Name: Parabioza u myszy: szczegółowy protokół (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-06T21:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Naucz się parabiozy u myszy, aby badać wspólny układ krążenia. Technika chirurgiczna łączy dwa organizmy bez immunosupresji, umożliwiając długoterminowe obserwacje chimerizmu krwi metodą cytometrii przepływowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Adriane Mosley i Libuse Jerabek (Stanford) za pomoc w technice chirurgicznej.

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi komitetu UCLA's animal care and use oraz National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Czas trwania opisanej poniżej procedury to około 45-60 minut od początku do końca.
1. Przygotowanie pola operacyjnego
<ol>
	<li>Zabieg należy wykonać w czystym pomieszczeniu do chirurgii dla zwierząt.</li>
	<li>Wyposażenie: waporyzator izofluranowy, pompka Gaymer T z poduszką grzewczą.</li>
	<li>Sterylne narzędzia: dwa zakrzywione kleszczyki, drobne nożyczki, uchwyt na igłę.</li>
	<li>Podczas całego zabiegu należy używać sterylnych rękawiczek.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Umieścić dwa samce lub samice myszy o tym samym pochodzeniu genetycznym, o podobnej wadze i wielkości, w tej samej klatce i monitorować przez co najmniej dwa tygodnie, aby zapewnić harmonijne współżycie. Samice myszy są preferowane ze względu na ich mniej agresywne zachowanie.</li>
	<li>Znieczulenie zwierząt za pomocą waporyzatora izofluranowego. Umieść myszy w komorze indukcyjnej Posi-Seal podłączonej do parownika izofluranu (4-5% v/v). Po wywołaniu znieczulenia przenieś zwierzę do obszaru golenia sierści i utrzymuj znieczulenie przez cały zabieg przez stożek nosowy połączony z izofluranem (1,5-2% v/v). Nałóż maść okulistyczną z patyczkiem higienicznym, aby zapobiec suchości oczu.</li>
	<li>Ułóż zwierzę w pozycji leżącej. Dokładnie ogol lewą stronę myszy umieszczoną po lewej i prawą stronę myszy umieszczoną po prawej stronie, zaczynając od około 1 cm powyżej łokcia do 1 cm poniżej kolana.</li>
	<li>Ogolone miejsca należy przygotować w aseptyce, dokładnie przecierając (2-3x) chusteczkami nasączonymi betadine, a następnie chusteczkami nasączonymi alkoholem. Umieść myszy na podgrzewanej podkładce pokrytej sterylną podkładką.</li>
	<li>W przypadku analgezji karprofen i buprenorfinę należy podawać dootrzewnowo lub podskórnie w dawkach odpowiednio 10 mg/kg mc. i 0,1 mg/kg.</li>
	<li>Ułóż zwierzęta na boku, tyłem do siebie, z przylegającymi ogolonymi obszarami skierowanymi do góry. Aby uniknąć zanieczyszczenia obszaru operacyjnego, przykryj myszy sterylną serwetą, odsłaniając tylko obszar operacji. Utwórz mały otwór na zasłonę, aby zachować sterylność podczas wykonywania operacji. Sprawiliśmy, że okno zasłony jest duże, aby zapewnić lepszą widoczność podczas nagrywania wideo.</li>
</ol>
3. Parabioza
<ol>
	<li>Za pomocą ostrych nożyczek wykonaj podłużne nacięcia skóry na ogolonych bokach każdego zwierzęcia, zaczynając od 0,5 cm powyżej łokcia aż do 0,5 cm poniżej stawu kolanowego (ryc. 1). Po nacięciu delikatnie oderwij skórę od powięzi podskórnej, przytrzymując skórę parą zakrzywionych kleszczy i oddziel powięź drugą parą, aby utworzyć 0,5 cm wolnej skóry. Wykonaj tę separację wzdłuż całego nacięcia.</li>
	<li>Rozpocznij łączenie od przyczepienia lewego łokcia jednego zwierzęcia do prawego łokcia drugiego. Zarówno oleczrany, jak i stawy kolanowe są wyraźnie rozróżnialne po nacięciu skóry. Aby ułatwić łączenie, zegnij łokieć pierwszej myszy i przełóż igłę niewchłanialnego szwu 3-0 pod olekranon. Podobnie zegnij łokieć drugiej myszy i przełóż pod nią ten sam szew. Przymocuj stawy mocno za pomocą podwójnego węzła chirurgicznego.</li>
	<li>Połącz stawy kolanowe zgodnie z tą samą procedurą.</li>
	<li>Po przyczepieniu stawów połącz skórę obu zwierząt za pomocą ciągłego wchłanialnego szwu Vicryl 5-0, zaczynając brzusznie od łokcia w kierunku kolana. Aby zapobiec pękaniu i oddzielaniu się skóry, wykonaj szczelne zamknięcie szwu skóry w okolicy łokci i kolan. Po zakończeniu przyczepiania skóry brzusznej wykonaj podwójny węzeł chirurgiczny. Umieść myszy w pozycji leżącej i kontynuuj szew grzbietowo, kończąc podwójnym węzłem chirurgicznym. Sprawdź ciągłość szwu i potwierdź brak otworów.</li>
