Name: Izolowany, częściowo nienaruszony preparat nabłonka czuciowego przedsionkowego myszy do elektrofizjologii i mikroskopii dwufotonowej o wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Poznaj metodę izolacji częściowo nienaruszonego nabłonka przedsionkowego myszy do badań elektrofizjologicznych i mikroskopii dwufotonowej. Technika umożliwia zachowanie fizjologicznych warunków komórek włoskowatych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tej pracy zostało zapewnione przez grant Garnett Passe and Rodney Williams Memorial Foundation Project dla R. i A.J. Campa.

1. Zwierzęta
<ol>
	<li>Myszy pozyskano z Australian Rodent Centre (ARC; Perth, Australia) i utrzymywano w Bosch Animal Facility Uniwersytetu w Sydney w standardowym 12-godzinnym cyklu światło/ciemność z wzbogaceniem środowiskowym. Wszystkie opisane eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki ds. Zwierząt Uniwersytetu w Sydney.</li>
	<li>Do wszystkich doświadczeń wykorzystano myszy samce i samice (C57/Bl6), ponieważ szczep ten jest powszechnie stosowany jako tło do manipulacji genetycznych i może być uznany za równoważny typowi dzikiemu (wildtype) 8-9.</li>
</ol>
2. Przygotowanie tkanki
<ol>
	<li>Przygotować 300 ml glicerolowego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) składającego się z (w mM): 26 NaHCO3, 11 glukozy, 250 glicerolu, 2,5 KCl, 1,2 NaH2PO4, 1,2 MgCl2 oraz 2,5 CaCl2. Przed dodaniem CaCl2 nasycić roztwór karbogenem (95% O2 i 5% CO2), aby ustalić pH na poziomie 7,4 i zapobiec wytrącaniu się wapnia (zmętnieniu). Zamrozić roztwór w zamrażarce o temperaturze -80 °C przez 45 min, aż powstanie zawiesina lodowa.</li>
	<li>Głęboko zanieczulić myszy ketaminą (100 mg/kg) (Parnell, Alexandria, Australia) poprzez wstrzyknięcie doszpikowe.</li>
	<li>Po ustąpieniu odruchówy pinch kończyn tylnych zdekapitować myszy za pomocą ostrych nożyczek ze stali nierdzewnej i wykonać cięcie skórne w płaszczyźnie strzałkowej za pomocą żyletki (zaokrąglona #22), aby odsłonić czaszkę. Na tym etapie oraz w krokach 2.3–2.8 sklepienie czaszki, mózg i znajdujący się pod nimi aparat przedsionkowy należy utrzymywać w jak najniższej temperaturze poprzez regularne aplikowanie lodowatego ACSF na tkankę.</li>
	<li>Używając szpiczastego ramienia standardowych nożyczek (FST, North Vancouver, Canada), wykonać niewielkie nacięcie w czaszce w okolicy lambda i przeciąć wzdłuż szwu strzałkowego. Należy upewnić się, że mózg nie jest „przeciągany” przez ostrze nożyczek podczas tego kroku.</li>
	<li>Ostrożnie odsunąć kości ciemieniowe bocznie, a kość potyliczną tylnie, używając kleszczyków kostnych Pearsona z płytkim zagięciem (FST).</li>
	<li>Następnie za pomocą małej szpatułki ze stali nierdzewnej delikatnie unieść mózg z powierzchni środkowej i tylnej jamy czaszki, a odsłonięty nerw przedsionkowo-ślimakowy (CNVIII) przeciąć w połowie drogi między uchem wewnętrznym a pniem mózgu za pomocą cienkich nożyczek irydowych. Przecięcie tego nerwu minimalizuje nadmierne napięcie aksonów pierwotnych aferentów i ich połączeń z komórkami rzęskowymi.</li>
	<li>Po przecięciu CN VIII usunąć mózg in toto.</li>
	<li>Labirynt przedsionkowy jest teraz wyraźnie widoczny w środkowej jamie czaszki, przy czym ślimak jest skierowany przednio-przyśrodkowo. Użyć kleszczyków kostnych po obu stronach labiryntu przedsionkowego, a następnie delikatnie go wyciąć, chwytając przedni kanał półkolisty i pociągając bocznie.</li>
	<li>Zanurzyć wycięte labirynty (Rysunek 1) w naczyniu sekcyjnym zawierającym lodowaty, stale nasycony gazem ACSF opisany w sekcji 2.1. Pod stereomikroskopem przytrzymać labirynt do dna naczynia, chwytając ślimaka. Używając precyzyjnej pęsety, zdrapać kość pokrywającą bańkę przedniego kanału półkolistego. Po uzyskaniu niewielkiego otworu w kości zacząć odrzucać fragmenty kości z bańki. Należy zachować ostrożność, aby nie przepchnąć pęsety przez kość, ponieważ może to spowodować uszkodzenie leżącego pod nią labiryntu błoniastego i nabłonka sensorycznego. Kontynuować tę procedurę do momentu odsłonięcia błoniastych przewodów i baniek przedniego oraz przyległego poziomego kanału półkolistego (Rysunek 2).</li>
</ol>
<img alt="Schemat anatomii ucha wewnętrznego i obraz mikroskopowy; ślimak, analiza SSC, porównanie struktur." src="/files/ftp_upload/50471/50471fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Wyizolowany labirynt błędnika myszy. A. Panel lewy) Schematyczne przedstawienie wyizolowanego labiryntu błędnika myszy. Oznaczono kluczowe punkty orientacyjne umożliwiające dostęp do nabłonka sensorycznego błędnika, ślimaka oraz przedniego i poziomego kanału półkolistego. Gwiazdki wskazują ampułkę kanału półkolistego zawierającą nabłonek sensoryczny błędnika. B. Panel prawy) Fotomikrografia wyizolowanego labiryntu błędnika od miesięcznej myszy.
<img alt="Schemat anatomii ucha wewnętrznego; obraz mikroskopowy przedstawiający kanały półkoliste, CNVIII, narządy zmysłów." src="/files/ftp_upload/50471/50471fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Obnażenie błonnego labiryntu przedsionkowego. Kość pokrywająca ampule przedniego i poziomego kanału półkolistego została zdrapana, aby odsłonić czarno-brązowe, nakrapiane ampule błonaste oraz powiązane z nimi nerwy ampularne (CNVIII). Schemat w dolnym panelu przedstawia struktury w zaznaczonym obszarze mikrofotografii i pokazuje relację między przewodami kanałów półkolistych a ampulami i CNVIII.
<ol start="10">
	<li>Za pomocą precyzyjnej pęsety delikatnie unieś ampulle i powiązany z nimi utriculus od błędnika kostnego, dbając o to, aby nie uszkodzić centralnego obszaru ampull (zawierającego nabłonek sensoryczny). W niektórych przypadkach może być konieczne przecięcie proksymalnej części błoniastego przewodu półkolistego nożyczkami irydologicznymi, aby odseparować ampulle od kości.</li>
