Name: Test Infinium do zastosowań genotypowania SNP na dużą skalę (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 13 min 33 s
Description: Poznaj metodę Infinium do genotypowania SNP na dużą skalę przy użyciu technologii Illumina. Protokół obejmuje amplifikację DNA, hybrydyzację do koralików oraz skanowanie chipów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tej pracy zostało zapewnione przez NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959 i NIH R56 AI063274

<ol><li>Shi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+large-scale+pharmacogenetic+studies+by+high-throughput+mutation+detection+and+genotyping+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies.</a> Clin. Chem. 47 (2), 164-172 (2001).</li>
<li>Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping+by+the+5%27-nuclease+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping by the 5'-nuclease reaction.</a> Methods Mol. Biol. 212, 129-148 (2003).</li>
<li>Seeb, J. E., Pascal, C. E., Ramakrishnan, R., Seeb, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping+by+the+5%27-nuclease+reaction%3A+advances+in+high+throughput+genotyping+with+non-model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping by the 5'-nuclease reaction: advances in high throughput genotyping with non-model organisms.</a> Methods in Mol. Biol. 578, 277-292 (2009).</li>
<li>Bayés, M., Gut, I. G. Overview of Genotyping. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBay%C3%A9s%2C+M+%22Molecular+Analysis+and+Genome+Discovery%22">Molecular Analysis and Genome Discovery</a>. ed, , 2nd, John Wiley & Sons, Ltd. Chichester, UK. 1-23 (2011).</li>
<li>Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Nucleotide+Polymorphisms+for+High-Throughput+Genotyping+of+Anopheles+arabiensis+in+East+and+Southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Single-Nucleotide Polymorphisms for High-Throughput Genotyping of Anopheles arabiensis in East and Southern Africa.</a> J. Med. Entomol. 49 (2), 307-315 (2012).</li>
<li>Liu, Z. SNP Genotyping Platforms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiu%2C+Z+%22Next+generation+sequencing+and+whole+genome+selection+in+aquaculture%22">Next generation sequencing and whole genome selection in aquaculture</a>. , Wiley-Blackwell. 123-132 (2011).</li>
<li>Shen, R., Fan, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+SNP+genotyping+on+universal+bead+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.%2FFundam+and+Mol.+Mech.+of+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">High-throughput SNP genotyping on universal bead arrays.</a> Mutat. Res./Fundam and Mol. Mech. of Mutagenesis. 573 (1), 70-82 (2005).</li>
<li>Ragoussis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+technologies+for+all%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%3A+Technol%22%5BJournal%5D)">Genotyping technologies for all.</a> Drug Discov. Today: Technol. 3 (2), 115-122 (2006).</li>
<li>Wu, C. C., Shete, S., Jo, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Genome+Detection+of+Disease-Associated+Deletions+or+Excess+Homozygosity+in+a+Case-Control+Study+of+Rheumatoid+Arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Whole-Genome Detection of Disease-Associated Deletions or Excess Homozygosity in a Case-Control Study of Rheumatoid Arthritis.</a> Hum. Mol. Genet. , (2012).</li>
<li>Green, E. K., Hamshere, M., Forty, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+bipolar+disorder+susceptibility+alleles+and+identification+of+two+novel+genome-wide+significant+associations+in+a+new+bipolar+disorder+case-control+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Replication of bipolar disorder susceptibility alleles and identification of two novel genome-wide significant associations in a new bipolar disorder case-control sample.</a> Mol. Psychiatry. , (2012).</li>
<li>Shete, S., Hosking, F. J., Robertson, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+identifies+five+susceptibility+loci+for+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study identifies five susceptibility loci for glioma.</a> Nat. Genet. 41 (8), 899-904 (2009).</li>
<li>Inc Illumina. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Infinium+HD+Ultra+User+Guide+11328087+RevB-1%22">Infinium HD Ultra User Guide 11328087 RevB-1</a>. , 15-101 (2009).</li>
<li>Turner, S., Armstrong, L. orenL., Yuki Bradford,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+Control+Procedures+for+Genome+Wide+Association+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Quality Control Procedures for Genome Wide Association Studies.</a> Curr Protoc Hum Genet. , 1-19 (2011).</li>
</ol>

