Zliczanie komórek za pomocą hemacytometru
Wiele eksperymentów biomedycznych wymaga manipulacji znaną ilością komórek, aby uzyskać dokładne, powtarzalne i istotne statystycznie dane. Dlatego na…
Liczenie komórek jest istotnym etapem w wielu testach komórkowych, służącym do określania liczby oraz żywotności komórek. Ogólnie celem liczenia jest ustalenie, w jakim stopniu próbkę o nieznanym stężeniu komórek należy rozcieńczyć do dalszego zastosowania. Najpowszechniejszym narzędziem laboratoryjnym do liczenia komórek jest hemacytometr.
Hemacytometr to narzędzie pomiarowe, które pierwotnie zostało stworzone do liczenia komórek krwi. W centrum hemacytometru znajdują się dwie komory pomiarowe, w których znajduje się wyryta laserowo siatka.
Siatka składa się z 9 głównych kwadratów. Cztery kwadraty narożne są dodatkowo podzielone na 16 mniejszych kwadratów. Kwadrat centralny jest podzielony na 25 takich mniejszych kwadratów, z których każdy jest z kolei podzielony na 16 mikrokwadratów.
Na dalszym końcu każdej komory znajdują się porty wprowadzania próbek, do których nanosi się próbkę komórek przeznaczoną do policzenia.
Po obu stronach komór pomiarowych znajdują się podpory do montażu szkiełka nakrywki, na których spoczywa kwarcowe szkiełko nakrywka, zazwyczaj około 0.1 mm nad komorą pomiarową.
Ponieważ powierzchnia każdego dużego kwadratu wynosi 1 mm2, objętość zawarta w każdym dużym kwadracie wynosi 0.1 mm3 lub 1/10 000 ml.
Przed rozpoczęciem liczenia należy zawsze oczyścić szkiełko nakrywkę oraz komorę licznikową za pomocą etanolu i chusteczki typu Kimwipe, aby usunąć wszelkie kłaczki, odciski palców lub ślady wody.
Następnie ostrożnie dodaj niewielką ilość wody do każdego z podpór montażowych szkiełka nakrywki; napięcie powierzchniowe wody utrzyma szkiełko na miejscu.
Teraz delikatnie zhomogenizuj zawiesinę komórkową lub pipetuj ją w górę i w dół, aby rozbić wszelkie agregaty komórek. Użyj mikropipety, aby pobrać około 10 μl zawiesiny, a następnie wprowadź próbkę przez jeden z portów wlotowych. Roztwór zostanie wciągnięty do komory licznikowej dzięki działaniu kapilarnemu i powinien pokryć całą siatkę.
Podczas osiadania komórek wybierz odpowiedni obiektyw. Następnie umieść hemacytometr na stoliku mikroskopu.
Następnie obejrzyj komórki pod mikroskopem. Jeśli w każdym z dużych kwadratów znajduje się mniej niż 5 komórek, może być konieczne ponowne odwirowanie próbki i resuspensja osadu w mniejszej objętości. Jeśli komórki nakładają się na siebie lub są zbyt gęste, by można było je łatwo odróżnić, może być konieczne rozcieńczenie próbki w większej objętości roztworu. Pamiętaj o zapisaniu czynnika rozcieńczenia komórek, ponieważ będzie on potrzebny w późniejszych obliczeniach.
Teraz czas na policzenie komórek!
Jak wspomniano wcześniej, komora liczebna jest pokryta wygrawerowaną laserowo siatką. Linie kwadrantów ułatwiają śledzenie liczonych komórek. Wybierz rozmiar kwadrantu do liczenia w zależności od gęstości komórek w próbce. Na przykład, jeśli liczba komórek jest niska, policz wszystkie komórki w jednym z narożnych kwadrantów. W przypadku próbek o średniej liczbie komórek wybierz jeden z 16 mniejszych kwadrantów. Jeśli gęstość komórek jest bardzo wysoka, policz komórki w jednym z 25 centralnych kwadrantów. Bez względu na wybrany kwadrant lub gęstość próbki komórek, policz co najmniej 20-50 komórek na kwadrant.
Nie wszystkie komórki będą znajdować się dokładnie wewnątrz kwadrantów. Można liczyć komórki, które dotykają górnej i lewej linii, ale należy pomijać te dotykające dolnej lub prawej linii. Aby uzyskać najdokładniejszy wynik, użyj licznika komórek do śledzenia ich liczby i wyciągnij średnią z liczby komórek w 4 kwadrantach tego samego rozmiaru.
