Name: Przedkliniczna ocena inhibitorów kinazy tyrozynowej w leczeniu ostrej białaczki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Poznaj strategię przedklinicznej oceny inhibitorów kinazy tyrozynowej w leczeniu ostrej białaczki. Metoda obejmuje Western blot, analizy klonogenne i bioluminescencyjne obrazowanie terapeutycznej skuteczności in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Obrazowanie in vivo zostało wykonane przy użyciu udostępnionego zasobu IVIS w Centrum Onkologicznym Uniwersytetu Kolorado (wspieranego przez grant P30-CA046934). Cytometrię przepływową przeprowadzono w Flow Cytometry Shared Resource, University of Colorado Cancer Center (wspieranym przez grant P30CA046934). Prace te były częściowo wspierane przez Narodowe Instytuty Zdrowia (RO1CA137078 DKG). ABLS jest członkiem Programu Rozwoju Naukowców Pediatrycznych, wspieranego przez granty Amerykańskiej Akademii Pediatrii, Amerykańskiego Towarzystwa Pediatrycznego oraz Narodowego Instytutu Zdrowia Dziecka i Rozwoju Człowieka im. Eunice Kennedy Shriver (K12-HD000850).

Wszystkie eksperymenty z udziałem zwierząt były zgodne ze standardami regulacyjnymi zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kolorado. Zademonstrowany protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Kolorado.
1. Fosfobiałko Western Blot
<ol>
	<li>Przygotowanie lizatów
	<ol>
		<li>Hodowla linii komórkowych wyrażających receptorową kinazę tyrozynową będącą przedmiotem zainteresowania. Zebrać komórki i płytkę 3-5 x 106 komórek/próbkę w 400 μl pożywki wzrostowej w 48-dołkowym naczyniu do hodowli tkankowych. Inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 2-3 godziny.</li>
		<li>Dodać 100 μl 5x roztworu TKI do podłoża wzrostowego i inkubować przez 60 minut.</li>
		<li>Przygotuj bufor do lizy z 50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10% (v/v) glicerolem, 1% (v/v) Triton X-100 i inhibitorami proteazy. Jeśli kultury nie będą poddawane działaniu perwanadatemu przed zbiorem, należy dodać inhibitory fosfatazy (1 mM ortowanaradu sodu i 0,1 mM molibdenianu sodu) do buforu do lizy.</li>
		<li>Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować roztwór inhibitora fosfatazy perwanadatenowej (PV). Przygotować 0,3% roztwór nadtlenku wodoru (UWAGA) w zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w ciemnej probówce na lodzie (rozcieńczenie 1:100 30% roztworu podstawowego). Gotować podwielokrotność 0,2 M roztworu podstawowego ortowanadanu sodu (OV, UWAGA) przez 5 minut. Rozcieńczyć w stosunku 1:10 w PBS, aby uzyskać roztwór 20 mM OV w temperaturze pokojowej (RT). Zmieszać 0,3% nadtlenku wodoru i 20 mM OV 1:1 i inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
		<li>Rozcieńczyć PV do pełnego podłoża (60 μl PV + 940 μl medium). Dodać 100 μl rozcieńczonego PV/studzienkę. Inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 3 minuty, a następnie umieścić płytkę na lodzie.</li>
		<li>Zbierz komórki w zimnych probówkach do mikrofug z prędkością 2 500 obr./min przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 120 μl buforu do lizy. Inkubować na lodzie przez 15 minut. Klarować lizat w zimnym mikrofugowaniu przy 6 000 obr./min przez 3 min. Przenieść supernatant do świeżej zimnej probówki. Przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunoprecypitacja
	<ol>
		<li>Odkręć kulki sefarozy Protein G w mikrofuzie z prędkością 1 000 obr./min przez 1 min. Usuń supernatant i umyj kulki 2x 1 ml zimnego PBS. Dodaj równą objętość PBS, aby uzyskać 50% zawiesiny. Do każdej próbki dodać przeciwciało pierwszorzędowe i 20 μl kulek 50% białka G. Inkubować przez 2 godziny - O/N w temperaturze 4 °C na rotatorze.</li>
		<li>Pulsuj kulki w zimnej mikrofolinie z prędkością 9 000 obr./min. Usunąć supernatant i przemyć kulki 2x 150 μl buforem do lizy na zimno. Wirować w zimnej mikrofudze z prędkością 1 000 obr./min przez 1 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 20 μl buforze do próbek 2X SDS z 2-merkaptoetanolem (UWAGA). Zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Gotuj próbki przez 5 minut i uruchom na żelu tris-glicynowym SDS-PAGE. Przenieś białka do błony nitrocelulozowej i wykryj fosfobiałko za pomocą western blot.</li>
		<li>Przepłukać osuszyć wodą, a następnie inkubować w 2% SDS, 62,5 mM Tris (pH 6,8), 0,1 M β-merkaptoetanolu (UWAGA) przez 30 minut w temperaturze 50 °C. Płukać 2x wodą, a następnie myć przez 60-90 minut w 5-6 zmianach TBS-T w celu usunięcia roztworu odpędzającego.</li>
		<li>Wykrywanie białka całkowitego za pomocą western blot.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test metylocelulozy
<ol>
	<li>Podwielokrotność 4 ml pożywki z metylocelulozą na 50 ml stożkowych probówek za pomocą sterylnej igły o dużym otworze z końcem. (Uwaga: Metyloceluloza może być porcjowana i przechowywana w temperaturze -20 °C. Przed użyciem rozmrozić w temperaturze RT O/N.)</li>
	<li>Dodać 500 μl 10x TKI lub nośnika w pożywce wzrostowej do 4 ml mieszaniny metylocelulozy i wirować przez 10 sekund.</li>
	<li>Zbierz i policz komórki. Przygotować zawiesinę komórek w pożywce wzrostowej w stężeniu, które jest 10 razy wyższe niż końcowe stężenie komórek. Dodać 500 μl zawiesiny komórek do mieszaniny metylocelulozy. Wiruj przez 10 sekund i odstaw na 10 minut, aby usunąć bąbelki.</li>