Autorzy tego artykułu nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

Zastosowania genotypowania na dużą skalę wykorzystano do lepszego zrozumienia mechanizmu genetycznego leżącego u podstaw wielu chorób u ludzi. Odkrycie dowolnego znaczącego wariantu poprzez analizę asocjacyjną całego genomu może oznaczyć region kandydujący do dalszych badań. Ponadto dane genotypowe są dobrym narzędziem do kontroli jakości w projektach sekwencjonowania.
Aby zmaksymalizować przepustowość próbki, wiele płytek z próbkami może być amplifikowanych i przechowywanych w stanie rozdrobnionym, ponownie zawieszonym. Osiem płytek może zostać wzmocnionych w ciągu jednego dnia, łącząc pierwsze 24 godziny protokołu dla wielu partii i zapewniając wystarczającą ilość materiału na ~2-8 dni obróbki chipów. Jeśli amplifikowane płytki są wcześniej składowane, a nowe próbki są hybrydyzowane z wiórami natychmiast po rozpoczęciu skanowania w poprzednim przebiegu, przetwarzanie może przebiegać w sposób ciągły bez konieczności robienia przerw w celu dodatkowego przygotowania próbki. W związku z tym, chociaż próbki będą potrzebowały trzech dni, aby przejść pełne testy, dane mogą być generowane codziennie. Zakładając, że codziennie przetwarzane są 24 chipy, 5-dniowy tydzień pracy pozwala na przeprowadzenie ponad 1,000 próbek DNA na 12-próbkowym chipie kulkowym. Jeśli jednak którykolwiek z etapów lub odczynników nie powiedzie się, wiele partii może być zagrożonych niską wydajnością, zanim będzie można zastosować jakąkolwiek korektę. Błędy mogą umknąć uwadze, dopóki tablice nie zostaną przeskanowane lub przeanalizowane; W związku z tym, jeśli przepustowość zostanie zmaksymalizowana, setki próbek na różnych etapach protokołu mogą już zostać poddane tej samej wadliwej obróbce w momencie wykrycia. Ponieważ utraconych odczynników i danych nie można odzyskać, użytkownik musi rozważyć te zagrożenia w stosunku do potrzeby przyspieszenia przepływu pracy.
Oprogramowanie analityczne GenomeStudio jest pierwszą szansą, aby naprawdę ocenić sukces procesu genotypowania. Jeśli wykresy intensywności Norm-R i Norm-Theta są prawidłowo zgrupowane, średnia częstotliwość wywołań (procent wszystkich pomyślnie wpisanych SNP) próbek powinna zbliżyć się do 99%, chociaż wartość ta różni się nieznacznie w zależności od typu tablicy. Dane z dowolnej próby, w której współczynnik połączeń jest niższy niż 85-90%, nie są wiarygodne i należy je odrzucić. Do celów kontroli jakości, wyniki powinny być porównywane z dowolnymi wcześniej znanymi genotypami, gdy tylko jest to możliwe. Jeśli takie dane nie istnieją, celowe powielanie próbek jest użytecznym narzędziem do weryfikacji rozmieszczenia płyt lub tablic. Te zduplikowane pary należy umieścić na oddzielnych chipach, płytach, partiach lub projektach; Ich genotypy sprawdzane są przy porodzie. Podczas gdy specyficzne ograniczenia QC różnią się w zależności od preferencji badacza, powszechne ograniczenia SNP opierają się na powodzeniu połączenia próby, równowadze Hardy'ego-Weinberga lub brakach między przypadkami a kontrolami, podczas gdy wspólne ograniczenia próby opierają się na wskaźnikach połączeń, niespójnościach Mendla lub odniesieniach heterozygotyczności chromosomu X do klinicznych danych dotyczących płci [13].
Jeśli pojawi się jakikolwiek problem, Pulpit Kontrolny, znajdujący się w pakiecie analiz, może zostać przesłany do firmy w celu ustalenia przyczyny. Te kontrole mogą często zawęzić problem do najbardziej prawdopodobnego kroku lub awarii odczynnika. Jeśli w eksperymencie genotypowania Infinium zostaną znalezione jakiekolwiek interesujące SNP, ich wykresy intensywności powinny zostać dwukrotnie sprawdzone w GenomeStudio pod kątem błędów grupowania przed przeprowadzeniem dalszych badań.
Nieudany eksperyment z genotypowaniem Infinium jest prawdopodobnie spowodowany błędem przetwarzania przez człowieka lub niską jakością wejściowego DNA. Kwantyfikacja próbki musi być dokładna i precyzyjna. Aby uzyskać najlepsze wyniki, wszelkie odczynniki dodane do dowolnej próbki lub chipa muszą być dozowane w objętości ustalonej w protokole. Pipety muszą być odpowiednio skalibrowane. Odczynników nie należy uruchamiać po upływie terminu ważności i nie należy ich ponownie zamrażać po rozmrożeniu, z wyjątkiem odczynnika RA1. W celu zminimalizowania ewentualnych błędów barwienia i przedłużania, mieszaninę formamidu/EDTA należy przygotowywać świeżą co miesiąc. Wszystkie odczynniki o temperaturze -20 °C należy przechowywać wyłącznie w zamrażarkach z ręcznym rozmrażaniem. Wszystkie materiały laboratoryjne używane w częściach protokołu do barwienia, przedłużania i mycia należy dokładnie spłukać wodą i łagodnym detergentem natychmiast po nieużyciu. Zbiorniki nawilżające w komorze hyb należy wyszorować szczotką do probówki i łagodnym detergentem. Szkiełka należy myć 10% wybielaczem, zgodnie z instrukcją obsługi, raz w tygodniu.

