Name: Obrazowanie molekularne MR raka prostaty z drobnocząsteczkowym środkiem kontrastowym ukierunkowanym na peptyd CLT1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Poznaj obrazowanie molekularne raka prostaty u myszy za pomocą peptydowego środka kontrastowego do MRI ukierunkowanego na białka osocza. Ta metoda umożliwia precyzyjną detekcję guzów z wysoką rozdzielczością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest częściowo wspierana przez American Heart Association GRA Spring 09 Postdoctoral Fellowship (09POST2250268) oraz NIH R01 CA097465. Jesteśmy bardzo wdzięczni dr Wen Li i dr Vikas Gulani za badanie i konfigurację protokołu MRI oraz pani Yvonne Parker za pomoc w implantacji guza.

Protokół zaadaptowany z wcześniejszego badania11.
1. Koniugacja Gd-DOTA z peptydem CLT1
<ol>
	<li>Korzystając ze standardowej syntezy peptydów w fazie stałej, zsyntetyzuj peptyd CLT1 (CGLIIQKNEC) z aminokwasów chronionych Fmoc na żywicy chlorku 2-chlorotrytylu (1,0 mmol).</li>
	<li>Po dodaniu końcowego aminokwasu, cyklizować liniowy peptyd na żywicy trifluorooctanem talu(III) (1,09 g, 2,0 mmol, 2 równoważniki) w DMF (20 ml) w temperaturze 0 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Następnie sprzęgnij kolejno PEG i lizynę z N-końcem peptydu CLT1 (1,0 mmol) na żywicy, reagując sekwencyjnie z Fmoc-NH-PEG-COOH (3,0 mmol), Fmoc-Lys(Fmoc)-OH (3,0 mmol) i drugą partią Fmoc-Lys(Fmoc)-OH (6 mmol).</li>
	<li>Usuń Fmoc za pomocą piperydyny. Dodaj DOTA-tris(t-Bu) (4,58 g, 8,0 mmol, 2 odpowiedniki dla każdej grupy aminowej), aby reagować z czterema wolnymi aminami z dendrymeru lizyny na żywicy przez 2 godziny.</li>
	<li>Na koniec rozszczepić i odbezpieczyć produkt od żywicy, traktując go koktajlem kwasu trifluorooctowego, wody i triizobutylosilanu (TIS) (20 ml, 95/2,5/2,5) przez 8 godzin w temperaturze pokojowej. Usuń żywicę przez filtrację, a następnie przemycie kwasem trifluorooctowym (TFA). Dodać połączone filtraty kroplami do zimnego eteru etylowego (200 ml), odwirować i przepłukać 4x eterem etylowym. Suszyć w próżni, aby uzyskać bezbarwne ciało stałe (1,99 g, 61% wydajności).</li>
	<li>Oczyszczać surowy produkt preparatywną HPLC przy użyciu gradientu 0-40% rozpuszczalnika B (0,1% TFA w acetonitrylu) w rozpuszczalniku A (0,1% wodny roztwór TFA) przez 20 minut i 40-90% rozpuszczalnika B w rozpuszczalniku A przez 10 min.</li>
	<li>Rozpuścić CLT1-dL-(DOTA)4 (250 mg, 0,077 mmol) w wodzie DI (15 ml) i dostosować pH do 6 za pomocą 1 M NaOH. Dodawać porcjami Gd(OAc)3,4H2O (472 mg, 0,462 mmol, 1,5 ekwiwalentu monoamidu DOTA) porcjami do roztworu, utrzymując pH na poziomie 6 przy użyciu 1 M NaOH. Mieszać roztwór reakcyjny w temperaturze pokojowej przez 48 godzin.</li>
	<li>Zespolić pozostałość Gd(III) kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) (90 mg, 0,31 mmol) i oczyścić produkt surowy za pomocą kolumny wykluczającej wielkość, aby uzyskać produkt końcowy CLT1-dL-(Gd-DOTA)4 (169 mg, 57%).</li>
</ol>
2. Charakterystyka środków kontrastowych
<ol>
	<li>Zmierzyć zawartość Gd(III) za pomocą optyczno-indukcyjnie sprzężonej plazmo-optycznej spektroskopii emisyjnej.</li>
	<li>Uzyskanie widm masowych czasu przelotu z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOF) w trybie liniowym z kwasem 2,5-dihydroksybenzoesowym (2,5-DHB) jako matrycą.</li>
	<li>Zmierzyć czasy relaksacji wodnego roztworu środków kontrastowych CLT1-dL-(Gd-DOTA)4 i nieukierunkowanego środka kontrolnego sCLT1-dL-(Gd-DOTA)4 o różnych stężeniach przy 60 MHz (1,5 T) za pomocą relaksometru w temperaturze 37 °C. Użyć sekwencji impulsów inwersyjno-regeneracyjnych do pomiaru T1 i sekwencji Carra-Purcella-Meibooma-Gilla z 500 echami do pomiaru T2. Obliczyć rozluźnienie T1 iT2 czynników ze zboczy powierzchni 1/T1 i 1/T2 w zależności od stężeń Gd.</li>
</ol>
3. Hodowla komórkowa i rozwój modelu zwierzęcego z ortotopowym guzem prostaty PC3
<ol>
	<li>Hodowla komórek raka gruczołu krokowego PC3 z konstytutywną ekspresją białka zielonej fluorescencji (GFP) w pożywce RPMI uzupełnionej 5% płodową surowicą bydlęcą i penicyliną/streptomycyną/fungizonem, pobrano przez trypsynizację i ponownie zawiesino w gęstości 2,5 x 104 komórek/μl PBS.</li>
	<li>Utrzymuj samce nagich myszy atymicznych NIH (w wieku 4-5 tygodni) w Athymic Animal Core Facility, Case Western Reserve University (CWRU) zgodnie z protokołem dla zwierząt zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt CWRU.</li>
	<li>Powierzchnie chirurgiczne spryskano 2% roztworem chlorheksydyny, a następnie pokryto chłonnymi obłożeniami. Podczas zabiegu noszono sterylne rękawiczki chirurgiczne. Przed operacją na zwierzętach należy wstrzyknąć Avertin (250 mg / kg) w celu znieczulenia myszy. Alternatywnie ketamina/ksylazyna/acepromazyna może być stosowana w stężeniu 50/5/1 mg/kg. Na mysz nałożono maść okulistyczną w celu utrzymania odpowiedniej wilgotności podczas znieczulenia.</li>
	<li>Operację należy rozpocząć od wycięcia małego nacięcia przez skórę i otrzewną wzdłuż dolnej linii środkowej na długości około 1 cm za pomocą sterylnego skalpela. Podczas operacji przeżycia wokół miejsca nacięcia przykryto sterylną serwetę chirurgiczną.</li>