	<li>Podawaj 0,5 ml 0,9% NaCl podskórnie każdej myszy, aby zapobiec odwodnieniu.</li>
</ol>
4. Rekonwalescencja pooperacyjna
<ol>
	<li>Trzymaj zwierzęta na podgrzewanej podkładce do czasu wyzdrowienia.</li>
	<li>Po wyzdrowieniu należy podać leki przeciwbólowe karprofen i buprenorfinę. Powtarzać dootrzewnowo lub podskórnie odpowiednio co 24 i 12 godzin przez 48 godzin w tych samych dawkach opisanych powyżej (krok 2.5). Monitoruj zwierzęta pod kątem oznak bólu i niepokoju, takich jak drżenie, letarg, gryzienie ogona, wygięty grzbiet, brak pielęgnacji itp. codziennie przez dwa tygodnie.</li>
	<li>Profilaktycznie należy leczyć myszy zawiesiną doustną Sulfametoksazol / trimetoprim w butelce z wodą 2 mg sulfa/ml +0,4 mg trim/ml przez 10 dni, aby zapobiec infekcjom bakteryjnym.</li>
	<li>Umieść każdą parę parabiotyków w czystej klatce z monolitycznym materiałem ściółkowym (np. ręcznikiem papierowym lub chłonną sterylną wkładką), aby zapobiec aspiracji materiału ściółkowego. Zwierzęta należy umieścić w klatce wypełnionej ściółką, gdy są w stanie utrzymać pozycję leżącą mostka z głową do góry. Aby zminimalizować wysiłek związany z sięganiem po pokarm podczas przystosowywania się do życia parabiotycznego, umieść zwilżone granulki żywności na podłodze klatki. Zapewnij materiał do zagnieżdżania. W ciągu 1-2 tygodni myszy parabiotyczne mają zdolność normalnego poruszania się na chirurgicznie sparowanych kończynach przednich i tylnych.</li>
	<li>Chimeryzm krwi występuje 10-14 dni po zabiegu.</li>
</ol>
5. Potwierdzenie i procedura odwrotna
<ol>
	<li>Po dwóch tygodniach pobierz krew z żył ogonowych każdej myszy do analizy cytometrycznej przepływowej, aby potwierdzić chimeryzm krwi (ryc. 3).</li>
	<li>Przetwarzanie krwi do analizy cytometrii przepływowej: rozcieńczyć 2-3 krople krwi w 500 μl 10 mM EDTA. Dodać 500 μl 2% dekstranu (rozcieńczonego w PBS), dokładnie wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min. Przenieść supernatant do nowej probówki, wirować z prędkością 1 200 obr./min przez 5 minut i ponownie zawiesić granulowane komórki w PBS (lub innym buforze) do analizy metodą cytometrii przepływowej.</li>
	<li>W zależności od projektu eksperymentalnego, para parabiotyków może zostać rozdzielona w późniejszych punktach czasowych. Z naszego doświadczenia wynika, że utrzymywaliśmy parabiozę par przez okres do 9 miesięcy bez żadnych komplikacji.</li>
	<li>Wykonaj odwrotną procedurę na sterylnej powierzchni chirurgicznej. Znieczulij myszy, umieszczając je w komorze indukcyjnej podłączonej do parownika izofluranu (4-5%) i utrzymuj znieczulenie 1,5-2% izofluranem, jak opisano powyżej (krok 2.2).</li>
	<li>Usunąć włosy z obszaru otaczającego początkowy szew i aseptycznie przygotować ogolone miejsca, jak opisano powyżej (kroki 2.3, 2.4).</li>
	<li>W przypadku analgezji karprofen i buprenorfinę należy podawać dootrzewnowo lub podskórnie w dawkach odpowiednio 10 mg/kg i 0,1 mg/kg.</li>
	<li>Przykryj obszar operacyjny sterylną serwetą, jak opisano powyżej (krok 2.6).</li>
	<li>Za pomocą ostrych nożyczek oddziel myszy przez podłużne nacięcie wzdłuż szwu bocznego i delikatnie odłącz nowo utworzoną powięź między dwiema myszami za pomocą pary zakrzywionych kleszczy. Aby rozdzielić stawy, odetnij węzły łączącego je szwu. Odetnij skórę wzdłuż nacięcia, aby uzyskać gładkie krawędzie i ponownie przymocuj skórę za pomocą wchłanialnego, ciągłego szwu Vicryl z powłoką 5-0.</li>
	<li>Aby zapobiec odwodnieniu, podawaj 0,5 ml 0,9% NaCl podskórnie każdej myszy. Trzymaj zwierzęta na podgrzewanej podkładce do czasu wyzdrowienia.</li>
	<li>Po wyzdrowieniu należy powtórzyć podawanie leku przeciwbólowego, karprofenu (10 mg/kg) co 24 godziny i buprenorfiny (0,1 mg/kg) co 12 godzin przez 48 godzin.</li>
	<li>Aby zapobiec infekcjom bakteryjnym, należy leczyć myszy zawiesiną doustną sulfametoksazolu/trimetoprimu (2 mg sulfa/ml +0,4 mg trim/ml) w butelce z wodą przez 10 dni.</li>
</ol>

