Używanie hemekytometru do liczenia komórek
Liczenie komórek jest ważnym krokiem w wielu testach opartych na komórkach w celu określenia liczby komórek i żywotności. Ogólnie rzecz biorąc, celem liczenia jest zrozumienie, ile próbki o nieznanym stężeniu komórek należy rozcieńczyć do dalszego wykorzystania. Najpopularniejszym narzędziem laboratoryjnym do liczenia komórek jest hemacytometr.
Hemacytometr to narzędzie do liczenia, które zostało pierwotnie stworzone do liczenia komórek krwi. W środku hemacytometru znajdują się dwie komory zliczające, na których znajduje się laserowo wytrawiona siatka.
Siatka składa się z 9 głównych kwadrantów. Cztery narożne ćwiartki są dalej podzielone na 16 mniejszych kwadrantów. Środkowa ćwiartka jest podzielona na 25 mniejszych kwadrantów, z których każdy jest jeszcze bardziej podzielony na 16 mikrokwadrantów.
Na drugim końcu każdej komory znajdują się porty do wprowadzania próbek, do których dozuje się próbkę komórki, która ma zostać policzona.
Po obu stronach komór liczących znajdują się wsporniki montażowe szkiełka nakrywkowego, na których spoczywa kwarcowe szkiełko nakrywkowe, zwykle około 0,1 mm powyżej komory liczenia.
Ponieważ powierzchnia każdego dużego kwadratu wynosi 1 mm2, objętość zawarta w każdym dużym kwadracie wynosi 0,1 mm3 lub 1/10 000 ml.
Przed liczeniem zawsze poświęć chwilę na użycie etanolu i chusteczki do chusteczki, aby oczyścić i wysuszyć wszelkie kłaczki, odciski palców lub znaki wodne z szkiełka nakrywkowego i komory liczenia.
Następnie ostrożnie dodaj niewielką ilość wody do każdego ze wsporników montażowych szkiełka nakrywkowego, napięcie powierzchniowe wody utrzyma szkiełko nakrywkowe na miejscu.
Teraz delikatnie rozetrzeć zawiesinę komórek lub pipetować ją w górę iw dół, aby usunąć wszelkie grudki komórek. Za pomocą mikropipety zassać około 10 μl zawiesiny, a następnie załadować próbkę do jednego z portów wprowadzających. Roztwór zostanie wciągnięty do komory zliczającej przez działanie kapilarne i powinien pokryć całą siatkę.
Podczas gdy komórki się uspokajają, wybierz cel. Następnie załaduj hemytometr na stolik.
Następnie obejrzyj komórki pod mikroskopem. Jeśli w każdym z dużych kwadrantów znajduje się mniej niż 5 komórek, może być konieczne ponowne odwirowanie próbki i ponowne zawieszenie osadu w mniejszej objętości. Jeśli komórki nakładają się na siebie lub są po prostu zbyt gęste, aby można je było łatwo odróżnić, może być konieczne rozcieńczenie próbki w większej objętości roztworu. Pamiętaj, aby śledzić czynnik, za pomocą którego rozcieńczasz swoje komórki. Będzie on potrzebny w późniejszych obliczeniach.
Teraz nadszedł czas na policzenie komórek!
Jak wspomnieliśmy wcześniej, komora liczenia jest pokryta siatką trawioną laserowo. Linie kwadrantów ułatwiają śledzenie liczonych komórek. Wybierz kwadrant rozmiaru do zliczania w zależności od gęstości komórek w próbce. Na przykład, jeśli liczba komórek jest niewielka, policz wszystkie komórki w jednym z narożnych kwadrantów. W przypadku próbek ze średnią liczbą komórek należy wybrać jeden z 16 mniejszych kwadrantów. Jeśli gęstość komórek jest bardzo duża, policz komórki w jednym z 25 środkowych kwadrantów. Bez względu na to, który kwadrant wybierzesz lub gęstość próbki komórek, policz co najmniej 20-50 komórek na dylemat.