	<li>Przenieś triadę zawierającą obie ampulle i utriculus do szalki Petriego wypełnionej pożywką kulturacyjną Leibovitz's L-15 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Wykorzystaj światłowód do podświetlenia tkanki od tyłu. Pozwala to na wyraźną wizualizację grzebienia (crista) zawierającego nabłonek sensoryczny wewnątrz ampull.</li>
	<li>Używając precyzyjnych nożyczek irydologicznych, ostrożnie wykonaj nacięcie w nakrapianym „daszku” utriculus. Kontynuuj nacięcie przez daszek ampulli przedniej, a następnie poziomej. Wykonaj nacięcie jak najbliżej krawędzi nabłonka sensorycznego, unikając kontaktu z nim (Rysunek 3A). Upewnij się, że nad nabłonkiem sensorycznym nie pozostały fragmenty błony (Rysunek 3B).</li>
	<li>Przenieś wyizolowany, częściowo nienaruszony preparat do małej komory rejestracyjnej z szklanym dnem wypełnionej pożywką L-15. Przymocuj preparat za pomocą siatki z cienkich nylonowych włókien zamocowanych do spłaszczonego, U-kształtnego drutu platynowego (Rysunek 3B). W idealnym przypadku włókna siatki nie powinny zakrywać nabłonka sensorycznego, jednak w sytuacjach wymagających większej stabilności można zastosować pojedyncze włókno przecinające nabłonek sensoryczny.</li>
</ol>
<img alt="Układ elektrofizjologiczny do badania ampuli; rozmieszczenie elektrod na grzebieniu; schemat anatomiczny." src="/files/ftp_upload/50471/50471fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Izolowany preparat półzachowany nabłonka sensorycznego błędnika. A. Schematyczne przedstawienie preparatu półzachowanego i konfiguracji elektrod. Ampula pokrywająca grzebień została „odsłonięta”, aby wyeksponować powierzchnię nabłonka sensorycznego (kolor zielony). B. Fotomikrografia półzachowanego preparatu typu „triada”, pokazująca grzebień przedni (ac) i poziomy (hc) (utriculus przesłonięty za ac). Zwróć uwagę na nylonowe włókno użyte do przymocowania preparatu do podstawy komory rejestracyjnej. Pasek skali: 100 μm. C. Elektroda rejestrująca umieszczona na pojedynczej komórce rzęsnej błędnika. Pasek skali: 15 μm.
3. Elektrofizjologia
<ol>
	<li>Przepłukaj półzachowany preparat stale natlenionym medium L-15. Medium zawiera wskaźnik pH (czerwień fenolową) i kolor medium powinien być monitorowany podczas wszystkich pomiarów. pH w obecności tlenu powinno wynosić 7,3-7,4 i odpowiadać kolorowi czerwonemu.</li>
	<li>Przygotuj pipety rejestrujące ze szkła borokrzemianowego o średnicy 1,5 mm (średnica wewnętrzna 1,19 mm), stosując dwuetapowy protokół (stopień grzania 1: 72; stopień grzania 2: 50) w wyciągaczu mikropipet (Narishige, Japonia, model PP-830), aby uzyskać końcową impedancję 3-4 MΩ.</li>
	<li>Wypełnij trzon pipety 3-4 mm wewnętrznym roztworem na bazie fluorku potasu zawierającym (w mM) 110 KF, 12 KCl, 27 KOH, 1 NaCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 1,8 MgCl2, 3 D-glukozy oraz 2 Na-ATP; pH 7,4 skorygowane KOH.</li>
	<li>Owiń trzon pipety 2-3 razy, jak najbliżej końcówki, cienkim paskiem parafilmu, aby odizolować elektrodę i zmniejszyć pojemność pipety.</li>
	<li>Ustaw pipetę nad nabłonkiem sensorycznym przy niskim powiększeniu (5X) w mikroskopie odwróconym (Olympus BX51). Przełącz na wysokie powiększenie (40X) i zlokalizuj pojedyncze komórki rzęsate błędnika za pomocą podłączonej kamery CCD.</li>
	<li>Umieść pipetę na błonie zlokalizowanej komórki rzęsatej (Rysunek 3C) za pomocą mikromanipulatora (Sutter Instruments, Kalifornia, USA). Po uzyskaniu uszczelnienia gigaohmowego przerwij błonę komórkową, przykładając niewielką wartość podciśnienia przez port ssący w uchwycie pipety.</li>
	<li>Wykonaj rejestrację metodą voltage clamp w konfiguracji whole-cell, stosując standardowe techniki 8-9.</li>
</ol>
4. Mikroskopia dwufotonowa
<ol>
	<li>Przygotować 0,9% roztwór soli fizjologicznej zawierający 5 mM Oregon Green 488 BAPTA-1 (OGB-1; sól heksapotasowa; Invitrogen, Niemcy).</li>
	<li> ideaćca zanurzona, umieścić „odkrytą” (de-roofed) preparację półzachowaną triady na małym kawałku papieru filtracyjnego (4x4 mm, grubość 0,8 μm; Millipore, Niemcy), upewniając się, że nabłonek sensoryczny nie jest zasłonięty od góry.</li>
	<li>Przenieść papier filtracyjny wraz z preparatem na pokrytą roztworem soli fizjologicznej platynową elektrodę bazową (7 μl) elektroporatora, składającego się z generatora impulsów i wzmacniacza szerokopasmowego, a następnie pokryć dodatkowymi 5 μl 5 mM roztworu syntetycznego barwnika wskaźnikowego wapnia Oregon Green 488 BAPTA-1 (Rycina 4).</li>
</ol>
<img alt="Schemat układu elektrochemicznego z elektrodami platynowymi; potencjalne zastosowanie w badaniu detekcji jonów." src="/files/ftp_upload/50471/50471fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Elektroporacja objętościowa. A. schemat przedstawiający przekrój poprzeczny konfiguracji elektroporacji. Preparat częściowo nienaruszony (*) umieszczono na kawałku papieru filtracyjnego zanurzonym w barwniku wapniowym (Oregon Green 488 BAPTA-1), a prąd przyłożono pomiędzy 2 elektrody platynowe. Adaptacja z Briggman i Euler, 2011 10.
<ol start="4">
	<li>Ustaw górną elektrodę platynową równolegle do elektrody podstawy w odległości około 2 mm, uważając, aby nie zaburzyć orientacji preparatu podczas kontaktu z roztworem Oregon Green 488 BAPTA-1.</li>
	<li>Przepuść krótki impuls prądu przez preparat (Parametry prądu: +13 V, szerokość impulsu 10 msec, częstotliwość 1 Hz, 10 impulsów prostokątnych) 10-11.</li>
	<li>Na dnie szklanej komory rejestracyjnej wypełnionej pożywką L-15 umieść niewielką ilość oleju silikonowego i ułożyć na nim półintegrałny preparat, ponownie upewniając się, że nabłonek sensoryczny nie jest zasłonięty od góry. Aby zapewnić stabilność podczas obrazowania, zamocuj nad preparatem siatkę nylonową zgodnie z powyższym opisem (patrz punkt 2.13).</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu dwufotonowego wykonaj rejestracje optyczne spontanicznej aktywności wapniowej w nabłonku sensorycznym (Rysunek 7), stosując standardowe protokoły obrazowania 10-11.</li>
</ol>