	<li>Pobrać 4 ml mieszaniny metylocelulozy za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml i sterylnej igły o dużym otworze z końcem. Unikaj rysowania bąbelków. Dozować 1 ml mieszaniny metylocelulozy na środek trzech płytek do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm. Obracaj naczyniami, aż dno zostanie całkowicie pokryte metylocelulozą.</li>
	<li>Dla każdej płytki metylocelulozowej należy przygotować sterylną płytkę do hodowli tkankowej o średnicy 10 cm z dwiema dodatkowymi płytkami do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm wypełnionymi sterylną wodą, aby zapewnić wilgotne środowisko. Umieścić kultury w inkubatorze z płaszczem wodnym w temperaturze 37 °C w 5% CO2 na 10-14 dni.</li>
	<li>Policz rodziny po 1-2 tygodniach. Kolonie powinny mieć więcej niż 20 komórek i nie zachodzić na siebie. Kolonie można liczyć za pomocą odwróconego mikroskopu wyposażonego w stolik mikroskopowy z siatką lub za pomocą automatycznego licznika kolonii. Należy również ocenić zmiany wielkości lub morfologii kolonii w odpowiedzi na leczenie TKI . Aby poprawić wykrywanie przez licznik kolonii, zabarwić kolonie, dodając kroplami 60-100 μl (3-(4,5-dimetylo-2-tiazolylo)-2,5-difenylo-2H-tetrazolium roztworu bromku (MTT, 5 mg/ml wH2O, przechowywać w temperaturze -20 °C, chronić przed światłem, UWAGA) kroplami na powierzchni każdej płytki i inkubować przez 8 godzin w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
</ol>
3. Test miękkiego agaru
<ol>
	<li>Przygotuj 1% szlachetnego agaru na dolną warstwę, 0,7% szlachetnego agaru na wierzchnią warstwę i 2x podłoże wzrostowe. Zrównoważyć 2x pożywkę wzrostową w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C. Podgrzej 1% i 0,7% agar szlachetny w kuchence mikrofalowej (około 1 min/100 ml) i zrównoważ w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C. Wymieszaj równe części 1% agaru i 2x pożywki i osobno 0,7% agaru i 2x podłoża w 50 ml stożków. Zaplanuj 10 ml miękkiej mieszanki agarowej/płytki sześciodołkowej dla każdej warstwy.</li>
	<li>Oznaczyć 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych. Napełnij każdą studzienkę 1,5 ml 1% miękkiej mieszanki agarowej. Unikaj pęcherzyków podczas galwanizacji. Suszyć płytki ze zdjętymi pokrywkami w sterylnym kapturze przez 30 minut.</li>
	<li>Policz komórki. Przygotować zawiesinę komórkową w pożywce wzrostowej w stężeniu, które jest 500 razy wyższe niż końcowe stężenie komórek. Dodaj zawiesinę komórek do 0,7% mieszaniny agarowej, dobrze wymieszaj i dozuj 1,5 ml mieszaniny komórek agaru na wierzch 1% warstwy agaru. Pozwól górnej warstwie zestalić się przez 30 minut.</li>
	<li>Przygotować 1x pożywkę wzrostową zawierającą TKI lub kontrolę nośnika. Dodać 2 ml pożywki o pożądanym stężeniu TKI na wierzch górnej warstwy agaru.</li>
	<li>Inkubować kultury przez 10 dni w temperaturze 37 °C w 5% CO2 . Usuwaj i wymieniaj podłoże nakładające co 3 dni.</li>
	<li>Gdy kolonie są widoczne gołym okiem, odessać pożywkę nakładającą i dodać 200 μl roztworu błękitu nitrotetrazolowego (1 mg/ml NBT w H2O, przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem, UWAGA). Powrót do inkubatora na 24-48 godzin. Ustawić temperaturę w temperaturze 4 °C na co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem liczenia. Poplamione talerze można przechowywać w temperaturze 4 °C przez jeden miesiąc. Policz kolonie za pomocą mikroskopu lub automatycznego licznika kolonii.</li>
</ol>
4. Ocena inhibicytacji fosfoprotein in vivo
<ol>
	<li>Zebrać komórki rosnące w fazie logarytmicznej przez odwirowanie w wirówce stołowej z prędkością 1 500 obr./min przez 5 minut. Umyć komórki raz sterylnym PBS i ponownie zawiesić w PBS w odpowiednim stężeniu (zwykle 1-5 x 10 7 komórek/ml). Przeszczep komórki w objętości 100 μl 6-12 tygodniowym myszom NSG przez dożylne wstrzyknięcie do żyły ogonowej za pomocą strzykawki insulinowej 28 G. Umieść zwierzę w unieruchomieniu, podgrzej ogon w zlewce z ciepłą wodą, aby rozszerzyły żyły, a przed wstrzyknięciem oczyść ogon wacikiem z chlorheksydyną. Po wstrzyknięciu należy uciskać miejsce wstrzyknięcia za pomocą jałowej gazy, aż do ustąpienia krwawienia. Przeszczep co najmniej 3 zwierzęta w grupie. Utrzymuj myszy na wodzie zawierającej 1 mg/ml siarczanu gentamycyny.</li>
	<li>Czternaście dni po przeszczepie, należy potraktować zwierzęta wyłącznie TKI lub podłożem i pobrać próbki do analizy zahamowania celu. Zważyć zwierzęta i podsycić je odpowiednią dawką (mg/kg masy ciała) TKI lub podłoża. Lek należy podawać w objętości 5 ml/kg masy ciała we wstrzyknięciu dootrzewnowym (i.p.) lub 10 ml/kg masy ciała przez zgłębnik doustny. W przypadku wstrzyknięcia dożylnego należy ręcznie przytrzymać mysz i wstrzyknąć w prawy dolny kwadrant brzucha za pomocą igły 29 G. W przypadku zgłębnika ustnego należy ręcznie przytrzymać mysz i trzymać zwierzę w pozycji pionowej. Umieść rurkę zgłębnika w jamie ustnej, nad językiem i w tylnej części jamy ustnej. Lekko dociśnij, aby przepuścić rurkę przez przełyk i do żołądka. Nacisnąć tłok strzykawki, aby podać lek. Jeśli tłok nie wciska się łatwo, igłębnik należy wyjąć i ponownie umieścić. Preparaty TKI należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.</li>