Typowanie polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) jest kluczową metodą identyfikacji wariantów ryzyka związanych z chorobą. Historycznie rzecz biorąc, zakres eksperymentów genotypowania był ograniczony przez dostępną technologię. Metody genotypowania oparte na elektroforezie żelowej są ograniczone pod względem przepustowości próbki i SNP[1]. Opracowanie tych testów może być często pracochłonne, opierając się na składzie i strukturze regionu otaczającego wariant w celu optymalizacji[1]. Testy genotypowania TaqMan, opracowane przez Life Technologies, mogą szybko i przy minimalnym zaangażowaniu techników badać dużą liczbę próbek[2], ale ograniczenia dotyczące multipleksowania SNP nadal ograniczają całkowitą liczbę genotypów do znacznie poniżej miliona dziennie[3,4]. Platforma iPlex firmy Sequenom może również uruchamiać wiele próbek jednocześnie, ale ponieważ można multipleksować mniej niż sto SNP, przepustowość jest ogólnie porównywalnie niska[5]. Technologia strumienia SNP Beckmana Coultera może teoretycznie wyprodukować ponad trzy miliony genotypów dziennie, ale technologia ta ogranicza zakres projektu do maksymalnie zaledwie czterdziestu ośmiu SNP na reakcję[4,6]. Podczas gdy test GoldenGate może przetwarzać prawie dwieście próbek DNA każdego dnia na setkach lub tysiącach SNP na próbkę, cena za genotyp nie jest konkurencyjna w stosunku do zaawansowanych, ultra-wysokoprzepustowych technik przy typowaniu ponad trzech tysięcy SNP jednocześnie[4,7]. W celu przetwarzania kilku milionów genotypów dziennie, co jest skalą wymaganą w przypadku dużych badań asocjacyjnych całego genomu, testy hybrydyzacji macierzy stały się najbardziej opłacalną opcją na rynku.
Linia tablic hybrydyzacyjnych Affymetrix i linia tablic opartych na Infinium firmy Illumina pozwalają potencjalnie na równoległe typowanie setek próbek na setkach tysięcy lub milionach SNP[4,8]. Te SNP mogą być rozproszone po całym genomie, zlokalizowane w regionach zainteresowań, takich jak egzomy, lub dostosowane do preferencji użytkownika. Zaletą tych macierzy jest nie tylko możliwość dokładnego genotypowania miliona SNP na próbkę jednocześnie, ale także pomiaru zmienności liczby kopii, potencjalnie ujawniając nieprawidłowości chromosomalne. Układy OMNI BeadChip dostosowane do Infinium mają obecnie możliwość genotypowania do prawie pięciu milionów markerów na próbkę, w tym pół miliona niestandardowych loci, na prawie stu próbkach każdego dnia.
Ponieważ większość chorób ma komponent genetyczny, te eksperymenty na dużą skalę mogą być kluczowe w poszukiwaniu genów związanych z chorobą. Genotypowanie o wysokiej przepustowości pozwala na wydajne generowanie genotypów w zestawach próbek wystarczająco dużych, aby przekonująco wykryć asocjację genetyczną przy niższych częstościach alleli mniejszych. Projekty genotypowania całego genomu mogą być wykorzystywane do lokalizowania regionów o statystycznie istotnej częstości występowania alleli kliniczno-kontrolnych lub różnicach w liczbie kopii [9,10,11]. Według National Human Genome Research Institute, badania asocjacyjne całego genomu doprowadziły do 1490 oddzielnych publikacji w okresie od 25 listopada 2008 r. do 25 stycznia 2013 r., wynikających z odkrycia 8283 SNP o wartości p mniejszej niż 1 x 10-5 (patrz http://www.genome.gov/gwastudies/). Badania te, w których badano schorzenia od wzrostu do raka jąder, skorzystały z szerokiego podejścia zapewnionego przez analizę całego genomu. W takich przypadkach całe obszary zainteresowania mogłyby umknąć uwadze, gdyby zakres wpisywania był zbyt restrykcyjny. W związku z tym w przypadku wielkoskalowych analiz asocjacyjnych preferowaną techniką jest technika genotypowania całego genomu.
Istnieją różne wersje testu Infinium, z których każda jest przeznaczona do użycia z określonymi typami tablic. Test InfiniumUltra, omówiony szczegółowo poniżej, jest odpowiedni dla wielu układów z 12 lub 24 próbkami. Często genotypują one ponad sto tysięcy SNP na próbkę DNA i koncentrują się na docelowych regionach, takich jak egzom lub niestandardowe panele. Inne wersje testów mogą być wymagane dla innych typów chipów, takich jak macierze genotypowania całego genomu. Ponieważ jednak wszystkie testy Infinium mają wspólną podstawę i różnią się głównie nazwami odczynników, objętościami odczynników lub dokładną procedurą barwienia odczynników, techniki udoskonalone w jednej wersji testu mogą być często powszechnie stosowane. Inne tablice, takie jak macierze metylacji, mogą również używać prawie identycznego protokołu. Należy zachować ostrożność, aby używać wyłącznie wersji testu wymaganej dla używanego typu chipa. Niektóre typy, takie jak te mierzące poziom ekspresji genów, mogą wymagać użycia protokołu innego niż Infinium.
Próbki muszą być przetwarzane partiami. Na przykład w teście InfiniumUltra probówki z odczynnikiem do prehybrydyzacji zawierają wystarczającą objętość, aby uruchomić 96 próbek, a probówek nie można ponownie zamrozić. W związku z tym próbki muszą być badane w partiach po 96 próbek jednocześnie. Próbki zostaną amplifikowane pierwszego dnia. Po około 1 godzinie pracy na stole próbki należy podgrzewać w piecu konwekcyjnym przez 20-24 godziny. Następnego dnia prawie 4 godziny zostaną poświęcone na fragmentację, wytrącanie i ponowne zawieszanie próbek, po czym próbki mogą zostać zamrożone do wykorzystania w przyszłości lub zhybrydyzowane z chipem. Ładowanie wiórów trwa prawie 2 godziny, po czym próbki będą hybrydyzowane przez noc przez 16-24 godziny. Trzeciego dnia etap barwienia i przedłużania trwa ~4 godziny. Kolejna godzina zostanie poświęcona na mycie, powlekanie i suszenie frytek. Na koniec skanowane są matryce, co może zająć od 15 do 60 minut/chip, w zależności od użytego typu.
Obowiązują standardowe środki ostrożności i czystości w laboratorium. Chociaż amplifikacja nie jest oparta na PCR, konieczne są oddzielne stacje robocze do procedur przed i po amplifikacji, aby zminimalizować prawdopodobieństwo zanieczyszczenia. Numer identyfikacyjny każdego używanego odczynnika dostarczonego w zestawie musi być zapisany na karcie śledzenia. Odczynniki należy rozmrozić bezpośrednio przed użyciem i kilkakrotnie odwrócić przed dozowaniem. DNA, które ma być typowane, musi być genomowym DNA wysokiej jakości (współczynnik absorbancji 260/280 wynosi 1,6-2,0, współczynnik absorbancji 260/230 poniżej 3,0), wyizolowanym metodami wzorcowymi i oznaczonym ilościowo za pomocą fluorometru. Degradacja DNA jest często czynnikiem przyczyniającym się do niskiej jakości wyników testów. Zazwyczaj wymagane jest 200 ng DNA, chociaż ilość ta może się różnić w przypadku niektórych typów chipów. Robot do obsługi cieczy Tecan może zautomatyzować wiele etapów protokołu i zminimalizować błąd ludzki jako czynnik.

