Name: Mikroprzepływowa reakcja wychwytywania-cykloaddycji w układzie scalonym w celu odwracalnego unieruchomienia małych cząsteczek lub struktur wieloskładnikowych do zastosowań w biosensorach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-23T18:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Poznaj metodę odwracalnego unieruchomienia małych cząsteczek i nanocząstek na powierzchniach czujników SPR przy użyciu chemii cykloaddycji bioortogonalnej. Technika ta umożliwia szybką regenerację powierzchni i wielokrotne cykle pomiarowe w badaniach oddziaływań molekularnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Potwierdzamy finansowanie z NIH (NHLBI Contract No. HHSN268201000044C do R.W., S.H. i S.Y.S.).

1. Przygotowanie koniugatów GST i nanocząstek (NP)
<ol>
	<li>Przygotowanie GST-TCO:
	<ol>
		<li>Dodać 8 μl roztworu TCO-NHS (50 mM w DMSO) do 100 μl GST (1 mg/ml w PBS) i wstrząsać mieszaniną w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Usuń nadmiar odczynnika za pomocą wirowej kolumny odsalającej Zeba. Odzyskany filtrat zawierający koniugat GST-TCO jest przechowywany w temperaturze 4 °C przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie GST-Tz:
	<ol>
		<li>Dodać 6 μl roztworu Tz-NHS (25 mM w DMF) do 75 μl GST (1 mg/ml w PBS) i wstrząsać mieszaniną w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną 25 μl PBS i oczyścić za pomocą wirowej kolumny odsalającej. Przesącz zawierający koniugat GST-Tz jest przechowywany w temperaturze 4 °C przed użyciem.</li>
	</ol>
	nuta: Analizy masy (MALDI-TOF) wykazały, że średnio ~10 cząsteczek Tz lub TCO było sprzężonych z GST.</li>
	<li>Przygotowanie NP-TCO:
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl roztworu TCO-NHS (50 mM w DMSO) do 150 μl aminowanych nanocząstek (NP-NH2, 8,7 mg Fe/ml w PBS, rdzeń żelazny 3 nm ~ 8 000 Fe/NP) i wstrząsać mieszaniną w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Usunąć nadmiar odczynnika przez filtrację żelową za pomocą kolumny NAP-10 eluowanej buforem PBS. Zbierz kolorową opaskę zawierającą produkt NP-TCO.</li>
		<li>Zagęścić filtrat do końcowej objętości ~150 μl za pomocą filtra odśrodkowego (100 k MWCO).</li>
		<li>Dodać 50 μl bezwodnika bursztynowego (0,1 M w DMSO) do roztworu NP-TCO i wstrząsać w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę (bezwodnik reaguje z pozostałymi aminami, tworząc końcowe kwasy karboksylowe. Zapobiega to niespecyficznym interakcjom z powierzchnią dekstranu).</li>
		<li>Oczyść produkt NP-TCO za pomocą kolumny NAP-10 eluującej PBS. Przed użyciem przechowywać roztwór NP-TCO w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie powierzchni
Wszystkie testy rezonansu plazmonów powierzchniowych są wykonywane na urządzeniu Biacore T100 (GE Healthcare) w temperaturze 25 °C przy użyciu chipa czujnika CM5 i PBS-P jako bufora do działania, chyba że zaznaczono inaczej. Oprogramowanie Biacore Control and Evaluation dostarczone wraz z urządzeniem służy do przeprowadzania eksperymentów i analizowania danych. Dwa tryby pracy, kreatory aplikacji i uruchamianie ręczne, będą wykorzystywane do przygotowania powierzchni i monitorowania wbudowanego w układ scalony cykloaddycji. Tryb konstruktora metod będzie używany do ustawiania eksperymentów wiązania w odwrotnej orientacji oraz do pomiaru szybkości reakcji cykloaddycji. Dane są odejmowane z podwójnym odniesieniem, a analizy kinetyczne są wykonywane przy użyciu modelu wiązania Langmuira 1:1.
<ol>
	<li>Użyj szablonu kreatora immobilizacji amin i wybierz immobilizację w komórkach przepływu 1 (odniesienie) i 2 (wykrywanie). Zmodyfikowanie metody aminowej w celu aktywacji powierzchniowych grup karboksylowych przez wstrzyknięcie roztworu 1:1 0,4 M EDC: 0,1 M NHS przez 480 sekund przy natężeniu przepływu 10 μl/min. Ustawić wstrzyknięcie etanoloaminy w celu ugaszenia pozostałych aktywowanych estrów do czasu kontaktu 420 sekund przy natężeniu przepływu 10 μl/min.</li>
