Name: Test egzonukleazy oparty na fluorescencji w celu scharakteryzowania DmWRNexo, ortologu ludzkiej egzonukleazy progeroidalnej WRN i jej zastosowania do innych nukleaz (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Poznaj fluorescencyjny test aktywności egzonukleazy w badaniach stabilności genomu. Ta metoda umożliwia analizę aktywności enzymu WRN i preferencji substratowych w sposób odtwarzalny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy międzyradnemu Programowi Nowej Dynamiki Starzenia za sfinansowanie tej pracy [ES/G037086/1] oraz Prof. Dave'owi Sherrattowi (Wydział Biochemii, Uniwersytet Oksfordzki) za dostęp do Fuji FLA-3000.

<ol><li>Mason, P. A., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+DNA+exonucleases+in+protecting+genome+stability+and+their+impact+on+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%22%5BJournal%5D)">The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing.</a> Age (Dordr. 34, 1317-1340 (2012).</li>
<li>Payne, M., Hickson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+instability+and+cancer%3A+lessons+from+analysis+of+Bloom%27s+syndrome%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Genomic instability and cancer: lessons from analysis of Bloom's syndrome).</a> Biochem. Soc. Trans. 37, 553-559 (2009).</li>
<li>Yu, C. E., Oshima, J., Fu, Y. H., Wijsman, E. M., Hisama, F., Alisch, R., Matthews, S., Nakura, J., Miki, T., Ouais, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+cloning+of+the+Werner%27s+syndrome+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Positional cloning of the Werner's syndrome gene.</a> Science. 272, 258-262 (1996).</li>
<li>Huang, S., Li, B., Gray, M. D., Oshima, J., Mian, I. S., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+premature+ageing+syndrome+protein%2C+WRN%2C+is+a+3%27--%3E5%27+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">The premature ageing syndrome protein, WRN, is a 3'-->5' exonuclease.</a> Nat. Genet. 20, 114-116 (1998).</li>
<li>Goto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndrome-causing+mutations+in+Werner+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Trends%22%5BJournal%5D)">Syndrome-causing mutations in Werner syndrome.</a> Biosci. Trends. 2, 147-150 (2008).</li>
<li>Perry, J. J., Yannone, S. M., Holden, L. G., Hitomi, C., Asaithamby, A., Han, S., Cooper, P. K., Chen, D. J., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WRN+exonuclease+structure+and+molecular+mechanism+imply+an+editing+role+in+DNA+end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">WRN exonuclease structure and molecular mechanism imply an editing role in DNA end processing.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 13, 414-422 (2006).</li>
<li>Opresko, P. L., Laine, J. P., Brosh, R. M., Seidman, M. M., Bohr, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+action+of+the+helicase+and+3%27+to+5%27+exonuclease+of+Werner+syndrome+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coordinate action of the helicase and 3' to 5' exonuclease of Werner syndrome protein.</a> J. Biol. Chem. 276, 44677-44687 (2001).</li>
<li>Plchova, H., Hartung, F., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+an+exonuclease+from+Arabidopsis+thaliana+reveals+similarities+to+the+DNA+exonuclease+of+the+human+Werner+syndrome+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of an exonuclease from Arabidopsis thaliana reveals similarities to the DNA exonuclease of the human Werner syndrome protein.</a> J. Biol. Chem. 278, 44128-44138 (2003).</li>
<li>Hartung, F., Plchova, H., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterisation+of+RecQ+homologues+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular characterisation of RecQ homologues in Arabidopsis thaliana.</a> Nucleic Acids Res. 28, 4275-4282 (2000).</li>
<li>Saunders, R. D., Boubriak, I., Clancy, D. J., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+Drosophila+ortholog+of+WRN+exonuclease+that+is+required+to+maintain+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a Drosophila ortholog of WRN exonuclease that is required to maintain genome integrity.</a> Aging Cell. 7, 418-425 (2008).</li>