<table><tbody><tr><td><mocny>Materiały eksploatacyjne lub sprzęt</mocny></td><td><silny>Producent</mocny></td><td><silny>Numer części</mocny></td><td><mocny>Minimum wymagane dla 96 próbek</mocny></td></tr><tr><td>0,8 ml Płytka głębinowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0765</td><td>1</td></tr><tr><td>Mata talerzowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0674</td><td>2</td></tr><tr><td>Basen odczynników</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-502</td><td>9</td></tr><tr><td>Arkusze termozgrzewalne</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0559</td><td>1</td></tr><tr><td>Przekładka przepływowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9563984</td><td>6</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet - 200 &mu; l</td><td>Końcówki</td> do pipet <td>Rainin GP-L200F</td><td>192</td></tr><tr><td>- 10 &mu; l</td><td>Rainin</td><td>GP-L10F</td><td>16</td></tr><tr><td>końcówek do pipet - 1 000 &mu; l</td><td>Rainin</td><td>GP-L1000F</td><td>16</td></tr><tr><td>Bufor zawiesinowy DNA</td><td>Teknova</td><td>T0220</td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>0,1 N NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC12419-0010</td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>Izopropanol (klasa HPLC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>etanolu (200-proof)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td>330 ml</td></tr><tr><td>formamidu (100%)</td><td>Thomas Scientific</td><td>C001K38</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M)</td><td>Amresco</td><td>E177</td><td>0,2 ml</td></tr><tr><td>10 &mu; l Pipeta 8-kanałowa</td><td>Rainin</td><td>L8-10XLS</td><td>1</td></tr><tr><td>200 &mu; l Pipeta 8-kanałowa</td><td>Rainin</td><td>L8-200XLS</td><td>2</td></tr><tr><td>1,000 &mu; l Pipeta jednokanałowa</td><td>Rainin</td><td>L-1000XLS</td><td>1</td></tr><tr><td>Wytrząsarka do mikropłytek</td><td>VWR</td><td>13500-890</td><td>1</td></tr><tr><td>Wirówka do mikropłytek z chłodzeniem</td><td>VWR</td><td>BK369434</td><td>1</td></tr><tr><td>Piec do hybrydyzacji</td><td>Illumina</td><td>SE-901-1001</td><td>1</td></tr><tr><td>Inkubator do mikropróbek Hybex</td><td>SciGene</td><td>1057-30-0</td><td>1</td></tr><tr><td>Wkładka</td> <td>bloku ciepła Hybex MIDIIllumina</td><td>BD-60-601</td><td>1</td></tr><tr><td>Zgrzewarka</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0384</td><td>1</td></tr><tr><td>Komora Hyb z wkładką i matą</td><td>Illumina</td><td>BD-60-402</td><td>2</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-804-20</td><td>1</td></tr><tr><td>Przepływowe części</td><td>montażowe Illumina</td><td>WG-10-202</td><td>8</td></tr><tr><td>Kosz i naczynie do mycia</td><td>Illumina</td><td>BD-60-450</td><td>1</td></tr><tr><td>Genepaint Stojak na komorę</td><td>Tecan</td><td>760-800</td><td>1</td></tr><tr><td>Sonda temperatury</td><td>Illumina</td><td>A1-99-109</td><td>1</td></tr><tr><td>Stojak do barwienia i naczynie</td><td>Illumina</td><td>WG-10-207</td><td>1</td></tr><tr><td>Pęseta samozamykająca</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>5374-NM</td><td>1</td></tr><tr><td>Kolektor próżniowy</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>2240</td><td>1</td></tr><tr><td>iScan lub HiScan</td><td>Illumina</td><td>- </td><td>1</td></tr></tbody></table>

test infinium do zastosowań genotypowania snp na dużą skalę

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotypowanie wariantów w ludzkim genomie okazało się skuteczną metodą identyfikacji powiązań genetycznych z fenotypami. Rozmieszczenie wariantów w obrębie rodzin lub populacji może ułatwić identyfikację genetycznych czynników choroby. Panel genotypowania BeadChips firmy Illumina umożliwia badaczom genotypowanie tysięcy lub milionów polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP) lub analizowanie innych wariantów genomu, takich jak liczba kopii, w dużej liczbie próbek DNA. Te SNP mogą być rozprzestrzeniane w całym genomie lub ukierunkowane na określone regiony, aby zmaksymalizować potencjalne odkrycie. Test Infinium został zoptymalizowany pod kątem szybkiego uzyskania wysokiej jakości, dokładnych wyników. Przy odpowiedniej konfiguracji jeden technik może przetworzyć od kilkuset do ponad tysiąca próbek DNA tygodniowo, w zależności od rodzaju macierzy. Ten test prowadzi użytkowników przez każdy krok, począwszy od genomowego DNA, a skończywszy na skanowaniu macierzy. Za pomocą odpowiednich odczynników próbki są amplifikowane, fragmentowane, wytrącane, ponownie zawieszane, hybrydyzowane z chipem, rozszerzane o pojedynczą zasadę, barwione i skanowane w systemie obrazowania optycznego o wysokiej rozdzielczości iScan lub Hi Scan. Do amplifikacji DNA wymagany jest jeden nocny krok. DNA jest denaturowane i amplifikowane izotermicznie przez amplifikację całego genomu; w związku z tym nie jest wymagany PCR. Próbki są hybrydyzowane z macierzami podczas drugiego etapu nocnego. Trzeciego dnia próbki są gotowe do skanowania i analizy. Amplifikowane DNA może być przechowywane w dużych ilościach, co pozwala na przetwarzanie matryc kulek każdego dnia tygodnia, maksymalizując w ten sposób przepustowość.