<ol><li>Bert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exp%C3%A9riences+et+consid%C3%A9rations+sur+la+greffe+animale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+l%27Anatomie+et+de+la+Physiologie%22%5BJournal%5D)">Expériences et considérations sur la greffe animale.</a> Journal de l'Anatomie et de la Physiologie. 1, 69-87 Forthcoming.</li>
<li>Bunster, E., Meyer, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+of+parabiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Improved methods of parabiosis.</a> Anat. Rec. 57, 339-380 (1933).</li>
<li>Waskow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+parabiotic+mice+for+the+study+of+DC+and+DC+precursor+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of parabiotic mice for the study of DC and DC precursor circulation.</a> Methods Mol. Biol. 595, 413-428 (2010).</li>
<li>Finerty, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parabiosis+in+physiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Parabiosis in physiological studies.</a> Physiol. Rev. 32, 277-302 (1952).</li>
<li>Aicher, A., Heeschen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonbone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cells%3A+what+is+their+exact+location%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Nonbone marrow-derived endothelial progenitor cells: what is their exact location.</a> Circ. Res. 101, e102(2007).</li>
<li>Abe, S., Boyer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+derived+from+the+circulation+contribute+to+the+repair+of+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Cells derived from the circulation contribute to the repair of lung injury.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170, 1158-1163 (2004).</li>
<li>Donskoy, E., Goldschneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymocytopoiesis+is+maintained+by+blood-borne+precursors+throughout+postnatal+life.+A+study+in+parabiotic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymocytopoiesis is maintained by blood-borne precursors throughout postnatal life. A study in parabiotic mice.</a> J. Immunol. 148, 1604-1612 (1992).</li>
<li>Powell, A. E., Anderson, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+between+Intestinal+epithelial+cells+and+macrophages+in+a+cancer+context+results+in+nuclear+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fusion between Intestinal epithelial cells and macrophages in a cancer context results in nuclear reprogramming.</a> Cancer Res. 71, 1497-1505 (2011).</li>
<li>Duyverman, A. M., Kohno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+parabiosis+skin+transplantation+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A transient parabiosis skin transplantation model in mice.</a> Nat. Protoc. 7, 763-770 (2012).</li>
<li>Ajami, B., Bennett, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+self-renewal+can+sustain+CNS+microglia+maintenance+and+function+throughout+adult+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life.</a> Nat. Neurosci. 10, 1538-1543 (2007).</li>
<li>Weissman, I. L., Jerabek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+and+the+H-Y+antigen%3A+Requirement+for+male+T+cells%2C+but+not+B+cells%2C+to+induce+tolerance+in+neonatal+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Tolerance and the H-Y antigen: Requirement for male T cells, but not B cells, to induce tolerance in neonatal female mice.</a> Transplantation. 37, 3-6 (1984).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Omawiana tutaj metoda parabiozy przedstawia minimalne trudności techniczne i skutkuje niską śmiertelnością. Przyczep stawów kolanowych i łokciowych jest znaczącym ulepszeniem techniki Bunstera i Meyera. Zabieg pozostaje jednak inwazyjny, dlatego konieczne jest utrzymanie sterylnych warunków przez cały czas trwania zabiegu. Aby dodatkowo zapobiec zakażeniu miejsca operowanego, ważne jest, aby zwierzęta poddane parabiozie otrzymywały kombinację antybiotyków i były regularnie monitorowane. Aby zapewnić mocne podparcie i zap...

