Name: Działanie bioreaktora laboratoryjnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-12T15:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Poznaj konfigurację i działanie bioreaktora laboratoryjnego do hodowli komórek bioinżynieryjnych. Naucz się kalibracji sond pH i tlenu, autoklawowania oraz monitorowania parametrów kultury bakteryjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt był częściowo wspierany przez Uniwersytet Johnsa Hopkinsa, Biuro Rektora poprzez Gateway Science Initiative.

<ol>
	<li>Rozpocznij pracę od ustawienia statku. Konwencjonalny fermentor składa się z następujących elementów, które należy zainstalować (rysunek 1):
	<ol>
		<li>Sonda pH - do pomiaru pH w żywej kulturze. Skalibruj sondę przed instalacją i wysterylizuj ją w naczyniu. Zamontuj sondę w płycie czołowej.</li>
		<li>Sonda pO2 - do pomiaru zawartości tlenu rozpuszczonego wewnątrz naczynia podczas fermentacji. Zamontuj w płycie czołowej.</li>
		<li>Rura żniwna do pobierania próbek kultury. Zamontuj ten element o regulowanej wysokości w płycie czołowej.</li>
		<li>Rozpylacz gazowy - znajduje się na dnie naczynia i zapewnia napar gazowy do kultury. Podłącz iskrownik do źródła gazu na fermentorze i zamontuj w płycie głównej.</li>
		<li>Wał wirnika i wirnik - wirnik miesza kulturę i ma kluczowe znaczenie dla utrzymania jednorodności kultury w zbiorniku.</li>
		<li>Skraplacz spalin - do ograniczania strat parowania w zbiorniku poprzez chłodzenie ścieżki spalin.</li>
		<li>Przewody pomp odczynników do kontroli pH lub dodawania paszy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyczyść naczynie i główkę wodą z mydłem. Do szorowania naczynia i płyty głowicy zalecana jest miękka szczotka. Do czyszczenia naczynia nie można używać wybielaczy ani środków czyszczących z chlorem.</li>
	<li>Jeśli podłoże nie jest labilne termicznie, dodaj je do czystego naczynia. Dodawaj tylko do momentu osiągnięcia maksymalnej objętości roboczej. W tym przypadku maksymalna objętość robocza wynosi 3,3 l dla zbiornika o całkowitej pojemności 5 l.</li>
	<li>Zamontuj płytę czołową zbiornika, upewniając się, że uszczelka o-ring jest prawidłowo osadzona.</li>
	<li>Zamontować skraplacz spalin.</li>
	<li>Zainstaluj sondę przeciwpieniącą w porcie 10 mm.</li>
	<li>Zamontuj rurę zbierającą w jej porcie 10 mm. Połóż kawałek rurki na wierzchu i zaciśnij go.</li>
	<li>Zamontuj rurkę i filtr 0,20 μm na wlocie iskrowym, a następnie zaciśnij je.</li>
	<li>Skalibruj sondę pH:
	<ol>
		<li>Zebrać 2 referencyjne w małych zlewkach, butelce do mycia i zapasowej zlewce do mycia.</li>
		<li>Podłącz sondę pH do fermentora i włącz fermentor.</li>
		<li>Przewiń do parametru pH i za pomocą przycisku menu przewiń do opcji "Cal" i naciśnij "Enter".</li>
		<li>Wybierz "2" dla kalibracji 2-punktowej.</li>
		<li>Zmyj końcówkę sondy i zanurz ją w buforze o niskim poziomie odniesienia. Wartość na fermentorze ustabilizuje się. Za pomocą + i - dostosuj wyświetlaną wartość, aby odpowiadała wartości buforu referencyjnego pH. Gdy przestanie migać, naciśnij "Enter".</li>
		<li>Zmyj sondę i włóż ją do drugiego bufora referencyjnego. Poczekaj, aż wartość się ustabilizuje, a następnie użyj klawiatury, aby wyświetlić wartość dopasowaną do górnej wartości bufora odniesienia. Naciśnij "Enter", aby potwierdzić.</li>
		<li>Umyj końcówkę sondy i odłącz ją od fermentora. Załóż nasadkę ochronną na złącze i zamontuj ją w płycie czołowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwórz końcówkę sondy pO2 i sprawdź, czy jest wystarczająca ilość elektrolitu do pokrycia końcówki. Jeśli nie, dodaj trochę do zbiornika i zamknij go z powrotem.</li>
	<li>Zamontuj sondę pO2 w płycie głowicy i upewnij się, że nasadka autoklawu jest założona, aby chronić jego połączenia elektryczne. Zostanie skalibrowany po sterylizacji.</li>
	<li>Zaopatrz się w butelkę do podawania odczynnika z rurką zanurzeniową i filtrem powietrza. Dodaj rurkę pompy do portu rurki zanurzeniowej i podłącz drugi koniec do portu wlotowego w fermentorze.</li>
	<li>Umieść rurki na wszystkich nieużywanych portach, a następnie zaciśnij rurkę.</li>
	<li>Zamontuj filtr 0,45 μm na skraplaczu spalin. Filtr ten zapewnia, że naczynie nie ma ciśnienia w autoklawie.</li>
	<li>Sprawdź, czy wszystkie rurki, które znajdują się poniżej poziomu nośnika, są zaciśnięte, aby zapobiec wydostawaniu się nośnika.</li>
	<li>Umieścić naczynie w autoklawie na 25 - 30 minut w temperaturze 121 °C, cykl płynny. Uwaga: Kiedy wyjdzie, będzie bardzo gorąco.</li>
	<li>Zamontuj naczynie na podstawie fermentora.</li>
	<li>Podłącz sondy pH.</li>
	<li>Podłącz sondy pO2</li>.
	<li>Podłącz rozpylacz do rotametru dodawania gazu.</li>
	<li>Sterylnie dodać 1 M odczynnik NaOH do butelki z rurką zanurzeniową i zamontować głowicę pompy na trzpieniu głowicy pompy podstawy.</li>
	<li>Umieść czujnik temperatury w osłonie termometrycznej na płycie głównej. Upewnij się, że sięga aż do dna osłony termometrycznej.</li>
	<li>Opuść ramię mieszające na sprzęg wirnika zbiornika.</li>
	<li>Upewnij się, że fermentor jest włączony.</li>
	<li>Sprawdź, czy woda jest dostępna dla fermentora.</li>
	<li>Włącz dopływ powietrza do fermentora.</li>
	<li>Przewiń do parametru temperatury i ustaw temperaturę na 37 °C. Naciśnij przycisk "Enter", aby rozpocząć regulację temperatury. Naczynie nagrzeje się w ciągu 15 minut lub krócej.</li>
	<li>Ustaw przepływ gazu na 1 objętość naczynia mediów na minutę lub mniej. W tej konfiguracji przepływ gazu wynosi 3 l/min. Na dole powinny pojawić się bąbelki.</li>
	<li>Przewiń do parametru mieszania i ustaw na 300 obr./min. Naciśnij "Enter", aby włączyć mieszanie.</li>
	<li>Gdy temperatura osiągnie 37 °C, przewiń do parametru pH i ustaw go na 6,8. Włącz kontrolę pH, naciskając przycisk "Enter".</li>
	<li>Ustaw mieszanie na maksymalną prędkość 1 000 obr./min dla biegu.</li>
	<li>Upewnij się, że sonda pO2 jest prawidłowo spolaryzowana, aby wyświetlać prawidłowe wartości. Po 2 godzinach przewiń do parametru pO2 i użyj przycisku "Menu", aby wybrać "Funkcję kalibracji" i wybierz kalibrację 1-punktową.</li>
	<li>Po 15 minutach użyj kursorów, aby ustawić wartość na 100 i naciśnij "Enter". Spowoduje to kalibrację pO2.</li>
	<li>Przewiń do pozycji mieszania i ustaw na 300 obr./min.</li>
	<li>Za pomocą przycisku "Menu" ustaw "Kaskadę" na "włączone" w menu mieszania. Zwiększy to szybkość mieszania w celu rozdrobnienia pęcherzyków powietrza i wtłoczenia większej ilości tlenu do roztworu wraz ze wzrostem zapotrzebowania na wzrost.</li>
	<li>Przewiń do parametru pO2 i ustaw wartość na 30. Naciśnij przycisk "Enter", aby uruchomić pO2.</li>
	<li>Uruchom pakiet oprogramowania sterującego na komputerze.</li>
	<li>Po skalibrowaniu sond mieszanie jest stabilne przy 300 obr./min, temperatura wynosi 37 °C, a pH jest bliskie 6,8, nadszedł czas na inokulację. Za pomocą alkoholu wysterylizuj port, który będzie używany do inokulacji.</li>
	<li>Pobrać inokulum do strzykawki i dodać je do wysterylizowanego portu. Zamknij port.</li>
	<li>Oznacz czas szczepienia w dzienniku pokładowym.</li>
	<li>Ważne jest również, aby pobrać próbkę w czasie sterylizacji. Wysterylizuj koniec rurki rury do zbioru alkoholem.</li>
	<li>Otwórz zacisk zakrywający port poboru i użyj strzykawki, aby pobrać próbkę. Ta pierwsza próbka jest zwykle odrzucana, ponieważ znajdowała się w rurze.</li>
	<li>Użyj innej strzykawki, aby pobrać kolejną próbkę.</li>
	<li>Za pomocą trzeciej strzykawki wepchnij powietrze z powrotem przez rurkę, aby usunąć jak najwięcej martwej objętości z linii i zacisnąć linię.</li>
	<li>Określ gęstość komórek i pH i zapisz wartości. W przypadku kultur drobnoustrojów przydatne jest rejestrowanie wartości co godzinę. Interwał jest zależny od kultury.</li>
	<li>Metodologia zbioru zależy od intencji uprawy po zakończeniu wzrostu. W takim przypadku należy pobrać próbkę z hodowli po raz ostatni, aby otrzymać wartości końcowe dotyczące gęstości komórek i możliwego pH lub pomiaru masy mokrych komórek. Otwórz płytę główną, pozostawiając zawartość wyrzuconą w wyznaczonym "zbiorniku do zabijania" z wybielaczem lub innymi środkami przeciwdrobnoustrojowymi.</li>
</ol>