Aby obliczyć liczbę komórek w objętości 1 ml, pomnóż liczbę policzonych komórek przez 10 000, ponieważ, jak wspomniano wcześniej, każdy duży kwadrat na siatce stanowi 1/10 000 ml. Jeśli policzono jeden z tych większych kwadrantów, po prostu pomnóż tę liczbę przez 1. Jeśli policzono jeden z mniejszych kwadratów w jednym z narożnych kwadrantów, pomnóż tę liczbę przez 16. Jeśli policzono wszystkie komórki w jednym z 25 centralnych kwadrantów, pomnóż tę liczbę przez 25. Jeśli zawiesina komórkowa została rozcieńczona przed nałożeniem na hemacytometr, należy również pomnożyć wynik przez czynnik rozcieńczenia.
Zatem, aby obliczyć liczbę komórek w 1 ml tej próbki, pomnożylibyśmy 20 komórek w tym centralnym kwadrancie przez 10⁴ i 25, aby otrzymać łącznie 5 x 10⁶ komórek w 1 ml próbki.
Teraz, gdy znamy całkowitą liczbę komórek w 1 ml próbki, musimy pomnożyć tę liczbę przez całkowitą objętość naszego roztworu. Na przykład, jeśli mamy 5 x 10⁶ komórek w 1 ml, to w 2 ml będziemy mieli łącznie 1 x 10⁷ komórek.
Następnie, aby uniknąć błędów wynikających z pomyłek w liczeniu, nierównomiernego rozkładu komórek lub błędów pipetowania, napełnij drugą stronę komory i policz próbkę komórek po raz drugi.
Liczenie komórek pod mikroskopem to również doskonały moment na ocenę żywotności komórek w próbce. W tym celu przed naniesieniem na hemacytometr do próbki często dodaje się błękit trypanu, który jest barwnikiem żywotności.
Żywe komórki nie wchłaniają tego barwnika, ponieważ są one bardzo selektywne pod względem substancji przenikających przez ich błony. Martwa komórka nie posiada jednak nienaruszonej błony, co pozwala błękitowi trypanu przeniknąć do wnętrza i zabarwić cytoplazmę.
Aby sprawdzić żywotność próbki komórek, należy rozcieńczyć alikwot zawiesiny komórkowej w błękicie trypanu, a następnie nanieść próbkę zabarwioną błękitem trypanu w taki sam sposób, jak zwykłą próbkę komórek. W kontraście fazowym żywe komórki będą wyglądać na jasne i złociste i to je należy liczyć; nie należy liczyć matowych, martwych, niebieskich komórek.
Liczbę komórek oblicza się w ten sam sposób co wcześniej, jednak tym razem mnożąc wynik końcowy przez czynnik rozcieńczenia błękitem trypanu. Zatem gdyby nasza pierwotna reprezentatywna próbka została najpierw rozcieńczona w błękicie trypanu, pomnożylibyśmy całkowitą liczbę komórek przez rozcieńczenie błękitem trypanu w stosunku 1:10, co dałoby łącznie 1x108 komórek w naszej próbce.
Po zakończeniu liczenia należy pamiętać o wyczyszczeniu szkiełka nakrywkowego i komory liczbowej!
Skoro opanowaliście już profesjonalne liczenie komórek, omówmy kilka powodów, dla których w konkretnym eksperymencie konieczna może być wiedza o liczbie posiadanych komórek.
Po wyizolowaniu komórek z tkanki prawidłowej lub eksperymentalnej ważne jest ustalenie liczby odzyskanych komórek. W tym przypadku badacze będą chcieli wiedzieć, ile splenocytów, czyli komórek śledziony, wyizolowali z tej śledziony mysiej.
Podczas przeprowadzania eksperymentu mającego na celu sprawdzenie reakcji dwóch różnych populacji komórek, istotne jest określenie liczby każdego z typów komórek poddawanych mieszaniu, jak w tym eksperymencie ko-kultury z limfocytami B i T.
Znajomość liczby komórek jest niezbędna w wielu innych typach testów opartych na komórkach. Tutaj przygotowywany jest test ELISPOT, aby określić liczbę komórek w próbce, które będą wydzielać IFNγ, białko zapalne, w odpowiedzi na ludzkiego wirusa brodawczaka.
Przy przeprowadzaniu eksperymentu, w którym z interesujących nas komórek należy wyekstrahować lub wyizolować mRNA, ważne jest określenie początkowej liczby komórek, aby uzyskać wystarczającą ilość mRNA do przeprowadzenia badania.
Hemacytometr jest niedrogim i stosunkowo łatwym w użyciu narzędziem do liczenia komórek, jednak proces ten może być żmudny i obarczony ryzykiem błędu ludzkiego.