	<li>Nazwa liganda wejściowego, anty-GST (18 μg/ml w buforze octanowym o pH 5,0) i ustawione na wstrzykiwanie przez czas kontaktu 420 sekund przy natężeniu przepływu 10 μl/min.</li>
	<li>Umieść wymagane fiolki z roztworem w stojaku na odczynniki 2, upewniając się, że pozycje są zgodne z listą zawartości. Zapisz i rozpocznij unieruchomienie. 
	Uwaga: Uruchomienie kreatora unieruchomienia w ten sposób powoduje unieruchomienie anty-GST na poziomie od ~14 000 do 17 000 RU.</li>
	<li>Edytuj kreatora unieruchomienia, aby wstrzykiwać roztwór liganda GST (20 μg/ml) tylko przez 420 sekund przy 5 μl/min nad referencyjną komórką przepływową 1.</li>
</ol>
3. Monitorowanie wbudowanego w układ scalony wychwytywania-cykloaddycji funkcjonalizowanych cząsteczek
<ol>
	<li>Monitorowanie wbudowanego w układ scalony cykloaddycji przechwytywania w czasie rzeczywistym (ilustracja 2).
	<ol>
		<li>Umieść fiolki z roztworem GST-TCO (20 μg/ml), Tz-BnNH2 (10 μM) i regeneracyjnym (10 mM glicyny, pH = 2,0) w stojaku na odczynniki 2. Wybierz metodę uruchamiania ręcznego, ustaw natężenie przepływu na 5 μl/min, a ścieżkę przepływu na Komórka przepływu 2.</li>
		<li>Wstrzykiwać roztwór GST-TCO przez 420 sek.</li>
		<li>Wstrzykiwać roztwór Tz-BnNH2 przez 600 sek.</li>
		<li>Zregeneruj powierzchnię za pomocą dwóch 30 sekundowych wstrzyknięć roztworu regeneracyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monitorowanie montażu na chipie struktur wielokomponentowych w czasie rzeczywistym (ilustracja 3):
	<ol>
		<li>Umieścić fiolki z roztworem GST-Tz (20 μg/ml), NP-TCO (100 μg Fe/ml), Tz-BnNH2 (10 μM) i regeneracyjnym (10 mM glicyny, pH = 2,0) w stojaku na odczynniki 2. Wybierz metodę ręcznego uruchamiania przyrządu, ustaw natężenie przepływu na 5 μl/min, a ścieżkę przepływu na Komórka przepływu 2.</li>
		<li>Wstrzykiwać roztwór GST-Tz przez 60 sekund.</li>
		<li>Wstrzykiwać roztwór NP-TCO przez 60 sekund.</li>
		<li>Wstrzykiwać roztwór Tz-BnNH2 przez 60 sekund.</li>
		<li>Zregeneruj powierzchnię za pomocą dwóch 30 sekundowych wstrzyknięć roztworu regeneracyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Monitorowanie gęstości unieruchomienia i wyznaczanie szybkości cykloaddycji
<ol>
	<li>Charakterystyka szybkości reakcji cykloaddycji małych cząsteczek (ryc. 4).
	<ol>
		<li>Wybierz nową metodę i wprowadź parametry ogólne. W panelu kroków testu utwórz nowy krok i nadaj mu nazwę Próbka. Ustaw ustawienia Cel i Połącz bazę na Przykład.</li>
		<li>W panelu Typy cykli Utwórz nowy krok cyklu i wstaw następujące polecenia: Przechwytywanie, pobieranie próbek, regeneracja 1 i regeneracja 2.</li>
		<li>Wybierz polecenie Przechwyć; wprowadź nazwę liganda (GST-TCO, 20 μg/ml), czas kontaktu 120 sekund przy 5 μl/min i ustaw ścieżkę przepływu na: Drugi. Wybierz polecenie Próbka; wprowadź czas kontaktu 180 sekund, czas dysocjacji 60 sekund, natężenie przepływu 30 μl/min i ustaw ścieżkę przepływu na: Oba. Wybierz polecenie Regeneracja 1; wejściowa nazwa roztworu regeneracyjnego (10 mM glicyna-HCl pH 2,0), czas kontaktu 30 sekund przy 30 μl/min i ustaw ścieżkę przepływu na: Sekunda. Powtórz to samo dla polecenia Regeneration 2.</li>
		<li>Wybierz pozycję Setup Run i ustaw ścieżkę przepływu na: 2-1. Wybierz następny i wypełnij listę próbek roztworem analitu (Tz-BnNH2) i szeregiem stężeń (0,3-10 μM, rozcieńczenie 1:2). Wybierz obok panelu pozycji stojaka. Umieść fiolki z roztworem w stojaku na odczynniki 2, a serię rozcieńczeń na płytce 96-dołkowej, upewniając się, że pozycje są zgodne z listą zawartości. Zapisz szablon metody i rozpocznij test wiązania. Dane wiążące i analizę kinetyczną przedstawiono na rysunku 4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Charakterystyka szybkości reakcji cykloaddycji NP (ryc. 4).
	<ol>
		<li>Otwórz zapisany szablon metody od góry i zmień następujące parametry. Wybierz panel Przechwyć; zmień nazwę liganda na GST-Tz, 20 μg/ml. Wybierz panel Próbka; Zmień czas kontaktu na 120 sekund, czas kontaktu i czas dysocjacji na 120 sekund.</li>