	<li>Delikatnie zewnętrzizuj i ustabilizuj płaty grzbietowe prostaty, aby odsłonić prostatę. Wstrzyknąć zawiesinę komórek PC3-GFP w PBS (20 μl) do gruczołu krokowego za pomocą igły o rozmiarze 30. Na koniec zamknij nacięcie za pomocą automatycznego klipsa do rany12.</li>
	<li>W celu monitorowania po zabiegu należy monitorować zwierzęta dwa razy dziennie przez 1 tydzień. Objawy choroby obejmują brak jedzenia, ciemny mocz zbierający się wokół cewki moczowej i niestabilny chód, który może wskazywać na infekcję lub niedrożność pęcherza moczowego w zszywkach.</li>
	<li>Po 10 dniach usuń zszywki za pomocą zmywacza do zszywek. Monitoruj zwierzęta codziennie, aby ocenić wielkość guza i wszelkie oznaki bólu, takie jak utrata wagi, odchylenia behawioralne i wady motoryczne. Poddaj eutanazji zwierzęta, które wykazały wielkość guza przekraczającą etycznie dozwolony limit lub dowody bólu podczas wzrostu guza.</li>
</ol>
4. Potwierdzenie specyficzności peptydów wiążących nowotwór za pomocą obrazowania fluorescencyjnego i histologii
<ol>
	<li>Po inokulacji komórek nowotworowych należy odczekać około 4 tygodni wzrostu guza przed rozpoczęciem obrazowania. Przed wstrzyknięciem sond peptydowych należy uzyskać obrazy fluorescencyjne GFP z żywymi myszami na obrazie fluorescencyjnym, aby zweryfikować obecność guza.</li>
	<li>Dożylnie wstrzyknąć peptydy znakowane Texas Red myszom z guzem w dawce 10 nmol / mysz.</li>
	<li>Poświęć myszy 2 godziny później przez zwichnięcie szyjki macicy, zbierz guz i główne narządy i natychmiast zobrazuj na obrazie fluorescencyjnym. Filtry światła zielonego należy stosować dla GFP (wzbudzenie: 444-490 nm; emisja: filtr długoprzepustowy 515 nm; ustawienia akwizycji: 500-720 w krokach co 10 nm) i filtry światła czerwonego dla czerwieni teksańskiej (wzbudzenie: 576-621 nm; emisja: filtr długoprzepustowy 635 nm; ustawienia akwizycji: 630-800 w krokach co 10 nm). Czas naświetlania 10 ms dla GFP i 150 ms dla Texas Red.</li>
	<li>Natychmiast po pomiarze fluorescencji całej tkanki należy pobrać tkanki nowotworowe, utrwalić formaliną i dokonać kriosekcji w plasterkach o wielkości 5 μm.</li>
	<li>Po spłukaniu PBS zamocować 1 kroplą podłoża montażowego zawierającego 4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI), natychmiast zobrazować na konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym.</li>
</ol>
5. Rezonans magnetyczny (MRI)
<ol>
	<li>Około 4 tygodnie po inokulacji komórek nowotworowych pozwól guzom urosnąć do 0,3-0,6 cm średnicy. Do badania MRI należy użyć skanera MRI o masie 7 T z cewką o częstotliwości radiowej (RF).</li>
	<li>Znieczulij mysz 2% mieszaniną izofluranu i tlenu w komorze indukcyjnej izofluranu. Na mysz nałożono maść okulistyczną w celu utrzymania odpowiedniej wilgotności podczas znieczulenia.</li>
	<li>Włóż igłę o rozmiarze 30 do rurki o długości 1,0 m wypełnionej heparynizowaną solą fizjologiczną. Umieść samodzielnie wykonany cewnik w żyle ogona myszy.</li>
	<li>Umieść mysz w magnesie i utrzymuj w znieczuleniu wziewnym z 1,5% izofluranem-tlenem przez stożek nosowy.</li>
	<li>Umieść czujnik oddechowy podłączony do systemu monitorowania na brzuchu, aby monitorować tempo i głębokość oddychania. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 °C, wdmuchując gorące powietrze do magnesu przez system sterowania ze sprzężeniem zwrotnym.</li>
	<li>Zacznij od obrazów przekroju strzałkowego, używając sekwencji lokalizacyjnej w celu zidentyfikowania lokalizacji guza (TR/TE = 200/3,7 ms, FOV = 3,0 cm, grubość plastra = 2,2 mm, numer plastra = 16, średnia = 2, kąt odwrócenia = 45°, matryca = 128 x 128).</li>
	<li>Użyj gradientowej sekwencji tłumienia tłuszczu 2D T1, aby uzyskać obrazy osiowe 2D dla CE-MRI (TR/TE = 151,2/1,9 ms, FOV = 3,0 cm x 3,0 cm, grubość warstwy = 1,2 mm, numer warstwy = 12, średnia = 1, kąt odwrócenia = 80°, matryca = 128 x 128).</li>
	<li>Po uzyskaniu wyjściowego obrazu MR przed wstrzyknięciem należy rozpocząć wstrzykiwanie środka docelowego lub środka kontrolnego w dawce 0,03 mmol Gd/kg poprzez przepłukanie 200 μl soli fizjologicznej.</li>
	<li>Kontynuuj wykonywanie obrazów CE-MRI w różnych punktach czasowych przez maksymalnie 30 minut.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie i analiza obrazu
<ol>
	<li>Do analizy obrazu należy używać oprogramowania do obrazowania.</li>
	<li>Narysuj obszary zainteresowania (ROI) na całym guzie i nerkach w dwuwymiarowej płaszczyźnie obrazowania i zmierz średnią intensywność sygnału.</li>
	<li>Aby określić ilościowo dane CE-MRI, zmierz wzmocnienie kontrastu guza lub nerki (ΔSNR) poprzez obliczenie wzrostu SNR po kontraście w stosunku do SNR przed kontrastem, używając następującego równania: ΔSNR = (St / σt) - (S0/σ0), gdzie S0 i St oznaczają sygnał w guzie lub nerkach przed i po kontraście, a σ0 i σt są odchyleniem standardowym hałasu mierzonego od powietrza tła przed i po kontraście.</li>
	<li>Oblicz wartości p za pomocą dwustronnego testu t studenta, zakładając istotność statystyczną na poziomie p<0,05.</li>
</ol>