Prawidłowo przetworzony chip z kuleczkami powinien podczas skanowania wykazywać jasną i wyraźną intensywność czerwonego i zielonego światła laserowego. Na Ryc. 6 oprogramowanie skanujące iScan wyświetla standardową próbkę genomowego DNA pomyślnie zhybrydyzowaną z niestandardowym panelem matrycy do genotypowania SNP. Nukleotydy znakowane, które zostały przyłączone podczas etapów elongacji i barwienia, fluorescują pod wpływem światła dwóch laserów. Ponieważ nukleotydy te selektywnie wydłużają łańcuch oligonukleotydowy kuleczki zhybrydyzowany z fragmentem nici DNA, a łańcuchy oligonukleotydowe są zaprojektowane tak, aby kończyć się w miejscu wariantu, kolor i intensywność otrzymanego sygnału mogą być wykorzystane do określenia alleli obecnych w miejscu SNP.
Aby zaimportować pliki wyjściowe ze skanera do oprogramowania analitycznego GenomeStudio, niezbędne są dwa elementy: przygotowany przez użytkownika arkusz próbek, który przypisuje identyfikatory próbek oraz informacje kliniczne do chipID i pozycji, a także specyficzny dla danej macierzy manifest SNP, uzyskany bezpośrednio od producenta. Przykładowe arkusze próbek można znaleźć na stronie internetowej firmy. Po utworzeniu projektu w GenomeStudio genotypy można uzyskać z wynikowych klastrów intensywności generowanych automatycznie przez oprogramowanie. Choć dostępnych jest wiele opcji wyświetlania, domyślny widok, Norm-R (znormalizowana wartość intensywności) względem Norm-Theta (stosunek intensywności alleli), jest często najłatwiejszym wykresem do rozróżnienia trzech odrębnych klastrów. Większość SNP powinna wykazywać jeden, dwa lub trzy klastry, w zależności od częstości występowania rzadkiego allela.
Trzy skupienia reprezentują próbki wykazujące allele AA, AB lub BB (patrz Rysunek 7). Genotypy tych skupień można przypisać poprzez import szablonu pozycji skupień bezpośrednio od producenta, wybranie opcji „Cluster All SNPs” z paska narzędzi analizy oprogramowania lub poprzez klikanie i przeciąganie kolorowych kół na wykresach intensywności w celu ręcznej edycji wyników. Kolor próbki na wykresie intensywności (czerwony, fioletowy lub niebieski) wskazuje przypisany genotyp (odpowiednio AA, AB lub BB); kolor czarny oznacza brak przypisania. Przeglądając listę SNP w panelu Full Data oprogramowania, można wyświetlić lub przywołać skupienia dla każdego SNP. Po przypisaniu satysfakcjonujących wyników dla skupień, panel Full Data oprogramowania wyświetla genotypy dla każdej poszczególnej próbki w każdym konkretnym SNP. Opcja Column Chooser nad tabelą pozwala na przełączanie formatów danych.
Dane można eksportować za pomocą paska narzędzi Analysis lub bezpośrednio z tabeli Full Data w celu przeprowadzenia szczegółowej analizy.
<img alt="Schemat protokołu analizy Infinium; procesy amplifikacji DNA, hybrydyzacji i barwienia." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przegląd – Protokół analizy Infinium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Instrument do sekwencjonowania DNA Illumina, widok z góry, przedstawiający konfigurację kartridża dla eksperymentów sekwencjonowania." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Kompletna podstawa i mata komory Hyb wraz z pokrywą.[12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększony obraz</a>.
<img alt="Proces pipetowania mikroarray, analiza genomiczna, konfiguracja eksperymentu laboratoryjnego, profilowanie DNA/RNA." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Załadowanie Beadchipu – Nanieś próbkę na porty wlotowe.[12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Eksperyment z mikromacierzą DNA, szkiełko z wieloma próbkami, konfiguracja badania ekspresji genów." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Usuwanie folii ochronnej Beadchip – Chwyć folię za róg i delikatnie odklej ją po przekątnej.[12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Chip fotoniczny w układzie spektroskopowym, używany do wzbudzeń optycznych i badań absorpcji przejściowej." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Kompletny zespół przepływowy Beadchip – BeadChip jest oddzielony od szkiełka przedmiotowego za pomocą dystansera i połączony za pomocą zacisków. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig5highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Analiza danych z mikromacierzy, wyniki ekspresji genów; diagram z czerwono-zielnymi wzorami intensywności." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Prawidłowy skan BeadChip – A) BeadChip jest skanowany za pomocą lasera czerwonego i zielonego; oprogramowanie skanujące wyświetla oba obrazy jednocześnie. Sekcje przechodzące kontrolę jakości (QC) intensywności zostaną podświetlone na zielono na wyświetlaczu BeadChip po lewej stronie. Sekcje nieprzechodzące kontroli jakości intensywności zostaną podświetlone na czerwono. B) Po zakończeniu skanowania oprogramowanie nałoży na siebie obrazy czerwony i zielony. Przedstawiono powiększony obraz. Kolor i intensywność każdego pojedynczego koralika (bead) wskazują obecny allel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz</a>.
<img alt="Wykresy analizy skupień genotypów przedstawiające rozkład SNP; wizualizacja genetyki statystycznej." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Profile skupień SNP NORM-R vs. NORM-THETA – A) Prawidłowy SNP z trzema wyraźnymi skupieniami reprezentującymi genotypy AA, AB i BB, oznaczone kolorami czerwonym, fioletowym i niebieskim. B) SNP wymagający edycji. Środkowe skupienie, które powinno być homozygotyczne AB, pozostało nieprzypisane. Skupienie BB zostało błędnie przypisane jako AB. C) SNP o słabej wydajności. Z tego wykresu intensywności nie można uzyskać żadnych genotypów, ponieważ nie istnieją wyraźne skupienia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz</a>.

Opisano protokół, który wykorzystuje testy Infinium firmy Illumina do przeprowadzania genotypowania na dużą skalę. Testy te mogą niezawodnie genotypować miliony SNP w setkach pojedynczych próbek DNA w ciągu trzech dni. Po wygenerowaniu genotypy te można wykorzystać do sprawdzenia powiązań z wieloma różnymi chorobami lub fenotypami.