<ol><li>Shuler, M., Kargi, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShuler%2C+M+%22Bioprocess+Engineering+Basic+Concepts%22">Bioprocess Engineering Basic Concepts</a>. , 2nd, Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. (2002).</li>
<li>Hambor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor+Design+and+Bioprocess+Controls+for+Industrialized+Cell+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing.</a> BioProcess International. 10 (6), 22-33 (2012).</li>
<li>Wave [Internet]. , GE Life Sciences. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-US/brands/wave">http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-US/brands/wave</a> (2012).</li>
<li>Xcellerex [Internet]. , GE Life Sciences. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.xcellerex.com/platform-xdr-single-use-bioreactors.htm">http://www.xcellerex.com/platform-xdr-single-use-bioreactors.htm</a> (2012).</li>
<li>Julien, C., Whitford, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreactor%2C+Monitoring%2C+Modeling+and+Simulation%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Bioreactor, Monitoring, Modeling and Simulation.</a> BioProcess International. 5 (01), S10-S17 (2007).</li>
<li>Fike, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+Supplementation+Strategies+for+Biopharmaceutical+Production.+Part+1%3A+Identifying+a+Formulation%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Nutrient Supplementation Strategies for Biopharmaceutical Production. Part 1: Identifying a Formulation.</a> BioProcess International. 7 (11), 46-52 (2009).</li>
<li>Jana, S., Deb, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+efficient+production+of+heterologous+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 67, 289-298 (2005).</li>
<li>Wang, Z., Ly, M., Zhang, F., Zhong, W., Suen, A., Hickey, A. M., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E.+coli+K5+fermentation+and+the+preparation+of+heparosan%2C+a+bioengineered+heparin+precursor%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">E. coli K5 fermentation and the preparation of heparosan, a bioengineered heparin precursor.</a> Biotechnol. Bioeng. 107, 964-973 (2010).</li>
<li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaltz%2C+RH+%22Manual+of+Industrial+Microbiology+and+Biotechnology%22">Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology</a>. , 3rd, ASM Press. Washington DC. (2010).</li>
<li>Bioreactors [Internet]. , Applied Technical Resources. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atrbiotech.com/pdfs/bioreactors.pdf">http://www.atrbiotech.com/pdfs/bioreactors.pdf</a> (2012).</li>
<li>Infors, H. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInfors%2C+HT+%22Minifors+operating+Manual+and+user+guide%22">Minifors operating Manual and user guide</a>. , Bottmingen, Switzerland. Forthcoming.</li>
</ol>

