Name: Zapis obwodu neuronalnego z nienaruszonego układu nerwowego karalucha (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-04T20:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Poznaj technikę zapisu sygnałów z przewodu brzusznego karalucha przy użyciu stymulacji mechanicznej i elektrycznej. Ta metoda pozwala badać integrację informacji sensorycznej w ośrodkowym układzie nerwowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Hyewonowi Cooperowi za ilustracje.

1. Sekcja
Roztwór soli fizjologicznej dla karaluchów używany w tym protokole ma następujący skład:
Roztwór soli fizjologicznej dla karaluchów36: (gramy na 100 ml) 
210 mM NaCl (1,227 g) 
2,9 mM KCl (0,0216 g) 
1,8 mM CaCl2 (0,0265 g) 
0,2 mM NaH2PO4•2H2O (0,0032 g) 
1,8 mM na2HPO4•7H2O (0,0483 g) 
(pH 7,2. Dostosować pH za pomocą 1 M NaOH lub 1 M HCl).
<ol>
	<li>Wybierz samca karalucha ze zbiornika retencyjnego, który ma mocne cerci (ryc. 1). Ostatnie segmenty samca są wąskie w porównaniu z samicą; i nie zawierające jajników i masy jajowej, samce są łatwiejsze do rozcięcia. Samce P. americana mają parę krótkich rysików między cerci. Te rylce nie są obserwowane u samic.</li>
	<li>Odetnij skrzydła, nogi i głowę i przypnij ciało brzuszną stroną do góry do naczynia wyłożonego elastomerem silikonowym.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy podnieś płytki brzuszne i odetnij je drobnymi nożyczkami, zaczynając od tylnego końca i pracując do przodu. Zawsze utrzymuj narządy wewnętrzne wilgotne solą fizjologiczną, starając się, aby cerci były suche. Można użyć wosku lub kawałków gumy, aby ustawić brzuch do góry, aby zapobiec zwilżeniu cerci przez sól fizjologiczną. Jeśli zmokną, osusz je kawałkiem bibuły. Odepchnij na bok narządy wewnętrzne i istotę białą (ciało tłuszczowe). VNC znajduje się w środku pola, biegnie wzdłuż brzucha i powinien być widoczny między błyszczącymi tchawicami. Przewód nerwowy jest półprzezroczysty i początkowo może być trudny do zauważenia, dopóki oświetlenie nie zostanie odpowiednio wyregulowane (ryc. 2). NIE WOLNO dotykać VNC kleszczami lub szpilkami do owadów; zamiast tego manipuluj nim za pomocą szklanych sond.</li>
	<li>Usuń tchawicę zwierzęcia tak dobrze, jak to możliwe, ze sznura nerwowego za pomocą kleszczy i pary cienkich szklanych igieł, bardzo ostrożnie rozdziel łączniki VNC wzdłużnie między zwojami A6 i A5 lub A5 i A4 (ryc. 3). Wyciągnij cerci i brzuch do góry z kąpieli solankowej za pomocą skróconych szpilek przeciw owadom i wosku lub klina elastomeru silikonowego, który można przyciąć tak, aby pasował do preparatu (ryc. 4A i B). Zachowaj szczególną ostrożność w ostatnim segmencie jamy brzusznej, aby nie uszkodzić nerwów szyjnych, które wystają do zwoju (ryc. 2D i 5).</li>
</ol>
2. Nagrywanie zewnątrzkomórkowe
<ol>
	<li>Wypreparowany preparat, mikroskop i aparatura rejestrująca powinny być umieszczone w klatce Faradaya, aby blokować zewnętrzne pola elektryczne, szczególnie prądu przemiennego, które mogłyby zastąpić sygnały z neuronów (ryc. 6).</li>
	<li>Ustaw mikroskop tak, aby wychodził na stolik mikroskopu. Po umieszczeniu preparatu na scenie dostosuj położenie wiązki oświetlacza o wysokiej intensywności, aby uzyskać najlepszą jej wizualizację.</li>
	<li>Podłączyć wzmacniacz różnicowy AC/DC do zintegrowanej jednostki rejestrującej dane (szczegółowe informacje na temat konkretnych ustawień sprzętowych i programowych zostały wcześniej opisane 25). Stopień czołowy trzymający elektrodę ssącą powinien być podłączony do amplifier. Srebrny przewód uziemiający, który został pokryty Cl- włożony do brzucha, zapewnia bardziej stabilne nagrania. Powodem jest to, że jeśli roztwór w jamie ciała nie styka się z płynem do kąpieli w naczyniu, płyn związany z elektrodą rejestrującą pozostaje uziemiony.</li>
	<li>Ustaw częstotliwość nagrywania na 4 kHz. Ustaw skalę napięcia (oś y) na 500 mV (można to dostosować, aby zoptymalizować wizualizację ścieżki). Uruchom oprogramowanie do nagrywania w trybie ciągłym lub oscyloskopowym, aby rejestrować aktywność neuronalną w odpowiedzi na stymulacje.</li>
	<li>Wytnij jedno z łączników VNC w pobliżu A5 i umieść odcięty koniec przymocowany do A6 w elektrodzie ssącej. Pamiętaj, aby wciągnąć sól fizjologiczną do elektrody ssącej, aby zakryć znajdujący się w niej srebrny drut przed zassaniem nerwu.</li>
	<li>Za pomocą suchej pipety wdmuchnij powietrze w włosy znajdujące się na każdym odcinku macicy. Sprawdź, czy stymulacja włosów na szyjce macicy ipsilateral do zarejestrowanej tkanki łącznej daje inną odpowiedź niż przeciwległa. Zwróć uwagę na amplitudę odpowiedzi i liczbę skoków w danym przedziale czasu podczas stymulacji.</li>
	<li>Przenieś elektrodę ssącą do nerwu szyjnego w celu nagrania. Aby uzyskać lepsze dopasowanie, w razie potrzeby przełącz się na końcówkę elektrody z mniejszym otworem.</li>
	<li>Przetnij nerw szyjki macicy w pobliżu A6, a następnie zassaj nerw prowadzący do szyjki macicy. Powinno dojść do spontanicznego wystrzelenia potencjałów czynnościowych. Teraz wdmuchnij powietrze na szyjkę macicy i zanotuj reakcje.</li>
</ol>
3. Elektryczna stymulacja nerwów czuciowych w celu określenia rekrutacji
<ol>
	<li>Zmień oprogramowanie nagrywające w tryb przemiatania, tak aby rejestrowało ślady (100-500 ms) za każdym razem, gdy wyzwalany jest bodziec.</li>
	<li>Podłącz elektrodę stymulującą do wyjścia stymulatora.</li>
	<li>Połącz stymulatora z dwoma przewodami lub klipsami mini-hook.</li>
	<li>Podłącz wyjście wyzwalacza BNC ze stymulatora do wejścia wyzwalacza w jednostce nagrywającej.</li>
	<li>Następujące parametry stymulacji powinny wywołać reakcję: Czas trwania: 0,3 sek.; Opóźnienie: 10 ms; Częstotliwość: 1 Hz; Napięcie: dostosuj w razie potrzeby, aby uzyskać sygnał w nagraniach (nieco powyżej progu i możliwość uzyskania maksymalnej odpowiedzi). Nie ma powodu, aby przechodzić na napięcia znacznie wyższe niż maksymalny próg rekrutacji, ponieważ wysokie napięcie może być szkodliwe dla nerwu.</li>
	<li>Przeciąć nerw szyjki macicy tak dystalnie, jak to możliwe, tak aby długi korzeń nerwowy mógł zostać wciągnięty do stymulującej elektrody ssącej (ryc. 7, grot strzałki). Można użyć łącznika między A6 i A5 lub innego odcinka bardziej przedniego.</li>
	<li>Ustaw elektrodę ssącą do nagrywania, aby można było wciągnąć łącznik do elektrody. Pamiętaj, aby wciągnąć trochę soli fizjologicznej do elektrod ssących, aby zakryć znajdujący się w niej srebrny drut przed zassaniem nerwów. Upewnij się, że elektroda stymulująca jest również uziemiona w soli fizjologicznej do kąpieli (w jamie brzusznej w pobliżu A3 jest idealna).</li>
	<li>Dostarczaj serię pojedynczych bodźców o rosnącym napięciu, aż na ekranie pojawi się potencjał czynnościowy. Należy zanotować minimalne napięcie stymulujące i czas trwania, aby zrekrutować odpowiedź. Zwiększaj intensywność, aż do zaobserwowania odpowiedzi synaptycznej w łącznikach. Najpierw pojawia się duży kolec (zewnątrzkomórkowe AP) z gigantycznych aksonów, a następnie można zaobserwować inne mniejsze AP.</li>
</ol>