Parabioza, chirurgiczne połączenie dwóch organizmów, została po raz pierwszy opisana w 1864 roku przez Paula jako sposób na opracowanie modelu do badania wspólnych układów krążenia i polegała na połączeniu skóry i ścian mięśniowych dwóch szczurów1. Parabioza sprzyja tworzeniu się mikrokrążenia w miejscu zapalenia3 i ma kilka zastosowań w badaniach fizjologicznych, takich jak komunikacja hormonalna między przysadką mózgową a gonadami, a także rola nerek w nadciśnieniu4. Został on następnie wykorzystany do zbadania rekrutacji i integracji komórek progenitorowych w neowaskularyzacji5, migracji hematopoetycznych komórek macierzystych6 i transporcie limfocytów7, a także roli i kinetyki krążących komórek zapalnych lub macierzystych w przerzutach nowotworowych8,9 i chorobach neurodegeneracyjnych10.
Jedną z istotnych zalet parabiozy jest to, że zwierzęta współpracujące mają wspólne krążące antygeny, co pozwala na migrację komórek i neowaskularyzację bez wywoływania reakcji immunologicznej. Co ważne, Weissman i wsp. wykazali, że parabioza między samcami i samicami myszy nie prowadzi do powstawania przeciwciał anty H-Y11.
W oryginalnym protokole opisanym przez Paula, dwa zwierzęta były połączone ze sobą poprzez połączenie skóry i ścian mięśniowych1. Metoda ta powodowała jednak znaczne obciążenie zwierząt i skutkowała wysoką śmiertelnością z powodu zakażenia rany. Od tego czasu technika parabiozy została zrewidowana przez kilka grup, z których najbardziej dominującą jest protokół zaproponowany przez Bunstera i Meyera w 1933roku. Ich metoda obejmowała połączenie stawów łopatki, jam ciała i skóry, co pozwoliło na lepsze wsparcie i mniejszy ból dla zwierząt. Jednocześnie nowa metoda skutkowała minimalną opieką pooperacyjną i znacznie zmniejszyła śmiertelność. Opisany w niniejszym dokumencie protokół jest modyfikacją techniki Bunstera i Meyera, która jest mniej inwazyjna i pozwala na mocniejsze łączenie. Mianowicie, myszy są połączone przez stawy łokciowe i kolanowe, a także przez skórę. To połączenie zapobiega rozszerzaniu się skóry, a tym samym powoduje mniejszy ból i powikłania. W tym miejscu opisujemy łączenie dorosłej myszy typu dzikiego (WT) z konstytutywną myszą wykazującą ekspresję GFP. Pokazujemy, że dwa tygodnie po operacji możemy osiągnąć 50% chimeryzmu krwi, co świadczy o skuteczności tej procedury chirurgicznej w tworzeniu wspólnego układu krążenia.