Scepter Handheld Automatic Counter jest, jak wskazuje nazwa, przenośnym urządzeniem liczącym, które cechuje się wyższą dokładnością pomiaru w porównaniu do hemacytometru i potrafi rozróżniać zarówno wielkość, jak i objętość komórek w próbce.
Automatyczny licznik komórek TC10 ocenia zarówno liczbę, jak i żywotność komórek, automatycznie oblicza całkowitą liczbę komórek w próbce oraz umożliwia ich podgląd na ekranie urządzenia.
Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do liczenia komórek. W tym filmie omówiliśmy: czym jest hemacytometr, jak liczyć komórki i określać ich żywotność oraz różne powody, dla których może być konieczne liczenie komórek. Dziękujemy za uwagę i pamiętajcie, aby nie liczyć niebieskich komórek!
Zaloguj się lub , aby uzyskać dostęp do pełnej treści. Dowiedz się więcej o dostępie Twojej instytucji do treści JoVE tutaj
Liczenie komórek jest istotnym etapem w wielu testach komórkowych, służącym do określania liczby oraz żywotności komórek. Ogólnie celem liczenia jest ustalenie, w jakim stopniu próbkę o nieznanym stężeniu komórek należy rozcieńczyć do dalszego zastosowania. Najpowszechniejszym narzędziem laboratoryjnym do liczenia komórek jest hemacytometr.
Hemacytometr to narzędzie pomiarowe, które pierwotnie zostało stworzone do liczenia komórek krwi. W centrum hemacytometru znajdują się dwie komory pomiarowe, w których znajduje się wyryta laserowo siatka.
Siatka składa się z 9 głównych kwadratów. Cztery kwadraty narożne są dodatkowo podzielone na 16 mniejszych kwadratów. Kwadrat centralny jest podzielony na 25 takich mniejszych kwadratów, z których każdy jest z kolei podzielony na 16 mikrokwadratów.
Na dalszym końcu każdej komory znajdują się porty wprowadzania próbek, do których nanosi się próbkę komórek przeznaczoną do policzenia.
Po obu stronach komór pomiarowych znajdują się podpory do montażu szkiełka nakrywki, na których spoczywa kwarcowe szkiełko nakrywka, zazwyczaj około 0.1 mm nad komorą pomiarową.
Ponieważ powierzchnia każdego dużego kwadratu wynosi 1 mm2, objętość zawarta w każdym dużym kwadracie wynosi 0.1 mm3 lub 1/10 000 ml.
Przed rozpoczęciem liczenia należy zawsze oczyścić szkiełko nakrywkę oraz komorę licznikową za pomocą etanolu i chusteczki typu Kimwipe, aby usunąć wszelkie kłaczki, odciski palców lub ślady wody.
Następnie ostrożnie dodaj niewielką ilość wody do każdego z podpór montażowych szkiełka nakrywki; napięcie powierzchniowe wody utrzyma szkiełko na miejscu.
Teraz delikatnie zhomogenizuj zawiesinę komórkową lub pipetuj ją w górę i w dół, aby rozbić wszelkie agregaty komórek. Użyj mikropipety, aby pobrać około 10 μl zawiesiny, a następnie wprowadź próbkę przez jeden z portów wlotowych. Roztwór zostanie wciągnięty do komory licznikowej dzięki działaniu kapilarnemu i powinien pokryć całą siatkę.
Podczas osiadania komórek wybierz odpowiedni obiektyw. Następnie umieść hemacytometr na stoliku mikroskopu.
Następnie obejrzyj komórki pod mikroskopem. Jeśli w każdym z dużych kwadratów znajduje się mniej niż 5 komórek, może być konieczne ponowne odwirowanie próbki i resuspensja osadu w mniejszej objętości. Jeśli komórki nakładają się na siebie lub są zbyt gęste, by można było je łatwo odróżnić, może być konieczne rozcieńczenie próbki w większej objętości roztworu. Pamiętaj o zapisaniu czynnika rozcieńczenia komórek, ponieważ będzie on potrzebny w późniejszych obliczeniach.
Teraz czas na policzenie komórek!
Jak wspomniano wcześniej, komora liczebna jest pokryta wygrawerowaną laserowo siatką. Linie kwadrantów ułatwiają śledzenie liczonych komórek. Wybierz rozmiar kwadrantu do liczenia w zależności od gęstości komórek w próbce. Na przykład, jeśli liczba komórek jest niska, policz wszystkie komórki w jednym z narożnych kwadrantów. W przypadku próbek o średniej liczbie komórek wybierz jeden z 16 mniejszych kwadrantów. Jeśli gęstość komórek jest bardzo wysoka, policz komórki w jednym z 25 centralnych kwadrantów. Bez względu na wybrany kwadrant lub gęstość próbki komórek, policz co najmniej 20-50 komórek na kwadrant.