<ol><li>Brown, M. A., Semelka, R. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrown%2C+MA+%22MRI+Basic+Principles+and+Applications%22">MRI Basic Principles and Applications</a>. , 3rd, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. (2003).</li>
<li>Artemov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+magnetic+resonance+imaging+with+targeted+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular magnetic resonance imaging with targeted contrast agents.</a> J. Cell. Biochem. 90, 518-524 (2003).</li>
<li>Kalber, T. L., Kamaly, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low+molecular+weight+folate+receptor+targeted+contrast+agent+for+magnetic+resonance+tumor+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">A low molecular weight folate receptor targeted contrast agent for magnetic resonance tumor imaging.</a> Mol. Imaging Biol. 13, 653-662 (2011).</li>
<li>Schmieder, A. H., Winter, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+MR+imaging+of+melanoma+angiogenesis+with+alphanubeta3-targeted+paramagnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular MR imaging of melanoma angiogenesis with alphanubeta3-targeted paramagnetic nanoparticles.</a> Magn. Reson. Med. 53, 621-627 (2005).</li>
<li>Mulder, W. J., Strijkers, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MR+molecular+imaging+and+fluorescence+microscopy+for+identification+of+activated+tumor+endothelium+using+a+bimodal+lipidic+nanoparticle%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">MR molecular imaging and fluorescence microscopy for identification of activated tumor endothelium using a bimodal lipidic nanoparticle.</a> FASEB J. 19, 2008-2010 (2005).</li>
<li>Wang, S. J., Brechbiel, M., Wiener, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+a+new+MRI+contrast+agent+prepared+from+polypropyleneimine+dendrimers%2C+generation+2%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Radiol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of a new MRI contrast agent prepared from polypropyleneimine dendrimers, generation 2.</a> Invest. Radiol. 38, 662-668 (2003).</li>
<li>Amirbekian, V., Aguinaldo, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+and+matrix+metalloproteinases%3A+experimental+molecular+MR+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis and matrix metalloproteinases: experimental molecular MR imaging in vivo.</a> Radiology. 251, 429-438 (2009).</li>
<li>Overoye-Chan, K., Koerner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EP-2104R%3A+a+fibrin-specific+gadolinium-Based+MRI+contrast+agent+for+detection+of+thrombus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">EP-2104R: a fibrin-specific gadolinium-Based MRI contrast agent for detection of thrombus.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 6025-6039 (2008).</li>
<li>Pilch, J., Brown, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptides+selected+for+binding+to+clotted+plasma+accumulate+in+tumor+stroma+and+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Peptides selected for binding to clotted plasma accumulate in tumor stroma and wounds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2800-2804 (2006).</li>
<li>Rohrer, M., Bauer, H., Mintorovitch, J., Requardt, M., Weinmann, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+magnetic+properties+of+MRI+contrast+media+solutions+at+different+magnetic+field+strengths%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Radiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of magnetic properties of MRI contrast media solutions at different magnetic field strengths.</a> Invest. Radiol. 40, 715-724 (2005).</li>
<li>Wu, X., Burden-Gulley, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+evaluation+of+a+peptide+targeted+small+molecular+Gd-DOTA+monoamide+conjugate+for+MR+molecular+imaging+of+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and evaluation of a peptide targeted small molecular Gd-DOTA monoamide conjugate for MR molecular imaging of prostate cancer.</a> Bioconjugate Chem. 23, 1548-1556 (2012).</li>
<li>Burden-Gulley, S. M., Gates, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+molecular+diagnostic+of+glioblastomas%3A+detection+of+an+extracellular+fragment+of+protein+tyrosine+phosphatase+mu%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A novel molecular diagnostic of glioblastomas: detection of an extracellular fragment of protein tyrosine phosphatase mu.</a> Neoplasia. 12, 305-316 (2010).</li>
<li>McBride, J. 	D., Birgit, H., Leatherbarrow, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resin-coupled+cyclic+peptides+as+proteinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+and+Peptide%22%5BJournal%5D)">Resin-coupled cyclic peptides as proteinase inhibitors.</a> Protein and Peptide. 3 (3), 193-198 (1996).</li>
<li>Cline, D. J., Thorpe, C., Schneider, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+method+for+facile+intramolecular+disulfide+formation+in+synthetic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">General method for facile intramolecular disulfide formation in synthetic peptides.</a> Anal. Biochem. 335 (1), 168-170 (2004).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Kroki krytyczne
Dobór odpowiedniego biomarkera i celowanie w mały peptyd
Aby skutecznie opracować celowany środek kontrastowy o niewielkich rozmiarach, należy wziąć pod uwagę dwa kluczowe punkty. Po pierwsze, ważne jest, aby wybrać odpowiednie biomarkery molekularne, które są obficie obecne w chorych tkankach, a ich obecność jest niewielka w normalnych tkankach. Nasz wybrany biomarker związany z rakiem, skrzepnięte białka osocza, spełnia ten wymóg. Po...