<table><tbody><tr><td>Maszynka do strzyżenia</td> <td>Isoflurane-Phoenix</td><td>NDC 57319-559-06</td><td></td></tr><tr><td>Komora indukcyjna Posi-Seal</td><td>Produkty do obrazowania molekularnego</td><td>AS-01-0530-SM</td><td></td></tr><tr><td>Przenośny system anestezjologiczny</td><td>Produkty do obrazowania molekularnego</td><td>AS-01-0007</td><td></td></tr><tr><td>Pompa Gaymer</td><td>T Gaymar Industries, Inc</td> Koc ocieplający <td>TP650</td><td></td></tr><tr><td>(poduszka grzewcza)</td><td>Kent Scientific Corp</td><td>TP-22G</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze zakrzywione</td><td>Roboz</td><td>RS-5101</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Narzędzia do nauki (FST)</td><td>FST 14063-09</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na igły</td><td></td><td>FST FST 12501-13</td><td></td></tr><tr><td>Golarka elektryczna</td><td>Oster</td><td>Golden A5</td><td></td></tr></tbody></table>

parabioza u myszy: szczegółowy protokół

Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol

Parabioza to chirurgiczne połączenie dwóch organizmów, które umożliwiają dzielenie krążenia krwi. Przyczepienie skóry dwóch zwierząt sprzyja tworzeniu się mikrokrążenia w miejscu zapalenia. Partnerzy parabiotyczni dzielą się krążącymi antygenami, dzięki czemu są wolni od niepożądanych reakcji immunologicznych. Po raz pierwszy opisana przez Paula w 1864roku1, chirurgia parabiozy została udoskonalona przez Bunstera i Meyera w 1933 roku w celu poprawy przeżywalności zwierząt2. W obecnym protokole dwie myszy są łączone chirurgicznie po modyfikacji techniki Bunstera i Meyera. Zwierzęta są połączone przez stawy łokciowe i kolanowe, a następnie przyczepia się do skóry, zapewniając mocne podparcie, które zapobiega obciążeniu zszytej skóry. W tym artykule szczegółowo opisujemy parabiotyczne łączenie się wszechobecnej myszy wykazującej ekspresję GFP z myszą typu dzikiego (WT). Dwa tygodnie po zabiegu para zostaje rozdzielona, a komórki GFP dodatnie można wykryć za pomocą analizy cytometrii przepływowej w krążeniu krwi myszy WT. Chimeryzm krwi pozwala na zbadanie udziału krążących komórek jednego zwierzęcia w drugim.

Oczekiwanym wynikiem parabiozy dwóch organizmów jest równy wkład układu krwionośnego każdego z zwierząt do wspólnego krwiobiegu (Rysunek 2). Prawidłowe wyrównanie krwi parabiozowanych myszy WT i GFP-dodatnich można łatwo zweryfikować za pomocą analizy cytometrycznej. W tym przypadku krew żylną pobrano z ogonów obu parabiontów 2 tygodnie po operacji, a następnie poddano frakcjonowaniu w celu wyizolowania komórek krwi obwodowej (aby wykluczyć erytrocyty). Wyizolowaną frakcję komórek pochodzenia hematopoety...

Parabiotyczne połączenie dwóch organizmów prowadzi do rozwoju wspólnego układu krążenia. W tym protokole opisujemy kroki chirurgiczne mające na celu utworzenie parabiotycznego połączenia między myszą typu dzikiego a myszą konstytutywną z ekspresją GFP.