<ol><li>Full, R. J., Tu, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+a+rapid+running+insect%3A+two-%2C+four-+and+six-legged+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanics of a rapid running insect: two-, four- and six-legged locomotion.</a> J. Exp. Biol. 156, 215-231 (1991).</li>
<li>Ritzmann, R. E., Tobias, M. L., Fourtner, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flight+activity+initiated+via+giant+interneurons+of+the+cockroach%3A+Evidence+for+bifunctional+trigger+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Flight activity initiated via giant interneurons of the cockroach: Evidence for bifunctional trigger interneurons.</a> Science. 210, 443-445 (1980).</li>
<li>Libersat, F., Camhi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cercal+position+during+flight+in+the+cockroach%3A+a+mechanism+for+regulating+sensory+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of cercal position during flight in the cockroach: a mechanism for regulating sensory feedback.</a> J. Exp. Biol. 136, 483-488 (1988).</li>
<li>Ganihar, D., Libersat, F., Wendler, G., Cambi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wind-evoked+evasive+responses+in+flying+cockroaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology.+A%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Wind-evoked evasive responses in flying cockroaches.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 175, 49-65 (1994).</li>
<li>Pipa, R. aD., F, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPipa%2C+RaD+%22The+American+Cockroach%22">The American Cockroach</a>. , Chapman and Hall. 175-216 (1981).</li>
<li>Westin, J., Langberg, J. J., Camhi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+giant+interneurons+of+the+cockroach%3B+Periplaneta+americana+to+wind+puffs+of+different+directions+and+velocities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology+A%3A+Neuroethology%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Responses of giant interneurons of the cockroach; Periplaneta americana to wind puffs of different directions and velocities.</a> Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 121, 307-324 (1977).</li>
<li>Camhi, J. M., Tom, W., Volman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+escape+behavior+of+the+cockroach+Periplaneta+americana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A+Neuroethol.+Sens.+Neural+Physiol%22%5BJournal%5D)">The escape behavior of the cockroach Periplaneta americana.</a> J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Physiol. 128, 203-212 (1978).</li>
<li>Nicklaus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Die+Erregung+einzelner+Fadenhaare+von+Periplaneta+americana+in+Abh%C3%A4ngigkeit+von+der+Gr%C3%B6sse+und+Richtung+der+Auslenkung%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Vgl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Die Erregung einzelner Fadenhaare von Periplaneta americana in Abhängigkeit von der Grösse und Richtung der Auslenkung.</a> Z. Vgl. Physiol. 50, 331-362 (1965).</li>
<li>Westin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+to+wind+recorded+from+the+cercal+nerve+of+the+cockroach+Periplaneta+americana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A+Neuroethol.+Sens.+Neural+Physiol%22%5BJournal%5D)">Responses to wind recorded from the cercal nerve of the cockroach Periplaneta americana.</a> J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Physiol. 133, 97-102 (1979).</li>
<li>Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRitzmann%2C+RE+%22Neural+Mechanisms+of+Startle+Behavior%22">Neural Mechanisms of Startle Behavior</a>. , Plenum Press. 93-131 (1984).</li>
<li>Ritzmann, R. E., Pollack, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+thoracic+interneurons+that+mediate+giant+interneuron-to-motor+pathways+in+the+cockroach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A+Neuroethol.+Sens.+Neural+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of thoracic interneurons that mediate giant interneuron-to-motor pathways in the cockroach.</a> J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural Physiol. 159, 639-654 (1986).</li>
<li>Plummer, M. R., Camhi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+of+sensory+signals+from+noise+in+the+escape+system+of+the+cockroach+-+the+role+of+wind+acceleration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Discrimination of sensory signals from noise in the escape system of the cockroach - the role of wind acceleration.</a> J. Comp. Physiol. 142, 347-357 (1981).</li>
<li>Bullock, T. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBullock%2C+TH+%22Neural+Mechanisms+of+Startle+Behavior%22">Neural Mechanisms of Startle Behavior</a>. , Plenum Press. 1-14 (1984).</li>
<li>Pollack, A. J., Ritzmann, R. E., Watson, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+pathways+for+tactile+sensory+information+to+thoracic+interneurons+in+the+cockroach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Dual pathways for tactile sensory information to thoracic interneurons in the cockroach.</a> J. Neurobiol. 26, 33-46 (1995).</li>
<li>Atwood, H. L., Wiersma, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Command+interneurons+in+the+crayfish+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Command interneurons in the crayfish central nervous system.</a> J. Exp. Biol. 46, 249-261 (1967).</li>
<li>Olson, G. C., Krasne, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crayfish+lateral+giants+as+command+neurons+for+escape+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The crayfish lateral giants as command neurons for escape behavior.</a> Brain Res. 214, 89-100 (1981).</li>
<li>Comer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+cockroach+escape+behavior+with+lesions+of+individual+giant+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Analyzing cockroach escape behavior with lesions of individual giant interneurons.</a> Brain Res. 335, 342-346 (1985).</li>
<li>Comer, C. M., Dowd, J. P., Stubblefield, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escape+responses+following+elimination+of+the+giant+interneuron+pathway+in+the+cockroach%2C+Periplaneta+americana%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Escape responses following elimination of the giant interneuron pathway in the cockroach, Periplaneta americana.</a> Brain Res. 445, 370-375 (1988).</li>
<li>Keegan, A. P., Comer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wind-elicited+escape+response+of+cockroaches+%28Periplaneta+americana%29+is+influenced+by+lesions+rostral+to+the+escape+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The wind-elicited escape response of cockroaches (Periplaneta americana) is influenced by lesions rostral to the escape circuit.</a> Brain Res. 620, 310-316 (1993).</li>
<li>Casagrand, J. L., Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenic+amines+modulate+synaptic+transmission+between+identified+giant+interneurons+and+thoracic+interneurons+in+the+escape+system+of+the+cockroach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Biogenic amines modulate synaptic transmission between identified giant interneurons and thoracic interneurons in the escape system of the cockroach.</a> J. Neurobiol. 23, 644-655 (1992).</li>
<li>Roeder, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+ascending+giant+fiber+system+in+the+cockroach%2C+Periplaneta+americana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Organization of the ascending giant fiber system in the cockroach, Periplaneta americana.</a> J. Exp. Zool. 108, 243-261 (1948).</li>
<li>Ramos, R. L., Moiseff, A., Brumberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+and+versatility+of+extracellular+recordings+from+the+cockroach+for+neurophysiological+instruction+and+demonstration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Undergrad.+Neurosci.+Educ%22%5BJournal%5D)">Utility and versatility of extracellular recordings from the cockroach for neurophysiological instruction and demonstration.</a> J. Undergrad. Neurosci. Educ. 5, (2007).</li>
<li>Oakley, B., Schafer, R. Experimental neurobiology. , University of Michigan Press. Ann Arbor. (1978).</li>
<li>Welsh, J. H., Smith, R. I., Kammer, A. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWelsh%2C+JH+%22Laboratory+exercises+in+invertebrate+physiology%22">Laboratory exercises in invertebrate physiology</a>. , Burgess Publishing Company. Minneapolis. (1968).</li>
<li>Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+receptor+organs+in+the+crayfish+abdomen%3A+a+student+laboratory+exercise+in+proprioception%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Muscle receptor organs in the crayfish abdomen: a student laboratory exercise in proprioception.</a> J. Vis. Exp. (45), e2323(2010).</li>
<li>Bacon, J. P., Blagburn, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+sensory+neurons+in+mutant+cockroaches+compete+with+normal+cells+for+central+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ectopic sensory neurons in mutant cockroaches compete with normal cells for central targets.</a> Development. 115, 773-784 (1992).</li>
<li>Blagburn, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-factors+and+co-repressors+of+Engrailed%3A+expression+in+the+central+nervous+system+and+cerci+of+the+cockroach%2C+Periplaneta+americana%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tiss.+Res%22%5BJournal%5D)">Co-factors and co-repressors of Engrailed: expression in the central nervous system and cerci of the cockroach, Periplaneta americana.</a> Cell Tiss. Res. 327, 177-187 (2007).</li>
<li>Blagburn, J. M., Gibbon, C. R., Bacon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+engrailed+in+an+array+of+identified+sensory+neurons%3A+comparison+with+position%2C+axonal+arborization%2C+and+synaptic+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Expression of engrailed in an array of identified sensory neurons: comparison with position, axonal arborization, and synaptic connectivity.</a> J. Neurobiol. 28, 493-505 (1995).</li>
<li>Booth, D., Marie, B., Domenici, P., Blagburn, J. M., Bacon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+behavior%3A+engrailed+knock-out+changes+cockroach+escape+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of behavior: engrailed knock-out changes cockroach escape trajectories.</a> J. Neurosci. 29, 7181-7190 (2009).</li>
<li>Schrader, S., Horseman, G., Cokl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+sensitivity+of+wind-sensitive+giant+interneurons+in+the+cave+cricket+Troglophilus+neglectus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Directional sensitivity of wind-sensitive giant interneurons in the cave cricket Troglophilus neglectus.</a> J. Exp. Zool. 292, 73-81 (2002).</li>
<li>Libersat, F., Goldstein, R. S., Camhi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsynaptic+regulation+of+sensory+activity+during+movement+in+cockroaches%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nonsynaptic regulation of sensory activity during movement in cockroaches.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 8150-8154 (1987).</li>
<li>Stern, M., Ediger, V. L., Gibbon, C. R., Blagburn, J. M., Bacon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+cercal+filiform+hair+sensory+neurons+in+the+first-instar+cockroach+restores+escape+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Regeneration of cercal filiform hair sensory neurons in the first-instar cockroach restores escape behavior.</a> J. Neurobiol. 33, 439-458 (1997).</li>
<li>Blagburn, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+specificity+in+the+first+instar+cockroach%3A+patterns+of+monosynaptic+input+from+filiform+hair+afferents+to+giant+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Synaptic specificity in the first instar cockroach: patterns of monosynaptic input from filiform hair afferents to giant interneurons.</a> J. Comp. Physiol A. 166, 133-142 (1989).</li>
<li>Watanabe, H., Ai, H., Yokohari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+activity+patterns+of+odor-induced+synchronized+potentials+revealed+by+voltage-sensitive+dye+imaging+and+intracellular+recording+in+the+antennal+lobe+of+the+cockroach%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Sys.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal activity patterns of odor-induced synchronized potentials revealed by voltage-sensitive dye imaging and intracellular recording in the antennal lobe of the cockroach.</a> Front. Sys. Neurosci. (6), 55(2012).</li>
<li>Nishino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+and+olfactory+input+segregation+in+the+mushroom+body+calyces+in+a+basal+neopteran%2C+the+American+cockroach%5BTitle%5D)+AND+%22Arthropod+Struct.+Dev%22%5BJournal%5D)">Visual and olfactory input segregation in the mushroom body calyces in a basal neopteran, the American cockroach.</a> Arthropod Struct. Dev. 41, 3-16 (2012).</li>
<li>Elia, A. J., Gardner, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+effects+of+DDT+on+the+behavior+and+central+nervous+system+activity+in+Periplaneta+americana%5BTitle%5D)+AND+%22Pestic.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Long-term effects of DDT on the behavior and central nervous system activity in Periplaneta americana.</a> Pestic. Biochem. Physiol. 21, 326-335 (1984).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów.