	<li> Jeśli pożądane jest poddanie działaniu perwanadatu, należy przygotować roztwór fotowoltaiczny 20 minut przed zbiorem, jak opisano powyżej (etap 1.1.4) i rozcieńczyć do podłoża za pomocą 1 μM MgCl2 i 100 U/ml DNazy (120 μl PV + 880 μl pożywki). Uwaga: PV jest stabilny przez co najmniej 1 godzinę po rozcieńczeniu.</li>
	<li>Uśmiercać zwierzęta za pomocą środka odurzającego CO2 w odpowiednim czasie lub czasie po poddaniu działaniu substancji. Wypreparuj kości udowe, usuwając sierść, skórę i mięśnie z całej nogi, tak aby kości były całkowicie odsłonięte. Usuń kości udowe, przycinając nożyczkami preparacyjnymi tuż pod stawem biodrowym i ponownie powyżej stawu kolanowego. Przenieść na szalkę Petriego i przepłukać szpik kostny 1 ml zimnego PBS lub rozcieńczonego roztworu PV za pomocą strzykawki i igły 27 G. W przypadku leczenia PV inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 10 minut.</li>
	<li>Przygotować lizaty i przeanalizować poziomy fosfobiałka i białka całkowitego, jak wskazano powyżej (kroki 1.1.6-1.2.5).</li>
	<li>Określić ilościowo względne poziomy fosfobiałka i białka całkowitego dla każdej próbki za pomocą densytometrii. Obliczyć fosfobiałko/białko całkowite w stosunku do średniej wartości fosfobiałka/białka całkowitego dla zwierząt leczonych nośnikiem.</li>
</ol>
5. Ocena aktywności przeciwbiałaczkowej TKI we WSZYSTKICH modelach ksenoprzeszczepów
<ol>
	<li>W razie potrzeby wystaw myszy na działanie promieniowania o natężeniu 200 cGy w promienniku RS-2000 na dzień przed przeszczepem. Przeszczep myszy z liniami komórkowymi białaczki, jak opisano powyżej (krok 4.1). Przeszczep co najmniej 6 myszy na grupę. Identyfikuj myszy po uderzeniu w ucho. Alternatywnie marker może być użyty do identyfikacji myszy ze znakami krzyżyka na ogonach. Dodać wzbogacenie do klatek, aby zmniejszyć ryzyko agresji ze strony kopulatora w klatce podczas badania.</li>
	<li>Myszy należy traktować za pomocą TKI lub nośnika tylko w sposób opisany powyżej (krok 4.2). Codziennie monitoruj stan zdrowia myszy poprzez badanie fizykalne i określanie wagi. Spodziewane objawy białaczki (obniżony poziom aktywności, utrata masy ciała, paraliż kończyn tylnych i infekcje oczu). Utrata masy ciała o więcej niż 10%-15% jest zwykle związana ze śmiercią myszy w ciągu dwóch dni i jest zazwyczaj zastępczym punktem końcowym śmierci zgodnie ze standardowymi wymaganiami IACUC.</li>
	<li>Monitoruj wszczepienie i rozwój białaczki za pomocą systemu obrazowania bioluminescencyjnego in vivo do 2 razy w tygodniu. Przygotuj 200x roztwór podstawowy D-lucyferyny (30 mg/ml) w sterylnej wodzie. Mieszaj delikatnie przez odwrócenie, aż D-lucyferyna całkowicie się rozpuści. Zużyć natychmiast lub podwielokrotność i zamrozić w temperaturze -20 °C. Przed obrazowaniem za pomocą systemu obrazowania bioluminescencyjnego in vivo rozmrozić porcje D-lucyferyny w temperaturze RT i rozcieńczyć 1:2 w PBS do końcowego stężenia 15 mg/ml i przefiltrować przez filtr 0,2 μm.</li>
	<li>Znieczulij myszy przed obrazowaniem za pomocą 1,5% wdychanego izofluranu w tlenie. Monitoruj wystarczające znieczulenie, charakteryzujące się rozluźnieniem mięśni, utratą ruchu i utratą odpowiedzi na stymulację palców u stóp.</li>
	<li>Bezpośrednio przed obrazowaniem należy podać 150 mg/kg masy ciała D-lucyferynę we wstrzyknięciu dożylnym (10 μl 15 mg/ml lucyferyny/g masy ciała).</li>
	<li>Użyj systemu obrazowania bioluminescencyjnego in vivo, aby uchwycić 2 serie obrazów z sekwencyjnymi ekspozycjami 30, 60 i 90 sekund oraz ostateczny obraz z ekspozycją 120 sekund. Po obrazowaniu umieść myszy z powrotem w klatkach i monitoruj powrót do zdrowia po znieczuleniu. W zależności od intensywności bioluminescencji czasy ekspozycji mogą być różne. Optymalne czasy ekspozycji powinny być z góry określone dla danego modelu i utrzymywane na stałym poziomie, tak aby natężenia sygnału dla poszczególnych punktów czasowych były porównywalne w całym badaniu.</li>
	<li>Określ intensywność bioluminescencji dla każdej myszy za pomocą oprogramowania do akwizycji i analizy Living Image 3.2. Określ całkowite wartości strumienia mierzone w fotonach/sekundę, rysując obszary zainteresowania (ROI) o identycznym rozmiarze na każdej myszy.</li>
	<li>Uśmierc myszy przez ekspozycję na CO2 i zwichnięcie szyjki macicy, jeśli są w stanie agonalnym, wykazując paraliż, w przypadku utraty masy ciała większej niż 15% lub pod koniec badania. Przeprowadź sekcję myszy i zapisz obserwacje (np. powiększenie śledziony, wątroby lub węzłów chłonnych; blady szpik kostny). Wypreparować kości udowe i przepłukać szpik kostny zimnym PBS za pomocą igły 27 G.</li>
	<li>Zebrać komórki w mikrofudze z prędkością 2,500 obr./min przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w PBS zawierającym 2% FBS i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zebrać komórki i wybarwić 20 mg/ml DAPI (dichlorowodorek 4,6-dimidino-2-fenyloindolu, 1:1,000) i sprzężonym z FITC α-hCD45 (1:100) lub mysim przeciwciałem kontrolnym izotypu IgG1 (1:100). Oceń wszczepienie białaczki za pomocą cytometrii przepływowej. Brama na żywotną populację (DAPI ujemna) i określ procent komórek CD45 + (% blastów szpiku kostnego).</li>
</ol>

