną minutę i odessaj nadsącz.Wyjmij probówki z magnesu i przemyj je około 100 µL 10% FPS oraz dm. Powtórz czynność, aby w sumie wykonać pięć płukań po ostatnim przemyciu. Zzawiesź kuleczki w około 100 µL DMEM.Umieść probówki na magnesie na jedną minutę. Usuń medium, a następnie dodaj 100 do 200 µL podgrzanego roztworu 0,25% trypsyny w EDTA i inkubuj próbki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez pięć minut. Umieść probówki na magnesie na dwie minuty.Następnie ostrożnie przenieś komórki zawierające nadsącz do nowych probówek i wiruj je przez pięć minut przy 400 G. Na koniec, po usunięciu nadsączu, resuspenduj komórki w 80 do 100 µL medium do wzrostu komórek śródbłonka i wysiej je w 96- lub 384-dołkowej płytce hodowlanej, w zależności od oczekiwanej wydajności. Każda para komór komorowych z embrionów od E 14.5 do E 16.5 zazwyczaj daje od 450 do 600 komórek, co wykazano tutaj przy użyciu swoistego przeciwciała przeciwko śródbłonkowi rozpoznającego CD 31. Komórki śródbłonka wyizolowano z komór komorowych embrionów w dniu E 13.5.W przypadku hodowli na niepreparowanej szalce hodowlanej komórki te pozostają okrągłe i tworzą wzór brukowany w stanie bliskim konfluencji. Choć komórki te przylegają do płytek pokrytych rozcieńczonym kolagenem, komórki wyizolowane z komór komorowych w dniu E 18.5 tworzą mniej łańcuchów niż w przypadku pokrycia żelem kolagenowym. Dodatkowo, jako potwierdzenie ich tożsamości, komórki szybciej tworzą interakcje międzykomórkowe i formują łańcuchy oraz rozgałęzienia na żelu kolagenowym w porównaniu do płytki pokrytej kolagenem.Komórki na tej rycinie wykazują pozytywne barwienie z markerem śródbłonkowym ISO-selektyną. Ponadto, jak pokazano tutaj, komórki śródbłonka wyizolowane z komór mózgu w stadium E 18.5 były dodatnie w odniesieniu do markerów śródbłonkowych PAM oraz flick one. Rycina ta przedstawia komórki śródbłonka wyizolowane z komór mózgu zarodka w stadium E 14.5, zabarwione specyficznym dla śródbłonka barwnikiem cyto.16 wyizolowanych komórek przeżywa do jednego tygodnia hodowli, lecz są one oporne na pasażowanie, w związku z czym najlepiej nadają się do eksperymentów końcowych. Po opanowaniu, technika ta może zostać wykonana w około trzy i pół godziny, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne testy, takie jak testy tworzenia cewek oraz testy migracji w komorach Transwell, aby określić, jak wyizolowane komórki zachowują się in vitro.

isolation-of-embryonic-ventricular-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja komórek śródbłonka komór przedsionków zarodkowych

Niniejszy protokół wideo przedstawia izolację i hodowlę ludzkich komórek śródbłonka żyły pępekowej (HUVEC) z ludzkiej pępowiny. Po izolacji komórki te mogą być wykorzystywane w testach angiogenezy in vitro, takich jak zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego, zaprezentowany również przez laboratorium Hughesa.<br...

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)

Przedstawiamy metodę izolacji i hodowli czystych populacji komórek śródbłonka zastawek serca (VEC). Komórki VEC można izolować z obu stron cuspisu lub płatka zastawki, a bezpośrednio po tym procesie możliwe jest łatwe wyizolowanie znajdujących się pod nimi komórek śródmiąższowych (VIC).

Izolacja komórek śródbłonka zastawek

Niniejszy artykuł przedstawia metodę izolacji i hodowli zarodków przepiórki lub kury na etapie HH14.- komórki endokardialne zastawki oraz mezenchymalne komórki poduszeczki zastawkowej w stadium HH25.