Jednym z powodów zaprezentowania technik tego klasycznego preparatu jest to, że układ cerci był i nadal jest aktywnym obszarem badań nad rozwiązywaniem problemów związanych z rozwojem obwodów neuronalnych, a także kwestiami dotyczącymi naprawy i regeneracji synaps 26-31. Każda metoda wywoływania aktywności w brzusznym rdzeniu nerwowym karalucha może być wykorzystana do zbadania wpływu środków farmakologicznych lub insektycydów na funkcjonowanie układu nerwowego. Eksperymenty te są przeprowadzane po prostu przez rozpuszczenie neuroaktywnych substancji chemicznych w soli fizjologicznej. Po wymianie tego roztworu na normalne podłoże do kąpieli, można zaobserwować zmiany w aktywności wywołanej lub spontanicznej podczas rejestracji z łączników lub nerwu ruchowego, aby uzyskać spójny odczyt wpływu substancji chemicznej na czynność OUN.
Jak we wszystkich eksperymentach neurofizjologicznych, częstym problemem jest szum elektryczny. Prawdopodobnie największym czynnikiem wpływającym na jakość sygnału dla tych preparatów jest uszczelnienie elektrody ssącej na tkance nerwowej. Idealne jest szczelne uszczelnienie, które nie wciąga całkowicie nerwu szyjki macicy lub łącznika. Nagrania mogą być również wykonywane za pomocą podwójnych elektrod hakowych umieszczonych pod rdzeniem nerwowym i izolujących VNC mieszaniną oleju mineralnego i wazeliny. Mieszaninę można załadować do strzykawki i wydalić wokół rdzenia nerwowego32. Również dokładna sekcja jest tutaj tak samo ważna, jak w przypadku każdego preparatu na OUN. Niektórym może być łatwiej uzyskać dostęp do OUN poprzez wypreparowanie naskórka grzbietowego. Chociaż zmniejsza to możliwość uszkodzenia brzusznego rdzenia nerwowego, usunięcie wszystkich wnętrzności przy użyciu tego podejścia może być trudniejsze.
Nie jest to tutaj opisane, ale preparat ten jest podatny na zapis wewnątrzkomórkowy w gigantycznych interneuronach 32,33. Cały rdzeń nerwowy można również usunąć, aby pomieścić jednocześnie kilka elektrod rejestrujących i stymulujących. W rzeczywistości eksploracja płata czułkowego, ciała grzyba i innych przednich struktur OUN jest nadal w toku34-35. Podczas gdy ośrodkowy układ nerwowy karalucha nadal rzuca światło na nowoczesne badania neurobiologiczne, ten konkretny preparat jest na tyle prosty, że można go stosować w licencjackich laboratoriach akademickich.