Test Infinium do zastosowań genotypowania SNP na dużą skalę

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest prawidłowe zastosowanie testu Infinium w celu przetworzenia chipu do genotypowania. Jest to osiągane poprzez uprzednią amplifikację, fragmentację i izolację DNA. Drugim krokiem jest hybrydyzacja zdenaturowanej nici DNA z oligonukleotydami przyczepionymi do kulek na matrycy.Następnie oligonukleotyd przytwierdzony do kuleczki zostaje zabarwiony i selektywnie przedłużony o jedną zasadę. Ostatnim krokiem jest zeskanowanie płytek z kuleczkami w celu wykrycia znakowanego nukleotydu. Ostatecznie wyniki genotypowania służą do określenia alleli obecnych w analizowanym locus.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ wiele etapów barwienia i ładowania chipów pszczelich jest trudnych do opanowania. Wiele z tych czynności nie występuje w innych metodach genotypowania, a wiele elementów wyposażenia ma bardzo podobne nazwy. Na dzień przed amplifikacją należy przygotować DNA, dozując 200 ng DNA do każdej studni głębokiej płytki 96-dołkowej.Należy nanieść na płytkę co najmniej 96 próbek, aby uniknąć zmarnowania odczynników. Oznaczyć płytkę naklejką z kodem kreskowym dołączoną do zestawu, a następnie poddać ją wirowaniu w celu wyrównania objętości. Pozostawić próbki w szufladzie lub pod wyciągiem przez noc w celu odparowania cieczy.Przykryj płytkę luźno pokrywką lub ręcznikiem papierowym, aby zapobiec osadzaniu się kurzu do następnego ranka. Upewnij się, że dołki są suche, a następnie użyj dozownika z odczynnikiem i ośmiokanałowej pipety 10 µL, aby nanieść 4 µL buforu DNA Resus do każdego dołka w celu rehydratacji próbek. Jeśli zachowana zostanie ostrożność, aby nie dotknąć cieczy, wymiana końcówek pipety między poszczególnymi kolumnami nie jest konieczna.Następnie, za pomocą pipety ośmiokanałowej i świeżego zbiornika na odczynnik, nanieś 20 µL odczynnika MA one do każdej studni płytki. Przykryj płytkę wielorazową uszczelką, odwiruj krótko w wirówce pulsacyjnej i mieszaj w wstrząsarzu do mikropłytek przez jedną minutę przy 1600 RPM, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut. Pozostałe etapy amplifikacji nie zostaną pokazane w tym filmie, ale protokół znajduje się w towarzyszącym mu manuskrypcie.Po dodaniu wszystkich reagentów należy umieścić płytkę w odpowiednio skalibrowanym inkubatorze ustawionym na 37 °C na 20 do 24 godzin. Po amplifikacji próbki DNA są fragmentowane i wytrącane zgodnie z opisem w manuskrypcie, a następnie poddawane wirowaniu w wirówce wysokoprędkościowej. Należy sprawdzić dno płytki, nie odwracając jej.Aby potwierdzić, że próbki wytrąciły się w postaci niebieskiego osadu, odrzuć pokrywkę i szybko usuń ciecz, odwracając płytkę i energicznie uderzając nią o blat pokryty ręcznikami papierowymi. Po odwróceniu płytki należy uważać, aby jej nie obracać z powrotem. Dopóki wewnątrz pozostaje jakikolwiek płyn, wielokrotnie uderzaj płytką o blat, aż cała ciecz zostanie usunięta.Ustaw płytkę odwrócona na stojaku do probówek, aby wyschnęła w inkubatorze w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Następnie DNA należy resuspendować, aby rozpocząć procedurę hybrydyzacji. Umieść płytkę 96-dołkową zawierającą resuspendowane DNA na bloku grzejnym w temperaturze 95 °C przez 20 minut.Aby zdenaturować DNA po 20 minutach, należy wyjąć płytkę z próbkami z bloku grzewczego i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut; podczas chłodzenia płytki z próbkami przygotuj komorę ula. Jedna komora będzie potrzebna na każde cztery przetworzone chipy pszczele. Umieść gumową matę na górze podstawy komory ula, dopasowując szerszy otwór do przodu podstawy.Symbol kodu kreskowego wygrawerowany na podstawie powinien pozostać widoczny. Używając pipety 1000 µL, nanieś 400 µL odczynnika PB two do każdego z ośmiu zbiorników nawilżających znajdujących się w podstawie. Na podstawie umieść pokrywę komory hi i zapiąć oba końce, mocując dwa zatrzaski po przeciwległych stronach przekątnie.Najpierw, tuż przed zakończeniem 30-minutowego chłodzenia, umieść na blacie po cztery wkłady do komory Hi dla każdej używanej komory Hi. Otwórz opakowania z chipami z srebrnymi kuleczkami.Wyjmij chipy z przezroczystych plastikowych etui, nie dotykając kulek. Umieść każdy chip na wkładce komory hi. Zorientuj kod kreskowy chipa zgodnie z symbolem kodu kreskowego wytrawionym na górnej powierzchni wkładki.Kolejny krok, którym jest nakładanie próbek na układy bee chip, może być najbardziej krytycznym etapem protokołu. Prawidłowe wykonanie tej czynności wymaga wcześniejszego zaplanowania procesu przenoszenia próbek z płyty z DNA na układ bee chip. Zdejmij i wyrzuć pokrywę płyty z próbkami. Do dozowania cieczy na układy można użyć pipety wielokanałowej, jednak należy pamiętać, aby pobrać tylko taką liczbę próbek, która może zostać bezpiecznie umieszczona na układzie bee chip, ponieważ liczba rzędów na płycie nie zawsze odpowiada liczbie rzędów na układzie.Pobrać 15 µL próbki z płytki z próbkami i powoli nanieść na wlot do matrycy. Należy zachować szczególną ostrożność, aby umieścić właściwą próbkę na odpowiednim chipie z kuleczkami w pozycji odpowiadającej układowi chipa z kuleczkami. Kolejność została zapisana wcześniej.Otwórz komorę hi i umieść wkłady nad zbiornikami nawilżającymi. Kod kreskowy chipa powinien zostać umieszczony nad wytrawionym kodem kreskowym w podstawie komory hive. Nałóż pokrywę komory hive i zamknij wszystkie cztery klamry, zamykając klamry znajdujące się po przeciwległych stronach przekątnie.Najpierw inkubuj komorę hybrydyzacyjną w piecu w temperaturze 48 °C przez 16 do 24 godzin. Po zakończeniu hybrydyzacji komory hybrydyzacyjne należy wyjąć z pieca i inkubować w temperaturze pokojowej przez 25 minut w celu schłodzenia. Po schłodzeniu