Autor: A. Magno
 jest pracownikiem firmy ATR Biotech, która produkuje odczynniki i instrumenty użyte w tym artykule.

Bioreaktory zbiornikowe z mieszadłem są standardem w branży biotechnologicznej i są stosowane od ponad 40 lat 1. Mały zbiornik z mieszadłem był ważny dla zwiększania i zmniejszania skali, optymalizacji szczepów, charakterystyki i rozwoju procesów. Może również odgrywać ważną rolę w rozwoju medycyny zindywidualizowanej 2. Bioreaktor na małą skalę jest najbardziej zbliżony do warunków wzrostu komórek in situ , ponieważ może być monitorowany i optymalizowany przez cały przebieg. Najczęściej początkowe eksperymenty przeprowadza się przy użyciu kolb wytrząsających, ale warunki panujące w bioreaktorze na małą skalę znacznie różnią się od warunków panujących w kolbie wstrząsającej. W jednym eksperymencie stwierdziliśmy, że warunki optymalnego wzrostu E. coli i produkcji białka zielonej fluorescencji (GFP) w kolbie do wstrząsania nie przekładały się na mieszany zbiornik (dane niepublikowane).
Inne metody hodowli komórek na dużą skalę obejmują butelki rolkowe, jednorazowe bioreaktory z platformą bujaną 3 oraz większe bioreaktory jednorazowego użytku o objętości roboczej od 50 do 5 000 l. Każda metoda wiąże się z wyzwaniami związanymi ze zwiększaniem skali, ale znalazła swoje miejsce w produkcji. Bioreaktor z jednorazową platformą kołyszącą jest podobny do zbiornika z mieszadłem i zapewnia regulowane środowisko. Różni się od zbiornika z mieszadłem tym, że mieszanie następuje w wyniku ruchu kołyszącego w celu wytworzenia fal, aby zapobiec osiadaniu komórek i zapewnić natlenienie. Hydrodynamika dla tej metody różni się od zbiornika z mieszadłem, a maksymalna objętość jest ograniczona do 1 000 l. Różnice mogą wpływać na wzrost komórek i produkcję produktu. Inne systemy jednorazowego użytku łączą zbiornik z mieszadłem z reaktorem jednorazowego użytku, aby zapewnić platformę z minimalną infrastrukturą i powiązanymi kosztami ogólnymi oraz zdolnością do wysokowydajnego bioprzetwarzania 4.
Nowi użytkownicy bioreaktorów stacjonarnych mogą mieć problemy z określeniem początkowych wartości zadanych pH,pO2 i temperatury; Jednak w celu uzyskania tych informacji można odnieść się do opublikowanych badań 5, 6, 7, 8, 9. W szczególności w przypadku kultur bakteryjnych zaleca się rozpoczęcie mieszania z tą samą prędkością co kolba wytrząsarska i temperaturą przy tej samej wartości zadanej. Jako punkt wyjścia można również wykorzystać pH kultury z poprzednich cykli wytrząsania. Ustalenie wartości pO2 jest trudniejsze i zwykle jest określane empirycznie. Jednak rozpoczęcie od 50% pO2 jest zalecanym punktem wyjścia.