Istnieje ponad 4 000 gatunków karaluchów, ale tylko około 30 to szkodniki domowe. Być może najbardziej rozpoznawalny jest błędnie nazwany amerykański karaluch Periplaneta americana, który pochodzi z Afryki, a obecnie występuje prawie wszędzie na planecie. Oprócz dużej prędkościbiegu1 i unikania, w tropikach P. americana jest zdolny do lotu2,3.
Dominującymi cechami ośrodkowego układu nerwowego (OUN) karalucha są jego segmentacja i decentralizacja procesów kontroli4,5. Zwoje mózgu, klatki piersiowej i jamy brzusznej są połączone ze sobą sparowanymi łącznikami międzyzwojowymi, tworząc brzuszny rdzeń nerwowy (VNC).
Zwoje w każdym segmencie są centrami integrującymi. Składają się one z zewnętrznego, korowego obszaru zawierającego komórki odpowiedzialne za barierę przepuszczalności krew-mózg tuż pod nimi oraz somatów neuronów pochodzących z tego zwoju. Te somaty mogą należeć do interneuronów, neuronów modulacyjnych lub neuronów ruchowych. Dostarczają aksony, które pozostają w zwoju pochodzenia (interneuron lokalny) lub aksony, które wystają między zwojami OUN (interneurony międzyzwojowe) lub kończą się na komórkach mięśni obwodowych (neurony ruchowe). Większość somatów jest umieszczona brzusznie lub brzusznie bocznie w korze zwojowej5. Sparowane, międzyzwojowe łączniki zawierają tylko aksony i nie zawierają ciał komórek nerwowych.
Neuropil zwoju zawiera komórki glejowe (neuroglej), drogi aksonowe, wiązki aksonów i dendryty (neuryty) neuronów. Neuropil jest pozbawiony ciał komórek nerwowych. Jest to obszar w zwoju, w którym zachodzi bezpośrednia komunikacja synaptyczna między komórkami nerwowymi i integracja danych wejściowych.
Zdolność amerykańskiego karalucha P. americana do wykrywania i nagłego reagowania na zbliżającego się drapieżnika (stopa, ręka itp.) została przypisana obwodowi odruchowemu, który składa się z cerci i gigantycznego systemu włókien6,7. Cerci to para przypominających rogi, wrażliwych na wiatr struktur znajdujących się na końcu brzucha (ryc. 1). U P. americana brzuszna powierzchnia każdego cercusa zawiera około 200 nitkowatych (nitkowatych) włosów, które są zorganizowane w 14 kolumn. Dziewięć z tych kolumn można konsekwentnie zidentyfikować u różnych zwierząt zgodnie z właściwościami odpowiedzi powiązanej komórki receptorowej i aksonu. Każdy włos znajduje się w gnieździe, który pozwala mu najłatwiej zginać się w jednej płaszczyźnie, która jest specyficzna dla kolumny. Ruch włosa w jednym kierunku wzdłuż jego płaszczyzny indukuje depolaryzację w komórce receptorowej i wybuch potencjałów czynnościowych (AP) w neuronze czuciowym. Ruch w przeciwnym kierunku hamuje wszelkie trwające spontaniczne AP8. Preferowana płaszczyzna ugięcia i kierunkowość odpowiedzi jest inna w każdej kolumnie. W ten sposób nitkowate kompleksy włos-receptor są odpowiedzialne nie tylko za wykrywanie ruchu powietrza, ale także za "kodowanie" w postaci AP kierunku, z którego pochodzi prąd powietrza. Przetwarzanie tych informacji przez OUN skutkuje "odpowiednią" reakcją ucieczki6,7. Ta funkcjonalna, kolumnowa specyfika włosków czuciowych jest zachowana u różnych zwierząt.
Komórka receptorowa każdego włosa nitkowatego jest odpowiedzialna za przekształcenie mechanicznego odchylenia włosa w zdarzenie nerwowe (skutkujące wybuchem lub zahamowaniem AP w aksonie9 komórki receptorowej. AP przemieszczają się do końcowego zwoju brzusznego (A6) przez nerw szyjny XI, gdzie łączą się z gigantycznymi aksonami brzusznego rdzenia nerwowego (VNC). Uważa się, że gigantyczne aksony są odpowiedzialne za transmisję, a następnie pobudzenie neuronów ruchowych, co skutkuje zachowaniem ucieczki6,10,11.
Opóźnienie behawioralne reakcji ucieczki P. americana jest jednym z najkrótszych spośród wszystkich zwierząt7. Latencja behawioralna to czas między nadejściem bodźca do mechanoreceptora a zainicjowaniem reakcji ucieczki. W eksperymentach wykorzystujących kinematografię z dużą prędkością do zarejestrowania próby ucieczki przed atakującą ropuchą, zaobserwowano, że karaluch zaczyna odwracać się od ropuchy w ciągu około 40 ms (czas od początku wyprostowania języka do ruchu karalucha7,12. Korzystając z kontrolowanych podmuchów wiatru, opóźnienie behawioralne można zmniejszyć do 11 ms. Inne eksperymenty wykazały, że minimalna prędkość podmuchu wiatru wynosząca 12 mm/ms (przy przyspieszeniu 600 mm/ms2) może wywołać reakcję ucieczki, podczas gdy nawet niższe prędkości (3 mm/s) powodowały, że wolno chodzące karaluchy przestawały się poruszać.
Silna korelacja, która zazwyczaj istnieje między gigantycznymi systemami światłowodowymi a zachowaniem ucieczki, została dobrze udokumentowana13,14. W przypadkach, gdy dana komórka jest niezbędna i wystarczająca do wywołania określonego zachowania, komórka jest określana jako neuron dowodzenia15,16. Gigantyczne interneurony (GI) w obwodzie ucieczki wiatru P. americana nie są niezbędne dla tego odruchu. Zwierzęta, które eksperymentalnie uległy ablacji GI, nadal wykazują zachowanie ucieczki, dlatego te GI nie są uważane za neurony dowodzenia17,18. Przecięcie łączników szyjki macicy, które są rostralne z obwodem sensomotorycznym, również wpływa na zachowanie, co wskazuje, że zstępujący sygnał z mózgu ma wpływ na kierunek ucieczki19. Te aspekty precyzyjnej kontroli i redundancji mają zasadnicze znaczenie dla przetrwania organizmu i są uzupełniane przez modulację neurochemiczną za pomocą amin biogennych20.
Preparat do badania rdzenia nerwowego P. americana był eleganckim modelem dla neuroetologów przez wiele ostatnich dekad, począwszy od pionierskiej pracy Roedera21. Pozwala uczniom rejestrować, wyświetlać i analizować pierwotną aktywność sensoryczną i wynikające z niej reakcje gigantycznych interneuronów na ich dane wejściowe22,23,24. Oprócz przekazania idei, że możliwe do zidentyfikowania obwody neuronalne leżą u podstaw reakcji behawioralnych na środowisko, ćwiczenia te powinny zaszczepić uznanie dla biologicznego wkładu tego powszechnego szkodnika domowego.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Odczynnik&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>zestaw silikonowy 182</td><td>zestaw elastomeru silikonowego 182</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;strong&gt;S7653&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO (histochemia i patomorfologia)&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>Aby skorygować pH</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>W celu dostosowania pH</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Nazwa materiału&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Narzędzia do sekcji</td><td>World Precision Instruments</td><td>asortyment</td><td></td></tr><tr><td>Szpilki entomologiczne</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>26001-60</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereotypowy</td><td>World Precision Instruments</td><td>PZMIII-BS</td><td></td></tr><tr><td>Elektrody szklane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS7095B5X</td><td>Opakowanie 200 sztuk, elektrody ssące</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>MD4-M3-R</td><td>Można przymocować do podstawy lub do pręta metalowego</td></tr><tr><td>Drut srebrny (10/1,000 cala)</td><td>A-M Systems</td><td>782500</td><td></td></tr><tr><td>Komputer</td><td>dowolna firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz różnicowy AC/DC</td><td>A-M Systems</td><td>Model 3000</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 26T</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td>27T</td><td></td></tr><tr><td>Głowica pomiarowa</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td></td><td>W zestawie znajduje się wzmacniacz AC/DC</td></tr><tr><td>LabChart7</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przewody elektryczne</td><td>dowolna firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia szklane</td><td>stwórz siebie</td><td></td><td>Do manipulacji nerwami</td></tr><tr><td>Kable i złącza</td><td>dowolna firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety z gruszkami</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7</td><td>Opakowanie 500 sztuk</td></tr><tr><td>Zlewki</td><td>jakakolwiek firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wosk lub glina modelarska</td><td>jakakolwiek firma lub sklepy lokalne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stymulator</td><td>Grass Instruments</td><td>SD9 lub S88</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa końcówka do elektrody ssącej</td><td>lokalny sklep z artykułami budowlanymi (marka Watt's)</td><td>&amp;frac14; cal średnicy zewnętrznej x 0,170 cala średnicy wewnętrznej</td><td>Pokrój na małe kawałki. Wyciągnij nad płomieniem i przytnij końcówkę do odpowiedniej wielkości.</td></tr></tbody></table>