		<li>Wybrać listę próbek, zmienić analit na NP-TCO i szeregi stężeń (od 7 do 224 nM, rozcieńczenie 1:2). Umieść fiolki z roztworem w stojaku na odczynniki 2, a serię rozcieńczeń na płytce 96-dołkowej, upewniając się, że pozycje są zgodne z listą zawartości. Zapisz szablon metody i rozpocznij test wiązania. Dane wiążące i analizę kinetyczną przedstawiono na rysunku 4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Pomiar wiązania FKBP12 z unieruchomionym AP1497
Badania wiązania o odwróconej orientacji wykorzystują FKBP12 jako analit i związek AP1497 jako unieruchomiony ligand (Rysunek 5). Ogólna metoda dla tego testu jest konfigurowana w następujący sposób za pomocą narzędzia do tworzenia metod:
<ol>
	<li>Wybierz nową metodę i wprowadź parametry ogólne. W panelu kroków testu utwórz i nazwij kroki przechwytywania, pobierania próbek i regeneracji. Wybierz odpowiednie ustawienia Cel i Podłącz bazę.</li>
	<li>Wybierz panel Typy cykli i utwórz 3 kroki cyklu: Przechwytywanie, Próbkowanie i Regeneracja.</li>
	<li>Wstaw polecenie Przechwyć dwukrotnie w kroku cyklu przechwytywania. Wybierz panel Capture 1 (Przechwyć 1) i wybierz rozwiązanie do przechwytywania jako zmienną, ustaw czas kontaktu na 300 sekund przy natężeniu przepływu 5 μl/min i ustaw ścieżkę przepływu na: Drugi. Wybierz panel Capture 2 i wybierz rozwiązanie do przechwytywania jako zmienną, ustaw czas kontaktu na 250 sekund przy natężeniu przepływu 5 μl/min i ustaw ścieżkę przepływu na: Drugi.</li>
	<li>Wstaw polecenie Sample w kroku cyklu Sample. Wybierz panel Próbka; Ustaw czas kontaktu na 60 sekund, czas dysocjacji na 200 sekund przy natężeniu przepływu 30 μl/min i ustaw ścieżkę przepływu na: Jedno i drugie.</li>
	<li>Wstaw dwukrotnie polecenie Regeneracja w kroku Cykl regeneracji. Wybierz panel Regeneracja 1; wejściowa nazwa roztworu regeneracyjnego (10 mM glicyna-HCl pH 2,0), czas kontaktu 30 sekund przy 30 μl/min i ustaw ścieżkę przepływu na: Sekunda. Powtórz to samo dla panelu Regeneracja 2.</li>
	<li>Wybierz pozycję Setup Run i ustaw ścieżkę przepływu na: 2-1. Wybierz następne i wejściowe nazwy roztworów do wychwytywania (GST-TCO i AP1497-Tz), nazwę próbki (FKBP12), serię stężeń (0,020 do 5 μg/ml, rozcieńczenie 1:2) i MW (13 000). Umieść fiolki z roztworem w stojaku na odczynniki 2, a serię rozcieńczeń na płytce 96-dołkowej, upewniając się, że pozycje są zgodne z listą zawartości. Zapisz szablon metody i rozpocznij test wiązania. Dane analizy kinetycznej przedstawiono na rysunku 5.</li>
</ol>
6. Pomiar wiązania FKBP12 z AP1497 przyczepionym do unieruchomionych NP
Ogólna metoda immobilizacji nanocząstek, derywatyzacji małych cząsteczek i testu wiązania FKBP12 jest ustawiana w następujący sposób za pomocą narzędzia do tworzenia metod:
<ol>
	<li>Otwórz zapisany szablon metody od góry i zmodyfikuj. Wstaw dodatkowe polecenie przechwytywania w kroku cyklu przechwytywania. Wybierz panel Capture 1 (Przechwyć 1). usuń zaznaczenie opcji Capture solution as variable and name capture solution 1 (GST-Tz). Ustaw czas kontaktu na 60 sekund przy natężeniu przepływu 5 μl/min i ustaw ścieżkę przepływu na Sekunda. Wybierz panel Capture 2; usuń zaznaczenie opcji Capture Solution as Variable and Name Capture Solution 2 (NP-TCO). Ustaw czas kontaktu na 90 sekund przy natężeniu przepływu 5 μl/min i ustaw ścieżkę przepływu na sekundę. Wybierz panel Capture 3; usuń zaznaczenie opcji Capture solution as variable and name capture solution 3 (AP1497-Tz) (rozwiązanie do przechwytywania). Ustaw czas kontaktu na 180 sekund przy natężeniu przepływu 5 μl/min i ustaw ścieżkę przepływu na Sekunda.</li>
	<li>Wybierz pozycję Setup Run i ustaw ścieżkę przepływu na: 2-1. Wybierz pozycję Następny dwa razy. Umieść fiolki z roztworem w stojaku na odczynniki 2, a serię rozcieńczeń na płytce 96-dołkowej, upewniając się, że pozycje są zgodne z listą zawartości. Zapisz szablon metody i rozpocznij test wiązania. Dane analizy kinetycznej przedstawiono na rysunku 5.</li>
</ol>