<li>Cox, L. S., Boubriak, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Instability+in+Premature+Aging%2C+in+DNA+Damage+Repair%2C+Repair+Mechanisms+and+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Thomas%2C+A.E.%2C+Eds.+Nova+Science+Publishers%22%5BJournal%5D)">DNA Instability in Premature Aging, in DNA Damage Repair, Repair Mechanisms and Aging.</a> Thomas, A.E., Eds. Nova Science Publishers. , 1-34 (2010).</li>
<li>Cox, L. S., Clancy, D. J., Boubriak, I., Saunders, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Werner+Syndrome+in+Drosophila+melanogaster%3A+hyper-recombination+in+flies+lacking+WRN-like+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Modeling Werner Syndrome in Drosophila melanogaster: hyper-recombination in flies lacking WRN-like exonuclease.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1119, 274-288 (2007).</li>
<li>Boubriak, I., Mason, P. A., Clancy, D. J., Dockray, J., Saunders, R. D., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DmWRNexo+is+a+3%27-5%27+exonuclease%3A+phenotypic+and+biochemical+characterization+of+mutants+of+the+Drosophila+orthologue+of+human+WRN+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">DmWRNexo is a 3'-5' exonuclease: phenotypic and biochemical characterization of mutants of the Drosophila orthologue of human WRN exonuclease.</a> Biogerontology. 10, 267-277 (2009).</li>
<li>Mason, P. A., Boubriak, I., Robbins, T., Lasala, R., Saunders, R., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+orthologue+of+progeroid+human+WRN+exonuclease%2C+DmWRNexo%2C+cleaves+replication+substrates+but+is+inhibited+by+uracil+or+abasic+sites+%3A+Analysis+of+DmWRNexo+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%29%22%5BJournal%5D)">The Drosophila orthologue of progeroid human WRN exonuclease, DmWRNexo, cleaves replication substrates but is inhibited by uracil or abasic sites : Analysis of DmWRNexo activity in vitro.</a> Age (Dordr). , (2012).</li>
<li>Machwe, A., Xiao, L., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Length-dependent+degradation+of+single-stranded+3%27+ends+by+the+Werner+syndrome+protein+%28WRN%29%3A+implications+for+spatial+orientation+and+coordinated+3%27+to+5%27+movement+of+its+ATPase%2Fhelicase+and+exonuclease+domains%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Length-dependent degradation of single-stranded 3' ends by the Werner syndrome protein (WRN): implications for spatial orientation and coordinated 3' to 5' movement of its ATPase/helicase and exonuclease domains.</a> BMC Mol. Biol. 7, 6 (2006).</li>
<li>Mangerich, A., Veith, S., Popp, O., Fahrer, J., Martello, R., Bohr, V. A., Burkle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+WRN+exonuclease+activity+by+isotope+dilution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of WRN exonuclease activity by isotope dilution mass spectrometry.</a> Mech. Ageing Dev. 133, 575-579 (2012).</li>
<li>Xue, Y., Ratcliff, G. C., Wang, H., Davis-Searles, P. R., Gray, M. D., Erie, D. A., Redinbo, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+exonuclease+domain+of+WRN+forms+a+hexamer+on+DNA+and+possesses+both+3%27-+5%27+exonuclease+and+5%27-protruding+strand+endonuclease+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A minimal exonuclease domain of WRN forms a hexamer on DNA and possesses both 3'- 5' exonuclease and 5'-protruding strand endonuclease activities.</a> Biochemistry. 41, 2901-2912 (2002).</li>
<li>Machwe, A., Ganunis, R., Bohr, V. A., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blockage+of+the+3%27--%3E5%27+exonuclease+activity+of+WRN+protein+by+certain+oxidative+modifications+and+bulky+lesions+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selective blockage of the 3'-->5' exonuclease activity of WRN protein by certain oxidative modifications and bulky lesions in DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28, 2762-2770 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Określenie aktywności egzonukleazy oczyszczonych białek wymaga analizy produktów rozpadu DNA. Sekwencyjne rozszczepianie DNA przez egzonukleazy można uwidocznić poprzez oddzielenie znakowanych produktów rozszczepienia na żelach akrylowoamidowych. Historycznie rzecz biorąc, wiązało się to z końcowym znakowaniem substratu DNA za pomocą znakowania radioaktywnego (np. 32P lub 35S), ale z wadami związanymi ze stosowaniem znakowania radioaktywnego (koszt, kwestie bezpieczeństwa i niestabilność w ...