Podstawowa technologia fermentacji jest rozszerzeniem prostej techniki wytrząsania kolby do uprawy kultur. Wyrósł z pragnienia kontrolowania środowisk wzrostu żywych kultur w bardziej kompletny i ilościowy sposób. Kolby do wytrząsania z kultur wsadowych są zwykle ograniczone przez nieprecyzyjną kontrolę temperatury. Równomierność temperatury w inkubowanym wytrząsarce lub ciepłym pomieszczeniu jest bardzo zmienna, czasami odchyla się o 5 °C lub więcej od zamierzonej wartości zadanej. Ponieważ kolba wstrząsająca jest zwykle mieszana ze stałą prędkością, pobór tlenu i wymiana gazowa są ograniczone. Gdy dostępny tlen w otoczeniu zostanie wyczerpany, większość kultur nie będzie się rozwijać. W kolbach do wytrząsania nie ma kontroli pH. W wielu przypadkach, jeśli kultura nie jest ograniczona przez materiał paszowy, staje się kwaśna do tego stopnia, że szkodzi kulturze, a oddychanie dramatycznie zwalnia. Większość kultur w kolbach wstrząsowych jest również prowadzona jako "partia", co oznacza, że są one podawane tylko raz na początku inokulacji kultur lub w ich pobliżu. Po zużyciu tego początkowego źródła węgla kultura przestaje rosnąć. W niektórych przypadkach jego metabolizm może się przesunąć i zacząć zużywać inne metabolity w bulionie hodowlanym, czasami zmieniając charakterystykę powstałej biomasy lub białka. Kolby do wytrząsania są również zwykle narażone na utratę parowania pożywki w cieplejszych środowiskach hodowlanych, zwykle 10% objętości na 24 godziny w temperaturze 37 °C. Utrata ta zmienia gęstość kultury i uniemożliwia długotrwałą eksploatację systemu. Wreszcie, użytkownik może napotkać pienienie się z mediów po wymieszaniu. Pojawienie się piany w przestrzeni nad głową nad kulturą ograniczy wymianę gazową i dodatkowo zahamuje wzrost.
Podstawowy system fermentacji został zaprojektowany tak, aby rozwiązać wszystkie te ograniczenia. Staranną kontrolę temperatury w naczyniach fermentacyjnych uzyskuje się dzięki zastosowaniu mieszania wirnika i płaszcza grzewczego. Czujnik umieszczony w naczyniu i sprzężenie zwrotne sterowania ogrzewaniem i chłodzeniem tego płaszcza zwykle skutkuje kontrolą temperatury ±0,1 °C wokół wartości zadanej. Fermentory stołowe zazwyczaj zapewniają kontrolę pH poprzez dodawanie płynnego odczynnika przez pompę. Wartość pH jest stale monitorowana w celu utrzymania środowiska optymalnego dla wzrostu komórek. Prawidłowe napowietrzenie jest utrzymywane przez wspomniany wirnik mieszający lub przez wlew powietrza lub gazu uzupełnionego tlenem bezpośrednio do kultury. W przypadku kultur wrażliwych na ścinanie, gaz uzupełniony tlenem jest podstawowym mechanizmem utrzymania poziomu tlenu w hodowli. Pomiar tlenu w roztworze jest zwykle wykonywany za pomocą sondy polarograficznej, która zwykle nie jest dostępna do użytku w kolbach wstrząsowych. Możliwe jest również ciągłe lub okresowe dodawanie paszy do naczynia w celu utrzymania wzrostu w sposób liniowy lub wykładniczy. Skraplacz gazu wyjściowego zapewnia zimną powierzchnię do skraplania się pary w strumieniu spalin, zachowując w ten sposób objętość i gęstość kultury. Okresowe dodawanie przeciwpieniącego środka powierzchniowo czynnego jest uruchamiane przez sondę przewodności w hodowli, redukując pianę na powierzchni i umożliwiając wymianę gazową.
Naczynie, ze wszystkimi sondami, armaturą, wirnikami, rurami do zbierania i rurkami, jest montowane i sterylizowane w standardowym autoklawie. Po końcowej kalibracji sondy i ustabilizowaniu w środowisku operacyjnym, kultura jest dodawana do naczynia. System może być następnie wykorzystany do scharakteryzowania kultury w sposób, który jest bardziej ilościowy i precyzyjny niż w przypadku metody wstrząsania. Ścisła kontrola temperatury, pH, zawartości tlenu, zużycia paszy, parowania cieczy i poziomu piany przyczynia się do znacznie wyższej biomasy i lepszej wydajności białka.

<table><tbody><tr><td>Rosół LB</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>ampicylina</td><td>Sigma</td><td>A1593-25G</td><td></td></tr><tr><td>Rosół LB</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>przeciwpieniący 204</td><td>Sigma</td><td>A8311</td><td></td></tr><tr><td>1 M Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td>38215-1EA-R</td><td></td></tr><tr><td>Bufor referencyjny, pH 4,00</td><td>Sigma</td><td>B5020</td><td></td></tr><tr><td>Odniesienie Bufor o pH 7,00</td><td>Sigma</td><td>B4770</td><td></td></tr><tr><td>Elektrolit sondy pO2</td><td>Broadley James</td><td>AS-3140-C30-0025</td><td></td></tr><tr><td>Filtr 0,45 mikrona</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-02915-22</td><td></td></tr><tr><td>Filtr 0,22 mikrona</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-29950-40</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Luer Lock, 10 ml</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07940-12</td><td></td></tr><tr><td>Bioreaktor Minifors</td><td>Infors HT</td><td>B-Pack 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Pompa powietrza Air Admiral</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-79202-00</td><td></td></tr><tr><td>1175 PD Cyrkulator chłodzący</td><td>VWR</td><td>13721-204</td><td></td></tr></tbody></table>