Skuteczne obrazowanie celów molekularnych związanych z rakiem ma ogromne znaczenie dla poprawy dokładności wczesnego wykrywania i diagnozowania raka. Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) to potężna metoda obrazowania klinicznego o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i braku promieniowania jonizacyjnego1. Jednak nie jest dostępny celowany środek kontrastowy do klinicznego obrazowania molekularnego raka MR. Innowacyjny projekt i opracowanie celowanych środków kontrastowych do rezonansu magnetycznego znacznie przyczyniłoby się do postępu w zastosowaniu obrazowania molekularnego raka metodą MR. Podjęto znaczne wysiłki w celu opracowania celowanych środków kontrastowych do obrazowania MR biomarkerów ulegających ekspresji na powierzchni komórek nowotworowych. Ze względu na stosunkowo niską czułość MRI i niskie stężenie tych biomarkerów, wyzwaniem jest wygenerowanie wystarczającego wzmocnienia kontrastu dla skutecznego obrazowania molekularnego MR przy użyciu małocząsteczkowych ukierunkowanych środków kontrastowych2,3. W celu uzyskania wystarczającego wzmocnienia przygotowano różne systemy dostarczania, takie jak liposomy, nanocząstki i koniugaty polimerowe o dużym obciążeniu paramagnetycznych chelatów Gd(III) w celu zwiększenia lokalnego stężenia środków kontrastowych w miejscach docelowych4,5. Chociaż te systemy dostarczania były w stanie wygenerować znaczne wzmocnienie guza w modelach zwierzęcych, ich duże rozmiary skutkowały powolną i niepełną eliminacją z organizmu, co skutkowało przedłużoną akumulacją toksycznych jonów Gd(III), co może powodować poważne obawy dotyczące bezpieczeństwa6. Ostatnio niektóre badania wykazały, że ograniczenia MRI w obrazowaniu molekularnym można przezwyciężyć poprzez wybór odpowiednich biomarkerów molekularnych o wysokiej ekspresji lokalnej w zmianach chorobowych i użycie małych środków molekularnych, które mogą być łatwo wydalane7,8. Kluczową cechą tych środków jest to, że są one ukierunkowane na markery molekularne obficie obecne w chorych tkankach z niewielką obecnością w normalnych tkankach. Wysokie stężenie środków kontrastowych może wiązać się z tymi celami, co skutkuje wystarczającym wzmocnieniem kontrastu dla skutecznego obrazowania molekularnego MR. Ponieważ ich rozmiar jest mniejszy niż próg filtracji nerkowej, niezwiązane środki kontrastowe mogą być łatwo wydalane z organizmu przy zmniejszonym hałasie tła. Wybraliśmy uniwersalny biomarker związany z rakiem, skrzepnięte białka osocza, które obficie występują w zrębie guza i rzadko występują w zdrowych tkankach9. Zsyntetyzowaliśmy celowany środek kontrastowy zawierający mały peptyd celujący CGLIIQKNEC (CLT1), który wykazywał silne specyficzne wiązanie z modelem guza prostaty PC310 i czterema chelatami monoamidowymi Gd-DOTA. W tym miejscu przedstawiamy metodologię obrazowania molekularnego raka MR w celu wykrycia guzów u myszy.