Parabioza u myszy: szczegółowy protokół

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykonanie parabiotycznego połączenia dwóch myszy w celu zbadania wspólnego układu krwionośnego. Cel ten osiąga się poprzez wykonanie nacięcia po sąsiednich stronach ciał zwierząt. Po rozdzieleniu powięzi obie myszy zostają trwale połączone w stawach łokciowych i kolanowych.Ostatnim krokiem jest połączenie skóry obu zwierząt za pomocą ciągłego szwu. W końcowym etapie analiza cytometryczna przepływowa może wykazać chimeryzm krwi w ciągu 10 do 14 dni po zabiegu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak przeszczep szpiku kostnego czy wstrzykiwanie komórek, jest fakt, że nie wymaga ona immunosupresji, a także pozwala na utrzymanie krążenia CX przez długi czas.Procedura zostanie zademonstrowana na szczurach. Chirurg weterynaryjny z mojego laboratorium, z co najmniej dwutygodniowym wyprzedzeniem, przygotował kilka klatek z parami myszy tej samej płci, najlepiej samic, o tej samej genetyce oraz podobnej wielkości i wadze. Po wybraniu zgodnej pary, należy przeprowadzić parabiozę w czystym pomieszczeniu do zabiegów chirurgicznych zwierząt.Należy upewnić się, że wszystkie powierzchnie kontaktowe, narzędzia i rękawiczki są sterylne. Myszy należy znieczulić w komorze indukcyjnej PAI podłączonej do waporyzatora izofluranu. Po indukcji znieczulenia należy je utrzymywać przez cały czas trwania procedury.Stosując stożek nosowy i podając niższą stężenie izofluranu, należy teraz zgolić futro na brzuchu po przeciwnych stronach i nałożyć maść oftalmiczną. Następnie aseptycznie przygotować zgolone obszary, dokładnie przecierając je gazikami nasączonymi betadyną, a następnie gazikami nasączonymi alkoholem.Następnie przenieś myszy na podgrzewaną podkładkę przykrytą sterylnym gazikiem. W celu zapewnienia analgezji zastosuj karprofen i buprenorfinę. Ułóż myszy na bokach, plecami do siebie, z ogolonymi obszarami skierowanymi do góry.Następnie należy przykryć myszy jałowym polem operacyjnym, odsłaniając jedynie obszar zabiegu. Za pomocą ostrych nożyczek należy wykonać podłużne nacięcia skóry po bokach każdego zwierzęcia, rozpoczynając pół centymetra poniżej stawu kolanowego i kończąc pół centymetra powyżej stawu łokciowego. Po wykonaniu nacięcia należy delikatnie oddzielić skórę od powięzi podskórnej, unosząc skórę zakrzywioną pęsetą i oddzielając powięź drugą pęsetą.Aby uzyskać pół centymetra wolnej skóry, LEC oraz stawy kolanowe muszą być wyraźnie rozróżnialne. Po nacięciu skóry należy rozpocząć łączenie lewego i prawego LEC. Najpierw zgiąć łokieć pierwszej myszy i przeprowadzić igłę nici chirurgicznej 3.0 pod Theon.Po drugie, zegnij łokieć drugiej myszy i przeprowadź tę samą nić pod nim. Mocno zwiąż stawy podwójnym węzłem chirurgicznym. Następnie połącz stawy kolanowe, stosując tę samą procedurę.Po zespoleniu stawów zszyj skórę obu zwierząt ciągłym szwem z chłonnego materiału Vicryl 5-0. Zacznij od strony brzusznej w okolicy łokcia, aby zapobiec rozerwaniu i rozdzieleniu skóry.Wykonaj szczelne szwy skóry w obszarze wokół łokci i kolan. Połączenie płatów skóry jest krytycznym krokiem tej procedury. Należy upewnić się, że płaty są ściśle połączone, aby uniknąć rozejścia się rany i oddzielenia tkanek po operacji.Dlatego