<ol><li>Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Statistics.+2010%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J.+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer Statistics. 2010.</a> CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).</li>
<li>Kaatsch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+childhood+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Rev%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of childhood cancer.</a> Cancer Treat Rev. 36, 277-285 (2010).</li>
<li>Pui, C., Mullighan, C., Evans, W., Relling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+where+are+we+going+and+how+do+we+get+there%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there?</a> Blood. 120, 1165-1174 (2012).</li>
<li>Forman, S., Rowe, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myth+of+the+second+remission+of+acute+leukemia+in+the+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The myth of the second remission of acute leukemia in the adult.</a> Blood. 121, 1077-1082 (2013).</li>
<li>Ohanian, M., Cortes, J., Kantarjian, H., Jabbour, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+kinase+inhibitors+in+acute+and+chronic+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Tyrosine kinase inhibitors in acute and chronic leukemias.</a> Expert Opin Pharmacother. 13, 927-938 (2012).</li>
<li>Mikalsen, S., Kaalhus, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+pervanadate+and+permolybdate.+Connexin43%2C+phosphatase+inhibition%2C+and+thiol+reactivity+as+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Properties of pervanadate and permolybdate. Connexin43, phosphatase inhibition, and thiol reactivity as model systems.</a> J. Biol. Chem. 273, 10036-10045 (1998).</li>
<li>Zips, D., Thames, H., Baumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+anticancer+agents%3A+in+vitro+and+in+vivo+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation.</a> In Vivo. 19, 1-7 (2005).</li>
<li>Christoph, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+of+leukemia+cell+lines+in+vitro+and+in+mouse+xenografts%3A+Effects+of+monoclonal+and+polyclonal+cell+populations+on+intensity+and+kinetics+of+photon+emission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hematol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging of leukemia cell lines in vitro and in mouse xenografts: Effects of monoclonal and polyclonal cell populations on intensity and kinetics of photon emission.</a> J. Hematol. Oncol. 6, 10(2013).</li>
<li>Endresen, L., Tveit, K., Rugstad, H., Pihl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensitivity+measurements+of+human+tumour+cells+by+soft+agar+assays+are+influenced+by+the+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chemosensitivity measurements of human tumour cells by soft agar assays are influenced by the culture conditions.</a> Br. J. Cancer. 51, 843-852 (1985).</li>
<li>Tveit, K., Endresen, L., Rugstad, H., Fodstad, O., Pihl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+soft-agar+methods+for+assaying+chemosensitivity+of+human+tumours+in+vitro%3A+malignant+melanomas%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Comparison of two soft-agar methods for assaying chemosensitivity of human tumours in vitro: malignant melanomas.</a> Br. J. Cancer. 44, 539-544 (1981).</li>
<li>Rudin, M., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging in drug discovery and development.</a> Nat Rev Drug Discov. 2, 123-131 (2003).</li>
<li>Barrett, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescent+imaging+of+primary+patient+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+a+strategy+for+preclinical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling.</a> Blood. 118, 112-117 (2011).</li>
<li>Rice, B., Cable, M., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> J. Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W artykule opisano skuteczną strategię oceny nowych inhibitorów kinazy tyrozynowej w leczeniu ostrej białaczki. Stosując to podejście, aktywność biochemiczna i przeciwbiałaczkowa jest oceniana najpierw w testach komórkowych in vitro , a następnie w modelach ksenoprzeszczepów in vivo. Analizę immunoblot z powodzeniem wykorzystano do wykazania hamowania docelowej kinazy tyrozynowej w komórkach białaczkowych po leczeniu TKI oraz do bezpośredniego porównania siły działania wielu związków w komórkach. W prze...