<table><tbody><tr><td colspan="4">ODCZYNNIKI</td></tr><tr><td>Fmoc chronione aminokwasy</td><td>EMD Chemicals Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOTA-tris(t-Bu)</td><td>TCI America</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PyBOP, HOBt, HBTU</td><td>Nova Biochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DIPEA, trifluorooctan talu(III), TIS</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Texas Red, ester sukcynimidylowy, pojedynczy izomer</td><td>Invitrogen</td><td>T20175</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENTS</td></tr><tr><td>Agilent 1100 HPLC system</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZORBAX 300SB-C18 Kolumna PrepHT</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ICP-&#8211; S Optima 3100XL</td><td>Spektrometr masowy Perkin-Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Bruker</td><td>AutoflexTM Speed</td><td></td></tr><tr><td>Maestro FLEX System obrazowania in vivo</td><td>Cambridge Research Instrumentation, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skaner MRI Biospec 7T</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie molekularne mr raka prostaty z drobnocząsteczkowym środkiem kontrastowym ukierunkowanym na peptyd clt1

MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent

Macierz zewnątrzkomórkowa guza ma mnóstwo białek związanych z rakiem, które mogą być używane jako biomarkery do obrazowania molekularnego raka. W tej pracy wykazaliśmy skuteczne obrazowanie molekularne raka MR z małym peptydem ukierunkowanym na kompleks monoamidowy Gd-DOTA jako celowany środek kontrastowy MRI specyficzny dla skrzepłych białek osocza w zrębie guza. Przeprowadziliśmy eksperyment oceniający skuteczność środka do nieinwazyjnego wykrywania guza gruczołu krokowego za pomocą MRI w mysim ortotopowym modelu raka gruczołu krokowego PC-3. Celowany środek kontrastowy był skuteczny w wytwarzaniu znacznego wzmocnienia kontrastu guza przy niskiej dawce 0,03 mmol Gd/kg. Ukierunkowany na peptydy środek kontrastowy MRI jest obiecujący w obrazowaniu molekularnym MR guza gruczołu krokowego.