co cztery do pięciu miesięcy sprawdzamy, czy skóra jest ściśle złączona. Po zakończeniu zespolenia skóry od strony brzusznej, ułożyć myszy w pozycji brzusznej i kontynuować szycie od strony grzbietowej, kończąc podwójnym węzłem chirurgicznym. Zweryfikować ciągłość szwu i upewnić się, że nie ma w nim żadnych szczelin.Zakończ zabieg, podając podskórnie każdemu zwierzęciu 0,5 ml 0,9% NaCl, aby zapobiec odwodnieniu. Pozostaw zwierzęta na podgrzewanej podkładce do momentu ich wybudzenia. Umieść każdą parę parabiotyczną w czystej klatce z nawilżonym pokarmem w formie peletu, aby zminimalizować wysiłek związany z sięganiem po jedzenie podczas adaptacji do stanu parabiozy.Umieść pelet paszowy na dnie klatki. Należy również zapewnić materiał do budowy gniazda przez pierwsze 48 godzin po operacji. Podawaj karprofen co 24 godziny oraz buprenorfinę co 12 godzin codziennie przez dwa tygodnie.Monitoruj zwierzęta pod kątem oznak bólu i stresu, takich jak drżenie, letarg, obgryzanie ogona, wygięcie grzbietu, brak pielęgnacji itp. Aby zapobiec infekcjom bakteryjnym w ciągu pierwszych 10 dni po operacji, podawaj myszom doustną zawiesinę sulfametoksazolu i trimetoprymu w butelce z wodą. Pobranie krwi odbędzie się od 10 do 14 dni po zabiegu.Po upływie dwóch tygodni pobierz krew z żył ogonowych, aby potwierdzić, że proces ten zaszedł. Do analizy krwi wykorzystaj cytometrię przepływową. Rozcieńcz dwie do trzech kropli w 500 µL 10 mM EDTA.Następnie dokładnie wymieszaj rozcieńczenie z 500 µL 2% dekstryny w PBS. Inkubuj mieszaninę krwi w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie odwiruj ją, aby zebrać nadsącz. Do praktycznego zastosowania.Pary probiotyczne mogą być utrzymywane razem przez dziewięć miesięcy i rozdzielone bez żadnych komplikacji. Procedurę odwrotną należy przeprowadzić na sterylnej powierzchni chirurgicznej. Należy zastosować ten sam protokół znieczulenia, który opisano wcześniej, i usunąć owłosienie z obszaru otaczającego początkowy szew.Po aseptycznym przygotowaniu ogolonej skóry, podaj leki przeciwbólowe i osłoń pole operacyjne za pomocą draperii, używając ostrych nożyczek. Rozdziel myszy poprzez nacięcie podłużne wzdłuż szwu bocznego, aby oddzielić stawy, a następnie przetnij węzły szwu łączącego je u każdej myszy. Odetnij nadmiar skóry wzdłuż nacięcia, aby wygładzić brzegi.Następnie ponownie zszyj skórę, używając wchłanialnej szwy ciągłej 5-0 z powłoką Vicryl, aby zapobiec odwodnieniu, podaj podskórnie 0,5 mL 0,9% NaCl, a następnie umieść zwierzęta na ogrzewanej podkładce, aż wybudzą się z narkozy. Zastosuj te same pooperacyjne leki przeciwbólowe i przeciwbakteryjne, co opisano wcześniej; oczekiwanym wynikiem parabiozy dwóch organizmów jest równy wkład układów krwionośnych każdego z zwierząt do wspólnego krwiobiegu. Wyrównanie krwi z myszy typu dzikiego i myszy GFP-dodatnich poddanych parabiozie zbadano za pomocą analizy cytometrycznej z przepływem, zgodnie z wcześniejszymi badaniami.Krew pobrana z myszy typu dzikiego wykazała obecność chimeryzmu, na co wskazywał fakt, że około połowę komórek krwi stanowiły komórki GFP-dodatnie, a drugą połowę komórki typu dzikiego. Po opanowaniu tej techniki, jej wykonanie zajmuje od 45 do 60 minut, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury.