Nukleazy odgrywają istotną rolę w komórkach w usuwaniu uszkodzonego DNA, rozwiązywaniu struktur nonduplex, takich jak połączenia Hollidaya i zapewnianiu zdolności do korekty podczas replikacji DNA, zarówno wewnętrznej w polimerazach DNA, jak i zewnętrznej do nich1. Nukleazy mogą działać albo poprzez sekwencyjną degradację DNA z wolnych końców (egzonukleazy), albo przez rozszczepianie wewnętrznych wiązań fosfodiestrowych w dłuższej cząsteczce DNA (endonukleazy). Utrata aktywności nukleazy może skutkować wysoce specyficznymi fenotypami niestabilności genomu. Podczas gdy mutacja BLM należącej do rodziny helikazy RecQ powoduje nadmiernie wysokie wskaźniki wymiany chromatyd siostrzanych i globalnie podwyższone wskaźniki zachorowań na raka (przegląd Payne'a i Hicksona2), mutacja wysoce spokrewnionego białka WRN prowadzi do przedwczesnego starzeniasię 3; główną istotną różnicą między tymi dwoma członkami rodziny jest obecność domeny egzonukleazy 3'-5' z WRN4. Dowody na kluczową rolę egzonukleazy WRN w utrzymaniu stabilności genomu zgromadzono z analizy genotypów u pacjentów z WS5, wraz z badaniami mutacji punktowych i delecji w komórkach ludzkich, poparte badaniami krystalograficznymi izolowanej domeny egzonukleazy6. Jednak współpraca i wzajemne oddziaływanie między aktywnością egzonukleazy WRN a jej centralną aktywnością helikazy7 utrudnia wyodrębnienie funkcjonalności każdego z nich i ich względnego wkładu w stabilność genomu. U roślin i zwierząt z niższych warstw metazoanowych aktywność egzonukleazy WRN występuje na pojedynczym polipeptydzie pozbawionym aktywności helikazy8-10 (przegląd w Cox i Boubriak11); wykazano biochemicznie u Arabidopsis, że ta egzonukleaza działa koordynacyjnie z pokrewną helikazą WRN, skutecznie odtwarzając połączone aktywności enzymatyczne obserwowane u kręgowców WRN9. Badaliśmy egzonukleazę WRN u Drosophila, ponieważ doskonałe narzędzia genetyczne pozwalają na analizę wpływu mutacji egzonukleazy (bez wpływu na przypuszczalną pokrewną helikazę) na poziomie całego organizmu i poprzez rozwój10,12. Ponadto sklonowaliśmy, poddaliśmy ekspresji i oczyszczeniu rekombinowanej egzonukleazy Drosophila WRN (DmWRNexo), co pozwoliło na pełną analizę biochemiczną jej właściwości enzymatycznych13,14.
Analiza nukleazy in vitro tradycyjnie była przeprowadzana przy użyciu radioznakowanych oligonukleotydów, oceniając degradację poprzez szukanie drabinek produktów na żelach akrylamidowych4,8,15. Chociaż są to testy wrażliwe, nie są one ilościowo odtwarzalne z dnia na dzień ze względu na rozpad promieniotwórczy znakowanych substratów. Ponadto obchodzenie się z odczynnikami promieniotwórczymi i ich usuwanie stanowi poważne zagrożenie dla środowiska i zdrowia; Coraz większym problemem staje się również pozyskiwanie radioznaków. Alternatywna najnowsza metoda polega na ocenie ilości końcowego produktu degradacji za pomocą spektrometrii mas16. Jest to jednak czasochłonne (zajmuje kilka dni), wymaga specjalistycznego sprzętu, a odczyt to ilość produktu końcowego (pojedynczego nukleotydu), więc nie nadaje się do czułych pomiarów takich aspektów, jak procesywność enzymatyczna lub do określenia, czy niektóre nukleotydy, sekwencje lub modyfikacje prowadzą do wstrzymania lub zatrzymania nukleazy. Aby przezwyciężyć te problemy, dostosowaliśmy tradycyjne testy na bazie żelu do stosowania z fluorescencyjnymi substratami oligonukleotydowymi, generując stabilnie znakowane substraty, które mogą być używane w sposób powtarzalny przez długi czas, a tym samym umożliwiają bezpośrednie porównanie aktywności nukleazy w różnych warunkach.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silny>odczynnik/Materiał</td></tr><tr><td>Niestandardowe oligonukleotydy</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>Konieczne jest uzyskanie ich w wysokiej czystości np. z oczyszczaniem PAGE.</td></tr><tr><td></td><td></td><td>5'FLO</td><td>fluoresceina-5' GAACTATGGCTCTC GAGTGCTAGGACATGTCTGA CTACGTACAAGTCACC - 3'bubble</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>5'- GGTGACTTGTACGT AGTCAGACATGTCCTAGCAC TCGAGAGCCATAGTTC-3'40</td></tr><tr><td>% 19:1 Roztwór akrylamidu</td><td>Severn Biotech</td><td>20-2400-05</td><td>UWAGA: silna neurotoksyna, dlatego przez cały czas</td></tr> <tr><td>należy nosić rękawiczkiKolumny His-Trap (1 ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Wszystkie inne odczynniki</td><td>dowolny renomowany dostawca</td><td></td><td>Wymagany jest stopień biologii molekularnej (bez DNazy); probówki do mikrofug podobnie powinny być wolne od DNaz i RNaz</td></tr><td colspan="4">EquipmentHoefer SE400 aparatura żelowa Hoefer SE400-15-1.5 FLA-3000 (luminofor i fluorescencja <tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> imager)</td> Czytnik obrazów <td>Fuji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V2.02</td><td>Miernik obrazu FujiFilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V3.3</td><td>FujiFilm</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