Rysunek 1 przedstawia syntezę docelowego środka kontrastowego CLT1-dL-(Gd-DOTA)4 oraz ogólny schemat eksperymentu. CLT1-dL-(Gd-DOTA)4 wykazuje znacznie wyższą relaksywność niż kliniczny Gd-DOTA (Tabela 1). Przy 1.5 T relaksywność T1 na atom gadolinu dla CLT1-dL-(Gd-DOTA)4 w PBS (pH 7.4) jest około 3 razy wyższa niż dla Gd-DOTA10. Obrazowanie Maestro potwierdza silne specyficzne wiązanie CLT1 znakowanego Texas Red (CLT1-TR) z guzem, przy niewielkim wi...

Aby zademonstrować obrazowanie molekularne raka MR za pomocą środka kontrastowego MRI z małym peptydem specyficznym dla skrzepłych białek osocza w zrębie guza w modelu raka prostaty u myszy.

Obrazowanie molekularne MR raka prostaty z drobnocząsteczkowym środkiem kontrastowym ukierunkowanym na peptyd CLT1

Tumor extracellular  matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers  for cancer molecular imaging. In this work,  we ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie obrazowania molekularnego raka prostaty u myszy z wykorzystaniem bezpiecznego i skutecznego peptydowego środka kontrastowego w rezonansie magnetycznym (MR). Obrazowanie molekularne. W pierwszej kolejności w mysim modelu guza prostaty weryfikowane jest pomyślne rozwinięcie i odpowiednia wielkość ortotopowych guzów prostaty. Następnie specyficzność wiązania peptydu z guzem jest potwierdzana za pomocą obrazowania fluorescencyjnego oraz badań histologicznych w mysim modelu ortotopowego raka prostaty.Następnie, po uzyskaniu bazowych obrazów MR przed wstrzyknięciem, podaje się celowany lub kontrolny środek kontrastowy. Na koniec, w odstępach czasu przez okres do 30 minut, pozyskuje się obrazy MR po wzmocnieniu kontrastowym. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące, że celowany peptydem CLT one środek kontrastowy RI może być skuteczny w specyficznej detekcji guzów prostaty za pomocą technik obrazowania molekularnego MR.Główną zaletą molekularnego MRI z zastosowaniem ukierunkowanych środków kontrastowych MI w porównaniu z istniejącymi technologiami, takimi jak MRI oraz PET-MRI ze środkami kontrastowymi stosowanymi w klinice, jest możliwość uzyskania skutecznych, wzmocnionych obrazów guzów prostaty o wysokiej rozdzielczości w ramach jednej metody obrazowania. Przedstawimy to poniżej. Skuteczne molekularne MRI guza prostaty można osiągnąć poprzez wybór obfitego biomarkera w macierzy zewnątrzkomórkowej guza oraz zastosowanie małocząsteczkowych ukierunkowanych środków kontrastowych MI. Umiejętności w obchodzeniu się ze zwierzętami, kanulacja ogona oraz obsługa MRI są również kluczowe dla uzyskania wysokiej jakości obrazów MRR guzów. Wykorzystując standardową syntezę peptydów w fazie stałej, zsyntetyzuj, a następnie scharakteryzuj kompleksy GD DOTA monoamid, zgodnie z ilustracją. Po stworzeniu modelu zwierzęcego guza prostaty PC 3G FP zgodnie z protokołem tekstowym, z narkozuj myszy 2% izofluranem w tlenie w komorze indukcyjnej i wykonaj uszczypnięcie ogona, aby zweryfikować stopień sedacji.Następnie użyj obrazownika fluorescencyjnego, aby potwierdzić obecność guzów u myszy. Wstrzyknij myszom z guzami 10 mol na mysz peptydów znakowanych Texas Red. Dwie godziny później, po uśmierceniu myszy poprzez zwichnięcie karku, pobierz guz oraz główne organy i niezwłocznie wykonaj obrazowanie za pomocą obrazownika fluorescencyjnego.Następnie, po utrwaleniu tkanek nowotworowych formaliną i wykonaniu kriosiekcji o grubości 5 µm, należy osadzić tkankę, używając kropli medium montażowego zawierającego DPI. Następnie preparaty należy zobrazować przy użyciu konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. Około czterech tygodni po inokulacji guzy powinny osiągnąć średnicę od 0,3 do 0,6 cm. Po znieczuleniu myszy 2% izofluranem w tlenie w komorze indukcyjnej, należy zastosować maść oftalmiczną w celu utrzymania wilgotności oczu myszy i przeprowadzić test ucisku ogona, aby potwierdzić stopień sedacji.Następnie włóż igłę o rozmiarze 30 G do rurki o długości jednego metra wypełnionej solą fizjologiczną z heparyną. Potem wprowadź wykonany samodzielnie cewnik do żyły ogonowej myszy, korzystając ze skanera MRI 70 MHz z wolumetryczną cewką wysokiej częstotliwości. Umieść mysz w magnesie, a następnie załóż stożek nosowy i podawaj 1,5% izofluranu w tlenie, aby monitorować częstotliwość i głębokość oddechów.Umieść czujnik oddechowy podłączony do systemu monitorowania na brzuchu zwierzęcia. Utrzymuj temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 °C poprzez stały dopływ gorącego powietrza do magnesu. Następnie umieść zwierzę w MRI, aby zidentyfikować lokalizację guza.Rozpocznij od obrazowania w przekroju strzałkowym z wykorzystaniem sekwencji lokalizacyjnej. Następnie zastosuj sekwencję dwutłumieniową (two DT) z wagowaniem gradientowym i tłumieniem tłuszczu w celu uzyskania obrazów 2D w płaszczyźnie osiowej dla rezonansu magnetycznego z kontrastem (CE MRI). Po uzyskaniu obrazów wyjściowych guza rozpocznij wstrzykiwanie czynnika celowanego lub czynnika kontrolnego w dawce 0,03 mmol gadolinu na kg masy ciała.Kontynuuj pozyskiwanie obrazów CE MRI w różnych punktach czasowych przez maksymalnie 30 minut, aby całkowicie objąć i uzyskać obrazy całego guza. Po zakończeniu obrazowania pobierz 12 warstw, uśmierć zwierzę za pomocą dwutlenku węgla, a następnie przeanalizuj i przetwórz obrazy zgodnie z protokołem tekstowym przedstawionym tutaj; obrazowanie Maestro potwierdza silne, specyficzne wiązanie CLT one znakowanego Texas red do guza GFP PC three, przy niewielkim wiązaniu do normalnych organów i tkanek. Tymczasem niespecyficzny zmodyfikowany peptyd (scrambled peptide) wykazuje bardzo niewielkie wiązanie z guzem.Na tym rysunku przedstawiono typowe obrazy T1-zależne z wzmocnieniem kontrastowym przed i po wstrzyknięciu. Środek ukierunkowany powoduje silniejsze i dłuższe wzmocnienie w tkance nowotworowej w porównaniu ze środkami nieukierunkowanymi (scrambled). Wzmocnienie kontrastowe w pęcherzu moczowym stopniowo wzrasta w czasie, co wskazuje na to, że środki kontrastowe zostały wydalone drogą filtracji nerkowej.Ilościowa analiza sygnału wykazuje, że czynnik celowany wywołał istotniejsze wzmocnienie sygnału w tkance nowotworowej niż czynnik kontrolny w czasie do 30 minut. Badanie biodystrybucji pokazuje, że dwa dni po wstrzyknięciu w głównych narządach i tkankach występuje minimalna retencja gadolinium. Nasze wstępne wyniki wskazują, że celowane środki kontrastowe do MRI CLT one mogą być dostarczane specyficznie do guza przy stosunkowo niskiej dawce.W niniejszej pracy wykazaliśmy, że efektywnego molekularnego MRI raka prostaty można dokonać poprzez wybór odpowiedniego, obfitego biomarkera w mikrośrodowisku guza oraz zastosowanie małocząsteczkowego celowanego środka kontrastowego do MRI. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat opracowywania odpowiednich technik w celu przeprowadzenia efektywnego molekularnego MRI małych nowotworów złośliwych w modelach zwierzęcych z wykorzystaniem celowanego środka kontrastowego do MRI.