Nie wszystkie komórki będą dokładnie mieścić się w kwadrantach. Możesz policzyć komórki, które dotykają górnej i lewej linii, ale zignorować te, które dotykają dolnej lub prawej. Aby uzyskać najdokładniejszą liczbę, użyj licznika komórek, aby śledzić komórki i uzyskać średnią z liczby komórek w 4 kwadrantach tego samego rozmiaru.
Aby obliczyć liczbę komórek w objętości 1 ml, pomnóż liczbę zliczonych komórek przez 10 000, ponieważ, jak wspomnieliśmy wcześniej, każdy duży kwadrat na siatce to 1/10 000 ml. Jeśli policzyłeś jeden z tych większych kwadrantów, po prostu pomnóż tę liczbę 1. Jeśli policzyłeś jeden z mniejszych kwadratów w jednym z rogowych kwadrantów, pomnóż tę liczbę przez 16. Jeśli policzyłeś wszystkie komórki w jednym z 25 środkowych kwadrantów, pomnóż tę liczbę przez 25. Jeśli zdarzyło Ci się rozcieńczyć zawiesinę komórek przed załadowaniem hemacyometru, będziesz musiał również pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia.
Następnie, aby obliczyć liczbę komórek w 1 ml tej próbki, pomnożylibyśmy 20 komórek w tym centralnym kwadrancie przez 104 i 25, aby uzyskać w sumie 5 x 106 komórek w 1 ml próbki.
Teraz, gdy znamy całkowitą liczbę komórek w 1 ml próbki, musimy pomnożyć tę liczbę przez całkowitą objętość naszego roztworu. Na przykład, jeśli mamy 5 x 106 komórek w 1 ml, to w 2 ml będziemy mieli w sumie 1 x 107 komórek.
Następnie, aby uniknąć błędów wynikających z błędnego liczenia, nierównomiernego rozmieszczenia komórek lub błędów pipetowania, załaduj drugą stronę komory i policz próbkę komórki po raz drugi.
Liczenie komórek pod mikroskopem to również świetny czas na ocenę żywotności komórek w próbce. Błękit trypanowy, życiodajna barwa, jest często mieszany z próbką przed załadowaniem w tym celu do hemacytometru.
Żywe komórki wykluczają ten barwnik, ponieważ żywe komórki są bardzo selektywne, jeśli chodzi o to, co przepuszczają przez swoje błony. Martwa komórka nie ma jednak nienaruszonej błony, która umożliwia przejście błękitu trypanowego i zabarwienie cytoplazmy.
Aby sprawdzić żywotność próbki komórek, rozcieńczyć porcję zawiesiny komórek w błękicie trypanowym, a następnie załadować próbkę barwioną błękitem trypanowym, tak jak zwykłą próbkę komórkową. W kontraście fazowym żywe komórki będą wyglądać jasno i złoto i należy je policzyć; Nie licz żadnych matowych, martwych, niebieskich komórek.
Oblicz liczbę komórek jak poprzednio, tym razem mnożąc ostateczną liczbę przez współczynnik rozcieńczenia błękitu trypanowego. Tak więc, gdyby nasza pierwotna reprezentatywna próbka została najpierw rozcieńczona w błękitu trypanowym, pomnożylibyśmy naszą całkowitą liczbę komórek przez nasze rozcieńczenie błękitu trypanowego 1:10, co daje w sumie 1x108 komórek w naszej próbce.
Po zakończeniu liczenia pamiętaj o wyczyszczeniu szkiełka nakrywkowego i komory liczenia!
Teraz, gdy jesteś profesjonalistą w liczeniu komórek, porozmawiajmy o niektórych powodach, dla których możesz potrzebować wiedzieć, ile komórek masz w danym eksperymencie.
Po wyizolowaniu komórek z normalnej lub eksperymentalnej tkanki ważne jest, aby wiedzieć, ile komórek udało Ci się odzyskać. Tutaj badacze będą chcieli wiedzieć, ile splenocytów lub komórek śledziony wyizolowali z tej śledziony myszy.
Kiedy przeprowadzasz eksperyment, aby zobaczyć, jak reagują dwie różne populacje komórek, ważne jest, aby wiedzieć, ile komórek każdego typu mieszasz ze sobą, tak jak w tym eksperymencie z jednoczesną hodowlą komórek B i T.