test egzonukleazy oparty na fluorescencji w celu scharakteryzowania dmwrnexo, ortologu ludzkiej egzonukleazy progeroidalnej wrn i jej zastosowania do innych nukleaz

A Fluorescence-based Exonuclease Assay to Characterize DmWRNexo, Orthologue of Human Progeroid WRN Exonuclease, and Its Application to Other Nucleases

Egzonukleaza WRN bierze udział w rozwiązywaniu uszkodzeń DNA, które występują zarówno podczas replikacji DNA, jak i po ekspozycji na endogenne lub egzogenne genotoksyny. Prawdopodobnie odgrywa rolę w zapobieganiu akumulacji rekombinogennych produktów pośrednich, które w przeciwnym razie gromadziłyby się w przejściowo zatrzymanych widełkach replikacyjnych, co jest zgodne z hiperrekombinowanym fenotypem komórek pozbawionych WRN. U ludzi domena egzonukleazy składa się z N-końcowej części znacznie większego białka, które również wykazuje aktywność helikazy, wraz z dodatkowymi miejscami ważnymi dla interakcji DNA i białek. Natomiast u Drosophila aktywność egzonukleazy WRN (DmWRNexo) jest kodowana przez locus genetyczne odrębne od przypuszczalnej helikazy, co pozwala na biochemiczną (i genetyczną) analizę roli aktywności egzonukleazy w mechanizmach stabilności genomu. Tutaj demonstrujemy metodę fluorescencyjną do oznaczania aktywności egzonukleazy WRN przy użyciu oczyszczonego rekombinowanego DmWRNexo i znakowanych końcowo fluorescencyjnych oligonukleotydów. System ten zapewnia większą odtwarzalność niż testy radioaktywne, ponieważ oligonukleotydy substratowe pozostają stabilne przez wiele miesięcy i zapewnia bezpieczniejszą i stosunkowo szybką metodę szczegółowej analizy aktywności nukleazy, umożliwiając określenie polarności nukleazy, procesyjności i preferencji substratowych.

Przeprowadzenie analizy aktywności egzonukleazy in vitro wymaga szeregu kroków przygotowawczych oprócz właściwej analizy. Przegląd procedur przedstawiono na Rysunku 1.
Przed przeprowadzeniem testów egzonukleazy opartych na fluorescencji kluczowe jest zoptymalizowanie detekcji znakowanego fluorescencyjnie substratu oligonukleotydowego po rozdziale na żelach urea-akrylamidowych przy użyciu odpowiedniego systemu obrazowania fluorescencyjnego. Wybór filtra jest niezwykle ...

Egzonukleazy odgrywają kluczową rolę w zapewnieniu stabilności genomu. Utrata funkcji egzonukleazy WRN powoduje przedwczesne starzenie się. Badanie substratów i innych wymagań nukleazy in vitro może pomóc w wyjaśnieniu jej roli in vivo. Tutaj demonstrujemy szybki i powtarzalny test oparty na fluorescencji do pomiaru jego aktywności nukleazy.

Test egzonukleazy oparty na fluorescencji w celu scharakteryzowania DmWRNexo, ortologu ludzkiej egzonukleazy progeroidalnej WRN i jej zastosowania do innych nukleaz

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. ...

W tym doświadczeniu wykorzystano odporny i powtarzalny test oparty na fluorescencji do oznaczenia aktywności egzonukleazy. Oczyszczony enzym inkubuje się z fluorescencyjnym substratem DNA, aby umożliwić enzymowi sekwencyjną degradację DNA. Następnie produkty degradacji rozdziela się według wielkości za pomocą żelu akryloamidowo-mocznikowego.Następnie należy wykorzystać obrazowanie fluorescencyjne do identyfikacji i ilościowego określenia zakresu aktywności egzonukleazy. Wyniki analizy pozwalają określić preferowane warunki reakcji substratu, a także aktywność procesywną i ogólną enzymu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami opartymi na radioaktywności jest fakt, że substraty DNA pozostają stabilne przez długi czas, co zapewnia doskonałą powtarzalność, obniża koszty i zwiększa bezpieczeństwo.Najpierw należy dostosować stężenie lizatu bakteryjnego do 20 millimolar ole, używając odpowiedniej objętości dwumolarnego roztworu stokowego emit ole. Następnie należy uzupełnić objętość do co najmniej jednego mililitra, używając 20 millimolar ole wash. Jednomililitrową kolumnę hist trap płucze się 10 mililitrami wody milli Q. Następnie kolumnę równoważy się 10 mililitrami 20 millimolar ole.Następnie nałóż lizat na kolumnę; podczas nakładania lizatu na kolumnę może wystąpić znaczne ciśnienie wsteczne. Jest to całkowicie normalne. Nie należy wywierać zbyt dużej siły na strzykawkę i należy utrzymać stałe, równomierne ciśnienie.Zwykle obserwuje się łagodną zmianę koloru w momencie, gdy lizat wpływa do kolumny. Należy zebrać frakcję przepuszczoną do sterylnej butelki typu biju o pojemności 7 ml i przechowywać ją w lodzie. Następnie kolumnę należy przemyć 10 ml 20 mM imidazolem.Następnie przepuść przez kolumnę 5 ml 40 mM iolu. Uważnie obserwuj tłok strzykawki, aby odmierzyć frakcje o objętości 1 ml zbierane do każdej z probówek do wirówki. W podobny sposób, sekwencyjnie przepuść 5 ml każdej z pozostałych stężeń iolu, zbierając za każdym razem pięć frakcji po 1 ml.Przeanalizuj frakcje za pomocą metody dot blotting oraz sondowania z użyciem przeciwciała anty-hiss sprzężonego z HRP, aby zidentyfikować frakcje o najwyższym stężeniu. Przechowuj wszystkie odczynniki w temperaturze 4°C. Rozdziel master mix do sterylnych, wolnych od DNA probówek do wirówki o pojemności 0,5 ml. Uwzględnij również kontrolę bez enzymu w celu wizualizacji początkowego substratu.Następnie ustaw blok grzejny na odpowiednią temperaturę dla aktywności enzymu. Przygotuj probówkę z roztworem zatrzymującym i przechowuj ją w temperaturze pokojowej. Zorganizuj obszar roboczy w pobliżu bloku grzejnego, przygotowując końcowe odczynniki, które zostaną dodane do reakcji.Przygotuj pipetkę automatyczną o zakresie od 1 do 10 µL wraz z końcówkami, minutnik, statyw chłodzący lub pojemnik z lodem oraz roztwór zatrzymujący. Uruchom minutnik w momencie dodania enzymu do pierwszej probówki i umieść ją w bloku grzewczym. Kontynuuj dodawanie enzymu do pozostałych probówek w odstępach 15 sekund, umieszczając kolejne probówki w bloku grzewczym, gdy minutnik wskaże odpowiedni czas.Do pierwszej próbki dodaj 10 µL roztworu zatrzymującego i wymieszaj poprzez pipetowanie. Natychmiast umieść na lodzie. Kontynuuj zatrzymywanie reakcji w odpowiednich odstępach czasowych i w tej samej kolejności, w jakiej zostały przygotowane, aby każda reakcja trwała dokładnie tyle samo czasu inkubacji. Na żel akrylamidowy nanieś połowę lub całość każdej próbki. W jednej lub kilku pozostałych studzienkach nanieś 1x roztwór zatrzymujący zawierający barwnik, aby monitorować przebieg elektroforezy.Po elektroforezie wyjmij dystanse oraz jedną płytkę żelową. Ostrożnie wypłucz i dokładnie przetrzyj płytkę żelową, aby usunąć ślady wytrąconego mocznika. Połóż płytkę żelem do dołu na szklanej powierzchni uchwytu do żelu i, jeśli jest to konieczne, umieść ją w urządzeniu obrazującym.Zanotuj współrzędne żelu na szkle. Otwórz odpowiednie oprogramowanie i zeskanuj zaznaczony obszar pola skanowania, stosując warunki szczegółowo opisane w protokole tekstowym. Przytnij obraz i skompresuj dane.W razie potrzeby zapisz, a następnie wyeksportuj dane do pliku w celu przeprowadzenia analizy. Wykonanie analizy aktywności egzonukleazy in vitro wymaga szeregu etapów przygotowawczych. Oprócz właściwej analizy w przypadku tych testów egzonukleazowych opartych na fluorescencji kluczowa jest optymalizacja detekcji w systemie obrazowania fluorescencyjnego.Na przykład substrat oligonukleotydowy znakowany fluoresceiną wymaga filtra umożliwiającego wzbudzenie przy 470 nanometrach i emisję przy 520 nanometrach. Dzięki zastosowaniu tego filtra możliwe jest zwiększenie zdolności wykrywania niskich stężeń substratu lub produktu poprzez regulację zarówno czułości, jak i rozdzielczości obrazu. Należy zauważyć, że istnieje pewna tolerancja w zakresie szerokości pasma filtra.Ponieważ nieoptymalny dobór filtra nadal pozwala na częściową detekcję substratu, choć z znacznie niższą czułością. Odpowiednie połączenie stężenia znakowanego oligonukleotydu i ustawień obrazera może zapewnić stabilną detekcję substratu. Jest to istotne, ponieważ produkty degradacji po inkubacji z aktywną egzonukleazą będą występować w mniejszych ilościach w każdym prążku, gdyż substrat uległ sekwencyjnej fragmentacji.Pomyślny test egzonukleazy spowoduje sekwencyjną degradację substratu w kierunku końców. W rezultacie na żelu powstanie charakterystyczny wzór prążków DNA przypominający drabinę, który jest reprezentatywny dla degradacji egzonukleazy. Po optymalizacji detekcji, test może być wykorzystany do jakościowej i ilościowej analizy różnic w aktywności.Na przykład można określić obecność lub brak aktywności w przypadku mutantów nukleazy w porównaniu z białkiem typu dzikiego. Można również testować różne substraty pod kątem ich podatności na degradację przez nukleazę. W trakcie badania.Ten test in vitro może być wykorzystany do badania specyficzności substratowej oraz aktywności procesywnej badanej nukleazy.

a-fluorescence-based-exonuclease-assay-to-characterize-dmwrnexo

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Test oparty na fluorescencji do oznaczania egzonukleazy, aby scharakteryzować DmWRNexo, ortologiczny odpowiednik ludzkiej progeroidyna WRN egzonukleazy i jego zastosowanie do innych nukleaz

Badania genetyczne na drożdżach mogą być wykorzystywane do badania funkcji molekularnych i komórkowych ludzkich genów w komórkowym metabolizmie DNA. Opisano metody genetycznej charakterystyki produktu ludzkiego genu WRN, którego defekt występuje w zespole Wernera – chorobie objawiającej się przedwczesnym starzeniem się, w funkcjonalnie konserwowanych szlakach, wykorzystując drożdże jako przystępny system modelowy.

Badania genetyczne białek naprawy DNA u ludzi z wykorzystaniem drożdży jako systemu modelowego

Opisujemy metodę ilościowego pomiaru aktywności glikozylazy DNA oraz endonukleazy AP w czasie rzeczywistym w lizatach jąder komórkowych. Analiza ta pozwala na wyznaczenie szybkości aktywności naprawy DNA umożliwiającej analizę kinetyczną i może być dostosowana do ilościowego oznaczania aktywności naprawy DNA w lizatach tkanek i nowotworów lub z użyciem oczyszczonych białek.

Ilościowa analiza w czasie rzeczywistym aktywności naprawy przez wycinanie zasad w lizatach komórkowych z wykorzystaniem specyficznych dla uszkodzeń sond molekularnych (molecular beacons)

Nieoznakowana, nieradio-izotopowa metoda korekty polimerazy DNA i testu naprawy DNA została opracowana przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF o wysokiej rozdzielczości i strategii przedłużania pojedynczego nukleotydu. Test okazał się bardzo specyficzny, prosty, szybki i łatwy do wykonania w przypadku korekty i naprawy łatek krótszych niż 9-nukleotydy.

Korekta i test naprawy DNA przy użyciu przedłużenia pojedynczego nukleotydu i analizy spektrometrii mas MALDI-TOF

Opracowano systemy obserwacji w czasie rzeczywistym oparte na transferze energii rezonansu fluorescencji reakcji wymiany nici DNA, w której pośredniczy Rad51. Korzystając z przedstawionych tutaj protokołów, jesteśmy w stanie wykryć powstawanie produktów pośrednich reakcji i ich przekształcanie w produkty, jednocześnie analizując kinetykę enzymatyczną reakcji.

Obserwacja w czasie rzeczywistym reakcji wymiany nici DNA, w której pośredniczy Rad51

Zmieniona aktywność nukleazy jest związana z różnymi schorzeniami ludzkimi, co potwierdza jej potencjał jako biomarkera. Modułowa i łatwa do wdrożenia metodologia badań przesiewowych przedstawiona w tym artykule pozwala na wybór konkretnych sond kwasów nukleinowych do wykorzystania aktywności nukleazy jako biomarkera choroby.

Kinetyczne badanie przesiewowe aktywności nukleazy za pomocą sond kwasów nukleinowych

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

Nanomaszyny oparte na DNAzyme mogą być używane do wysoce selektywnego i czułego wykrywania kwasów nukleinowych. W artykule opisano szczegółowy protokół projektowania nanomaszyn opartych na DNAzyme z rdzeniem 10-23 przy użyciu wolnego oprogramowania i ich zastosowania w wykrywaniu fragmentu wirusa Epsteina-Barr jako przykładu.

DNAzyme 10-23 - Nanomaszyny do rozpoznawania kwasów nukleinowych

Prezentujemy protokoły oceny biegłości w naprawie szlaku pęknięć dwuniciowych w komórkach przy użyciu zestawu pozachromosomalnych substratów reporterowych opartych na luminescencji.

Ocena aktywności naprawczej pęknięć podwójnej nici DNA przy użyciu wysokoprzepustowych i ilościowych testów reporterowych opartych na luminescencji

W pracy przedstawiono prosty, przyjazny dla użytkownika ratiometryczny test FRET do wykrywania i ilościowej oceny aktywności DNazy oraz wykazano jego zastosowanie w analizie słabej nukleazy.

Ocena aktywności DNazy za pomocą ratiometrycznego transferu energii rezonansu fluorescencji

Protokół ten opisuje test biochemiczny przesunięcia żelu do pomiaru aktywności FEN1 (endonukleazy płatowej 1) i rozwoju inhibitora.

Fluorescencyjne wykrywanie aktywności nukleazy FEN1 i badania przesiewowe inhibitorów drobnocząsteczkowych

Poznaj fluorescencyjny test aktywności egzonukleazy w badaniach stabilności genomu. Ta metoda umożliwia analizę aktywności enzymu WRN i preferencji substratowych w sposób odtwarzalny.

Test egzonukleazy oparty na fluorescencji w celu scharakteryzowania DmWRNexo, ortologu ludzkiej egzonukleazy progeroidalnej WRN i jej zastosowania do innych nukleaz (Wideo) | JoVE Journal

Test egzonukleazy oparty na fluorescencji w celu scharakteryzowania DmWRNexo, ortologu ludzkiej egzonukleazy progeroidalnej WRN i jej zastosowania do innych nukleaz

Przeglądaj więcej filmów