zapis obwodu neuronalnego z nienaruszonego układu nerwowego karalucha

Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

Preparat brzusznego rdzenia nerwowego karalucha to łatwy do wykonania system do eksperymentów neuroetologicznych, modelowania sieci neuronowych i testowania fizjologicznych efektów insektycydów. W tym artykule opisano zakres modalności sensorycznych karaluchów, które można wykorzystać do określenia, w jaki sposób układ nerwowy owadów reaguje na zakłócenia środowiskowe. Nacisk kładziony jest tutaj na zachowanie ucieczki, w którym pośredniczy transmisja cerci do gigantycznych włókien w Periplaneta americana. To przygotowanie in situ wymaga jedynie umiarkowanych umiejętności preparacyjnych i wiedzy elektrofizjologicznej, aby wygenerować powtarzalne zapisy aktywności neuronalnej. Peptydy lub inne odczynniki chemiczne można następnie nakładać bezpośrednio na układ nerwowy w roztworze z solą fizjologiczną. Insektycydy mogą być również podawane przed preparacją, a obwód ucieczki może służyć jako wskaźnik stanu pobudliwości ośrodkowego układu nerwowego. W tym kontekście opisane tu testy byłyby również przydatne dla badaczy zainteresowanych regeneracją kończyn i ewolucją rozwoju układu nerwowego, dla których P. americana jest uznanym organizmem modelowym.

