2.7: Przemiana bakteryjna: elektroporacja

Transformacja bakteryjna to naturalnie występujący proces, w którym bakterie połykają obce DNA, a następnie je amplifikują lub klonują. W laboratorium proces ten można indukować sztucznie, wykorzystując impulsy pola elektrycznego o wysokim napięciu do tworzenia porów w błonie komórkowej bakterii, przez które może przejść plazmidowe DNA. Elektroporacja odnosi się do tej metody, a poniższy film pokaże jej zasady, procedurę krok po kroku i zastosowania.

Zanim zaczniemy mówić o elektroporacji bakterii, ważne jest, aby zrozumieć, jaki rodzaj DNA jest używany w tych eksperymentach: plazmid. Plazmid to mały, okrągły, pozachromosomalny fragment DNA, który działa jako wektor, nośnik określonej sekwencji DNA.

Niezależnie od tego, czy ta sekwencja jest genem białka fluorescencyjnego meduzy, czy enzymem roślinnym, jest wprowadzana do plazmidu za pośrednictwem regionu zwanego miejscem wielokrotnego klonowania lub MCS. Region ten zawiera specyficzne sekwencje, które są rozszczepiane przez endonukleazy restrykcyjne lub enzymy restrykcyjne. Te same enzymy restrykcyjne można wykorzystać do wycięcia interesującej Cię sekwencji, tak aby końce były komplementarne z nowo odciętymi końcami plazmidu.

Plazmidy zawierają również początek replikacji, w skrócie ORI, który wskazuje punkt, w którym zostanie zreplikowany. Jeśli chodzi o transformację, gen oporności na antybiotyki ma kluczowe znaczenie. Jak sama nazwa wskazuje, gen ten pozwala bakteriom wytwarzać enzym, który neutralizuje antybiotyk, umożliwiając im przetrwanie w pożywkach zawierających antybiotyki.

Elektroporacja wykorzystuje specjalistyczne urządzenie zwane elektroporatorem. Zazwyczaj ogniwa są umieszczane w kuwecie do elektroporacji, która ma elektrody po każdej stronie, które po włożeniu nawiązują kontakt elektryczny z maszyną.

Komórki bakteryjne zmieszane z DNA są ładowane do kuwety elektroporacyjnej i przez kilka milisekund przykładane jest pole elektryczne o napięciu od 1000 do 10 000 woltów na centymetr. Powoduje to, że napięcie na błonie osiąga 0,5-1 wolta, co uważa się, że prowadzi do przegrupowania dwuwarstwy fospolipidowej, która składa się na błonę komórkową, w taki sposób, że utworzą się pory. W tym stanie plazmidowe DNA przejdzie przez błonę, a po zakończeniu pulsowania dwuwarstwa sama się naprawi

Po pobraniu plazmidu bakterie mogą następnie rosnąć na płytkach agarowych zawierających antybiotyk.

Teraz, gdy dowiedzieliśmy się o plazmidach i mechanizmie elektroporacji. Przyjrzyjmy się, jak przebiega procedura.

Komórki, które mogą łatwo wchłaniać DNA, są określane jako komórki kompetentne. Najczęstszym rodzajem kompetentnych bakterii, które są przekształcane w badaniach biologii molekularnej, jest E. coli, które są bakteriami prokariotycznymi, które zamieszkują dolne jelito. Bakterie E. coli, które są przygotowane do elektroporacji, nazywane są komórkami elektrokompetentnymi.

Za każdym razem, gdy masz do czynienia z bakteriami, upewnij się, że miejsce pracy jest tak czyste, jak to tylko możliwe.

Obchodzenie się z bakteriami wymaga również praktykowania techniki aseptycznej. Zazwyczaj wiąże się to z użyciem palnika Bunsena do sterylizacji narzędzi i wytworzenia prądu konwekcyjnego, który utrzymuje zanieczyszczenia unoszące się w powietrzu z dala od miejsca pracy.

Bezpośrednio przed elektroporacją podgrzej pożywkę do temperatury pokojowej, rozgrzej płytki agarowe zawierające antybiotyk do 37°C i ostudź kuwety do elektroporacji na lodzie.

Następnie umyte elektrokompetentne ogniwa rozmrozić na lodzie.

Dodaj 1-5 μl zimnego plazmidu 1 ng / μl, który nie zawiera soli do komórek bakteryjnych, delikatnie wymieszaj i dodaj mieszaninę do zimnej kuwety. Upewnij się, że nie ma bąbelków.

Ustaw napięcie i natężenie pola elektroporatora na odpowiednie ustawienia dla swoich komórek. Tutaj widzisz elektroporator ustawiony na 1700 woltów i wytwarzający natężenie pola 17 kV/cm.

Wytrzyj zewnętrzną część kuwety do sucha i umieść ją w elektroporatorze. Pulsuj komórkami, aż usłyszysz sygnał dźwiękowy.

Nieudane pulsowanie powoduje wyładowanie elektryczne, które można zaobserwować jako widoczną iskrę i słyszalny trzask. To wyładowanie, określane jako wyładowanie łukowe, może być wynikiem zbyt dużej ilości soli w kompetentnych komórkach lub DNA.

Powodzenie transformacji można przewidzieć, zwracając uwagę na stałą czasową, czyli czas potrzebny do zaniku napięcia po przyłożeniu impulsu. Kiedy sól jest obecna, a roztwór do elektroporacji jest bardzo przewodzący, rozpad zachodzi szybko, powodując wyładowanie, a tym samym zabijając wiele komórek. W przypadku bakterii dobre stałe czasowe mieszczą się w zakresie 5-10 milisekund.