Ostra białaczka limfoblastyczna (ALL) jest najczęstszą złośliwością u dzieci1,2. Całkowity wskaźnik przeżycia dla pediatrycznej linii B ALL (B-ALL) wynosi około 85%, ale niektóre podtypy biologiczne, w tym linia T ALL (T-ALL), mają nadal gorsze rokowanie, nawet przy obecnych protokołach terapeutycznych. Dalsze leczenie nawrotowej ALL pozostaje wyzwaniem3. Chociaż większość dorosłych pacjentów z ostrą białaczką osiąga remisję po wcześniejszej chemioterapii, wielu pacjentów nadal cierpi na nawrótchoroby 4. Wiadomo, że obecne schematy chemioterapeutyczne w leczeniu ostrej białaczki powodują krótko- i długoterminowe skutki uboczne związane z toksycznością. Dlatego bardzo potrzebne są mniej toksyczne terapie, które są ukierunkowane na komórki rakowe przy minimalnym wpływie na normalne tkanki. W ostatnich latach położono nacisk na rozwój nowych, ukierunkowanych molekularnie środków o specyficzności dla komórek nowotworowych, często wykorzystując iteracyjną chemię do generowania wielu związków aktywnych, które następnie muszą być porównywanei traktowane priorytetowo5. Niniejszy artykuł opisuje skuteczną strategię przedklinicznej oceny TKI w leczeniu ostrej białaczki, która może być wykorzystana do oceny pojedynczego związku lub do bezpośredniego porównania wielu związków w celu ułatwienia opracowywania leków.
Przedstawiona tutaj metoda składa się z czterech kroków. Najpierw ocenia się aktywność biochemiczną (1) i przeciwbiałaczkową (2) związku (ów) w hodowli komórkowej, następnie w modelach zwierzęcych potwierdza się hamowanie celu, a na końcu określa się skuteczność terapeutyczną TKI (tki) w modelach ksenoprzeszczepów białaczki ortotopowej (4). Do tych badań ważne jest, aby wybrać odpowiednie linie komórkowe, które są przedstawicielami najczęstszych podtypów biologicznych. Należy wybrać linie komórkowe, które zarówno wyrażają cel zainteresowania, jak i nie mają celu zainteresowania, aby zbadać, czy efekty biologiczne są pośredniczone przez hamowanie celu. Jest to szczególnie istotne dla rozwoju inhibitorów małocząsteczkowych, które mają działanie niezgodne z celem, które może być ważne dla aktywności przeciwnowotworowej. Konieczne jest również wybranie linii komórkowej, która jest zależna od celu pod względem efektów funkcjonalnych, takich jak proliferacja lub przeżycie. Wstępne badania walidacyjne celu (poza zakresem tego artykułu) wykorzystujące interferencję RNA lub inne specyficzne środki do hamowania celu mogą być wykorzystane do identyfikacji linii komórkowych zależnych od celu. Pożądane jest również wybranie linii komórkowych, które mogą tworzyć mysie ksenoprzeszczepy, tak aby wyniki hodowli komórkowych można było bardziej bezpośrednio przełożyć na eksperymenty in vivo.
Do oceny aktywności biochemicznej, w której pośredniczą TKI w komórkach białaczkowych, spadek fosforylacji receptorów może być wykorzystany jako wskaźnik hamowania celu. Można zastosować analizę Western blot lub testy ELISA, w zależności od dostępności i swoistości przeciwciał. Jeśli dostępne są przeciwciała o swoistości wystarczającej dla celu, preferowane są testy ELISA, ponieważ są one bardziej ilościowe i skuteczne. W przypadkach, gdy przeciwciała o wystarczającej swoistości dla testu ELISA nie są dostępne, może być konieczna analiza western blot. W takim przypadku immunoprecypitacja dużej ilości lizatu może być przydatna do wykrywania celów, które są w niskiej liczebności. Podejście to jest szczególnie istotne w przypadku pomiaru fosfobiałek, które mogą mieć krótki okres półtrwania, aby umożliwić szybkie zmiany w sygnalizacji w odpowiedzi na bodźce środowiskowe. Niektóre fosforylowane białka są niezwykle labilne, najprawdopodobniej w wyniku kompleksowego tworzenia fosfataz. W celu solidnego i spójnego wykrywania tych fosforylowanych białek, możliwe jest również leczenie komórek perwanadatem, nieodwracalnym inhibitorem fosfatazy białkowo-tyrozynowej6, w celu ustabilizowania fosfoproteiny przed przygotowaniem lizatów całych komórek.
Aby określić, czy aktywność biochemiczna powoduje efekty przeciwnowotworowe, można monitorować procesy biologiczne zależne od celu w eksperymentach komórkowych. W przypadku linii komórkowych białaczki aktywność przeciwbiałaczkową, w której pośredniczą TKI, można ocenić za pomocą testów tworzenia kolonii przeprowadzonych w metylocelulozie lub miękkim agarze7. Miękki agar może być preferowany, ponieważ jest to stałe podłoże, które jest bardziej podatne na manipulację, jeśli konieczne jest wielokrotne traktowanie PTKI. Podczas gdy wiele linii komórkowych ostrej białaczki myloidowej (AML) utworzy kolonie w miękkim agarze , większość linii komórkowych ALL utworzy kolonie tylko w metylocelulozie, która jest podłożem półstałym. Chociaż możliwe jest odświeżanie pożywki i/lub TKI w kulturach metylocelulozy, można stosować tylko małe objętości i z ograniczoną częstotliwością. Podobnie trudniej jest zabarwić kolonie bez ich uszkodzenia w metylocelulozie. Wstępne badania powinny określić zdolność odpowiednich linii komórkowych do tworzenia kolonii w metylocelulozie i/lub miękkim agarze oraz optymalną gęstość komórek w hodowli, tak aby kolonie nie nakładały się na siebie i były w liczbie wystarczającej do uzyskania statystycznie istotnych danych (zwykle 50-200 kolonii na płytkę 35 mm).
Podczas gdy testy in vitro są solidne i opłacalne, a także mają mniej implikacji etycznych niż eksperymenty na całych zwierzętach, postęp związków terapeutycznych wymaga dowodu skuteczności i bezpieczeństwa w modelach zwierzęcych. W badaniach in vivo ludzkie linie komórkowe ostrej białaczki można ortotopowo przeszczepić do myszy NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), a TKI można łatwo podawać przez wstrzyknięcie lub zgłębnik doustny. Niektóre linie komórkowe mogą wymagać ekspozycji myszy NSG na niską dawkę promieniowania zależną od linii komórkowej w celu ustabilizowania się ksenoprzeszczepów, aw tym przypadku myszy mogą nie tolerować zgłębnika doustnego bez 5-10-dniowego okresu rekonwalescencji po napromieniowaniu. Ten manuskrypt opisuje generowanie ksenoprzeszczepów B-ALL i T-ALL przy użyciu określonych linii komórkowych (697 i Jurkat) jako przykładów, ale ksenoprzeszczepy mogą być ustalane u myszy NSG przy użyciu szerokiej gamy linii komórkowych. W przypadku, gdy inne linie komórkowe są bardziej odpowiednie, wymóg napromieniania, optymalna liczba komórek do przeszczepienia oraz czas wystąpienia i progresji choroby powinny być określone doświadczalnie. Idealnie byłoby, gdyby modele te charakteryzowały się pełną penetracją (u każdego przeszczepionego zwierzęcia rozwija się białaczka), spójną kinetyką (białaczka postępuje podobnie u wszystkich zwierząt) oraz rozsądnym oknem leczenia (najlepiej 20-30 dni między rozpoczęciem leczenia a usunięciem z badania z powodu choroby). W razie potrzeby liczbę przeszczepianych komórek można zwiększyć w celu poprawy penetracji i spójności kinetycznej lub zmniejszyć, aby poprawić okno leczenia.