Stymulacja włosków na cerkach podmuchem powietrza wywołuje wyładowania pierwotnych neuronów sensorycznych, które można rejestrować za pomocą zewnętrznych elektrod ssących przymocowanych albo do łączników między zwojami brzusznymi, albo bezpośrednio do nerwu cerkalnego (Rycina 8). Amplitudy impulsów rejestrowanych z obu obszarów są rzędu od kilku mikrowoltów do miliwoltów. Ze względu na integrację sensoryczną w zwoju liczba impulsów obserwowanych w złożonym potencjale czynnościowym lub jako pojedyncze impulsy rejestrowane z nerwu cerkalnego jest znacznie większa niż w rejestracjach z łączników. Należy jednak zauważyć, że w zapisie z łącznika występuje znacznie mniej szumów ze względu na szczelniejsze przyleganie elektrody do tkanki nerwowej.
Poprzez dmuchanie powietrzem w cerki można zaobserwować duże potencjały czynnościowe w łącznościach (Rysunek 8A). Stosując tę metodę stymulacji, rejestracje między A3 a A4 typowo wykazują duży potencjał charakterystyczny dla gigantycznych interneuronów. Rejestracja z nerwu cerkalnego podczas fizycznego pocierania cerki pęsetą wywołała silną serię aktywności (Rysunek 8B1). W innym pomiarze 2 dmuchnięcia powietrzem wywołały szybką odpowiedź w postaci serii impulsów w nerwie cerkalnym (Rysunek 8B2). Podczas stymulacji elektrycznej nerwu cerkalnego za pomocą elektrody ssącej i rejestracji w łączności między A3 a A4 można zaobserwować próg stymulacji niezbędny do wywołania odpowiedzi (Rysunek 8C1). Stymulacja elektryczna nerwu cerkalnego wyraźnie wywołuje odpowiedź w łącznościach, którą można ilościowo określić na potrzeby badań manipulacyjnych z użyciem czynników farmakologicznych lub zmian w lokalnym otoczeniu, takich jak temperatura (Rysunek 8C2).
<img alt="Schemat anatomiczny karaczana pokazujący cerki, z zaznaczonymi segmentami istotnymi dla badań biologicznych." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Periplaneta americana z nienaruszonymi cerkami.
<img alt="Anatomia homara ze szczegółami układu pokarmowego; widoki mikroskopowe podkreślające struktury wewnętrzne." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Widok brzuszny sznura nerwowego karalucha po usunięciu kutykuli brzusznej (A). Powiększony widok segmentu zaznaczonego strzałkami przedstawiono w (B). W (C) łączniki zostały rozdzielone między A4 i A3 za pomocą szklanej sondy. 6ty zwoj abdominalny pokazano w (D), z dwoma nerwami cerkalnymi wychodzącymi z końca ogonowego.
<img alt="Schemat układu nerwowego owada; elementy obejmują zwoje piersiowe, zwoje brzuszne, nerw cerkalny." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Schematyczny widok brzuszny sznura nerwowego karalucha.
<img alt="Disekcja owada, preparat przypięty do badania anatomicznego, badania biologiczne, analiza okazu." src="/files/ftp_upload/50584/50584fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Cerki są skierowane do góry, poza kąpiel solną. Otwarty odwłok można zalać solą fizjologiczną (A), przy czym końcowy odcinek ciała karaczana jest uniesiony za pomocą małego, klinowatego kawałka elastomeru silikonowego, aby utrzymać cerki poza kąpielą (B).
<img alt="Obraz mikroskopowy skrzeli skorupiaka przedstawiający strukturę filamentów; badanie układu oddechowego." src="/files/ftp_upload/50584/50584fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. 6ty zwoj brzuszny wraz z nerwem cerkalnym (obrysowany strzałkami).
<img alt="Ustawienie eksperymentu neuronaukowego w klatce Faradaya; obejmuje mikroskop, wzmacniacz i elektrody." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Konfiguracja sprzętu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50584/50584fig6large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.
<img alt="Eksperyment elektrofizjologiczny: schemat elektrod rejestrujących i stymulujących na włóknie nerwowym owada." src="/files/ftp_upload/50584/50584fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7. Ustawienie elektrod stymulujących i rejestrujących.
<img alt="Analiza przebiegów elektrofizjologicznych; wykres przedstawiający sygnały napięcia w czasie, skale 1 mV i 1 s." fo:content-width="5.75in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8. Rejestracje neuronalne z łączników i nerwu cerkalnego przy różnych procedurach stymulacji. Rejestracja za pomocą elektrody ssącej z łączników między A3 i A4 podczas podawania podmuchów powietrza do cerk (A). Rejestracja z pierwotnych neuronów cerkalnych za pomocą elektrody ssącej podczas mechanicznego pocierania (B1) lub podawania podmuchów powietrza (B2) skutkuje gwałtownymi serii aktywności w nerwie cerkalnym. Elektryczna stymulacja nerwu cerkalnego wywołuje odpowiedzi w łącznikach (C1). Zwróć uwagę na stopniowy wzrost intensywności stymulacji (strzałki wskazują amplitudę artefaktu stymulującego) oraz intensywność następujących po niej odpowiedzi wywołanych. Elektryczna stymulacja nerwu cerkalnego stanowi relatywnie bardziej kontrolowany sposób stymulacji nerwu cerkalnego, zapewniając powtarzalność stymulacji w celu ilościowego określenia odpowiedzi (C2).

Ten artykuł opisuje sekcję brzusznego rdzenia nerwowego karalucha oraz pozakomórkowe nagrania z nerwu szyjnego i łączników. Reakcje wywołane są generowane przez elektryczną stymulację nerwu szyjnego lub bezpośrednią mechaniczną stymulację szyjki macicy.