<ol><li>Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otoferlin+is+critical+for+a+highly+sensitive+and+linear+calcium-dependent+exocytosis+at+vestibular+hair+cell+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).</li>
<li>Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, , (2009).</li>
<li>Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, , (2009).</li>
<li>Chatlani, S., Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+recordings+from+calyx+endings+in+the+turtle+posterior+crista%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista.</a> 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, , (2010).</li>
<li>Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, , (2010).</li>
<li>Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vestibular+primary+afferent+activity+in+an+in+vitro+preparation+of+the+mouse+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear.</a> J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).</li>
<li>Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+accumulation+between+type+I+hair+cells+and+calyx+terminals+in+mouse+crista%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista.</a> Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).</li>
<li>Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+synaptic+transmission+differs+in+mouse+type+A+and+B+medial+vestibular+nucleus+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro.</a> J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).</li>
<li>Camp, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+glycine+receptor+function+reduces+excitability+of+mouse+medial+vestibular+nucleus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons.</a> Neuroscience. 170, 348-360 (2010).</li>
<li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).</li>
<li>Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+specificity+in+the+direction-selectivity+circuit+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina.</a> Nature. 471, 183-188 (2011).</li>
<li>Rennie, K. J., Streeter, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+currents+in+isolated+vestibular+afferent+calyx+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals.</a> J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).</li>
<li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog%2C+Rana+catesbeiana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 237-274 (1988).</li>
<li>Rennie, K. J., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+currents+in+isolated+vestibular+hair+cells+from+the+guinea-pig+crista+ampullaris%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Res%22%5BJournal%5D)">Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris.</a> Hear. Res. 51, 279-291 (1991).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Mechanizmom leżącym u podstaw naszego zmysłu równowagi poświęcono niewiele uwagi w porównaniu z innymi układami sensorycznymi, np. wzrokowym i słuchowym. Spośród badań, w których badano zmiany w funkcji przedsionkowej lub równowagi, większość koncentrowała się na pomiarach behawioralnych, w tym odruchu przedsionkowo-ocznym, z niepełną wiedzą na temat podstawowych elementów budulcowych równowagi - samych przedsionkowych komórek rzęsatych. Badania, które koncentrowały się na komórkach rzęsatych, prawie zawsze rob...