Aby ustalić, czy TKI pośredniczą w hamowaniu celu in vivo, pobiera się próbki od myszy z ksenoprzeszczepami białaczkowymi po leczeniu TKI lub samym nośnikiem. Idealnie byłoby, gdyby dawka i schemat podawania w tych eksperymentach były oparte na badaniach farmakokinetycznych , które często mogą być wykonywane przez laboratoria komercyjne i wykraczają poza zakres tego artykułu. Jeśli dostępne są dane farmakokinetyczne, stężenie związku wymagane do skutecznego zahamowania działania docelowego w hodowli komórkowej oraz maksymalne stężenie w surowicy po podaniu pojedynczej dawki TKI mogą być wykorzystane do określenia dawki początkowej w badaniach na zwierzętach. Badania farmakokinetyczne mogą również dostarczyć informacji na temat czasu pobrania próbki po leczeniu w badaniach farmakodynamicznych oraz drogi podawania. Zahamowanie celu można ocenić w każdym dotkniętym narządzie, ale preferowane są tkanki, które najłatwiej jest pobrać i przetworzyć. Większość linii komórkowych ostrej białaczki tworzy się w wątrobie, szpiku kostnym, śledzionie, krwi obwodowej i ośrodkowym układzie nerwowym, chociaż konkretne narządy dotknięte chorobą i zakres wszczepienia w tych narządach różnią się w zależności od modelu. Przedstawiony tutaj protokół ocenia hamowanie fosfoprotein w szpiku kostnym za pomocą analizy western blot, ale narządy stałe mogą być łatwiejsze do konsekwentnego pobierania i wymagać minimalnego przetwarzania lub nie wymagać żadnego przetwarzania przed zamrożeniem, co daje mniejsze możliwości degradacji fosfoprotein podczas pobierania i przetwarzania próbek. Immunohistochemia może być również stosowana do oceny guzów litych lub narządów dotkniętych białaczką.
Na koniec, skuteczność terapeutyczna TKI jest określana w modelach ksenoprzeszczepów białaczki ortotopowej. W przypadku tych badań czas rozpoczęcia leczenia może być zróżnicowany, tak aby choroba była mniej więcej ustalona. Leczenie można rozpocząć natychmiast po przeszczepieniu w przypadku badań wstępnych, a następnie zostać opóźnione w kolejnych badaniach do czasu wykrycia znacznego obciążenia chorobą, aby bardziej zbliżyć się do modelu leczenia diagnostycznego. Idealnie byłoby, gdyby te modele zwierzęce miały również zdolność do nieinwazyjnego pomiaru obciążenia chorobami. Zoptymalizowaliśmy metody wprowadzania genu lucyferazy świetlika do linii komórkowych białaczki za pomocą cząsteczek wirusopodobnych, co pozwala na nieinwazyjną, podłużną analizę początku i progresji choroby oraz ocenę obciążenia chorobą w szpiku kostnym i narządach stałych. Kluczowe znaczenie dla tego podejścia ma zastosowanie monoklonalnych linii komórkowych znakowanych lucyferazą w celu zapobieżenia zmienności w rozwoju białaczki wykazującej ekspresję lucyferazy związanej z użyciem poliklonalnych linii komórkowych i nie ma związku z leczeniem TKI8.
Razem wzięte, te kroki mogą być użyte do oceny pojedynczego TKI lub do bezpośredniego porównania i rankingu wielu TKI. Podczas gdy przedstawione tutaj protokoły koncentrują się na opracowywaniu TKI, metody te można dostosować do innych celów i opisano rozważania dotyczące opracowywania testów. W związku z tym strategia ta może mieć szersze zastosowanie do oceny przedklinicznej środków ukierunkowanych molekularnie w leczeniu ostrej białaczki.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Odczynnik/Materiał</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>MP Biomedicals</td><td>#02194057</td><td>GHS05, GHS07, H302-H318</td></tr><tr><td>Ortowanadan sodu</td><td>Sigma</td><td>#S6508</td><td>GHS07, H302+ H312+H332&nbsp;</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#M7522</td><td>GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>ColonyGel Podłoże bazowe dla ludzi&nbsp;</td><td>ReachBio</td><td>#1101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bromek 3-(4,5-dimetylo-2-tiazolilo)-2,5-difenylo-2H-tetrazolowy (MTT)</td><td>Sigma</td><td>#M5655</td><td>GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Agar szlachecki Difco&nbsp;</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>#214883</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Niebieski chlorek nitrotetrazolu</td><td>Sigma</td><td>#N6639</td><td>GHS07, H302&nbsp;</td></tr><tr><td>D-Lucyferin Firefly, Sól potasowa</td><td>PerkinElmer</td><td>#122796</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dihydochlorek 4',6-dimidino-2-fenyloindolu</td><td>Sigma</td><td>#D9542</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FITC CD45&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>#347463</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FITC Mysz IgG1 Kontrola izotypu</td><td>BD Bioscience</td><td>#51-35404X-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny</td><td>Sparhawk</td><td>#NDC58005-633-04</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Inhibitory proteazy&nbsp;</td><td>Roche</td><td>#11836153001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>#D4263</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Białko G</td><td>Beads Invitrogen</td><td>#10-1242</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>VETONE</td><td>#NDC13985-030-60</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><mocny>Sprzęt</mocny></td></tr><tr><td>Szalki do hodowli komórkowych, średnica 35 mm i czasy; H 10 mm</td><td>Nunclon</td><td>#D7804-500EA</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Szalki do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm x&nbsp; H 20 mm&nbsp; &nbsp;</td><td>Nunclon</td><td>#D8429-1CS&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>BD Bioscience</td><td>#353046</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Igły o końcu o rozmiarze 14 x 4 calach</td><td>Nauka o kadencji</td><td>#7956</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Strzykawka 5 ml z luer-lok</td><td>BD Bioscience</td><td>#309646</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Automatyczny licznik kolonii</td><td>GelCount Oxford Optronix</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>System obrazowania bioluminescencyjnego in vivo</td><td>PerkinElmer</td><td>#IVIS200</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Wagi przenośne Scout pro, waga</td><td>Ohaus</td><td>#SP202</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Środek powstrzymujący gryzonie w stylu Broome</td><td>Plas-labs</td><td>#551-BSRR</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dziurkacz do uszu, średnica stempla: 2 mm</td><td>FST</td><td>#24210-02</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Waciki z chlorheksydyną, Prevantics</td><td>PDI</td><td></td>#B10800<td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa 1 ml (40 jednostek) 29 g x 1/2</td><td>monoject</td><td>#8881500042</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Plastikowe igły do karmienia gryzoni (jednorazowe) 20 ga x 38 mm, sterylne</td><td>Instech</td><td>#FTP-20-38</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>1 ml jednorazowa strzykawka Luer-Lok</td><td>BD Bioscience</td><td>#309628</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa Lo-Dose U-100 z igłą 28 G x &frac12;, przymocowana na stałe BD</td><td>Bioscience</td><td>#329465</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bardzo cienkie nożyczki do bonn</td><td>FST</td><td>#14084-08</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki studenckie</td><td>FST</td><td>#91460-11</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultracienkie kleszcze Moria</td><td>FST</td><td>#11370-40</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bardzo cienkie szczypce graefe</td><td>FST</td><td>#11150-10</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rękojeść do skalpela</td><td>FST</td><td>#10003-12</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ostrza skalpela</td><td>FST</td><td>#10011-00</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