działanie bioreaktora laboratoryjnego

Operation of a Benchtop Bioreactor

Systemy fermentacji są używane do zapewnienia optymalnego środowiska wzrostu dla wielu różnych typów kultur komórkowych. Zdolność fermentorów do dokładnej kontroli temperatury, pH, a w szczególności stężenia rozpuszczonego tlenu, sprawia, że są one niezbędne do wydajnego wzrostu i ekspresji produktów fermentacji na dużą skalę. W tym filmie pokrótce opisano zalety fermentora w porównaniu z kolbą do wytrząsania. Zidentyfikuje również kluczowe elementy typowego stołowego systemu fermentacji i udzieli podstawowych instrukcji dotyczących konfiguracji naczynia i kalibracji jego sond. Widz zostanie zapoznany z procesem sterylizacji i pokazany, jak zaszczepić pożywkę wzrostową w naczyniu kulturą. Zademonstrowane zostaną również podstawowe koncepcje działania, pobierania próbek i zbioru. Omówiona zostanie również prosta analiza danych i czyszczenie systemu.

Bioreaktorem można sterować z użyciem oprogramowania IRIS lub bez niego. Jednakże w celu rejestracji danych najlepiej jest korzystać z oprogramowania. Przed dodaniem bakterii należy skalibrować czujniki pH i tlenu, ustawić prędkość mieszadła oraz temperaturę. Na Rysunku 2 przedstawiono dane wyjściowe z pracy bioreaktora. Temperatura została ustawiona na 30 °C, a prędkość mieszadła na 200 rpm. Parametry mogą być różne dla każdego eksperymentu, ale przed dodaniem bakterii system powinien znajdować się w stanie stacjonarnym. Na Rysunku 3 pokazano zmianę stężenia tlenu po dodaniu kultury bakteryjnej. Wartości zadane dla tego eksperymentu to 37 °C, mieszadło 200 rpm, O2 na poziomie 70%. W czasie 19:20 pompa zasilająca podaje kulturę startową bakterii o OD 0,1, co powoduje natychmiastowy spadek poziomu O2. Bioreaktor reaguje na zmieniający się poziom O2 poprzez zwiększenie przepływu powietrza i prędkości mieszadła. Wartości zadane dla tych zwiększeń są skonfigurowane w kaskadzie (krok 35). pH w reaktorze było monitorowane w czasie rzeczywistym; wartość pH najpierw spadła, a następnie wzrosła, co obrazują wahania linii pH w czasie (Rysunek 4). Cały przebieg procesu może zostać przeanalizowany, a parametry dostosowane do kolejnych eksperymentów.
<img alt="Schemat bioreaktora do procesu fermentacji, zawiera sondy, płaszcz grzewczy, panel sterowania." src="/files/ftp_upload/50582/50582fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Bioreaktor laboratoryjny z opisanymi i połączonymi wszystkimi elementami. Na tym rysunku przedstawiono reaktor z mieszadłem na początku procesu. Elementy reaktora są opisane i obejmują czujniki, mieszadło, termometr, butelki do podawania pożywki i pobierania próbek, port wylotowy, manometr ciśnienia powietrza, płaszcz grzewczy, wieżę kondensacyjną oraz panel sterowania.
<img alt="Wykres stanu równowagi statycznej; analiza danych systemu sterowania; wykres ciśnienia i temperatury w czasie." src="/files/ftp_upload/50582/50582fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Zrzut ekranu oprogramowania bioreaktora na początku procesu. Na początku procesu w bioreaktorze z mieszadłem ustawiono temperaturę na 30 °C (linia żółta), prędkość obrotową mieszadła na 200 rpm (linia czerwona), pH na 6,5 (linia zielona) oraz pO2 na 57,2% (linia niebieska). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig2large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.
<img alt="Wykres sterowania procesem w oprogramowaniu; monitorowanie danych; trendy temperatury i ciśnienia; analiza systemu." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50582/50582fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Zrzut ekranu z oprogramowania bioreaktora podczas procesu w momencie spadku poziomu tlenu. Gdy hodowla znajduje się w fazie aktywnego wzrostu, zużywa tlen, co prowadzi do zmniejszenia jego ilości w reaktorze (linia niebieska). Poprzez zwiększenie prędkości mieszadła do hodowli można dostarczyć więcej tlenu (linia czerwona). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.
<img alt="Wykres analizy danych; monitorowanie procesu chemicznego, wyjście graficzne z trendami danych szeregów czasowych." src="/files/ftp_upload/50582/50582fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Zrzut ekranu oprogramowania bioreaktora pokazujący zmianę pH w czasie. Wartość pH hodowli jest monitorowana w sposób ciągły i w czasie maleje w miarę produkcji kwasu mlekowego, a następnie rośnie po dodaniu zasady do bioreaktora (niebieska linia). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50582/50582fig4large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.

Fermentory są używane do zwiększania wydajności hodowli i produktywności komórek bioinżynieryjnych. Po przesiewie wielu kandydatów na hodowle mikrobiologiczne lub komórki zwierzęce w kolbach wstrząsowych, następnym logicznym krokiem jest zwiększenie biomasy wybranej kultury za pomocą fermentora. Ten film pokazuje konfigurację i działanie typowego systemu bioreaktora laboratoryjnego.