Będziesz chciał wiedzieć, ile masz komórek do wielu innych rodzajów testów opartych na komórkach. W tym przypadku przeprowadzany jest test ELISPOT w celu określenia liczby komórek w próbce, które będą wydzielać IFNγ, białko zapalne, w odpowiedzi na wirusa brodawczaka ludzkiego.
Podczas przeprowadzania eksperymentu, w którym mRNA musi zostać wyekstrahowane lub wyizolowane z komórek będących przedmiotem zainteresowania, ważne jest, aby wiedzieć, od ilu połączeń zaczynasz, aby uzyskać wystarczającą ilość mRNA do eksperymentu.
Hemacytometr jest niedrogim i stosunkowo łatwym w użyciu narzędziem do liczenia komórek, ale może być żmudny i może powodować błąd ludzki.
Ręczny automatyczny licznik Scepter jest, jak sama nazwa wskazuje, ręcznym urządzeniem liczącym, które ma lepszą dokładność liczenia w porównaniu z hemacytometrem i może rozróżniać zarówno rozmiar, jak i objętość komórek w próbce komórki.
Automatyczny licznik komórek TC10 ocenia zarówno liczbę komórek, jak i ich żywotność, automatycznie oblicza całkowitą liczbę komórek w próbce i umożliwia przeglądanie komórek na ekranie odczytu.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do liczenia komórek. W tym filmie omówiliśmy: czym jest hemacytometr, jak liczyć komórki i określać żywotność komórek oraz kilka różnych powodów, dla których może być konieczne liczenie komórek. Dziękujemy za oglądanie i pamiętaj, aby nie liczyć niebieskich komórek!
Wiele eksperymentów biomedycznych wymaga manipulacji znaną liczbą komórek w celu uzyskania dokładnych, powtarzalnych i statystycznie istotnych danych.…
Liczenie komórek jest ważnym krokiem w wielu testach opartych na komórkach w celu określenia liczby komórek i żywotności. Ogólnie rzecz biorąc, celem liczenia jest zrozumienie, ile próbki o nieznanym stężeniu komórek należy rozcieńczyć do dalszego wykorzystania. Najpopularniejszym narzędziem laboratoryjnym do liczenia komórek jest hemacytometr.
Hemacytometr to narzędzie do liczenia, które zostało pierwotnie stworzone do liczenia komórek krwi. W środku hemacytometru znajdują się dwie komory zliczające, na których znajduje się laserowo wytrawiona siatka.
Siatka składa się z 9 głównych kwadrantów. Cztery narożne ćwiartki są dalej podzielone na 16 mniejszych kwadrantów. Środkowa ćwiartka jest podzielona na 25 mniejszych kwadrantów, z których każdy jest jeszcze bardziej podzielony na 16 mikrokwadrantów.
Na drugim końcu każdej komory znajdują się porty do wprowadzania próbek, do których dozuje się próbkę komórki, która ma zostać policzona.
Po obu stronach komór liczących znajdują się wsporniki montażowe szkiełka nakrywkowego, na których spoczywa kwarcowe szkiełko nakrywkowe, zwykle około 0,1 mm powyżej komory liczenia.
Ponieważ powierzchnia każdego dużego kwadratu wynosi 1 mm2, objętość zawarta w każdym dużym kwadracie wynosi 0,1 mm3 lub 1/10 000 ml.
Przed liczeniem zawsze poświęć chwilę na użycie etanolu i chusteczki do chusteczki, aby oczyścić i wysuszyć wszelkie kłaczki, odciski palców lub znaki wodne z szkiełka nakrywkowego i komory liczenia.
Następnie ostrożnie dodaj niewielką ilość wody do każdego ze wsporników montażowych szkiełka nakrywkowego, napięcie powierzchniowe wody utrzyma szkiełko nakrywkowe na miejscu.
Teraz delikatnie rozetrzeć zawiesinę komórek lub pipetować ją w górę iw dół, aby usunąć wszelkie grudki komórek. Za pomocą mikropipety zassać około 10 μl zawiesiny, a następnie załadować próbkę do jednego z portów wprowadzających. Roztwór zostanie wciągnięty do komory zliczającej przez działanie kapilarne i powinien pokryć całą siatkę.