<ol><li>Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+pretargeted+labeling+of+cancer+cells+through+a+tetrazine%2Ftrans-cyclooctene+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).</li>
<li>Seitchik, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+tetrazine+amino+acid+directs+rapid+site-specific+in+vivo+bioorthogonal+ligation+with+trans-cyclooctenes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes.</a> J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).</li>
<li>Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+intracellular+biomarkers+and+mediators+of+cell+activation+using+nanosensors+and+bioorthogonal+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry.</a> ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).</li>
<li>Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+probes+for+polo-like+kinase+1+imaging+and+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).</li>
<li>Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diels-Alder+cycloaddition+for+fluorophore+targeting+to+specific+proteins+inside+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells.</a> J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).</li>
<li>Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+chemistry+amplifies+nanoparticle+binding+and+enhances+the+sensitivity+of+cell+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection.</a> Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).</li>
<li>Liong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+pathogen+detection+using+bioorthogonal+chemistry+and+diagnostic+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance.</a> Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).</li>
<li>Tassa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+bioorthogonal+chemistry+enables+immobilization+of+in+situ+modified+nanoparticles+and+small+molecules+for+label-free+monitoring+of+protein+binding+and+reaction+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics.</a> Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).</li>
<li>Pol, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+correct+protein+concentration+for+kinetics+and+affinity+determination+in+structure-function+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis.</a> J Vis Exp. (37), e1746(2010).</li>
<li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science. 289, 1760-1763 (2000).</li>
<li>Ong, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+proteins+to+which+small-molecule+probes+and+drugs+bind+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).</li>
<li>Tassa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+affinity+and+kinetic+analysis+of+targeted+small+molecule-modified+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles.</a> Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).</li>
<li>Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+targeting+of+nanoparticles+by+multivalent+attachment+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules.</a> Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).</li>
<li>Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance+assay+for+chloramphenicol%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol.</a> Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).</li>
<li>Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrimer-mediated+multivalent+binding+for+the+enhanced+capture+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).</li>
<li>Keelan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotoxicology%3A+nanoparticles+versus+the+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta.</a> Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).</li>
<li>Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+size+and+surface+properties+determine+the+protein+corona+with+possible+implications+for+biological+impacts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).</li>
<li>Lundqvist, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+the+protein+corona+around+nanoparticles%3A+a+test+study%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study.</a> ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).</li>
<li>Mammen, M., Choi, S. -K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyvalent+interactions+in+biological+systems%3A+implications+for+design+and+use+of+multivalent+ligands+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).</li>
<li>Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+random+and+oriented+antibody+immobilization+techniques+on+the+binding+capacity+of+immunosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor.</a> Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).</li>
<li>Arkin, M. R., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions%3A+progressing+towards+the+dream%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).</li>
<li>Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance+based+assay+for+the+detection+and+characterization+of+promiscuous+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors.</a> J Med Chem. 51, 574-580 (2008).</li>
<li>Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RGS+protein+inhibitor+CCG-4986+is+a+covalent+modifier+of+the+RGS4+Galpha-interaction+face%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face.</a> Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).</li>
<li>GE Healthcare. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biacore+Sensor+Surface+Handbook+BR-1005-71%22">Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71</a>. , Edition AB, (2005).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisana tutaj metoda wychwytywania-cykloaddycji umożliwia szybką, odwracalną immobilizację zmodyfikowanych nanocząstek i małych cząsteczek w celu bezznacznikowej interakcji opartej na chipach i badań kinetycznych. Protokół immobilizacji można wykonać w ciągu kilku minut, co wymaga stężenia <10 μM ligandów drobnocząsteczkowych. Modulując stężenie liganda i czas kontaktu, można ściśle kontrolować gęstość unieruchomienia. Nasze dane pokazują, że reakcje bioortogonalne na chipie zachowują zdolność funkcjonalizowanych in ...