Pomimo znaczącego wkładu układu przedsionkowego w nasze codzienne życie, jasne zrozumienie procesów odpowiedzialnych za obserwowany spadek funkcji przedsionkowej wraz z wiekiem pozostaje nieuchwytne. Jednym z powodów tego braku wiedzy jest to, że spadek funkcji przedsionkowej był prawie wyłącznie badany za pomocą testów behawioralnych, w tym odruchu przedsionkowo-ocznego (VOR), precyzyjnego wskaźnika zewnętrznej funkcji przedsionkowej, ale zapewnia ograniczony wgląd w zmiany składników wewnętrznych. Jest to główna przeszkoda w naszym zrozumieniu funkcji przedsionkowych komórek rzęsatych w zdrowiu, chorobie lub starzeniu się.
Chociaż przeprowadzono wiele badań nad pojedynczymi komórkami rzęsatymi przedsionkowymi, głównym mankamentem było poleganie na preparatach z ostrymi komórkami rzęsatymi, gdzie komórki rzęsate, a nawet zakończenia aferentne kielicha są usuwane z ich normalnego środowiska poprzez obróbkę mechaniczną i/lub enzymatyczną. Takie podejścia nieuchronnie zaburzają delikatną mikroarchitekturę między komórką rzęsatą a kielichem oraz komórką rzęsatą a komórką podporową. Wraz z opracowaniem częściowo nienaruszonych preparatów 1-5 i izolowanego preparatu błędnika myszy 6, istnieje teraz możliwość zbadania różnych form komunikacji synaptycznej w warunkach, które bardziej przypominają te in vivo. Rzeczywiście, Lim i in. (2011) wykazali wyraźne różnice w prądach całych komórek zarejestrowanych z ostro izolowanych komórek rzęsatych przedsionkowych typu I w porównaniu z tymi, które pozostały osadzone w nabłonku nerwowym. W szczególności uważa się, że potas gromadzi się w przestrzeni międzykomórkowej, między komórką rzęsatą a kielichem aferentnym, i znacząco zmienia odpowiedź komórek rzęsatych7. Tego typu informacje nie byłyby możliwe do uzyskania bez opisanego tu częściowo nienaruszonego nabłonka czuciowego przedsionkowego. Pokazujemy półnienaruszony preparat myszy crista 3 i pokazujemy reprezentatywne wyniki uzyskane z elektrofizjologii łatek całokomórkowych i dwufotonowego obrazowania wapnia.

<table><tbody><tr><td colspan="4">ODCZYNNIKI</td></tr><tr><td>Leibovitz medium L-15</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4386-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA-1-oregon green</td><td>Invitrogen</td><td>O6806</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT </td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica Microsystems</td><td>A60S</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop dwufotonowy</td><td>Olympus/La Vision</td><td>BX51WI/ TriMScope II</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 SF Kleszcze</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>FST</td><td>16221-14</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki standardowe</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>InstraTECH Konwerter A-D</td><td>HEKA</td><td>ITC-18</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Mikromanipulator</td><td>Sutter</td><td>MP-225/M wzmacniacz</td><td></td></tr><tr><td>wielozaciskowy</td><td>Axon Instruments</td><td>700B</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji danych (elektrofizjologia)</td><td>Axograph</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Imspector Oprogramowanie do akwizycji danych (dwufotonowe)</td><td>Innowacja Maxa Plancka</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

izolowany, częściowo nienaruszony preparat nabłonka czuciowego przedsionkowego myszy do elektrofizjologii i mikroskopii dwufotonowej o wysokiej rozdzielczości