Nie wszystkie komórki będą znajdować się dokładnie wewnątrz kwadrantów. Można liczyć komórki, które dotykają górnej i lewej linii, ale należy pomijać te dotykające dolnej lub prawej linii. Aby uzyskać najdokładniejszy wynik, użyj licznika komórek do śledzenia ich liczby i wyciągnij średnią z liczby komórek w 4 kwadrantach tego samego rozmiaru.
Aby obliczyć liczbę komórek w objętości 1 ml, pomnóż liczbę policzonych komórek przez 10 000, ponieważ, jak wspomniano wcześniej, każdy duży kwadrat na siatce stanowi 1/10 000 ml. Jeśli policzono jeden z tych większych kwadrantów, po prostu pomnóż tę liczbę przez 1. Jeśli policzono jeden z mniejszych kwadratów w jednym z narożnych kwadrantów, pomnóż tę liczbę przez 16. Jeśli policzono wszystkie komórki w jednym z 25 centralnych kwadrantów, pomnóż tę liczbę przez 25. Jeśli zawiesina komórkowa została rozcieńczona przed nałożeniem na hemacytometr, należy również pomnożyć wynik przez czynnik rozcieńczenia.
Zatem, aby obliczyć liczbę komórek w 1 ml tej próbki, pomnożylibyśmy 20 komórek w tym centralnym kwadrancie przez 10⁴ i 25, aby otrzymać łącznie 5 x 10⁶ komórek w 1 ml próbki.
Teraz, gdy znamy całkowitą liczbę komórek w 1 ml próbki, musimy pomnożyć tę liczbę przez całkowitą objętość naszego roztworu. Na przykład, jeśli mamy 5 x 10⁶ komórek w 1 ml, to w 2 ml będziemy mieli łącznie 1 x 10⁷ komórek.
Następnie, aby uniknąć błędów wynikających z pomyłek w liczeniu, nierównomiernego rozkładu komórek lub błędów pipetowania, napełnij drugą stronę komory i policz próbkę komórek po raz drugi.
Liczenie komórek pod mikroskopem to również doskonały moment na ocenę żywotności komórek w próbce. W tym celu przed naniesieniem na hemacytometr do próbki często dodaje się błękit trypanu, który jest barwnikiem żywotności.
Żywe komórki nie wchłaniają tego barwnika, ponieważ są one bardzo selektywne pod względem substancji przenikających przez ich błony. Martwa komórka nie posiada jednak nienaruszonej błony, co pozwala błękitowi trypanu przeniknąć do wnętrza i zabarwić cytoplazmę.
Aby sprawdzić żywotność próbki komórek, należy rozcieńczyć alikwot zawiesiny komórkowej w błękicie trypanu, a następnie nanieść próbkę zabarwioną błękitem trypanu w taki sam sposób, jak zwykłą próbkę komórek. W kontraście fazowym żywe komórki będą wyglądać na jasne i złociste i to je należy liczyć; nie należy liczyć matowych, martwych, niebieskich komórek.
Liczbę komórek oblicza się w ten sam sposób co wcześniej, jednak tym razem mnożąc wynik końcowy przez czynnik rozcieńczenia błękitem trypanu. Zatem gdyby nasza pierwotna reprezentatywna próbka została najpierw rozcieńczona w błękicie trypanu, pomnożylibyśmy całkowitą liczbę komórek przez rozcieńczenie błękitem trypanu w stosunku 1:10, co dałoby łącznie 1x108 komórek w naszej próbce.
Po zakończeniu liczenia należy pamiętać o wyczyszczeniu szkiełka nakrywkowego i komory liczbowej!
Skoro opanowaliście już profesjonalne liczenie komórek, omówmy kilka powodów, dla których w konkretnym eksperymencie konieczna może być wiedza o liczbie posiadanych komórek.
Po wyizolowaniu komórek z tkanki prawidłowej lub eksperymentalnej ważne jest ustalenie liczby odzyskanych komórek. W tym przypadku badacze będą chcieli wiedzieć, ile splenocytów, czyli komórek śledziony, wyizolowali z tej śledziony mysiej.
Podczas przeprowadzania eksperymentu mającego na celu sprawdzenie reakcji dwóch różnych populacji komórek, istotne jest określenie liczby każdego z typów komórek poddawanych mieszaniu, jak w tym eksperymencie ko-kultury z limfocytami B i T.