przedkliniczna ocena inhibitorów kinazy tyrozynowej w leczeniu ostrej białaczki

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptorowe kinazy tyrozynowe są zaangażowane w rozwój i progresję wielu nowotworów, w tym białaczki i guzów litych, i są atrakcyjnymi celami terapeutycznymi. W tym miejscu opisujemy skuteczną czteroetapową strategię przedklinicznej oceny inhibitorów kinazy tyrozynowej (TKI) w leczeniu ostrej białaczki. Początkowo analiza western blot służy do potwierdzenia zahamowania celu w hodowanych komórkach białaczkowych. Aktywność funkcjonalna jest następnie oceniana za pomocą testów klonogennych w kulturach metylocelulozy lub miękkiego agaru. Związki eksperymentalne, które wykazują aktywność w testach hodowli komórkowych, są oceniane in vivo przy użyciu myszy NOD-SCID-gamma (NSG) przeszczepionych ortotopowo z ludzkimi liniami komórkowymi białaczki. Wstępne badania farmakodynamiczne in vivo oceniają hamowanie docelowe w blastach białaczkowych wyizolowanych ze szpiku kostnego. Podejście to stosuje się w celu określenia dawki i schematu podawania wymaganych do skutecznego zahamowania celu. Kolejne badania oceniają skuteczność TKI in vivo przy użyciu komórek białaczkowych eksprymujących lucyferazy, umożliwiając w ten sposób nieinwazyjne bioluminescencyjne monitorowanie obciążenia białaczką i ocenę odpowiedzi terapeutycznej za pomocą systemu obrazowania bioluminescencyjnego in vivo. Strategia ta okazała się skuteczna w ocenie TKI in vitro i in vivo i może być stosowana do identyfikacji środków ukierunkowanych molekularnie o potencjale terapeutycznym lub do bezpośredniego porównania i priorytetyzacji wielu związków.

Przedstawione tutaj testy oceniają efekty biochemiczne i funkcjonalne pośredniczone przez inhibitory kinaz tyrozynowych (TKI) i mogą być wykorzystane do rankingu nowych związków na podstawie stopnia inhibicji celu in vitro oraz in vivo, redukcji tworzenia kolonii oraz opóźnienia leukemogenezy u myszy NSG przeszczepionych komórkami białaczki znakowanymi lucyferazą.
Do określenia stopnia inhibicji aktywnej formy fosforylowanej białka docelowego w komórkach białaczki po zastosow...

Receptorowe kinazy tyrozynowe są ektopowo wyrażane w wielu nowotworach i zostały zidentyfikowane jako cele terapeutyczne w ostrej białaczce. W artykule opisano skuteczną strategię oceny przedklinicznej inhibitorów kinazy tyrozynowej w leczeniu ostrej białaczki.

Przedkliniczna ocena inhibitorów kinazy tyrozynowej w leczeniu ostrej białaczki

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest efektywna ocena przedkliniczna inhibitorów tyrozynowej kinazy w leczeniu ostrej białaczki. Jest to realizowane poprzez przeprowadzenie w pierwszej kolejności analizy Western blot krwi w celu potwierdzenia inhibicji celu w hodowlanych komórkach białaczkowych. Drugim krokiem jest ocena aktywności funkcjonalnej z wykorzystaniem testu kolonogennego w metylocelulozie lub na podłożu półpłynnym.Kolejne badania farmakodynamiczne są wykorzystywane do oceny inhibicji celu w blastach białaczkowych w szpiku kostnym myszy z przeszczepioną ludzką białaczką. Uzyskane dane służą do określenia dawki i schematu podawania niezbędnych do skutecznej inhibicji celu in vivo. Ostatecznie strategia ta jest wykorzystywana do oceny skuteczności terapeutycznej TKI in vivo przy użyciu obrazowania bioluminescencyjnego.Niniejsza strategia została opracowana w celu wyłonienia najlepszego kandydata na inhibitor tyrozynowej kinazy do dalszych badań klinicznych. Procedury opisane w tym filmie mogą być wykorzystane do skutecznej oceny inhibitorów tyrozynowych kinaz in vitro oraz in vivo, aby zidentyfikować środki ukierunkowane o potencjale terapeutycznym oraz porównać wiele zwi

pre-clinical-evaluation-tyrosine-kinase-inhibitors-for-treatment

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przedkliniczne Ocena Inhibitorów Kinazy Tyrozyny w Leczeniu Ostrej Białaczki