Podczas gdy komórki się uspokajają, wybierz cel. Następnie załaduj hemytometr na stolik.
Następnie obejrzyj komórki pod mikroskopem. Jeśli w każdym z dużych kwadrantów znajduje się mniej niż 5 komórek, może być konieczne ponowne odwirowanie próbki i ponowne zawieszenie osadu w mniejszej objętości. Jeśli komórki nakładają się na siebie lub są po prostu zbyt gęste, aby można je było łatwo odróżnić, może być konieczne rozcieńczenie próbki w większej objętości roztworu. Pamiętaj, aby śledzić czynnik, za pomocą którego rozcieńczasz swoje komórki. Będzie on potrzebny w późniejszych obliczeniach.
Teraz nadszedł czas na policzenie komórek!
Jak wspomnieliśmy wcześniej, komora liczenia jest pokryta siatką trawioną laserowo. Linie kwadrantów ułatwiają śledzenie liczonych komórek. Wybierz kwadrant rozmiaru do zliczania w zależności od gęstości komórek w próbce. Na przykład, jeśli liczba komórek jest niewielka, policz wszystkie komórki w jednym z narożnych kwadrantów. W przypadku próbek ze średnią liczbą komórek należy wybrać jeden z 16 mniejszych kwadrantów. Jeśli gęstość komórek jest bardzo duża, policz komórki w jednym z 25 środkowych kwadrantów. Bez względu na to, który kwadrant wybierzesz lub gęstość próbki komórek, policz co najmniej 20-50 komórek na dylemat.
Nie wszystkie komórki będą dokładnie mieścić się w kwadrantach. Możesz policzyć komórki, które dotykają górnej i lewej linii, ale zignorować te, które dotykają dolnej lub prawej. Aby uzyskać najdokładniejszą liczbę, użyj licznika komórek, aby śledzić komórki i uzyskać średnią z liczby komórek w 4 kwadrantach tego samego rozmiaru.
Aby obliczyć liczbę komórek w objętości 1 ml, pomnóż liczbę zliczonych komórek przez 10 000, ponieważ, jak wspomnieliśmy wcześniej, każdy duży kwadrat na siatce to 1/10 000 ml. Jeśli policzyłeś jeden z tych większych kwadrantów, po prostu pomnóż tę liczbę 1. Jeśli policzyłeś jeden z mniejszych kwadratów w jednym z rogowych kwadrantów, pomnóż tę liczbę przez 16. Jeśli policzyłeś wszystkie komórki w jednym z 25 środkowych kwadrantów, pomnóż tę liczbę przez 25. Jeśli zdarzyło Ci się rozcieńczyć zawiesinę komórek przed załadowaniem hemacyometru, będziesz musiał również pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia.
Następnie, aby obliczyć liczbę komórek w 1 ml tej próbki, pomnożylibyśmy 20 komórek w tym centralnym kwadrancie przez 104 i 25, aby uzyskać w sumie 5 x 106 komórek w 1 ml próbki.
Teraz, gdy znamy całkowitą liczbę komórek w 1 ml próbki, musimy pomnożyć tę liczbę przez całkowitą objętość naszego roztworu. Na przykład, jeśli mamy 5 x 106 komórek w 1 ml, to w 2 ml będziemy mieli w sumie 1 x 107 komórek.
Następnie, aby uniknąć błędów wynikających z błędnego liczenia, nierównomiernego rozmieszczenia komórek lub błędów pipetowania, załaduj drugą stronę komory i policz próbkę komórki po raz drugi.
Liczenie komórek pod mikroskopem to również świetny czas na ocenę żywotności komórek w próbce. Błękit trypanowy, życiodajna barwa, jest często mieszany z próbką przed załadowaniem w tym celu do hemacytometru.
Żywe komórki wykluczają ten barwnik, ponieważ żywe komórki są bardzo selektywne, jeśli chodzi o to, co przepuszczają przez swoje błony. Martwa komórka nie ma jednak nienaruszonej błony, która umożliwia przejście błękitu trypanowego i zabarwienie cytoplazmy.