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Parabioza u myszy: Szczegółowy protokół

Niniejszy protokół przedstawia metody ekstrakcji plemników z jąder samców oraz następującą po niej inseminację samic myszy. Procedura ta jest przydatna w badaniach rozwojowych wymagających precyzyjnego określenia czasu, a także w pracach nad organizmami transgenicznymi.

Pozyskiwanie nasienia i sztuczne zapłodnienie myszy

Ten protokół zawiera instrukcję krok po kroku, jak generować parabiotyczne zarodki danio pręgowanego o różnym pochodzeniu genetycznym. W połączeniu z niezrównanymi możliwościami obrazowania zarodka danio pręgowanego, metoda ta zapewnia wyjątkowo potężny środek do badania funkcji autonomicznych i nieautonomicznych komórek dla genów kandydujących na badanie.

Generowanie parabiotycznych zarodków danio pręgowanego poprzez chirurgiczne zespolenie rozwijających się blastuli

Upłynnienie nasienia jest niezbędne do uwolnienia nasienia z żelu nasiennego. W badaniu przedstawiono procedury pobierania nasienia z żeńskiego układu rozrodczego po stosunku płciowym oraz pomiaru czasu upłynnienia nasienia.

Pobieranie nasienia po kryciu z żeńskiego układu rozrodczego i pomiar upłynnienia nasienia u myszy

Ten protokół opisuje mysi model chirurgii ortopedycznej, który był używany do badania mechanizmów pooperacyjnego zapalenia nerwów i zmian w zachowaniu, a w połączeniu z parabiozą, do badania regeneracji tkanek podczas starzenia.

Mysi model chirurgii ortopedycznej do badania pooperacyjnych dysfunkcji poznawczych i regeneracji tkanek

Tutaj prezentujemy protokół promujący integrację transgenów i produkcję założycielskich myszy transgenicznych z wysoką skutecznością poprzez proste wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego w przestrzeń okołobrewą zapłodnionego oocytu.

Produkcja transgenicznych myszy za pośrednictwem lentiwirusa: prosta i wysoce skuteczna metoda bezpośredniego badania założycieli

Tutaj opisujemy nową metodę wykrywania udanego ustanowienia wspólnego krążenia krwi dwóch parabiontów poprzez wstrzyknięcie glukozy do żyły ogonowej, która powoduje minimalne szkody i nie jest śmiertelna dla parabiontów.

Wykrywanie ustalenia wspólnego dopływu krwi u myszy parabiotycznych przez wstrzyknięcie glukozy do żyły ogonowej

Ten artykuł ma na celu pokazanie użycia partenogenetycznych haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych jako substytutu plemników do budowy półklonowanych embrionów.

Zastosowanie partenogenetycznych haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych myszy jako substytutu plemników

Przedstawiona metoda manipulacji szyjką macicy może wywołać pseudociążę u myszy bez potrzeby rozmnażania samic z samcami po wazektomii. Indukcja ciąży rzekomej jest niezbędna do powodzenia niechirurgicznego transferu zarodków i niechirurgicznego sztucznego zapłodnienia, które również zostały przedstawione.

Wywoływanie ciąży rzekomej u samic myszy bez konieczności wazektomii samców przed niechirurgicznym transferem zarodków lub sztucznym zapłodnieniem

Tutaj prezentujemy protokół hodowli określonych podtypów komórek podwzgórza w hodowli. Komórki mogą być wybierane na podstawie odpowiednich/unikalnych markerów błonowych i wykorzystywane w wielu zastosowaniach, w tym w testach immunofluorescencyjnych, elektrofizjologicznych i biochemicznych.

Izolacja docelowych neuronów podwzgórza do badań regulacji hormonalnej, metabolicznej i elektrycznej

Ten artykuł ustanawia linię produkcyjną dla wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek i jąder zarodków myszy do sekwencjonowania pojedynczych komórek i jąder.

Sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA zmutowanych całych zarodków myszy: od epiblastu do końca gastrulacji

Naucz się parabiozy u myszy, aby badać wspólny układ krążenia. Technika chirurgiczna łączy dwa organizmy bez immunosupresji, umożliwiając długoterminowe obserwacje chimerizmu krwi metodą cytometrii przepływowej.

Parabioza u myszy: szczegółowy protokół

Przeglądaj więcej filmów