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Zrozumienie funkcji komórek rzęsatych przedsionkowych w normalnych warunkach, czyli jak trauma, choroba i starzenie się zakłócają tę funkcję, jest kluczowym krokiem w rozwoju metod prewencyjnych i/lub nowych strategii terapeutycznych. Jednak większość badań dotyczących nieprawidłowej funkcji przedsionka nie dotyczyła poziomu komórkowego, ale koncentrowała się przede wszystkim na behawioralnych testach dysfunkcji przedsionkowych, takich jak analiza chodu i odruchów przedsionkowo-ocznych. Chociaż praca ta dostarczyła cennych danych na temat tego, co się dzieje, gdy coś idzie nie tak, niewiele informacji jest zbieranych na temat podstawowych przyczyn dysfunkcji. Spośród badań, które koncentrują się na procesach komórkowych i subkomórkowych, które leżą u podstaw funkcji przedsionkowej, większość opierała się na ostro izolowanych komórkach rzęsatych, pozbawionych połączeń synaptycznych i wspierających środowisko komórkowe. Dlatego głównym wyzwaniem technicznym był dostęp do niezwykle wrażliwych komórek rzęsatych przedsionkowych w preparacie, który jest najmniej zakłócony fizjologicznie. Tutaj pokazujemy częściowo nienaruszony preparat nabłonka czuciowego przedsionkowego myszy, który zachowuje lokalne mikrośrodowisko, w tym kompleksy komórek rzęsatych / pierwotnych aferentów.

Właściwości elektrofizjologiczne komórek rzęskowych błędnika zależą od złożonej mikroarchitektury, w której są one osadzone 7. Rysunek 5 pokazuje, że preparat półzachowany nabłonka błędnika może być wykorzystany do rozróżnienia między komórkami rzęskowymi typu I (Rysunek 5A), komórkami rzęskowymi typu II (Rysunek 5B) a pierwotnym neuronom aferentnym typu calyx (Rysunek 5C) na podstawie charakterystycznych przewodzeń całokomórkowych. Charaktery...

Analiza funkcji przedsionkowych komórek rzęsatych jest skomplikowana przez ich lokalizację głęboko w najtwardszej części czaszki, kości skroniowej skalistej. W większości badań nad funkcjonalnymi komórkami rzęsatymi wykorzystano dokładnie izolowane komórki rzęsate. W tym artykule opisano częściowo nienaruszony preparat nabłonka przedsionkowego myszy do badań elektrofizjologicznych i mikroskopii dwufotonowej.

Izolowany, częściowo nienaruszony preparat nabłonka czuciowego przedsionkowego myszy do elektrofizjologii i mikroskopii dwufotonowej o wysokiej rozdzielczości