Aby sprawdzić żywotność próbki komórek, rozcieńczyć porcję zawiesiny komórek w błękicie trypanowym, a następnie załadować próbkę barwioną błękitem trypanowym, tak jak zwykłą próbkę komórkową. W kontraście fazowym żywe komórki będą wyglądać jasno i złoto i należy je policzyć; Nie licz żadnych matowych, martwych, niebieskich komórek.
Oblicz liczbę komórek jak poprzednio, tym razem mnożąc ostateczną liczbę przez współczynnik rozcieńczenia błękitu trypanowego. Tak więc, gdyby nasza pierwotna reprezentatywna próbka została najpierw rozcieńczona w błękitu trypanowym, pomnożylibyśmy naszą całkowitą liczbę komórek przez nasze rozcieńczenie błękitu trypanowego 1:10, co daje w sumie 1x108 komórek w naszej próbce.
Po zakończeniu liczenia pamiętaj o wyczyszczeniu szkiełka nakrywkowego i komory liczenia!
Teraz, gdy jesteś profesjonalistą w liczeniu komórek, porozmawiajmy o niektórych powodach, dla których możesz potrzebować wiedzieć, ile komórek masz w danym eksperymencie.
Po wyizolowaniu komórek z normalnej lub eksperymentalnej tkanki ważne jest, aby wiedzieć, ile komórek udało Ci się odzyskać. Tutaj badacze będą chcieli wiedzieć, ile splenocytów lub komórek śledziony wyizolowali z tej śledziony myszy.
Kiedy przeprowadzasz eksperyment, aby zobaczyć, jak reagują dwie różne populacje komórek, ważne jest, aby wiedzieć, ile komórek każdego typu mieszasz ze sobą, tak jak w tym eksperymencie z jednoczesną hodowlą komórek B i T.
Będziesz chciał wiedzieć, ile masz komórek do wielu innych rodzajów testów opartych na komórkach. W tym przypadku przeprowadzany jest test ELISPOT w celu określenia liczby komórek w próbce, które będą wydzielać IFNγ, białko zapalne, w odpowiedzi na wirusa brodawczaka ludzkiego.
Podczas przeprowadzania eksperymentu, w którym mRNA musi zostać wyekstrahowane lub wyizolowane z komórek będących przedmiotem zainteresowania, ważne jest, aby wiedzieć, od ilu połączeń zaczynasz, aby uzyskać wystarczającą ilość mRNA do eksperymentu.
Hemacytometr jest niedrogim i stosunkowo łatwym w użyciu narzędziem do liczenia komórek, ale może być żmudny i może powodować błąd ludzki.
Ręczny automatyczny licznik Scepter jest, jak sama nazwa wskazuje, ręcznym urządzeniem liczącym, które ma lepszą dokładność liczenia w porównaniu z hemacytometrem i może rozróżniać zarówno rozmiar, jak i objętość komórek w próbce komórki.
Automatyczny licznik komórek TC10 ocenia zarówno liczbę komórek, jak i ich żywotność, automatycznie oblicza całkowitą liczbę komórek w próbce i umożliwia przeglądanie komórek na ekranie odczytu.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do liczenia komórek. W tym filmie omówiliśmy: czym jest hemacytometr, jak liczyć komórki i określać żywotność komórek oraz kilka różnych powodów, dla których może być konieczne liczenie komórek. Dziękujemy za oglądanie i pamiętaj, aby nie liczyć niebieskich komórek!
Liczenie komórek jest ważnym krokiem w wielu testach opartych na komórkach w celu określenia liczby komórek i żywotności. Ogólnie rzecz biorąc, celem liczenia jest zrozumienie, ile próbki o nieznanym stężeniu komórek należy rozcieńczyć do dalszego wykorzystania. Najpopularniejszym narzędziem laboratoryjnym do liczenia komórek jest hemacytometr.
Hemacytometr to narzędzie do liczenia, które zostało pierwotnie stworzone do liczenia komórek krwi. W środku hemacytometru znajdują się dwie komory zliczające, na których znajduje się laserowo wytrawiona siatka.