komór hybrydyzacyjnych otwórz jedną z nich. Usuń uszczelkę pokrywy z chipa, chwytając ją za jeden róg i delikatnie odklejając po przekątnej.Po usunięciu uszczelki należy niezwłocznie umieścić chip na tacy do chipów i zanurzyć w PB 1, uważając, aby nie dotknąć kulek. Powtarzać czynność, aż taca zostanie wypełniona chipami z kulkami, dbając o to, aby żaden chip nie wyschł.Delikatnie potrząśnij tacką, aby usunąć pęcherzyki powietrza, i pozostaw chipy zanurzone przez jedną minutę. Ponownie potrząśnij tacką. Przenieś tackę z chipami pszczelimi do drugiej miski do mycia wypełnionej roztworem PB.One, delikatnie potrząśnij i pozostaw do namoczenia w mydle przez jedną minutę.Następnie ponownie wymieszaj w stacji montażowej do przepływu cieczy. W wyżłobieniach umieść cztery czarne plastikowe wsporniki przepływowe. Napełniaj stację PB one po kolei, aż ciecz niemal osiągnie wysokość ośmiu uchwytów montażowych.Wyjmij chipy z koralikami z tacy i umieść je w stacji montażowej na plastikowym wsporniku przepływowym; kod kreskowy chipa powinien znajdować się nad symbolem kodu kreskowego wygrawerowanym w stacji montażowej. Gdy w stacji montażowej znajdą się cztery chipy, umieść przezroczysty plastikowy przekładkę na każdym chipie z koralikami. Krawędzie zewnętrzne przekładki powinny otaczać uchwyty wewnątrz stacji montażowej.Umieść plastikowy pręt montażowy w stacji montażowej, dopasowując go do rowków. Ostrożnie połóż szkiełko podstawowe na plastikowej przekładce, dociskając tylny koniec szkiełka do pręta montażowego i powoli opuszczając przednią część do cieczy. Rowek na górnej powierzchni szkiełka powinien być skierowany w dół, bezpośrednio nad kodem kreskowym chipa, pozostawiając szczelinę między chipem bee a szkiełkiem w miejscu kodu kreskowego.Po upewnieniu się, że między chipem a szkiełkiem nie ma pęcherzyków powietrza, zamocuj dwa metalowe zaciski wokół szkła. Przesuń jeden w stronę kodu kreskowego, a drugi w stronę tylnej krawędzi. Krawędzie plastikowych zacisków powinny obejmować plastikowy wspornik przepływowy znajdujący się pod chipem.Na tym schemacie przedstawiono kompletny diagram zestawu przepływowego. Gdy wszystkie kuleczki znajdą się w zestawach przepływowych, należy użyć nożyczek chirurgicznych i odciąć oba końce dystansera jak najbliżej szkiełka przedmiotowego. Po osiągnięciu przez stojak komory temperatury 44 stopni, należy rozpocząć procedurę, umieszczając zestaw przepływowy bee chip na stojaku komory poprzez wsunięcie zestawu w dół i zahaczenie wspornika u góry. Tylna strona bee chip powinna stykać się ze stojakiem komory.Szkiełko przedmiotowe powinno być skierowane na zewnątrz, a wyżłobienie znajdować się u góry, tworząc rezerwuar na odczynniki. Po umieszczeniu wszystkich zestawów z chipami pszczelimi na statywie komory, należy użyć pipety 200 µL, aby dodać 150 µL odczynnika RA one do zestawów przepływowych. Dzięki dozowaniu cieczy do szklanego rezerwuaru, odczynnik naturalnie spłynie po szkiełku i wypłynie u podstawy zestawu, co umożliwi bezpośrednie wprowadzanie kolejnych odczynników do rezerwuaru.Pozostałe etapy barwienia przedłużenia nie zostaną przedstawione. Po zakończeniu barwienia i przedłużenia należy zapoznać się z protokołem zawartym w towarzyszącym manuskrypcie. Rozmontuj zespół przepływowy, wkładając cienki metalowy pręt pomiędzy zatrzaski a wspornik.Następnie przejście do kolejnego etapu. Odłożyć szkiełko przedmiotowe i natychmiast wyjąć chip z pszczołą, po czym umieścić go w pionowym pojemniku na chipy i zanurzyć w PB 1; powtórzyć czynność dla każdego zestawu przepływowego. Należy zadbać o to, aby każdy chip był skierowany w tym samym kierunku i zminimalizować jego kontakt z powietrzem.Następnie należy ukończyć tę procedurę. Zgodnie z protokołem zawartym w towarzyszącym tekście, prawidłowo przetworzony chip bee powinien wykazywać jasne i wyraźne intensywności czerwonego i zielonego światła laserowego podczas skanowania, ponieważ nukleotydy znakowane, które zostały przyłączone podczas etapów elongacji i barwienia, będą fluorescować pod wpływem światła dwóch laserów. Przedstawiono tutaj standardową próbkę genomicznego DNA pomyślnie zhybrydyzowaną z sekcjami przechodzącymi przez intensywność niestandardowej matrycy do genotypowania SNP.W przypadku przejścia kontroli jakości (QC), odpowiednie sekcje na wyświetlaczu bee chip po lewej stronie podświetlą się na zielono. W przypadku zbyt niskiej intensywności, kontrola jakości (QC) podświetli wyświetlacz bee chip na czerwono.Po zakończeniu skanowania nałożone zostaną na siebie obrazy w kolorze czerwonym i zielonym. Przedstawiono tutaj powiększony obraz, na którym widać, jak nukleotydy selektywnie wydłużają łańcuch oligonukleotydowy zakotwiczony na kuleczkach, zhybrydyzowany z fragmentowaną nicią DNA. Ponieważ łańcuchy nukleotydowe są zaprojektowane tak, aby kończyć się w miejscu wariantu, kolor i intensywność otrzymanego sygnału mogą służyć do określenia alleli obecnych w miejscu SNP.Pliki wyjściowe ze skanera są importowane do oprogramowania Genome Studio Analysis, które generuje profile klastrów. Jest to przykład poprawnego SNP z trzema wyraźnymi klastrami reprezentującymi genotypy aa, A, B oraz B, B, odpowiednio w kolorze czerwonym, fioletowym i niebieskim. Ten wykres intensywności przedstawia SNP, który wymagał edycji czarnego środkowego klastra, który powinien być homozygotyczny.AB pozostaje nieoznaczone. Klaster BB jest błędnie określony jako ab. Ostatny wykres intensywności przedstawia SNP o niskiej wydajności.Na podstawie tego wykresu intensywności nie można wyznaczyć genotypów, ponieważ nie występują wyraźne skupiska. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o szybkim procesowaniu chipów pszczelich. Nie należy wystawiać ich na działanie powietrza przez dłuższy czas.