Natychmiast po pulsacji wyjmij kuwetę i dodaj 1 ml pożywki bezpośrednio do komórek. Tę komórkę zawierającą pożywkę umieszcza się w probówce i inkubuje w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, wytrząsając, w celu odzyskania sprawności komórek.

Następnie, stosując technikę aseptyczną, dodaj 20-200 uL komórki do płytki agarowej zawierającej antybiotyk. Odwróć płytki tak, aby agar znalazł się na wierzchu i aby kondensacja nie wpadła do komórek i inkubuj przez noc w temperaturze 37°C.

Bakterie przekształcone za pomocą plazmidu powinny tworzyć kolonie. Policz kolonie i oblicz wydajność transformacji, czyli liczbę udanych transformantów podzieloną przez całkowitą ilość platerowanego DNA.

Agar i pożywka, które stanowią pożywienie dla bakterii, powinny być wstępnie przygotowane i wysterylizowane w autoklawie. Przed użyciem pozwól płynnemu pożywce ostygnąć do temperatury pokojowej i pozwól agarowi ostygnąć do 50-55°C – temperatury, w której można dodać antybiotyk i wlać płytki. Następnie pozwól talerzom ostygnąć do temperatury pokojowej, aby stężały.

Ponieważ bakterie używane w transformacji są przechowywane w zamrażarce, należy je najpierw rozmrozić na lodzie, rozprowadzić na płycie agarowej bez antybiotyków, a następnie hodować przez noc w temperaturze 37°C.

Stosując technikę aseptyczną, wybierz kolonię bakterii z płytki agarowej i hoduj ją w większej kulturze o pojemności 500 ml przez noc w temperaturze 37°C w inkubatorze z wytrząsaniem.

Podczas wzrostu komórek przygotuj około litra wody dejonizowanej i uzupełnij 10% roztworu glicerolu i wody, objętość do objętości. Roztwory należy sterylizować w autoklawie i pozostawić do ostygnięcia w temperaturze 4°C.

Pomiary absorbancji służą do określenia, czy bakterie znajdują się w środkowej fazie wzrostu, co oznacza, że łatwo wchłoną DNA. Gdy komórki osiągną tę fazę, umieść je na lodzie i trzymaj tam przez cały zabieg.

Następnie umyj komórki, rozdzielając je w dwóch dużych probówkach wirówkowych i odwiruj w temperaturze 4°C, odlej supernatant i ponownie zawieś w zimnej 100 ml sterylnej wody dejonizowanej. Powtórz ten krok co najmniej jeszcze raz. Celem tego etapu jest usunięcie soli, która silnie wpłynie na technikę elektroporacji.

Wykonaj dwa dodatkowe płukania w 50 ml 10% glicerolu w wodzie i na koniec ponownie zawieś bakterie w tym samym roztworze.

Dodaj 50 μl komórek do wielu probówek Eppendorfa. Ogniwa te są teraz gotowe do użycia w elektroporacji i powinny być przechowywane w temperaturze 4°C. Można je również błyskawicznie zamrozić i przechowywać w temperaturze -80°C.

Jak zaraz zobaczysz, elektroporacja ma wiele zastosowań.

Alternatywą dla elektroporacji jest przemiana w szok cieplny, która polega na wystawieniu bakterii zarówno na chlorek wapnia, jak i ciepło w celu wprowadzenia DNA do komórek.

Ogólnie rzecz biorąc, szok cieplny jest łagodniejszy dla bakterii niż elektroporacja i nie wymaga niskiej zawartości soli. Reakcje ligacji, czyli te, które polegają na wprowadzeniu docelowego genu do plazmidu, mogą być stosowane bezpośrednio w transformacji szoku cieplnego. Transformacja szoku cieplnego jest tańsza niż elektroporacja i nie opiera się na drogim sprzęcie ani kuwetach. Z drugiej strony, szok cieplny prowadzi do niższej wydajności przemiany niż elektroporacja i trwa dłużej. Ogranicza się również do protoplastów bakteryjnych, drożdżowych i roślinnych, podczas gdy elektroporację można zastosować do komórek ssaków.

Na zdjęciu widać mysie fibroblasty embrionalne ładowane do kuwety do elektroporacji. Po zakończeniu elektroporacji można określić wydajność transformacji, obserwując stopień, w jakim komórki wytwarzają zielone białko fluorescencyjne kodowane przez plazmid. Transfekcja to termin określający transformację komórek ssaków, która zazwyczaj wymaga niższego natężenia pola niż komórki bakteryjne i wyższych stałych czasowych.

Elektroporację można również przeprowadzić u całych zwierząt, takich jak rozwijający się zarodek kurczaka, który widziałeś tutaj. Plazmidowe DNA jest wstrzykiwane do mózgu pisklęcia, a następnie sonda elektroporacyjna jest używana do przyłożenia pola elektrycznego do tkanki mózgowej. Po dniu lub dwóch, zielone i czerwone białka fluorescencyjne - kodowane przez plazmid - są wytwarzane przez neurony, a naukowcy mogą zaobserwować zmiany strukturalne w rozwijającym się mózgu pisklęcia.

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do transformacji bakteryjnej przez elektroporację. Ten film przedstawił plazmid jako najczęściej przekształcany typ DNA, omówił biofizyczny mechanizm uważany za leżący u podstaw elektroporacji, pokazał uogólnioną procedurę prowadzenia elektroporacji i opisał, w jaki sposób elektroporacja może być stosowana w systemie ssaków. Dzięki za oglądanie!