Siatka składa się z 9 głównych kwadrantów. Cztery narożne ćwiartki są dalej podzielone na 16 mniejszych kwadrantów. Środkowa ćwiartka jest podzielona na 25 mniejszych kwadrantów, z których każdy jest jeszcze bardziej podzielony na 16 mikrokwadrantów.
Na drugim końcu każdej komory znajdują się porty do wprowadzania próbek, do których dozuje się próbkę komórki, która ma zostać policzona.
Po obu stronach komór liczących znajdują się wsporniki montażowe szkiełka nakrywkowego, na których spoczywa kwarcowe szkiełko nakrywkowe, zwykle około 0,1 mm powyżej komory liczenia.
Ponieważ powierzchnia każdego dużego kwadratu wynosi 1 mm2, objętość zawarta w każdym dużym kwadracie wynosi 0,1 mm3 lub 1/10 000 ml.
Przed liczeniem zawsze poświęć chwilę na użycie etanolu i chusteczki do chusteczki, aby oczyścić i wysuszyć wszelkie kłaczki, odciski palców lub znaki wodne z szkiełka nakrywkowego i komory liczenia.
Następnie ostrożnie dodaj niewielką ilość wody do każdego ze wsporników montażowych szkiełka nakrywkowego, napięcie powierzchniowe wody utrzyma szkiełko nakrywkowe na miejscu.
Teraz delikatnie rozetrzeć zawiesinę komórek lub pipetować ją w górę iw dół, aby usunąć wszelkie grudki komórek. Za pomocą mikropipety zassać około 10 μl zawiesiny, a następnie załadować próbkę do jednego z portów wprowadzających. Roztwór zostanie wciągnięty do komory zliczającej przez działanie kapilarne i powinien pokryć całą siatkę.
Podczas gdy komórki się uspokajają, wybierz cel. Następnie załaduj hemytometr na stolik.
Następnie obejrzyj komórki pod mikroskopem. Jeśli w każdym z dużych kwadrantów znajduje się mniej niż 5 komórek, może być konieczne ponowne odwirowanie próbki i ponowne zawieszenie osadu w mniejszej objętości. Jeśli komórki nakładają się na siebie lub są po prostu zbyt gęste, aby można je było łatwo odróżnić, może być konieczne rozcieńczenie próbki w większej objętości roztworu. Pamiętaj, aby śledzić czynnik, za pomocą którego rozcieńczasz swoje komórki. Będzie on potrzebny w późniejszych obliczeniach.
Teraz nadszedł czas na policzenie komórek!
Jak wspomnieliśmy wcześniej, komora liczenia jest pokryta siatką trawioną laserowo. Linie kwadrantów ułatwiają śledzenie liczonych komórek. Wybierz kwadrant rozmiaru do zliczania w zależności od gęstości komórek w próbce. Na przykład, jeśli liczba komórek jest niewielka, policz wszystkie komórki w jednym z narożnych kwadrantów. W przypadku próbek ze średnią liczbą komórek należy wybrać jeden z 16 mniejszych kwadrantów. Jeśli gęstość komórek jest bardzo duża, policz komórki w jednym z 25 środkowych kwadrantów. Bez względu na to, który kwadrant wybierzesz lub gęstość próbki komórek, policz co najmniej 20-50 komórek na dylemat.
Nie wszystkie komórki będą dokładnie mieścić się w kwadrantach. Możesz policzyć komórki, które dotykają górnej i lewej linii, ale zignorować te, które dotykają dolnej lub prawej. Aby uzyskać najdokładniejszą liczbę, użyj licznika komórek, aby śledzić komórki i uzyskać średnią z liczby komórek w 4 kwadrantach tego samego rozmiaru.
Aby obliczyć liczbę komórek w objętości 1 ml, pomnóż liczbę zliczonych komórek przez 10 000, ponieważ, jak wspomnieliśmy wcześniej, każdy duży kwadrat na siatce to 1/10 000 ml. Jeśli policzyłeś jeden z tych większych kwadrantów, po prostu pomnóż tę liczbę 1. Jeśli policzyłeś jeden z mniejszych kwadratów w jednym z rogowych kwadrantów, pomnóż tę liczbę przez 16. Jeśli policzyłeś wszystkie komórki w jednym z 25 środkowych kwadrantów, pomnóż tę liczbę przez 25. Jeśli zdarzyło Ci się rozcieńczyć zawiesinę komórek przed załadowaniem hemacyometru, będziesz musiał również pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia.
