Transformacja bakteryjna: elektroporacja

Transformacja bakteryjna jest procesem występującym w naturze, w którym bakterie pobierają obcy DNA, a następnie go powielają lub klonują. W warunkach laboratoryjnych proces ten można wywołać sztucznie, wykorzystując impulsy elektryczne o wysokim napięciu do tworzenia porów w błonie komórkowej bakterii, przez które może przeniknąć plazmidowy DNA. Ta metoda nazywana jest elektroporacją, a poniższy film zaprezentuje jej zasady, procedurę krok po kroku oraz zastosowania.

Zanim przejdziemy do omówienia elektroporacji bakterii, ważne jest zrozumienie rodzaju DNA wykorzystywanego w tych eksperymentach: plazmidu. Plazmid to mały, kolisty, pozachromosomalny fragment DNA, który pełni rolę wektora, czyli nośnika specyficznej sekwencji DNA.

Niezależnie od tego, czy sekwencja ta jest genem białka fluorescencyjnego z meduzy, czy enzymem z roślin, jest ona wstawiana do plazmidu poprzez region nazywany wielostanowiskową sekwencją klonowania lub MCS. Region ten zawiera specyficzne sekwencje przecinane przez endonukleazy restrykcyjne lub enzymy restrykcyjne. Te same enzymy restrykcyjne mogą zostać użyte do wycięcia interesującej nas sekwencji, tak aby jej końce były komplementarne do nowo przeciętych końców plazmidu.

Plazmidy zawierają również miejsce inicjacji replikacji, w skrócie ORI, które wyznacza punkt, w którym nastąpi replikacja. W przypadku transformacji kluczowe znaczenie ma gen oporności na antybiotyki. Jak wynika z nazwy, gen ten pozwala bakteriom na produkcję enzymu neutralizującego antybiotyk, co umożliwia im przeżycie w pożywkach zawierających antybiotyk.

Elektroporacja wykorzystuje specjalistyczne urządzenie nazywane elektroporatorem. Zazwyczaj komórki umieszcza się w kuwecie do elektroporacji, która posiada elektrody po obu stronach, zapewniające kontakt elektryczny z urządzeniem po jej włożeniu.

Komórki bakteryjne wymieszane z DNA nanosi się do kuwety do elektroporacji, a następnie przykłada pole elektryczne rzędu 1000 do 10 000 V/cm przez kilka milisekund. Powoduje to, że napięcie na błonie osiąga wartość 0,5-1 V, co prawdopodobnie prowadzi do reorganizacji dwuwarstwy fosfolipidowej tworzącej błonę komórkową i powstania porów. W tym stanie plazmidowe DNA przenika przez błonę, a po zakończeniu impulsu dwuwarstwa ulega samonaprawie.

Po pobraniu plazmidu bakterie mogą następnie rosnąć na płytkach z agarem zawierającym antybiotyk.

Po zapoznaniu się z plazmidami i mechanizmem elektroporacji, przyjrzyjmy się sposobowi przeprowadzenia tej procedury.

Komórki, które mogą łatwo pobierać DNA, nazywa się komórkami kompetentnymi. Najczęstszym typem bakterii kompetentnych poddawanych transformacji w badaniach z zakresu biologii molekularnej jest E. coli – prokariotyczne bakterie zasiedlające dolny odcinek jelita grubego. Komórki E. coli przygotowane do elektroporacji określa się mianem komórek elektrokompetentnych.

Podczas pracy z bakteriami należy dbać o to, aby obszar roboczy był maksymalnie czysty.

Praca z bakteriami wymaga również stosowania technik aseptycznych. Zazwyczaj wiąże się to z użyciem palnika Bunsena do sterylizacji narzędzi oraz tworzenia prądu konwekcyjnego, który zapobiega przedostawaniu się zanieczyszczeń z powietrza do strefy roboczej.

Bezpośrednio przed elektroporacją należy ogrzać pożywkę do temperatury pokojowej, doprowadzić płytki z agarem zawierającym antybiotyk do temperatury 37°C oraz schłodzić kuwety do elektroporacji w lodzie.

Następnie rozmrozić w lodzie przemyte komórki elektrokompetentne.

Do komórek bakteryjnych dodać 1-5uL zimnego, wolnego od soli plazmidu o stężeniu 1ng/μL, delikatnie wymieszać, a następnie przenieść mieszaninę do zimnej kuwety. Należy upewnić się, że w roztworze nie ma pęcherzyków powietrza.

Ustawić napięcie i natężenie pola w elektroporatorze zgodnie z parametrami odpowiednimi dla używanych komórek. Tutaj widzimy elektroporator ustawiony na 1700 voltów, co daje natężenie pola wynoszące 17kV/cm.

Wytrzeć do sucha zewnętrzną powierzchnię kuwety i umieścić ją w elektroporatorze. Poddać komórki impulsowi elektrycznemu aż do usłyszenia sygnału dźwiękowego.

Niepowodzenie impulsu powoduje wyładowanie elektryczne, które objawia się widoczną iskrą i słyszalnym trzaskiem. Wyładowanie to, nazywane przeskokiem iskry, może być wynikiem zbyt wysokiego stężenia soli w komórkach kompetentnych lub w DNA.

Sukces transformacji można przewidzieć, obserwując stałą czasową, czyli czas, w jakim napięcie zanika po przyłożeniu impulsu. W obecności soli, gdy roztwór do elektroporacji jest bardzo przewodzący, zanik następuje gwałtownie, co powoduje wyładowanie i w konsekwencji śmierć wielu komórek. Dla bakterii prawidłowe stałe czasowe mieszczą się w przedziale 5-10 milisekund.