Działanie bioreaktora laboratoryjnego

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie bioreaktora, który zapewni kontrolowane środowisko do wielkoskalowej hodowli komórek bioinżynieryjnych. Jest to realizowane poprzez montaż naczynia, kalibrację sondy pH oraz autoklawowanie zmontowanego naczynia. W drugim kroku naczynie po autoklawowaniu mocuje się do podstawy fermentora i ustawia parametry prędkości obrotowej mieszadła, temperatury, pH oraz nasycenia tlenem.Następnie uruchamia się bioreaktor, aby po ręcznej kalibracji sondy tlenowej osiągnąć pożądaną prędkość mieszadła, wartość zadaną temperatury oraz nasycenie tlenem. Ostatnim krokiem jest zaszczepienie bioreaktora kulturą bakteryjną i monitorowanie warunków w bioreaktorze za pomocą oprogramowania komputerowego. W końcowej fazie można przeanalizować charakterystykę wzrostu kultury, a następnie poddać ją dalszemu przetwarzaniu w celu ekstrakcji i oczyszczania pożądanego produktu.W tym filmie prezentujemy konfigurację i obsługę bioreaktora do fermentacji bakteryjnej. Wizualna demonstracja tej metody może być pomocna, ponieważ montaż, kalibracja i monitorowanie bioreaktora mogą stanowić trudne zadanie dla osób nieznających tej technologii. Zatem zaczynajmy.Na początek należy do czystego naczynia dodać podłoże bakteryjne, które nie jest termolabilne. Należy dopełniać do momentu osiągnięcia maksymalnej objętości roboczej, która dla naczynia o całkowitej objętości 5 litrów wynosi 3,3 litra. Zamontować płytę głowicy naczynia, upewniając się, że uszczelka typu O-ring jest prawidłowo osadzona. Zainstalować skraplacz gazów wylotowych.Włóż rurkę odprowadzającą do otworu o średnicy 10 milimetrów. Nałóż na nią odcinek wężyka. Podłącz go do butelki do próbek i zaciśnij wężyk zaciskiem.Zainstaluj wężyk i filtr 0,2 mikrona na wlocie napowietrzania, a następnie go zaklemuj. Aby skalibrować sondę pH, przygotuj dwa bufory referencyjne w małych zlewkach, butelkę z wodą destylowaną oraz zlewkę do płukania. Podłącz sondę pH do fermentora i włącz urządzenie.Przewiń do parametru pH, a następnie za pomocą przycisku menu przejdź do opcji kalibracji i zatwierdź wybór przyciskiem enter. Wybierz opcję „two” dla kalibracji dwupunktowej. Opłucz końcówkę sondy pH i zanurz ją w buforze referencyjnym o niskim pH.Wartość na fermentorze ustabilizuje się po użyciu klawiszy plus i minus. Dostosuj wyświetlaną wartość tak, aby odpowiadała wartości buforu referencyjnego pH. Gdy przestanie ona migać, naciśnij Next.Zmyj bufor referencyjny o niskiej wartości z sondy i zanurz sondę w drugim buforze referencyjnym. Odczekaj, aż wartość się ustabilizuje, a następnie za pomocą klawiatury ustaw wyświetlaną wartość tak, aby odpowiadała wartości wysokiego buforu referencyjnego. Naciśnij enter, aby zatwierdzić.Wypłucz końcówkę sondy i odłącz ją od fermentora. Nałóż nasadkę ochronną na złącze i zamontuj ją w płycie górnej. Otwórz końcówkę sondy tlenowej i sprawdź, czy znajduje się w niej wystarczająca ilość elektrolitu, aby zakryć końcówkę.Zainstaluj sondę tlenową w płycie głowicy. Upewnij się, że założono nasadkę do autoklawu, aby chronić połączenia elektryczne, ponieważ sonda zostanie wysterylizowana przed kalibracją. Następnie przygotuj butelkę do podawania odczynników z rurką zanurzeniową i filtrem powietrza.Podłącz przewod pompy do portu rurki zanurzeniowej, a drugi koniec do portu wlotowego fermentora. Na wszystkich niewykorzystanych portach umieść przewody, a następnie je zaklemuj. Zainstaluj filtr 0,45 mikrona na kondensatorze gazów wylotowych. Filtr ten zapobiega wzrostowi ciśnienia w naczyniu podczas autoklawowania.Należy sprawdzić, czy wszystkie rurki znajdujące się poniżej poziomu pożywki są zaklemowane, aby zapobiec wyciekowi pożywki. Naczynie należy umieścić w autoklawie i sterylizować przez 25 do 30 minut w temperaturze 121°C w cyklu dla cieczy. Po ostygnięciu naczynia z autoklawu kolejnym krokiem jest jego montaż na podstawie fermentora.Następnie podłącz kabel sondy pH. Podłącz kabel sondy tlenowej i podepnij sparger do układu doprowadzania gazu. Rotter, włącz fermentor, zachowując sterylność.Do butelki z rurką pobierającą należy dodać odczynnik wodorotlenku sodu o stężeniu 1 M, a następnie zamontować głowicę pompy na wrzecionie podstawy głowicy pompy. Czujnik temperatury należy umieścić w tulei termometrycznej na płycie głowicy. Należy upewnić się, że czujnik dotarł do samego dna tulei.Obniż ramię mieszadła na sprzęgło wirnika naczynia. Upewnij się, że fermentor jest włączony. Sprawdź, czy do fermentora doprowadzona jest woda.Włącz dopływ powietrza do fermentora. Przewiń do parametru temperatury i ustaw temperaturę na 37 °C. Naciśnij przycisk enter, aby uruchomić kontrolę temperatury.Naczynie nagrzeje się w ciągu 15 minut lub krócej. Ustaw przepływ gazu na wartość równą lub