Izolacja i hodowla zarodkowych komórek progenitorowych zastawek ptasich

W niniejszej pracy opisujemy protokół izolacji i hodowli mysich komórek śródbłonka płuc. Metoda ta obejmuje mechaniczną i enzymatyczną dysocjację tkanki płucnej oraz dwuetapowy proces oczyszczania z wykorzystaniem przeciwciał anty-PECAM-1 oraz anty-ICAM-2 sprzężonych z kuleczkami magnetycznymi, co pozwala na uzyskanie czystej populacji komórek śródbłonka pochodzenia głównie naczyniowego mikroskopowego.

Izolacja i hodowla komórek śródbłonka płuc noworodków myszy

Ten film demonstruje łatwą i niezawodną strategię przygotowania czystych kultur komórek śródbłonka z embrionalnej przodomózgowia w ciągu 10-12 dni i będzie przydatny do badań skoncentrowanych na wielu aspektach angiogenezy mózgowej.

Izolacja i hodowla komórek śródbłonka z zarodka przodomózgowia

Zdolność do izolowania komórek śródbłonka zastawki serca (VEC) jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów rozwoju, utrzymania i choroby zastawki.  W tym miejscu opisujemy izolację VEC od embrionalnych i dorosłych myszy Tie2-GFP za pomocą FACS, co pozwoli na badania określające udział VEC w procesach rozwojowych i chorobowych.

Izolacja komórek śródbłonka mysiej zastawki

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) pochodzą z wyspecjalizowanych (hemogennych) komórek śródbłonka podczas rozwoju, jednak niewiele wiadomo o procesie, w którym niektóre komórki śródbłonka decydują się na ukrwienie. Przedstawiono metodę opartą na cytometrii przepływowej, pozwalającą na jednoczesną izolację hemogennych komórek śródbłonka i HSPC z mysich tkanek embrionalnych.

Izolacja mysich embrionalnych hemogennych komórek śródbłonka

Celem tego protokołu jest odizolowanie komórek progenitorowych śródbłonka od krwi pępowinowej. Niektóre z zastosowań obejmują wykorzystanie tych komórek jako biomarkera do identyfikacji pacjentów z ryzykiem sercowo-naczyniowym, leczenia chorób niedokrwiennych oraz tworzenia konstruktów naczyń krwionośnych i zastawek serca za pomocą inżynierii tkankowej.

Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych z ludzkiej krwi pępowinowej

Przedstawiamy protokół izolacji komórek śródbłonka wsierdzia i naczyń wieńcowych z serc szczurów poprzez sekwencyjne trawienie tkanek w buforze trawiennym, pobieranie komórek z powtarzających się cykli wirowania i oczyszczanie komórek za pomocą mikrogranulek anty-szczurzych CD31.

Izolacja komórek śródbłonka wsierdzia i naczyń wieńcowych z wolnej ściany komory serca szczura

Obecny protokół opisuje ostrą izolację żywotnych komórek mięśni gładkich serca i naczyń krwionośnych od dorosłego, młodocianego, larwalnego i embrionalnego danio pręgowanego (Danio rerio), nadającego się do badań elektrofizjologicznych.

Izolacja komórek mięśni gładkich serca i naczyń krwionośnych od dorosłych, młodocianych, larwalnych i embrionalnych danio pręgowanego do badań elektrofizjologicznych

Chociaż jest to trudne, izolacja komórek śródbłonka płuc jest niezbędna do badań nad zapaleniem płuc. Niniejszy protokół opisuje procedurę wysokowydajnej izolacji komórek śródbłonka makronaczyniowego i mikronaczyniowego o wysokiej czystości.

Izolacja i oczyszczanie komórek śródbłonka mikronaczyniowego i makronaczyniowego z próbek pochodzących z płuc

Poznaj metodę izolacji embrionalnych komórek śródbłonka komór z mysich zarodków transgenicznych. Technika ta wykorzystuje kolagenazę, przeciwciała i separację magnetyczną do uzyskania czystych populacji komórek.

Izolacja embrionalnych komórek śródbłonka komór

Przeglądaj więcej filmów