Efektywne reakcje koniugacji są cennymi narzędziami do łączenia bioaktywnych cząsteczek z powierzchniami dla różnych zastosowań biotechnologicznych. Ostatnio bardzo szybka bioortogonalna [4+2] reakcja cykloaddycji między transcyklooktenem (TCO) a 1,2,4,5-tetrazyną (Tz) została wykorzystana do znakowania powierzchni komórek, struktur subkomórkowych, przeciwciał i nanocząstek. 1-7 Tutaj używamy reakcji cykloaddycji [4+2] w połączeniu z wychwytywaniem antygenu/przeciwciała (GST/anty-GST) do odwracalnej syntezy na chipie struktur wieloskładnikowych do analizy interakcji powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) i monitorujemy proces w czasie rzeczywistym (Rysunek 1). 8,9 Warto zauważyć, że strategia wychwytywania-cykloaddycji umożliwia regenerację powierzchni przy użyciu ustalonego protokołu. 8 W związku z tym możliwy jest teraz montaż stabilnych powierzchni czujników z kontrolą nad orientacją i gęstością ligandów dla wielu nowych formatów testów. Korzystając z tej strategii, demonstrujemy immobilizację małych cząsteczek derywatyzowanych TCO/Tz, i charakteryzujemy tempo cykloaddycji w różnych warunkach buforowych. Wybraliśmy dobrze znaną interakcję między FKBP12 a cząsteczką AP1497, która wiąże FKBP1210-12 jako przykład, aby sprawdzić, czy strategia wychwytywania-cykloaddycji zachowuje zdolność małej cząsteczki do interakcji z celem, gdy jest bezpośrednio przyłączona do unieruchomionych antygenów GST lub do unieruchomionych nanocząstek (NP).
Ta metoda oferuje kilka korzyści. Po pierwsze, możliwe jest odwracalne unieruchomienie małych cząsteczek na chipach czujników. Po drugie, unieruchomienie małych cząsteczek TCO/Tz umożliwia również badania interakcji bez znaczników, które odwracają orientację kanonicznych badań SPR i mogą dostarczyć uzupełniającego spojrzenia na interakcję wiążącą. Po trzecie, metoda ta umożliwia syntezę mikroprzepływową docelowych nanocząstek i natychmiastową ocenę ich właściwości wiązania. Daje to nadzieję na poprawę efektywności oceny lub badań przesiewowych docelowych nanocząstek, a także zmniejszenie wymaganych ilości nanocząstek. 13-15 Po czwarte, podejście to może mierzyć kinetykę reakcji bioortogonalnych reakcji cykloaddycji w czasie rzeczywistym przy ciągłym przepływie. Wreszcie, chemia unieruchomienia TCO/Tz jest silna w obecności surowicy. Podsumowując, przewidujemy, że to wszechstronne podejście znacznie ułatwi budowę stabilnych powierzchni czujników dla szerokiej gamy badań mikroprzepływowych mających znaczenie dla zastosowań komórkowych in vitro i in vivo.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>Sensor Chip CM5</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1005-30</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw sprzęgła aminowego</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1000-50</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do przechwytywania GST</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1002-23</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolumny NAP-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0854-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GST, liofilizowany w 1X PBS</td><td>Genscript</td><td>Z02039</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>rhFKBP12</td><td>R& D Systems</td><td>3777-FK&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Surfaktant P-20</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1000-54</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glicyna 2.0</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1003-55</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Wirowa kolumna odsalająca Zeba</td><td>Thermo</td><td>89882</td><td>7 K MWCO</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4</td><td>Fisher</td><td>UFC810096</td><td>100 K filtr odśrodkowy</td></tr><tr><td>TCO-OH</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Syntetyzowany we własnym</td></tr><tr><td>zakresie TCO-NHS</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Syntetyzowany we własnym zakresie, *Komercyjnie dostępny w Click Chemistry Tools # 1016-25</td></tr><tr><td>Tz-BnNH2</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Synteza we własnym zakresie</td></tr><tr><td>Tz-NHS</td><td>Ref. 8</td><td>764701</td><td>Syntetyzowany we własnym zakresie, *Dostępny w handlu od Sigma Aldrich # 764701</td></tr><tr><td>NP-NH2 = CLIO-NH2</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Syntetyzowany we własnym</td></tr><tr><td>zakresie AP1497, AP1497-Tz</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Syntetyzowany wewnętrznie</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>SPR Biosensor</td><td>GE Opieka zdrowotna</td><td>Biacore T100</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