mniejszą niż jedna objętość pożywki w naczyniu na minutę. W tej konfiguracji przepływ gazu wynosi 3 l/min.Na dnie powinny pojawić się pęcherzyki. Przewiń do parametru mieszania i ustaw wartość 300 RPM. Naciśnij enter, aby włączyć mieszanie.Po osiągnięciu temperatury 37 °C przejdź do parametru pH i ustaw go na 6,8. Włącz kontrolę pH, naciskając przycisk enter.Ustaw mieszanie na maksymalną prędkość 1000 RPM na czas trwania procesu. Upewnij się, że sonda tlenowa jest prawidłowo spolaryzowana, aby po dwóch godzinach wyświetlała właściwe wartości. Przewiń do parametru tlenu.Użyj przycisku menu, aby wybrać funkcję kalibracji, a następnie wybierz kalibrację jednopunktową. Po 15 minutach użyj kursorów, aby ustawić wartość na 100 i naciśnij enter. Spowoduje to skalibrowanie nasycenia tlenem.Przewiń do sekcji mieszania i ustaw wartość 300 RPM. Za pomocą przycisku menu włącz funkcję kaskady w menu mieszania. Pozwoli to na zwiększenie prędkości mieszania w celu rozbicia pęcherzyków powietrza i wymuszenia rozpuszczenia większej ilości tlenu w roztworze w miarę wzrostu zapotrzebowania wynikającego z namnażania kultur.Przewiń do parametru tlenu i ustaw wartość na 30. Naciśnij przycisk enter. Uruchom pakiet oprogramowania sterującego na komputerze PC.Po skalibrowaniu sond mieszanie jest stabilne przy 300 RPM. Temperatura wynosi 37 °C, a pH jest bliskie 6,8. Nadszedł czas na inokulację przy użyciu alkoholu.Sterylizuj port, który będzie wykorzystany do inokulacji. Pobierz inokulum do strzykawki i wprowadź je do wysterylizowanego portu. Zamknij port i odnotuj czas inokulacji w dzienniku komputerowym.Ważne jest również pobranie próbki w momencie inokulacji. Po otwarciu zacisku i zakryciu portu do zbioru, należy nacisnąć tłok strzykawki, aby przepłukać linię. Następnie należy odciągnąć tłok strzykawki.Aby pobrać próbkę, odkręć butelkę i wylej pierwszą porcję, ponieważ znajdowała się ona w rurce. Ponownie przymocuj butelkę i za pomocą tego samego tłoka strzykawki pobierz kolejną próbkę. Zdejmij butelkę i opróżnij jej zawartość do naczynia.W celu przeprowadzenia testu, należy wtłoczyć powietrze z powrotem do rurki za pomocą strzykawki i zamknąć zacisk na przewodzie portu pobierania próbek. Następnie należy określić gęstość komórek oraz pH i zapisać uzyskane wartości. W przypadku kultur drobnoustrojów zaleca się zapisywanie wartości co godzinę, jednak odstęp między pobieraniem próbek zależy od rodzaju hodowli.Metodyka zbioru będzie zależeć od przeznaczenia hodowli po zakończeniu wzrostu. W tym przypadku należy pobrać ostatnią próbkę hodowli, aby uzyskać wartości końcowe dla gęstości komórek oraz ewentualne pH lub pomiar mokrej masy komórek. Na koniec należy otworzyć płytę górną, zebrać hodowlę, a następnie zutylizować zawartość naczynia w wyznaczonym zbiorniku do dekontaminacji z dodatkiem wybielacza lub innych środków przeciwdrobnoustrojowych.W tym filmie zaprezentowano konfigurację i obsługę typowego laboratoryjnego systemu bioreaktora. Na tej rycinie przedstawiono bioreaktor na początku procesu, z opisanymi i podłączonymi wszystkimi elementami. Na tej rycinie zaprezentowano dane wyjściowe z reprezentatywnego przebiegu pracy bioreaktora.Początek pracy w reaktorze z mieszadłem. Temperaturę ustawiono na 30 °C, prędkość obrotową mieszadła na 200 RPM, pH na 6,5 oraz poziom tlenu na 57,2%. Parametry mogą się różnić w zależności od eksperymentu, jednak przed dodaniem bakterii system powinien znajdować się w stanie ustalonym. Na następnej rycinie zmiana stężenia tlenu po dodaniu kultury bakteryjnej została przedstawiona niebieską linią.Pompa zasilająca dostarcza bakteryjną kulturę startową o wartości OD wynoszącej 0.1, co powoduje gwałtowny spadek. W odniesieniu do poziomu O2, bioreaktor reaguje na zmiany stężenia O2 poprzez zwiększenie prędkości obrotowej mieszadła. Ten ostatni obraz ekranu oprogramowania bioreaktora przedstawia zmianę pH w czasie, reprezentowaną przez ciemnoniebieską linię.Wartość pH hodowli była monitorowana w sposób ciągły i z czasem ulegała obniżeniu, w miarę produkcji i wzrostu stężenia kwasu mlekowego. Cały przebieg procesu można przeanalizować, a parametry dostosować do kolejnych eksperymentów.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat konfiguracji i monitorowania bioreaktora w celu ekspresji białka rekombinowanego. Systemy fermentacyjne są wykorzystywane do zapewnienia optymalnego środowiska wzrostu dla wielu różnych rodzajów kultur w skali zwiększonej. Możliwość precyzyjnej kontroli temperatury, pH oraz w szczególności stężeń tlenu rozpuszczonego, jaką zapewniają fermentory, sprawia, że są one niezbędne do wydajnego, wielkoskalowego wzrostu i ekspresji produktów fermentacji.Dziękujemy za obejrzenie tego filmu i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Obsługa bioreaktora stołowego