mr-molecular-imaging-prostate-cancer-with-small-molecular-clt1

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Obrazowanie Molekularne MR Raka Prostaty z Zastosowaniem Małego Cząsteczkowego Cząsteczkowego Środka Kontrastującego CLT1

Dyfuzyjna tomografia fluorescencyjna oferuje stosunkowo niskokosztowe i potencjalnie wysokoprzepustowe podejście do przedklinowego obrazowania guzów in vivo. Przedstawiono metodologię zbierania danych optycznych, kalibracji i rekonstrukcji obrazu dla bezkontaktowego systemu w dziedzinie czasu sterowanego tomografią komputerową, z wykorzystaniem fluorescencyjnego celowania w biomarker nowotworowy – receptor Epidermal Growth Factor Receptor w modelu glejaka u myszy.

Tomografia dyfuzyjna fluorescencji w dziedzinie czasu sterowana tomografią komputerową u małych zwierząt w celu lokalizacji biomarkerów nowotworowych

Ten film demonstruje technikę wykorzystującą radioimmunokoniugat do obrazowania in vivo guza na modelu mysim. Po wstrzyknięciu radioimmunokoniugatu przeciwciała koniugatu wiążą się ze specyficznym antygenem błonowym na komórkach nowotworowych. Radioznacznik koniugatu emituje pozytony, które oddziałują z sąsiednimi elektronami w celu wytworzenia energii, która jest wykrywana przez skaner pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) w celu stworzenia obrazu guza.