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie niemal naturalnego preparatu nabłonka sensorycznego błędnika myszy, który może zostać wykorzystany do badania podstawowych procesów komórkowych i podkomórkowych komórek rzęsnych błędnika. Osiąga się to najpierw poprzez wyizolowanie kostnego labiryntu z czaszki. W drugim kroku, za pomocą precyzyjnych pęset, ostrożnie zdrapuje się kostny labirynt, aby odsłonić znajdujący się pod nim labirynt błoniasty, a następnie całkowicie usuwa się go z kostnej osłony.Następnie, poprzez wycięcie znajdującej się powyżej błony za pomocą precyzyjnych nożyczek irydowych, odsłania się nabłonek sensoryczny przedsionka. Ostatnim krokiem jest zamocowanie półzachowanego preparatu nabłonka sensorycznego w komorze z szklanym dnem i ustabilizowanie go za pomocą obciążonej siatki nylonowej. W końcowej fazie wykorzystuje się elektrofizjologię patch-clamp oraz mikroskopię dwufotonową, aby scharakteryzować odpowiednio wewnętrzne właściwości błonowe oraz profil sygnalizacji wapniowej każdego typu komórki rzęsatej przedsionka i/lub neuronu pierwotnego.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, w tym preparatami izolowanych komórek rzęskowych, jest możliwość zachowania układu komórek rzęskowych i ich pierwotnych neuronów doprowadzających w warunkach jak najbliższych naturalnym. Oznacza to, że możemy wykonywać pomiary w warunkach zbliżonych do fizjologicznych oraz przeprowadzać te pomiary jednocześnie. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ technika preparatyki jest bardzo trudna do opanowania, głównie ze względu na głębokie umieszczenie aparatu przedsionkowego w obrębie kości skroniowej czaszki, a także fakt, że sam nabłonek sensoryczny jest bardzo mały i łatwo ulega uszkodzeniu podczas sekcji.Procedury elektroporacji i dwufotonowej demonstracji zaprezentuje Stefano DeMarco, współpracownik mojego laboratorium. Po głębokim znieczuleniu i odcięciu głowy myszy C 57 black six zgodnie z lokalnymi wytycznymi instytucjonalnymi i rządowymi oraz odsłonięciu czaszki, wykonaj niewielkie nacięcie w czaszce w okolicy lambda i przetnij wzdłuż szwu strzałkowego. Upewnij się, że mózg nie zostanie uszkodzony przez ostrze nożyczek.W tym kroku należy nanieść lodowaty A CSF na mózg w celu schłodzenia tkanki, a następnie ostrożnie odsunąć kości ciemieniowe bocznie i kość potyliczną ku tyłowi, używając płytko wygiętych kleszczy Pearsona, ponownie nakładając lodowaty A CSF. Następnie, za pomocą małej szpatułki ze stali nierdzewnej, należy delikatnie unieść mózg z powierzchni środkowej i tylnej jamy czaszki. Labirynt błędnika jest teraz wyraźnie widoczny w środkowej jamie czaszki z widoczną ślimakiem.Wprowadź lodowaty A CSF i raju po obu stronach labiryntu przedsionkowego. Następnie delikatnie wyciśnij labirynt przedsionkowy, chwytając przedni kanał półkolisty i pociągając go bocznie. Zanurz wycięte labirynty w naczyniu sekcyjnym zawierającym lodowaty roztwór.Ciągle napowietrzany A CSF umieszczony pod stereomikroskopem. Ten schemat szczegółowo przedstawia wycięty labirynt. Następnie, pracując pod stereomikroskopem, chwyć ślimaka precyzyjną pęsetą i przytrzymaj labirynt przy dnie naczynia.Użyj drugiej pęsety, aby zdrapać kość pokrywającą ampullę przedniego kanału półkolistego. Po wykonaniu małego otworu w kości, zacznij usuwać odłamki kostne z okolicy ampulli. Należy uważać, aby nie przebić kości pęsetą, ponieważ może to spowodować uszkodzenie leżącego pod nią labiryntu błoniastego oraz nabłonka sensorycznego.Kontynuuj tę procedurę aż do momentu, gdy przednia i sąsiednia pozioma błona półkolista, przewody oraz pule zostaną odsłonięte, tak jak pokazano tutaj. Następnie, używając precyzyjnej pęsety, ostrożnie unieś pul i powiązany z nim utricle z labiryntu kostnego, upewniając się, że centralny obszar puli zawierający nabłonek sensoryczny nie został uszkodzony. Przenieś triadę zawierającą dwa pule i utricle do szalki Petriego wypełnionej pożywką hodowlaną Lebovitz L 15.Użyj światłowodu, aby podświetlić tkankę od tyłu, co umożliwi wyraźną wizualizację grzebienia zawierającego nabłonek sensoryczny wewnątrz pul. Następnie za pomocą precyzyjnych nożyczek irydowych ostrożnie wykonaj nacięcie w nakrapianym sklepieniu amp. Wykonaj nacięcie jak najbliżej krawędzi nabłonka sensorycznego, unikając jednak kontaktu z nim.Jak pokazano tutaj, należy upewnić się, że na nabłonku sensorycznym nie znajdują się fragmenty błony. Ten schemat przedstawia kształt końcowego preparatu oraz rozmieszczenie elektrody rejestrującej; przenieś wyizolowany, częściowo nienaruszony preparat do małej komory rejestrującej z szklanym dnem wypełnionej pożywką L 15. Unieruchom preparat za pomocą siatki z cienkich włókien