Znajomość liczby komórek jest niezbędna w wielu innych typach testów opartych na komórkach. Tutaj przygotowywany jest test ELISPOT, aby określić liczbę komórek w próbce, które będą wydzielać IFNγ, białko zapalne, w odpowiedzi na ludzkiego wirusa brodawczaka.
Przy przeprowadzaniu eksperymentu, w którym z interesujących nas komórek należy wyekstrahować lub wyizolować mRNA, ważne jest określenie początkowej liczby komórek, aby uzyskać wystarczającą ilość mRNA do przeprowadzenia badania.
Hemacytometr jest niedrogim i stosunkowo łatwym w użyciu narzędziem do liczenia komórek, jednak proces ten może być żmudny i obarczony ryzykiem błędu ludzkiego.
Scepter Handheld Automatic Counter jest, jak wskazuje nazwa, przenośnym urządzeniem liczącym, które cechuje się wyższą dokładnością pomiaru w porównaniu do hemacytometru i potrafi rozróżniać zarówno wielkość, jak i objętość komórek w próbce.
Automatyczny licznik komórek TC10 ocenia zarówno liczbę, jak i żywotność komórek, automatycznie oblicza całkowitą liczbę komórek w próbce oraz umożliwia ich podgląd na ekranie urządzenia.
Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do liczenia komórek. W tym filmie omówiliśmy: czym jest hemacytometr, jak liczyć komórki i określać ich żywotność oraz różne powody, dla których może być konieczne liczenie komórek. Dziękujemy za uwagę i pamiętajcie, aby nie liczyć niebieskich komórek!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a hemacytometer and why is it used for cell counting?
A hemacytometer is a counting chamber with a laser-etched grid originally designed for counting blood cells. It contains two counting chambers with grids divided into quadrants of varying sizes. The tool allows researchers to count cells under a light microscope and calculate total cell concentration, making it essential for determining cell numbers in biomedical experiments requiring known cell quantities.
Q2: How is the hemacytometer grid structured for cell counting?
The hemacytometer grid consists of 9 major quadrants. The four corner quadrants are subdivided into 16 smaller quadrants each, while the central quadrant contains 25 smaller quadrants, each further divided into 16 micro-quadrants. Each large square has an area of 1 mm² and contains a volume of 0.1 mm³, or 1/10,000th of a milliliter, which is critical for calculating total cell concentration.
Q3: What preparation steps are necessary before loading cells into a hemacytometer?
Clean the coverslip and counting chamber with ethanol and a kimwipe to remove lint, fingerprints, and watermarks. Apply water to the coverslip mounting supports to hold the coverslip in place using surface tension. Gently triturate the cell suspension by pipetting up and down to dislodge cell clumps, then aspirate approximately 10 microliters and load it into an introduction port where capillary action draws the solution across the grid.
Q4: How do you choose which quadrant to count based on cell density?
Select quadrant size according to cell density: for low cell numbers, count all cells in one corner quadrant; for medium density, use one of the 16 smaller quadrants; for high density, count cells in one of the 25 central quadrants. Always count at least 20-50 cells per quadrant to ensure accuracy. Count cells touching the top and left lines but disregard those touching bottom or right lines.
Q5: How do you calculate the total number of cells in your sample?
Multiply the cell count by 10,000 (since each large square equals 1/10,000th of a milliliter). Apply a multiplication factor based on quadrant size: multiply by 1 for large quadrants, by 16 for corner quadrants, or by 25 for central quadrants. If you diluted the sample, multiply by the dilution factor. Finally, multiply by total sample volume to determine total cell number in your experimental sample.
Q6: What is trypan blue exclusion and how does it determine cell viability?
Trypan blue is a vital stain that distinguishes live from dead cells. Live cells have intact membranes and exclude the dye, appearing bright and golden under phase contrast microscopy. Dead cells lack membrane integrity, allowing trypan blue to enter and stain the cytoplasm blue. Count only live cells and multiply the final count by the trypan blue dilution factor to determine viable cell concentration in your sample.
Q7: Why is accurate cell counting important in biomedical experiments?
Accurate cell counting ensures reproducible, statistically-relevant data in cell-based assays. Researchers need precise cell numbers when isolating cells from tissue, mixing different cell populations in co-culture experiments, performing immunoassays like ELISPOT, or extracting mRNA from cells. Knowing exact cell quantities allows proper dilution and standardization of experimental conditions across replicates and supports passaging cells cell lines subculturing methods and applications.