mikroprzepływowa reakcja wychwytywania-cykloaddycji w układzie scalonym w celu odwracalnego unieruchomienia małych cząsteczek lub struktur wieloskładnikowych do zastosowań w biosensorach

Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

Metody szybkiego unieruchamiania powierzchni małych cząsteczek bioaktywnych z kontrolą orientacji i gęstości unieruchomienia są wysoce pożądane dla zastosowań biosensorów i mikroukładów. W tym badaniu wykorzystujemy wysoce wydajną kowalencyjną bioortogonalną [4 + 2] reakcję cykloaddycji między transcyklooktenem (TCO) a 1,2,4,5-tetrazyną (Tz), aby umożliwić mikroprzepływową immobilizację cząsteczek derywatyzowanych TCO / Tz. Monitorujemy proces w czasie rzeczywistym w warunkach ciągłego przepływu za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR). Aby umożliwić odwracalne unieruchomienie i rozszerzyć zakres eksperymentalny powierzchni czujnika, łączymy niekowalencyjny składnik wychwytywania antygenu-przeciwciała z reakcją cykloaddycji. Dzięki naprzemiennemu prezentowaniu ugrupowań TCO lub Tz na powierzchni czujnika, możliwe jest teraz wiele procesów wychwytywania-cykloaddycji na jednej powierzchni czujnika w celu montażu na chipie i badań interakcji różnych struktur wieloskładnikowych. Ilustrujemy tę metodę dwoma różnymi eksperymentami unieruchomienia na chipie biosensora; mała cząsteczka AP1497, która wiąże białko 12 wiążące FK506 (FKBP12); i ta sama mała cząsteczka jako część unieruchomionej i funkcjonalizowanej in situ nanocząstki.