Pojawienie się genetycznej oporności na terapię inhibitorami kinaz stanowi poważne wyzwanie dla skutecznej terapii przeciwnowotworowej. Identyfikacja i charakterystyka mutacji opornych na nowo opracowany lek pomaga w lepszym zarządzaniu klinicznym i projektowaniu leków nowej generacji. W tym miejscu opisujemy nasz protokół badań przesiewowych in vitro i walidacji opornych mutacji.

Metoda badań przesiewowych i walidacji opornych mutacji przeciwko inhibitorom kinaz

Tutaj prezentujemy protokół dla macierzy przeciwciał do identyfikacji zmian w szlakach sygnałowych w różnych modelach komórkowych. Zmiany te, spowodowane przez leki/niedotlenienie/światło ultrafioletowe/promieniowanie lub przez nadekspresję/regulację w dół/nokauty, są ważne dla różnych modeli choroby i mogą wskazywać, czy terapia będzie skuteczna lub czy mogą zidentyfikować mechanizmy oporności na leki.

Ocena oporności na inhibitory kinazy tyrozynowej poprzez badanie szlaków transdukcji sygnału przez macierze przeciwciał

Tutaj opisujemy protokoły genetycznej i chemicznej walidacji c-Fos i Dusp1 jako celu terapeutycznego w białaczce, używając genetycznych i humanizowanych modeli mysich in vitro i in vivo. Metodę tę można zastosować do dowolnego celu walidacji genetycznej i rozwoju terapeutycznego.

Metody oceny roli c-fos i dusp1 w zależności onkogenu

Tutaj opisujemy protokół, w którym model ksenoprzeszczepu uzyskany od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną jest używany jako strategia oceny i monitorowania toksyczności związanej z receptorem chimerycznego antygenu T ukierunkowanym na CD19.

Ocena toksyczności związanej z chimerycznym receptorem antygenowym limfocytów T przy użyciu mysiego modelu ksenoprzeszczepu pobranego od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną

W tym miejscu opisano metodę opartą na cytometrii fosfoprzepływowej do analizy sygnalizacji za szlakami mTORC1, JAK / STAT5 i MAPK w ostrych ludzkich komórkach białaczki szpikowej ksenoprzeszczepowanych myszom i uzyskanych z aspiratów szpiku kostnego. Poziomy p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 i p-ERK1/2 są jednocześnie mierzone za pomocą spektralnego cytometru przepływowego nowej generacji o wysokiej czułości.

Wewnątrzkomórkowa cytometria fosfoflowa ostrej białaczki szpikowej Ksenotransplantacje pochodzące od pacjentów

Protokół ten opisuje skuteczną metodę ilościowego określania różnic w uszkodzeniach DNA wywołanych przez inhibitory typu I i typu II w zmutowanych komórkach FLT3 poprzez zastosowanie testu komety.

Test kometarny w celu ilościowego określenia uszkodzeń DNA w komórkach 32D z ekspresją mutanta FLT3 po ekspozycji na inhibitory FLT3 typu I i II

Protokół ma na celu opisanie mysiego modelu generującego nawroty ostrej białaczki limfoblastycznej, oparty na dynamice odpowiedzi na chemioterapię indukcyjną.

Model myszy nawrotu białaczki do indukcyjnej chemioterapii ostrej białaczki limfoblastycznej

Celem tej techniki jest ocena funkcji neurotransmitera serotoniny (5-HT) u żywego, oddychającego swobodnie zwierzęcia z wykorzystaniem farmakologicznego obrazowania rezonansem magnetycznym (phMRI) oraz dożylnego podania fluoksetyny, będącej selektywnym inhibitorem zwrotnego wychwytu serotoniny (SSRI).

Zastosowanie fMRI z wyzwaniem farmakologicznym w badaniach przedklinicznych: aplikacja do układu 5-HT

Ustanowienie ortotopowego modelu nowotworu pęcherza moczowego w celu oceny efektów przeciwnowotworowych wewnątrz pęcherzowo podanego saRNA oraz monitorowanie wzrostu guza za pomocą ultradźwięków i obrazowania bioluminescencyjnego.

Ortotopowy model nowotworu pęcherza moczowego oraz ocena leczenia wewnątrz pęcherzowego za pomocą saRNA

Złożone masy tkankowe, od organów po guzy, składają się z różnych elementów komórkowych. Wyjaśniliśmy udział fenotypów komórkowych w tkance przy użyciu wieloznakowanych fluorescencyjnych myszy transgenicznych w połączeniu z wieloparametrowym barwieniem immunofluorescencyjnym, a następnie rozmieszaniem widmowym w celu rozszyfrowania pochodzenia komórek, a także cech komórek na podstawie ekspresji białka.

Ilościowa analiza wielospektralna po przeszczepie tkanki fluorescencyjnej w celu wizualizacji pochodzenia, typów i interakcji komórek

Poznaj strategię przedklinicznej oceny inhibitorów kinazy tyrozynowej w leczeniu ostrej białaczki. Metoda obejmuje Western blot, analizy klonogenne i bioluminescencyjne obrazowanie terapeutycznej skuteczności in vivo.

Przedkliniczna ocena inhibitorów kinazy tyrozynowej w leczeniu ostrej białaczki

Przeglądaj więcej filmów