W tym protokole przedstawiono produkcję, konfigurację i podstawowe działanie mikroprzepływowego bioreaktora pikolitrowego (PLBR) do analizy pojedynczych komórek mikroorganizmów prokariotycznych. Mikroorganizmy istotne z przemysłowego punktu widzenia zostały przeanalizowane jako dowód zasadności, co pozwoliło na wgląd w tempo wzrostu, morfologię i niejednorodność fenotypową w określonych okresach czasu, co jest prawie niemożliwe przy użyciu konwencjonalnych metod.

Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa

Korzystając z bioreaktora pneumatycznego, demonstrujemy montaż, działanie i wydajność tego jednorazowego systemu bioreaktorów do wzrostu komórek ssaków.

Hodowla komórek ssaków przy użyciu systemu jednorazowego bioreaktora pneumatycznego

Nowatorski projekt reaktora, nazwany bioreaktorem o wysokiej gęstości (HDBR), jest prezentowany do hodowli i badania społeczności drobnoustrojów o dużej gęstości. W tym przypadku HDBR jest z powodzeniem stosowany w konfiguracji fotobioreaktora (PBR) do badania metabolizmu azotu przez mieszaną społeczność glonów o dużej gęstości.

Nowatorski bioreaktor do hodowli o dużej gęstości różnych zbiorowisk mikroorganizmów

Ten artykuł opisuje proces montażu i działania laboratoryjnego bioreaktora fotosyntetycznego, który może być użyty, w połączeniu z innymi metodami, do oszacowania odpowiednich parametrów wzrostu kinetycznego. System ten stale monitoruje pH, światło i temperaturę za pomocą czujników, jednostki akwizycji i sterowania danymi oraz oprogramowania do akwizycji danych typu open source.

Budowa i konfiguracja laboratoryjnego bioreaktora fotosyntetycznego glonów z monitorowaniem temperatury, światła i pH do testów wzrostu kinetycznego

Moc wejściowa w bioreaktorach z mieszadłem może być mierzona za pomocą momentu obrotowego, który działa na wał wirnika podczas obrotu. W artykule opisano, w jaki sposób łożysko powietrzne może być wykorzystane do skutecznego zmniejszenia strat tarcia obserwowanych w uszczelnieniach mechanicznych i poprawy dokładności pomiarów mocy wejściowej w małych zbiornikach.

Pomiary mocy wejściowej w bioreaktorach z mieszadłem w skali laboratoryjnej

Przedstawiono szczegółowy protokół jednoczesnego działania 48 równoległych kultur komórkowych w różnych warunkach w systemie mikrobioreaktora. Opisano proces hodowli komórek, zbiór i późniejszą analizę miana przeciwciał.

Zastosowanie wysokowydajnego zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktorów do produkcji modelowej IgG1 w komórkach CHO

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę przeprowadzania projektu eksperymentu w zautomatyzowanym mikro-bioreaktorze, a następnie zbierania komórek i kwantyfikacji białka za pomocą kolumny Białko A.

Optymalizacja procesów z wykorzystaniem zautomatyzowanych mikrobioreaktorów o wysokiej przepustowości w hodowli komórek jajnika chomika chińskiego

Ten protokół szczegółowo opisuje montaż układów mini-bioreaktorów, które mają być wykorzystane do hodowli złożonego przepływu złożonych zbiorowisk kałowych w warunkach beztlenowych. Omówiono również metody montażu, inokulacji i pobierania próbek z reaktorów do dalszej analizy.

Montaż bioreaktora do ciągłej hodowli złożonych zbiorowisk kałowych

Minibioreactor Array (MBRA) to wysokowydajny, konfigurowalny system hodowli o ciągłym przepływie, który umożliwia hodowlę złożonych społeczności drobnoustrojów, wspierając równoległe eksperymenty w celu badania dynamiki mikrobiomu, interakcji terapeutycznych i reakcji drobnoustrojów na czynniki środowiskowe.

Zaktualizowany protokół montażu i użytkowania macierzy minibioreaktorów (MBRA)

Nasz zespół opracował system hodowli w bioreaktorze, który naśladuje fizjologiczne naprężenia pulsacyjne układu sercowo-naczyniowego w celu regeneracji wszczepialnych zastążek naczyniowych o małej średnicy.

Projektowanie biologicznych przeszczepów naczyniowych z wykorzystaniem bioreaktora pulsacyjnego

Poznaj konfigurację i działanie bioreaktora laboratoryjnego do hodowli komórek bioinżynieryjnych. Naucz się kalibracji sond pH i tlenu, autoklawowania oraz monitorowania parametrów kultury bakteryjnej.

Działanie bioreaktora laboratoryjnego

Przeglądaj więcej filmów