nylonowych przymocowanych do spłaszczonego, U-kształtnego drutu platynowego. Tkanka jest teraz gotowa do rejestracji elektrofizjologicznej.Przeprowadź perfuzję półintegralnego preparatu za pomocą stale natlenionego medium L 15. Upewnij się, że medium pozostaje czerwone, co wskazuje na pH z tlenem w zakresie od 7,3 do 7,4. W trakcie procedury przygotuj pipety rejestrujące z wewnętrzną średnicą 1,5 mm oraz 1,19 mm.Wytraw szklaną pipetę krzemianową, stosując dwuetapowy protokół w wyciągaczu do mikro pipet, aby uzyskać końcową impedancję od trzech do czterech megaomów. Wypełnij trzasteń pipety od trzech do czterech milimetrów wewnętrznym roztworem na bazie fluorku potasu. Następnie owiń trzasteń pipety dwa do trzech razy, jak najniżej w stronę końcówki, cienkim paskiem parafiny, aby zaizolować elektrodę i zmniejszyć pojemność pipety.Ustaw pipetę nad nabłonkiem sensorycznym, korzystając z małego powiększenia 5x w mikroskopie pionowym. Przełącz na większe powiększenie 40x i zlokalizuj pojedyncze komórki rzęsiste przedsionka za pomocą podłączonej kamery CCD. Używając mikromanipulatora, ustaw pipetę na błonie wybranej komórki rzęsistej.Po uzyskaniu uszczelnienia rzędu gigaoma, należy przerwać ciągłość błony komórkowej, przykładając niewielkie podciśnienie za pomocą portu ssącego w uchwycie pipety, a następnie przeprowadzić rejestrację metodą clampowania napięcia w całej komórce (whole cell voltage clamp), stosując standardowe techniki dla mikroskopii dwufotonowej. Pozostawić fragment dachu komory częściowo nienaruszony. Preparat należy zanurzyć, a następnie przenieść na mały kawałek papieru filtracyjnego.Należy upewnić się, że nabłonek sensoryczny nie jest przesłonięty od góry. Papier filtracyjny wraz z preparatem należy umieścić na pokrytej solą fizjologiczną dolnej elektrodzie platynowej elektroporatora. Górną elektrodę platynową należy ustawić równolegle do elektrody dolnej, w odległości około dwóch milimetrów, uważając, aby nie zmienić orientacji preparatu.Po kontakcie z Oregon Green 4 88 bafta, przygotowuje się roztwór zgodnie z tym obrazem. Przepuść krótki impuls prądu przez preparat. Nanieś niewielką ilość oleju silikonowego na dno szklanej komory rejestracyjnej wypełnionej pożywką L 15.Następnie ponownie umieść na nim półzachowany preparat, upewniając się, że nabłonek sensoryczny nie jest przesłonięty od góry. Aby zapewnić stabilność podczas obrazowania, przykryj preparat siatką nylonową. Następnie, korzystając z mikroskopu dwufotonowego, wykonaj rejestracje optyczne spontanicznej aktywności wapniowej w nabłonku sensorycznym, stosując standardowe protokoły obrazowania.Na tym obrazie przedstawiono prądy całej komórki zarejestrowane z komórki rzęsatej przedsionka typu pierwszego, charakteryzującej się dużymi, zanikającymi prądami ogona, wskazanymi tutaj strzałką. Prądy całej komórki zostały zarejestrowane z komórki rzęsatej przedsionka typu drugiego. Zwróć uwagę na brak prądów ogona.Na tym obrazie przedstawiono rejestrację z całej komórki (whole cell recording) z pierwotnego włókna doprowadzającego do kielicha (calyx), charakteryzującą się przejściowymi prądami sodowymi, na co wskazuje strzałka po depolaryzacji z ujemnego potencjału spoczynkowego wynoszącego -120 mV. Wszystkie komórki utrzymywano przy potencjale -60 mV. Rycina ta przedstawia zależności IV dla komórek rzęsek typu drugiego zarejestrowanych u młodych i starszych myszy w odpowiedzi na zwiększenie czasu trwania depolaryzacji.Te histogramy przedstawiają średnią przewodność i stosunek aktywacji komórek rzęsatych typu drugiego u młodych i starych myszy na podstawie krzywych IV z 100 milisekund. Te mikrografie dwufotonowe pokazują aktywację wapniową BAFTA one Oregon green w odpowiedzi na standardowy L 15 PERFU eight w górnym panelu lub L 15 zawierający 100 millimolar potassium chloride w dolnym panelu. Strzałki wskazują tę samą pojedynczą komórkę rzęsatą przed i po dodaniu potassium chloride.Wykres ten przedstawia profil fluorescencji wapnia pojedynczej komórki wskazanej strzałką na poprzednym obrazie. Ta mikrografia dwufotonowa nabłonka sensorycznego pokazuje ładowanie Oregon Green 488 bta-1 do poszczególnych komórek rzęsatych. Wstawka przedstawia subkomórkową lokalizację wapnia w cytoplazmie komórki rzęsatej typu I wskazanej strzałką lub w kielichowatym zakończeniu pierwotnym aferentnym otaczającym komórkę rzęsatą typu I wskazaną podwójnymi strzałkami.Po opanowaniu techniki, sekcja może zająć mniej niż 10 minut. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak izolować nabłonek sensoryczny przedsionka, jak zachować jego nienaruszoną strukturę oraz jak utrzymać jego żywotność do zapisów elektrofizjologicznych i dwufotonowego obrazowania wapnia.