Dane i rysunki zostały opracowane na podstawie publikacji 8. 
 Efektywna i odwracalna immobilizacja bioaktywnych małych cząsteczek z kontrolą nad ich orientacją i gęstością odgrywa kluczową rolę w opracowywaniu nowych zastosowań biosensorów. Wykorzystując szybką reakcję bioortogonalną między TCO a Tz, opisujemy metodę stopniowego składania i regeneracji powierzchni ligandów z zachowaniem aktywności biologicznej. Rysunek 2 przedstawia monitorowanie w czasie rzeczywistym immobil...

Prezentujemy metodę szybkiego, odwracalnego unieruchamiania małych cząsteczek i funkcjonalizowanych zespołów nanocząstek do badań powierzchniowego rezonansu plazmonów (SPR), wykorzystując sekwencyjną bioortogonalną chemię cykloaddycji na chipie i wychwytywanie przeciwciała-antygen.

Mikroprzepływowa reakcja wychwytywania-cykloaddycji w układzie scalonym w celu odwracalnego unieruchomienia małych cząsteczek lub struktur wieloskładnikowych do zastosowań w biosensorach

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zademonstrowanie szybkiej i uniwersalnej strategii odwracalnego unieruchamiania małych cząsteczek oraz funkcjonalizowanych nanocząsteczek na powierzchni chipów sensorycznych. Jest to osiągane poprzez najpierw unieruchomienie przeciwciał anty-GST na powierzchni sensora, a w drugim kroku wychwyt antygenu GST.Funkcjonalizacja grupami trans-cyklooktynu lub tetrazyny zapewnia powierzchnię reaktywną dla późniejszych reakcji cykloaddycji z małocząsteczkowymi pochodnymi tetrazyny lub koniugatami nanocząstek z trans-cyklooktanem, które są następnie funkcjonalizowane małocząsteczkowymi pochodnymi tetrazyny. Następnie funkcjonalizowana powierzchnia może zostać wykorzystana do analizy oddziaływań z pożądanym rozpuszczonym celem. W ostatnim kroku powierzchnia jest regenerowana, co umożliwia kolejne cykle wychwytywania i cykloaddycji. Wyniki wiązania na chipie wykazują, że reakcje bioortogonalne zachowują zdolność unieruchomionych małych cząsteczek lub funkcjonalizowanych in situ nanocząstek do oddziaływania z celem FKBP12 oraz ilustrują, w jaki sposób podejście to może rozszerzyć zakres zastosowań SPR.Główną zaletą tej techniki edycji cyklu przechwy

microfluidic-on-chip-capture-cycloaddition-reaction-to-reversibly

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Mikropłytowna reakcja uchwytywania-cykloaddycji na chipie do odwracalnej imobilizacji małych cząsteczek lub struktur wieloskładnikowych w zastosowaniach biosensorowych

W niniejszym artykule opisujemy sposób uzyskiwania przebiegów FRET z pojedynczych cząsteczek DNA unieruchomionych na powierzchni przy użyciu zautomatyzowanego konfokalnego mikroskopu skanującego.

Zautomatyzowany system do pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek dla unieruchomionych na powierzchni biomolekuł

Mikrofluidyczne platformy kropelkowe są obiecującymi narzędziami do eksperymentów wysokoprzepustowych, ponieważ umożliwiają one niskokosztowe generowanie piko-litrowych, samoczynnie odseparowanych komór z częstotliwością rzędu kHz. Dzięki integracji z szybkimi, czułymi i wysokorozdzielczymi metodami spektroskopii fluorescencyjnej, duże ilości informacji generowanych w tych systemach mogą być efektywnie wydobywane, przetwarzane i wykorzystywane.

Metody detekcji fluorescencyjnej dla mikroprzepływowych platform kroplkowych

W tym artykule prezentujemy mikroprzepływowy chip do analizy pojedynczych komórek. Umożliwia ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych białek, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników za pomocą testów fluorescencyjnych lub testów immunologicznych.

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Urządzenia milifluidyczne są wykorzystywane do kontrolowanej syntezy nanomateriałów, czasowo-rozdzielczej analizy mechanizmów reakcji i katalizy ciągłego przepływu.

Millifluidyka do syntezy chemicznej i czasowo-rozdzielczych badań mechanistycznych

Prezentujemy mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do wykrywania hybrydyzacji DNA. Po funkcjonalizacji sondy ssDNA bada się swoistość, czułość i granicę wykrywalności za pomocą komplementarnych i niekomplementarnych celów ssDNA. Wyniki ilustrują wpływ zdarzeń hybrydyzacji DNA na układ elektrochemiczny, przy granicy wykrywalności wynoszącej 3,8 nM.

Mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do bezznacznikowej analizy hybrydyzacji DNA

Prezentujemy dyskretny system wprowadzania próbek kropel do spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICPMS). Opiera się na tanim i jednorazowym chipie mikroprzepływowym, który generuje wysoce monodyspersyjne kropelki w zakresie wielkości 40−60 μm przy częstotliwościach od 90 do 7 000 Hz.

Układ mikroprzepływowy do próbki ICPMS Wprowadzenie

Tutaj opisujemy wytwarzanie i działanie dwuwarstwowego systemu mikroprzepływowego wykonanego z polidimetylosiloksanu (PDMS). Pokazujemy potencjał tego urządzenia w zakresie wychwytywania, kierowania szlakiem koordynacyjnym krystalicznego materiału molekularnego i kontrolowania reakcji chemicznych na uwięzionych strukturach na chipie.

Mikroprzepływowe klatki pneumatyczne: nowatorskie podejście do wychwytywania kryształów w chipach, manipulacji i kontrolowanej obróbki chemicznej

Prezentujemy platformę mikroprzepływową ze zintegrowaną siecią elektrod powierzchniowych, która łączy rezystancyjne wykrywanie impulsów (RPS) z wielokrotnym dostępem z podziałem kodu (CDMA), do wielokrotnego wykrywania i wymiarowania cząstek w wielu kanałach mikroprzepływowych.

Platforma mikroprzepływowa z multipleksowaną detekcją elektroniczną do przestrzennego śledzenia cząstek

Platforma mikroprzepływowego biosensoru została zaprojektowana i wykonana przy użyciu taniej technologii fotorezystu z suchą folią do szybkiej i czułej kwantyfikacji różnych analitów. Ten jednorazowy system pozwala na elektrochemiczny odczyt testów enzymatycznych immobilizowanych na chipie za pomocą techniki stop-flow.

Elektrochemiczna platforma biosensorów mikroprzepływowych oparta na suchym filmie fotorezystu: produkcja urządzenia, przygotowanie testu na chipie i obsługa systemu

Mikrofluidyka to potężne narzędzie do tworzenia testów diagnostycznych. Jednak często wymagany jest drogi sprzęt i materiały, a także pracochłonne techniki wytwarzania i obsługi. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół wytwarzania akrylowego urządzenia mikroprzepływowego do magnetycznych testów immunologicznych opartych na mikro- i nanocząsteczkach w tanich i prostych w użyciu.

Mikromielenie mikroprzepływowe urządzenia akrylowego sterowane numerycznie z ograniczeniem naprzemiennym dla testów immunologicznych opartych na nanocząstkach magnetycznych

Ten artykuł proponuje nową generację wieloparametrycznych platform analitycznych o zwiększonej przepustowości do charakterystyki podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Metoda opiera się na połączeniu multipleksowanych metod biodetekcji z analizami metrologicznymi i morfomechanicznymi za pomocą mikroskopii sił atomowych, w połączeniu ze spektroskopią Ramana, w celu kwalifikacji celów pęcherzykowych uwięzionych na biochipie mikromacierzy.

Multimodalna platforma analityczna na multipleksowanym chipie do obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego do analizy podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Poznaj metodę odwracalnego unieruchomienia małych cząsteczek i nanocząstek na powierzchniach czujników SPR przy użyciu chemii cykloaddycji bioortogonalnej. Technika ta umożliwia szybką regenerację powierzchni i wielokrotne cykle pomiarowe w badaniach oddziaływań molekularnych.

Mikroprzepływowa reakcja wychwytywania-cykloaddycji w układzie scalonym w celu odwracalnego unieruchomienia małych cząsteczek lub struktur wieloskładnikowych do zastosowań w biosensorach (Wideo) | JoVE Journal

Mikroprzepływowa reakcja wychwytywania-cykloaddycji w układzie scalonym w celu odwracalnego unieruchomienia małych cząsteczek lub struktur wieloskładnikowych do zastosowań w biosensorach

Przeglądaj więcej filmów