Natychmiast po zadanym impulsie wyjąć kuwetę i dodać 1 ml pożywki bezpośrednio do komórek. Pożywkę z zawiesiną komórek umieścić w probówce i inkubować w temperaturze 37°C przez 1 godzinę z wytrząsaniem, aby umożliwić regenerację komórek.

Następnie, stosując technikę aseptyczną, nanieść 20-200uL zawiesiny komórkowej na płytkę z agarem zawierającym antybiotyk. Odwrócić płytki tak, aby agar znajdował się na górze (zapobiega to spływaniu kondensatu na komórki) i inkubować przez noc w temperaturze 37°C.

Bakterie transformowane plazmidem powinny utworzyć kolonie. Należy policzyć kolonie i obliczyć wydajność transformacji, która jest stosunkiem liczby udanych transformantów do całkowitej ilości DNA naniesionej na płytkę.

Agar i pożywki, które zapewniają odżywienie bakterii, powinny być wcześniej przygotowane i wysterylizowane w autoklawie. Przed użyciem należy pozwolić, aby pożywki płynne ostygły do temperatury pokojowej, a agar do 50-55˚C – jest to temperatura, w której można dodać antybiotyk i zalać szalki. Następnie należy pozostawić szalki do ostygnięcia w temperaturze pokojowej w celu ich zestalenia.

Ponieważ bakterie wykorzystywane w transformacji są przechowywane w zamrażarce, muszą one zostać najpierw rozmrożone na lodzie, wyseiane na szalkę z agarem bez antybiotyków, a następnie inkubowane przez noc w 37˚C.

Stosując technikę aseptyczną, należy wybrać kolonię bakteryjną z szalki z agarem i namnożyć ją w większej kulturze 500mL przez noc w 37°C w inkubatorze wytrząsowym.

Podczas wzrostu komórek należy przygotować około litra wody dejonizowanej i sporządzić 10% roztwór glicerolu w wodzie (objętość do objętości). Roztwory należy wysterylizować w autoklawie i schłodzić do 4˚C.

Pomiary absorbancji są wykorzystywane do określenia, czy bakterie znajdują się w środkowej fazie logarytmicznej wzrostu, co oznacza, że będą chętnie pobierać DNA. Po osiągnięciu przez komórki tej fazy należy umieścić je na lodzie i utrzymywać w tej temperaturze przez cały czas trwania procedury.

Następnie należy przemyć komórki, rozdzielając je do dwóch dużych probówek wirówkowych i wirując w 4°C, odlać nadsącz i zawiesić ponownie w zimnych 100mL sterylnej wody dejonizowanej. Krok ten należy powtórzyć co najmniej raz. Celem tego konkretnego etapu jest usunięcie soli, które silnie wpływają na technikę elektroporacji.

Należy przeprowadzić dwa dodatkowe przemycia w 50 ml 10% glicerolu w wodzie, a na koniec zawiesić bakterie w tym samym roztworze.

Do wielu probówek typu Eppendorf należy dodać po 50μL komórek. Komórki te są teraz gotowe do użycia w elektroporacji i powinny być przechowywane w 4˚C. Można je również zamrozić szokowo i przechowywać w -80˚C.

Jak za chwilę zobaczycie, elektroporacja znajduje wiele zastosowań.

Alternatywą dla elektroporacji jest transformacja szokiem termicznym, która polega na poddaniu bakterii działaniu chlorku wapnia oraz wysokiej temperatury w celu wprowadzenia DNA do komórek.

Ogólnie szok termiczny jest łagodniejszy dla bakterii niż elektroporacja i nie wymaga niskiego stężenia soli. Reakcje ligacji, polegające na wstawieniu genu docelowego do plazmidu, mogą być wykorzystane bezpośrednio w transformacji szokiem termicznym. Transformacja szokiem termicznym jest tańsza od elektroporacji i nie wymaga drogiego sprzętu ani kuwet. Z drugiej strony, szok termiczny prowadzi do niższej wydajności transformacji niż elektroporacja i trwa dłużej. Jest on również ograniczony do bakterii, drożdży i protoplastów roślinnych, podczas gdy elektroporację można stosować w komórkach ssaków.

Tutaj widzimy wprowadzanie embrionalnych fibroblastów mysich do kuwety do elektroporacji. Po zakończeniu elektroporacji wydajność transformacji można określić, obserwując stopień, w jakim komórki produkują zielone białko fluorescencyjne kodowane przez plazmid. Transfekcja to termin określający transformację komórek ssaków, która zazwyczaj wymaga niższych natężeń pola niż w przypadku komórek bakteryjnych oraz wyższych stałych czasowych.

Elektroporację można przeprowadzić również u całych zwierząt, takich jak rozwijający się zarodek kurczaka widoczny tutaj. DNA plazmidowe jest wstrzykiwane do mózgu kurczaka, a następnie za pomocą sondy do elektroporacji przykłada się pole elektryczne do tkanki mózgowej. Po jednym lub dwóch dniach neurony produkują zielone i czerwone białka fluorescencyjne – kodowane przez plazmid – co pozwala naukowcom obserwować zmiany strukturalne w rozwijającym się mózgu kurczaka.

Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do transformacji bakteryjnej metodą elektroporacji. W tym filmie przedstawiono plazmid jako najczęściej transformowany typ DNA, omówiono biofizyczny mechanizm leżący u podstaw elektroporacji, zaprezentowano ogólną procedurę przeprowadzania elektroporacji oraz opisano, w jaki sposób elektroporacja może być wykorzystywana w układach ssaków. Dziękujemy za uwagę!