an-isolated-semi-intact-preparation-mouse-vestibular-sensory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Izolowany półintaktowy preparat narządu przedsionkowego myszy do elektrofizjologii i wysokorozdzielczej mikroskopii dwufotonowej

Niniejsza procedura opisuje metodę izolacji i hodowli mysiego narządu Cortiego z lub bez listka spiralnego i neuronów zwoju spiralnego. Prezentujemy również metodę ekspresji egzogennego genu reporterowego w eksplantacie narządu Cortiego za pomocą elektroporacji.

Kultura pierwotna i elektroporacja plazmidowa mysiego narządu Cortiego.

Ten film przedstawia izolację mysiego narządu lemieszowo-nosowego (VNO) i przygotowanie tkanek do cięcia wibratomem. Sekcje służą do scharakteryzowania biofizycznych i fizjologicznych atrybutów określonej grupy neuronów czuciowych.

Przygotowanie mysiego narządu lemieszowo-nosowego do przekroju wibratomu

Ten film demonstruje technikę całokomórkowego patch-clamp do elektrofizjologicznego zapisu z płaskiej siatkówki myszy. Cienka szklana pipeta z elektrodą służy do zbliżania się do gwiazdotwórczych komórek amakrynowych (SAC) w siatkówce. Po uformowaniu uszczelki stosuje się ssanie w celu pęknięcia membrany i utworzenia konfiguracji zacisku krosowego całej komórki. Na koniec mierzy się przepływ jonów przez receptory synaptyczne SAC za pomocą konfiguracji.

Ustanawianie opaski krosowej całej komórki do zapisu elektrofizjologicznego z siatkówki myszy z płaskim mocowaniem

Źródło: Van Wonterghem, E., et al. Mikrodysekcja i wizualizacja skaningowej mikroskopii elektronowej myszy z całego mocowania. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia przygotowanie i obrazowanie tkanki splotu naczyniówkowego z mózgu myszy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Proces obejmuje utrwalanie, odwadnianie i powlekanie tkanki przewodzącą warstwą platyny w celu stabilizacji i przygotowania próbki do obrazowania. SEM rejestruje szczegółowe obrazy komórek nabłonka z...

Wizualizacja splotu naczyniówkowego mózgu myszy za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Siatkówka nerwowa myszy w wieku 8 dni znajduje się na 4% bloku żelatyny. Po wyizolowaniu warstwy fotoreceptorów (200 μm) za pomocą wibratomu, fotoreceptory są wysiewane po dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej do hodowli. Warstwa fotoreceptorowa może być wykorzystana do analiz molekularnych, biochemicznych lub transplantacji.

Cięcie wibratomem siatkówki myszy w celu przygotowania kultur fotoreceptorowych

Rzęski węchowych neuronów czuciowych zawierają białka kaskady transdukcji sygnału, ale szczegółowa analiza przestrzenna ich rozmieszczenia jest trudna w kriosekcjach. Opisujemy tutaj zoptymalizowane podejście do znakowania całego mocowania i wizualizacji en face białek rzęskowych.

Znakowanie całego mocowania rzęsek w głównym układzie węchowym myszy

Analiza fizjologicznych właściwości węchowych neuronów czuciowych nadal napotyka na techniczne ograniczenia. Tutaj rejestrujemy je przez perforowany patch-clamp w nienaruszonym preparowaniu nabłonka węchowego u myszy ukierunkowanych na geny. Technika ta pozwala na scharakteryzowanie właściwości błony i odpowiedzi na określone ligandy neuronów wyrażających określone receptory węchowe.

Perforowany zapis patch-clamp węchowych węchowych neuronów czuciowych myszy w nienaruszonym neuroepithelium: analiza funkcjonalna neuronów wyrażających zidentyfikowany receptor zapachowy

Opracowaliśmy poziome przygotowanie siatkówki dorosłego ssaka z płaszczyzną przekroju równoległą do powierzchni siatkówki. Pola dendrytyczne neuronów siatkówki o orientacji niepromieniowej nie zostały obcięte, co pozwoliło na badanie przetwarzania sygnału za pomocą patch-clamp i technik obrazowania.

Przygotowanie poziomych wycinków siatkówki dorosłej myszy do badań elektrofizjologicznych

Ten artykuł przedstawia zmodyfikowaną metodę przygotowania powierzchni ślimaka, która wymaga odwapnienia i użycia kleju komórkowego i tkankowego do przyklejenia kawałków nabłonka ślimaka do 10 mm okrągłych szkiełek nakrywkowych do immunohistochemii u dorosłych ślimaków myszy.

Przygotowanie powierzchni ślimaka u dorosłej myszy

Prążek naczyniowy jest niezbędny do generowania potencjału wewnątrzślimakowego. Tutaj przedstawiamy sekcję rozstępów naczyniowych dorosłej myszy w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra lub barwienia immunologicznego.

Rozwarstwienie rozstępu naczyniowego dorosłej myszy w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra lub barwienia immunologicznego

W tym artykule przedstawiono uproszczony protokół rozwarstwiania i dysocjacji mysiego nabłonka węchowego w celu sekwencjonowania jednojądrowego RNA.

Szybka dyssekcja i dysocjacja nabłonka węchowego myszy w celu uzyskania zawiesin jednojądrowych

Poznaj metodę izolacji częściowo nienaruszonego nabłonka przedsionkowego myszy do badań elektrofizjologicznych i mikroskopii dwufotonowej. Technika umożliwia zachowanie fizjologicznych warunków komórek włoskowatych.

Izolowany, częściowo nienaruszony preparat nabłonka czuciowego przedsionkowego myszy do elektrofizjologii i mikroskopii dwufotonowej o wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal

Izolowany, częściowo nienaruszony preparat nabłonka czuciowego przedsionkowego myszy do elektrofizjologii i mikroskopii dwufotonowej o wysokiej rozdzielczości

Przeglądaj więcej filmów