Następnie, aby obliczyć liczbę komórek w 1 ml tej próbki, pomnożylibyśmy 20 komórek w tym centralnym kwadrancie przez 104 i 25, aby uzyskać w sumie 5 x 106 komórek w 1 ml próbki.
Teraz, gdy znamy całkowitą liczbę komórek w 1 ml próbki, musimy pomnożyć tę liczbę przez całkowitą objętość naszego roztworu. Na przykład, jeśli mamy 5 x 106 komórek w 1 ml, to w 2 ml będziemy mieli w sumie 1 x 107 komórek.
Następnie, aby uniknąć błędów wynikających z błędnego liczenia, nierównomiernego rozmieszczenia komórek lub błędów pipetowania, załaduj drugą stronę komory i policz próbkę komórki po raz drugi.
Liczenie komórek pod mikroskopem to również świetny czas na ocenę żywotności komórek w próbce. Błękit trypanowy, życiodajna barwa, jest często mieszany z próbką przed załadowaniem w tym celu do hemacytometru.
Żywe komórki wykluczają ten barwnik, ponieważ żywe komórki są bardzo selektywne, jeśli chodzi o to, co przepuszczają przez swoje błony. Martwa komórka nie ma jednak nienaruszonej błony, która umożliwia przejście błękitu trypanowego i zabarwienie cytoplazmy.
Aby sprawdzić żywotność próbki komórek, rozcieńczyć porcję zawiesiny komórek w błękicie trypanowym, a następnie załadować próbkę barwioną błękitem trypanowym, tak jak zwykłą próbkę komórkową. W kontraście fazowym żywe komórki będą wyglądać jasno i złoto i należy je policzyć; Nie licz żadnych matowych, martwych, niebieskich komórek.
Oblicz liczbę komórek jak poprzednio, tym razem mnożąc ostateczną liczbę przez współczynnik rozcieńczenia błękitu trypanowego. Tak więc, gdyby nasza pierwotna reprezentatywna próbka została najpierw rozcieńczona w błękitu trypanowym, pomnożylibyśmy naszą całkowitą liczbę komórek przez nasze rozcieńczenie błękitu trypanowego 1:10, co daje w sumie 1x108 komórek w naszej próbce.
Po zakończeniu liczenia pamiętaj o wyczyszczeniu szkiełka nakrywkowego i komory liczenia!
Teraz, gdy jesteś profesjonalistą w liczeniu komórek, porozmawiajmy o niektórych powodach, dla których możesz potrzebować wiedzieć, ile komórek masz w danym eksperymencie.
Po wyizolowaniu komórek z normalnej lub eksperymentalnej tkanki ważne jest, aby wiedzieć, ile komórek udało Ci się odzyskać. Tutaj badacze będą chcieli wiedzieć, ile splenocytów lub komórek śledziony wyizolowali z tej śledziony myszy.
Kiedy przeprowadzasz eksperyment, aby zobaczyć, jak reagują dwie różne populacje komórek, ważne jest, aby wiedzieć, ile komórek każdego typu mieszasz ze sobą, tak jak w tym eksperymencie z jednoczesną hodowlą komórek B i T.
Będziesz chciał wiedzieć, ile masz komórek do wielu innych rodzajów testów opartych na komórkach. W tym przypadku przeprowadzany jest test ELISPOT w celu określenia liczby komórek w próbce, które będą wydzielać IFNγ, białko zapalne, w odpowiedzi na wirusa brodawczaka ludzkiego.
Podczas przeprowadzania eksperymentu, w którym mRNA musi zostać wyekstrahowane lub wyizolowane z komórek będących przedmiotem zainteresowania, ważne jest, aby wiedzieć, od ilu połączeń zaczynasz, aby uzyskać wystarczającą ilość mRNA do eksperymentu.