Zapis obwodu neuronalnego z nienaruszonego układu nerwowego karalucha

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

Technika ta pokazuje, w jaki sposób organizm wykrywa swoje środowisko za pomocą mechano-sensorycznych bodźców oraz jak informacja jest integrowana i przekształcana w wyższych ośrodkach OUN poprzez odsłonięcie brzusznego rdzenia nerwowego i nerwów okrężnych. Najpierw rejestruje się z łączników w brzusznym rdzeniu nerwowym, co pokazuje rodzaj sygnałów przekazywanych przez OUN. Następnie rejestruje się z pierwotnych neuronów czuciowych, aby porównać aktywność neuronów pierwotnych z aktywnością w łącznikach.Wyniki pokazują, w jaki sposób ruch cienkich włosków pod wpływem wibracji powietrza wiąże sygnały elektryczne z OUN i jak te sygnały są przetwarzane. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat integracji aktywności neuronów czuciowych i karalucha lub może być zastosowana do innych obwodów motorycznych lub innych organizmów modelowych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ preparacja zwierzęcia może być nieco trudna, aby wypreparować zwierzę w odpowiedni sposób, aby włosy czuciowe były suche podczas nagrywania z pierwotnego nerwu czuciowego.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ jest trudna do nauczenia, ponieważ łatwo jest uszkodzić pęczek nerwowy. Wybierz samca karalucha ze zbiornika, który ma mocne około, ostatnie segmenty samca są wąskie i nie mają jajników i masy jajowej, w przeciwieństwie do samicy. Samce P Americana mają również parę krótkich oczu między krążkami, nie obserwowanych u samic, odciętych skrzydła, nogi i głowę.Następnie przypnij ciało brzuszną stroną do naczynia wyłożonego elastomerem silikonowym za pomocą kleszczy. Podnieś płytki brzuszne i odetnij je cienkimi nożyczkami, zaczynając od tylnego końca i pracując do przodu Zawsze utrzymuj narządy wewnętrzne wilgotne za pomocą wyżymaczek, starając się, aby były suche. Odbywa się to za pomocą wosku lub gumy do podniesienia brzucha.Jeśli Cirque ulegnie zamoczeniu, osusz je kawałkiem bibuły. Następnie odsuń na bok narządy wewnętrzne i istotę białą. VNC powinien być teraz widoczny między błyszczącą tchawicą E.It biegnie wzdłuż brzucha.Może być konieczne dostosowanie oświetlenia, aby zobaczyć VNC. Nie dotykaj VNC kleszczami ani szpilkami do owadów. Zamiast tego manipuluj nim za pomocą szklanych sond.Usuń układ E tchawicy zwierzęcia ze sznura nerwowego tak dobrze, jak to możliwe, za pomocą kleszczy z parą cienkich szklanych igieł. Bardzo ostrożnie podziel łączniki VNC wzdłużnie między kołyską A sześć i pięć lub A pięć i cztery zwoje. Siri i brzuch wychodzą z kąpieli solankowej.Użyj skróconych szpilek do owadów i wosku lub klina z elastomeru silikonowego. Zachowaj szczególną ostrożność w ostatnim segmencie brzucha, aby uniknąć uszkodzenia nerwów kołowych, które wystają do zwoju. Wypreparowany mikroskop preparacyjny i aparatura rejestrująca powinny być umieszczone w klatce Faradaya, aby blokować zewnętrzne pola elektryczne, które mogłyby zastąpić sygnały z neuronów.Ustaw mikroskop tak, aby wychodził na stolik. Następnie dostosuj położenie wiązki oświetlacza o dużej intensywności. Aby jak najlepiej zobrazować przygotowanie, należy podłączyć wzmacniacz różnicowy AC CDC do zintegrowanej jednostki rejestrującej dane.Stopień główny trzymający mikroelektrodę powinien być podłączony do amplifier. Aby ustabilizować nagrania. Zmielić brzuch srebrnym drutem pokrytym chlorkiem.Powodem srebrnego przewodu uziemiającego jest to, że roztwór wewnątrz jamy ciała traci kontakt z płynem do kąpieli w naczyniu. Wtedy roztwór, który jest związany z elektrodą rejestrującą, pozostaje uziemiony. Następnie ustaw częstotliwość nagrywania na cztery kiloherce.Następnie uruchom skalę napięcia na ścieżce przy 500 miliwoltach. Dostosuj to w razie potrzeby i ustaw oprogramowanie tak, aby działało w trybie ciągłym lub oscyloskopowym w zależności od przygotowania. Wytnij jeden z łączników VNC blisko piątki.Następnie umieść odcięty koniec przymocowany do szóstki w elektrodzie ssącej wstępnie wypełnionej roztworem pierścienia. Za pomocą suchej pipety wdmuchnij powietrze na włosy znajdujące się na każdym cyrku. Sprawdź, czy stymulacja włosów na cyrku ipsilateralnie do zarejestrowanej tkanki łącznej daje inną odpowiedź niż przeciwległa.Zwróć uwagę na amplitudę odpowiedzi i częstotliwość skoków. Następnie przesuń elektrodę ssącą do okrągłego nerwu w celu nagrywania. Jeśli dopasowanie nie jest dobre, zmień końcówkę elektrody na mniejszą otwór.Następnie przetnij nerw koła blisko szóstki i zassaj nerw prowadzący do cyrku. Powinno to skutkować spontanicznymi potencjałami czynnościowymi. Teraz wdmuchnij powietrze w cyrk i zanotuj odpowiedzi.Przełącz oprogramowanie nagrywające w tryb przemiatania, aby rejestrować ślady za każdym razem, gdy uruchamiany jest bodziec. Ślady te powinny wynosić od jednej do 500 milisekund. Podłącz elektrodę stymulującą do wyjścia stymulatora i podłącz wyjście wyzwalacza BNC ze stymulatora do wejścia wyzwalacza w jednostce nagrywającej.Teraz pewne parametry stymulacji powinny wywołać reakcję, dostosować napięcie stymulujące, aby uzyskać sygnał nieco powyżej progu i być w stanie uzyskać maksymalną odpowiedź. Nie ma powodu, aby przechodzić na napięcia znacznie wyższe niż maksymalny próg rekrutacji. Ponieważ wysokie napięcie może być szkodliwe dla nerwu, przetnij nerw kołowy tak dystalnie, jak to możliwe, aby długi korzeń nerwowy mógł zostać wciągnięty w stymulującą drogę elektrody ssącej.Teraz można użyć łącznika między sześcioma i pięcioma zwojami lub w bardziej przednim segmencie. Wciągnij sól fizjologiczną do elektrody ssącej, a następnie wciągnij nacięty łącznik do elektrody. Upewnij się, że elektroda stymulująca jest uziemiona w soli fizjologicznej do kąpieli.Idealnie, elektroda rejestrująca powinna znajdować się w jamie brzusznej w pobliżu trójki. Teraz dostarczaj serię pojedynczych bodźców o rosnącym napięciu do momentu, gdy na ekranie pojawi się złożony potencjał czynnościowy. Zwróć uwagę na minimalne napięcie stymulujące i czas trwania, aby zrekrutować odpowiedź.Zacznij od niskiego poziomu i zwiększaj intensywność, aż zaobserwuje się odpowiedź synaptyczną w łącznikach. Najpierw pojawi się duży kolec i zewnątrzkomórkowy potencjał czynnościowy z gigantycznych aksonów, a następnie inne mniejsze potencjały czynnościowe można również zaobserwować poprzez zaciągnięcie się powietrzem w cci. Zaobserwowano duże skoki w łącznikach przy użyciu tego stymulującego paradygmatu.Nagrania z łączników między trójką a czwórką zazwyczaj wykazywały duży skok charakterystyczny dla gigantycznych neuronów międzyneuronowych nagrywających z nerwu kołowego, podczas gdy fizyczne pocieranie Siri pęsetą powodowało silny wybuch aktywności w innym nagraniu, dwa zaciągnięcia powietrza, z których każdy powodował szybką reakcję pękania w nerwie kołowym, gdy elektrycznie stymulował nerw kołowy za pomocą elektrody ssącej i nagrywał w łączniku między trzema i Zarejestrowano czwórkę, próg stymulacji do wywołanych reakcji. Elektryczna stymulacja nerwu kołowego wyraźnie wywołuje reakcję w łącznikach, którą można określić ilościowo do badań manipulacyjnych ze środkami farmakologicznymi lub z lokalnymi parametrami środowiskowymi Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu około godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, aby nie szczypać nerwów pęsetą ani nie ciągnąć nerwu zbyt mocno elektrodą ssącą.Mam nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu dobrze rozumiesz, jak przeprowadzić sekcję układu nerwowego karalucha i zebrać sensoryczne nagrania zewnątrzkomórkowe.