Technika obrazowania PET in vivo do wykrywania guzów w modelu mysim przy użyciu przeciwciał znakowanych radioaktywnie

Bioortogonalna cykloaddycja Dielsa-Aldera została wykorzystana do stworzenia skutecznej i modułowej, pretargetowanej strategii obrazowania PET dla raka. W niniejszym protokole etapy tej metodologii są opisane w kontekście systemu modelowego wykorzystującego przeciwciało ukierunkowane na raka jelita grubego huA33 i radioligand znakowany 64Cu.

Wykorzystanie bioortogonalnej cykloaddycji Dielsa-Aldera z odwróconym zapotrzebowaniem elektronów do wstępnie ukierunkowanego obrazowania PET

Immunohistochemia to potężna technika laboratoryjna do oceny lokalizacji i ekspresji białek w tkankach. Obecne półautomatyczne metody oznaczania ilościowego wprowadzają subiektywizm i często dają niepowtarzalne wyniki. W niniejszym artykule opisano metody multipleksowanej immunohistochemii i obiektywnej oceny ilościowej ekspresji i kolokalizacji białek za pomocą obrazowania wielospektralnego.

Kwantyfikacja ekspresji białek i kolokalizacji za pomocą multipleksowanego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania wielospektralnego

Dynamiczna polaryzacja jądrowa z późniejszym rozpuszczaniem próbki umożliwiła badania metabolizmu w systemach biologicznych w czasie rzeczywistym. Hiperspolaryzowany [1-13C]pirogronian zastosowano do badania aktywności dehydrogenazy mleczanowej w linii komórkowej raka gruczołu krokowego in vitro.

Hiperspolaryzowana spektroskopia i obrazowanie metabolicznego rezonansu magnetycznego 13C

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie domięśniowego wstrzykiwania komórek raka prostaty do środka prostaty, z późniejszą kastracją. Ortotopowe modele przedkliniczne androgenozależnego i opornego na kastrację raka gruczołu krokowego mają kluczowe znaczenie dla badania choroby w kontekście klinicznie istotnego mikrośrodowiska guza i immunokompetentnego gospodarza.

Bioluminescencyjny i fluorescencyjny, ortotopowy, syngeniczny mysi model androgenowego i opornego na kastrację raka gruczołu krokowego

Ten artykuł opisuje radiosyntezę, formułowanie, kontrolę jakości nowej sondy znakowanej radioaktywnie (tj. nanoniki NM-02 znakowanej 68Ga) oraz jej zastosowanie do obrazowania PET/CT małych zwierząt w modelu ksenoprzeszczepu.

Radiosynteza, kontrola jakości i obrazowanie pozytonowej tomografii emisyjnej małych zwierząt 68nanocząsteczek znakowanych Ga

Biopsja prostaty jest złotym standardem w diagnostyce raka prostaty. Biopsja gruczołu krokowego sterowana fuzją poznawczą, która łączy ultrasonografię przezodbytniczą ze wstępnie zmierzonymi parametrami MRI, poprawia dokładność biopsji i zwiększa wykrywalność klinicznie istotnego raka gruczołu krokowego.

Biopsja gruczołu krokowego pod kontrolą fuzji poznawczej przy użyciu wieloparametrycznego rezonansu magnetycznego i ultrasonografii przezodbytniczej

Nadmierne leczenie często stosuje się u pacjentów z rakiem prostaty niskiego ryzyka; Superaktywny nadzór może pomóc uniknąć takiego nadmiernego leczenia.

Nowa technika leczenia raka prostaty niskiego ryzyka — superaktywny nadzór

To badanie opisuje zautomatyzowany proces produkcji [68Ga]Ga-3BP-3940 za pomocą syntezatora GAIA V2, do obrazowania PET białka aktywującego fibroblasty. Przedstawiono również wyniki badań kontroli jakości przeprowadzonych na trzech seriach testowych.

Automatyczne przygotowanie [68Ga]GA-3BP-3940 na module syntezy do obrazowania PET mikrośrodowiska guza

Poznaj obrazowanie molekularne raka prostaty u myszy za pomocą peptydowego środka kontrastowego do MRI ukierunkowanego na białka osocza. Ta metoda umożliwia precyzyjną detekcję guzów z wysoką rozdzielczością.

Obrazowanie molekularne MR raka prostaty z drobnocząsteczkowym środkiem kontrastowym ukierunkowanym na peptyd CLT1

Przeglądaj więcej filmów