Hemacytometr jest niedrogim i stosunkowo łatwym w użyciu narzędziem do liczenia komórek, ale może być żmudny i może powodować błąd ludzki.
Ręczny automatyczny licznik Scepter jest, jak sama nazwa wskazuje, ręcznym urządzeniem liczącym, które ma lepszą dokładność liczenia w porównaniu z hemacytometrem i może rozróżniać zarówno rozmiar, jak i objętość komórek w próbce komórki.
Automatyczny licznik komórek TC10 ocenia zarówno liczbę komórek, jak i ich żywotność, automatycznie oblicza całkowitą liczbę komórek w próbce i umożliwia przeglądanie komórek na ekranie odczytu.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do liczenia komórek. W tym filmie omówiliśmy: czym jest hemacytometr, jak liczyć komórki i określać żywotność komórek oraz kilka różnych powodów, dla których może być konieczne liczenie komórek. Dziękujemy za oglądanie i pamiętaj, aby nie liczyć niebieskich komórek!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a hemacytometer and why is it used for cell counting?
A hemacytometer is a counting chamber with a laser-etched grid originally designed for counting blood cells. It contains two counting chambers with grids divided into quadrants of varying sizes. The tool allows researchers to count cells under a light microscope and calculate total cell concentration, making it essential for determining cell numbers in biomedical experiments requiring known cell quantities.
Q2: How is the hemacytometer grid structured for cell counting?
The hemacytometer grid consists of 9 major quadrants. The four corner quadrants are subdivided into 16 smaller quadrants each, while the central quadrant contains 25 smaller quadrants, each further divided into 16 micro-quadrants. Each large square has an area of 1 mm² and contains a volume of 0.1 mm³, or 1/10,000th of a milliliter, which is critical for calculating total cell concentration.
Q3: What preparation steps are necessary before loading cells into a hemacytometer?
Clean the coverslip and counting chamber with ethanol and a kimwipe to remove lint, fingerprints, and watermarks. Apply water to the coverslip mounting supports to hold the coverslip in place using surface tension. Gently triturate the cell suspension by pipetting up and down to dislodge cell clumps, then aspirate approximately 10 microliters and load it into an introduction port where capillary action draws the solution across the grid.
Q4: How do you choose which quadrant to count based on cell density?
Select quadrant size according to cell density: for low cell numbers, count all cells in one corner quadrant; for medium density, use one of the 16 smaller quadrants; for high density, count cells in one of the 25 central quadrants. Always count at least 20-50 cells per quadrant to ensure accuracy. Count cells touching the top and left lines but disregard those touching bottom or right lines.
Q5: How do you calculate the total number of cells in your sample?
Multiply the cell count by 10,000 (since each large square equals 1/10,000th of a milliliter). Apply a multiplication factor based on quadrant size: multiply by 1 for large quadrants, by 16 for corner quadrants, or by 25 for central quadrants. If you diluted the sample, multiply by the dilution factor. Finally, multiply by total sample volume to determine total cell number in your experimental sample.
Q6: What is trypan blue exclusion and how does it determine cell viability?
Trypan blue is a vital stain that distinguishes live from dead cells. Live cells have intact membranes and exclude the dye, appearing bright and golden under phase contrast microscopy. Dead cells lack membrane integrity, allowing trypan blue to enter and stain the cytoplasm blue. Count only live cells and multiply the final count by the trypan blue dilution factor to determine viable cell concentration in your sample.
Q7: Why is accurate cell counting important in biomedical experiments?
Accurate cell counting ensures reproducible, statistically-relevant data in cell-based assays. Researchers need precise cell numbers when isolating cells from tissue, mixing different cell populations in co-culture experiments, performing immunoassays like ELISPOT, or extracting mRNA from cells. Knowing exact cell quantities allows proper dilution and standardization of experimental conditions across replicates and supports passaging cells cell lines subculturing methods and applications.
Chapters in this video
0:00
Overview
0:32
Basic Hemacytometer Components
1:49
Basic Operation of the Hemacytometer
3:26
How to Count Cells
6:21
Determining Cell Viability
7:57
Applications
9:53
Summary
Videos from this collection: