A Fluorescence-based Exonuclease Assay to Characterize DmWRNexo, Orthologue of Human Progeroid WRN Exonuclease, and Its Application to Other Nucleases

Penelope A. Mason; Ivan Boubriak; Lynne S. Cox

doi:10.3791/50722

Test egzonukleazy oparty na fluorescencji w celu scharakteryzowania DmWRNexo, ortologu ludzkiej e...

JoVE Journal
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biology

A Fluorescence-based Exonuclease Assay to Characterize DmWRNexo, Orthologue of Human Progeroid WRN Exonuclease, and Its Application to Other Nucleases

Test egzonukleazy oparty na fluorescencji w celu scharakteryzowania DmWRNexo, ortologu ludzkiej egzonukleazy progeroidalnej WRN i jej zastosowania do innych nukleaz

Full Text

5,692 Views

06:10 min

December 23, 2013

DOI: 10.3791/50722-v

Penelope A. Mason¹, Ivan Boubriak¹, Lynne S. Cox¹

¹Department of Biochemistry,University of Oxford

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Egzonukleazy odgrywają kluczową rolę w zapewnieniu stabilności genomu. Utrata funkcji egzonukleazy WRN powoduje przedwczesne starzenie się. Badanie substratów i innych wymagań nukleazy in vitro może pomóc w wyjaśnieniu jej roli in vivo. Tutaj demonstrujemy szybki i powtarzalny test oparty na fluorescencji do pomiaru jego aktywności nukleazy.

W tym eksperymencie wykorzystano solidny, powtarzalny test oparty na fluorescencji w celu określenia aktywności egzonukleazy. Inkubuj oczyszczony enzym z fluorescencyjnym substratem DNA, aby umożliwić enzymowi sekwencyjną degradację DNA. Następnie rozpuść DNA na akrylamidowym żelu mocznikowym, aby oddzielić produkty degradacji według wielkości.

Następnie użyj obrazowania fluorescencyjnego, aby zidentyfikować i określić ilościowo zakres aktywności egzonukleazy. Analizowane wyniki pozwalają określić preferowane warunki reakcji substratowej, aktywność procesową i ogólną enzymu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi technikami opartymi na radioaktywności jest to, że substraty DNA są stabilne przez długi czas, co pozwala na doskonałą odtwarzalność, zmniejszenie kosztów i zwiększenie bezpieczeństwa.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos

Explore More Videos

Słowa kluczowe: test fluorescencyjny DmWRNexo egzonukleaza WRN uszkodzenie DNA stabilność genomu aktywność nukleazy replikacja DNA rekombinacja substrat oligonukleotydowy test radioaktywny procesywność preferencja substratu