neural-circuit-recording-from-an-intact-cockroach-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Rejestrowanie obwodów nerwowych z nietkniętego układu nerwowego karalucha

W niniejszym filmie zaprezentowano procedurę izolacji całych mózgów dorosłych muszek Drosophila w celu przygotowania do rejestracji z pojedynczych neuronów przy użyciu standardowej techniki whole-cell. Materiał zawiera obrazy komórek i neuronów znakowanych GFP, zarejestrowane podczas pomiarów.

Rejestracja z całej komórki z mózgu dorosłej muchy Drosophila

Nieinwazyjne pomiary wzorców aktywności neuronalnej u zwierząt zachowujących swobodną aktywność uzyskuje się poprzez połączenie rejestracji neurofizjologicznych z szybką wideografią.

Rejestracja aktywacji obwodów neuronalnych u zwierząt w warunkach swobodnego zachowania

Rejestracje elektrofizjologiczne z embrionów Drosophila umożliwiają analizę właściwości elektrycznych rozwijających się mięśni i neuronów, a także charakterystykę funkcjonalnej synaptogenezy w glutaminergicznych złączach neuromięśniowych oraz w centralnych synapsach cholinergicznych i GABAergicznych.

Rejestracja elektrofizjologiczna w zarodku Drosophila

Muszka owocówka, Drosophila melanogaster, wysuwa swój trąbek w celu żerowania w odpowiedzi na bodziec cukrowy działający na trąbek lub tarsus. Połączyłem obserwacje reakcji wysuwania trąbka (PER) z techniką obrazowania wapnia, co pozwala nam monitorować aktywność neuronów w mózgu równocześnie z obserwacją behawioralną.

Jednoczesna rejestracja sygnałów wapniowych z zidentyfikowanych neuronów i zachowań żerowania Drosophila melanogaster

Wideo demonstruje zewnątrzkomórkowy zapis aktywności neuronalnej z ośrodkowego układu nerwowego (OUN) larw Drosophila. Przecięty OUN jest umieszczany w komorze rejestracyjnej, a aktywność elektryczna z nerwu zstępującego jest rejestrowana w celu ustalenia podstawowej częstotliwości wypalania. Następnie wprowadza się czynnik testowy i rejestruje się zmianę częstotliwości wypalania w celu określenia działania pobudzającego lub hamującego czynnika.

Zewnątrzkomórkowy zapis aktywności elektrycznej w ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila

Pokazujemy różne warianty techniki wewnątrzkomórkowego zapisu wielojednostkowego, aby scharakteryzować reakcje wywołane zapachem w pierwszych trzech etapach szlaku węchowego bezkręgowców. Techniki te można łatwo zaadaptować do badania aktywności zespołu również w innych systemach neuronowych.

Wielojednostkowe metody rejestracji w celu scharakteryzowania aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy (Schistocerca americana)

Wcześniej opracowaliśmy technikę wszczepiania drutów tetrodowych do centralnego kompleksu mózgów karaluchów, która pozwala nam monitorować aktywność w poszczególnych jednostkach karaluchów na uwięzi. Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną wersję tej techniki, która pozwala nam również rejestrować aktywność mózgu u swobodnie poruszających się owadów.

Zewnątrzkomórkowy zapis tetrody drutowej w mózgu swobodnie chodzących owadów

U pszczół miodnych ustalono jednoczesne zewnątrzkomórkowe długoterminowe zapisy z dwóch różnych neuropile mózgowych lub dwóch różnych dróg anatomicznych. Nagrania te pozwalają na badanie czasowych aspektów przetwarzania neuronalnego w różnych obszarach mózgu zarówno na poziomie pojedynczego neuronu, jak i na poziomie zespołu u zachowującego się zwierzęcia.

Jednoczesne długoterminowe zapisy na dwóch etapach przetwarzania neuronalnego u zachowujących się pszczół miodnych

Ostre mikroelektrody umożliwiają dokładną elektrofizjologiczną charakterystykę fotoreceptorów i wizualnych interneuronów u żyjących Drosophila. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać tę metodę do rejestrowania wysokiej jakości odpowiedzi napięciowych poszczególnych komórek na kontrolowaną stymulację światłem. Ta metoda jest idealna do badania przetwarzania informacji neuronalnych w oczach złożonych owadów.

Elektrofizjologiczna metoda rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi napięciowych fotoreceptorów i interneuronów Drosophila na bodźce świetlne in vivo

Ten protokół opisuje metodę rejestrowania malejącej aktywności elektrycznej ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster, aby umożliwić ekonomiczne i wygodne testowanie środków farmakologicznych, mutacji genetycznych białek nerwowych i/lub roli niezbadanych ścieżek fizjologicznych.

Elektrofizjologiczny zapis aktywności ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym

Ten protokół przedstawia metodę obrazowania aktywności populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczej komórki u nietransgenicznych gatunków bezkręgowców przy użyciu barwników absorbancyjnych wrażliwych na napięcie i matrycy fotodiodowej. Takie podejście umożliwia szybki przepływ pracy, w którym obrazowanie i analiza mogą być realizowane w ciągu jednego dnia.

Obrazowanie optyczne oparte na fotodiodach do rejestrowania dynamiki sieci z rozdzielczością pojedynczego neuronu u bezkręgowców nietransgenicznych

Poznaj technikę zapisu sygnałów z przewodu brzusznego karalucha przy użyciu stymulacji mechanicznej i elektrycznej. Ta metoda pozwala badać integrację informacji sensorycznej w ośrodkowym układzie nerwowym.

Zapis obwodu neuronalnego z nienaruszonego układu nerwowego karalucha

Przeglądaj więcej filmów