infinium-assay-for-large-scale-snp-genotyping-applications

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Test Infinium do zastosowań polegających na genotypowaniu SNP na dużą skalę

Sekwencjonowanie puli DNA jest szybką i kosztowo efektywną strategią wykrywania rzadkich wariantów związanych ze złożonymi fenotypami w dużych kohortach. W niniejszym materiale opisujemy analizę obliczeniową sekwencjonowania nowej generacji pul 32 genów związanych z nowotworami przy użyciu pakietu oprogramowania SPLINTER. Metoda ta jest skalowalna i może być zastosowana do dowolnego analizowanego fenotypu.

Wykrywanie rzadkich wariantów genomicznych z sekwencjonowania pulującego przy użyciu SPLINTER

Opisujemy nową metodę izolacji DNA genomowego z krwi pełnej pobranej do badań osocza/serologii. Po pobraniu osocza zagęszczona krew jest zazwyczaj utylizowana. Nasza nowatorska metoda stanowi znaczną poprawę w stosunku do istniejących sposobów i umożliwia uzyskanie DNA oraz osocza z jednego pobrania, bez konieczności pobierania dodatkowej krwi.

Praktyczna i nowatorska metoda izolacji genomowego DNA z zestawów do pobierania krwi służących do konserwacji białek osocza

Okołokomorowa heterotopia guzkowa (PNH) jest najczęstszą formą wady rozwojowej kory mózgowej (MCD) w wieku dorosłym, ale jej podłoże genetyczne pozostaje nieznane w większości sporadycznych przypadków. Niedawno opracowaliśmy strategię identyfikacji nowych genów kandydujących do MCD i bezpośredniego potwierdzenia ich przyczynowej roli in vivo.

Nowatorska strategia łącząca macierz CGH, sekwencjonowanie całego eksomu i elektroporację in utero u gryzoni w celu identyfikacji genów odpowiedzialnych za wady rozwojowe mózgu

Opisany jest zintegrowany system do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji próbek onkologicznych. Ten wieloplatformowy system jest zoptymalizowany pod kątem biopsji guza o niskiej jakości i małej ilości, obsługuje niskie dane wejściowe DNA, zawiera dobrze scharakteryzowane wielowariantowe kontrole i zawiera nowatorski wariant wywołujący, który jest informowany o ilościowych przedanalitycznych środkach kontroli jakości.

Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

Ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji to efektywne czasowo i kosztowo podejście, które staje się coraz bardziej popularne zarówno w badaniach nad chorobami, jak i w diagnostyce klinicznej. Opisany tutaj protokół przedstawia złożony przepływ pracy wymagany do sekwencjonowania i procesu bioinformatycznego wykorzystywanego do identyfikacji wariantów genetycznych, które przyczyniają się do choroby.

Ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji i bioinformatyka w celu oceny genetycznych uwarunkowań chorób konstytucjonalistycznych

Identyfikacja wariantów genetycznych przyczyniających się do złożonych chorób ludzkich pozwala nam zidentyfikować nowe mechanizmy. W tym miejscu demonstrujemy podejście do genotypowania multipleksowego genów kandydujących lub analizy szlaków genowych, które maksymalizuje pokrycie przy niskich kosztach i jest podatne na badania kohortowe.

Testowanie genów kandydujących w klinicznych badaniach kohortowych z genotypowaniem multipleksowym i spektrometrią mas

Protokół przedstawia ogólne procedury laboratoryjne wymagane w preimplantacyjnych testach genetycznych na aneuploidię na platformie sekwencjonowania nowej generacji opartej na półprzewodnikach. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe etapy amplifikacji całego genomu, selekcji fragmentów DNA, budowy biblioteki, przygotowania szablonów i przepływu roboczego sekwencjonowania z reprezentatywnymi wynikami.

Preimplantacyjne badania genetyczne w kierunku aneuploidii na półprzewodnikowej platformie sekwencjonowania nowej generacji

Opracowaliśmy międzygatunkowe porównawcze podejście onkogenomiczne, wykorzystując analizy genomiczne i funkcjonalne badania genomowe do identyfikacji i porównania celów terapeutycznych w nowotworach powstających w genetycznie modyfikowanych modelach mysich i odpowiadającym im typie nowotworu ludzkiego.

Profilowanie genetyczne i badania przesiewowe w skali genomu w celu identyfikacji celów terapeutycznych w mysich modelach złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych

Biblioteki metagenomiczne archiwizują duże fragmenty ciągłych sekwencji genomowych mikroorganizmów bez konieczności ich wcześniejszej hodowli. Tworzenie...

Wielkoskalowe przesiewanie bibliotek metagenomicznych

Pyrosequencing(R) jest jedną z najbardziej szczegółowych, a zarazem prostych metod stosowanych obecnie do analizy polimorfizmów. Metoda ta umożliwiła szybką i efektywną ocenę polimorfizmów pojedynczego nukleotydu, w tym wielu polimorfizmów o istotnym znaczeniu klinicznym. W materiale wyjaśniono technikę oraz metodologię Pyrosequencing.

Pirosekwencjonowanie: prosta metoda dokładnego genotypowania

Poznaj metodę Infinium do genotypowania SNP na dużą skalę przy użyciu technologii Illumina. Protokół obejmuje amplifikację DNA, hybrydyzację do koralików oraz skanowanie chipów.

Test Infinium do zastosowań genotypowania SNP na dużą skalę

Przeglądaj więcej filmów