Mikroprzepływowa reakcja wychwytywania-cykloaddycji w układzie scalonym w celu odwracalnego unieruchomienia małych cząsteczek lub struktur wieloskładnikowych do zastosowań w biosensorach

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zademonstrowanie szybkiej i dającej się uogólnić strategii odwracalnego unieruchamiania małych cząsteczek i funkcjonalizowanych nanocząstek na powierzchni chipów czujników. Osiąga się to poprzez unieruchomienie przeciwciał anty GST na powierzchni czujnika. W drugim kroku wychwytywanie antygenu GST.

Funkcjonalizowany grupami transcyklocyklowymi, oktynowymi lub tetra zinami zapewnia reaktywną powierzchnię dla późniejszych reakcji edycji cyklo z małocząsteczkowymi pochodnymi sinusoidalnymi tet lub koniugatami cyklooktanowymi o trendzie nanocząstek, które są następnie funkcjonalizowane małocząsteczkowymi pochodnymi sinusoidalnymi. Następnie funkcjonalizowaną powierzchnię można wykorzystać do analizy interakcji z pożądanym rozpuszczonym celem. W ostatnim kroku powierzchnia jest regenerowana, co umożliwia kolejne cykle wychwytywania cyklo edycji, wyniki wiązania pokazują na statku bio ortogonalne reakcje zachowują zdolność unieruchomionych małych cząsteczek lub situ dwóch funkcjonalizowanych nanocząstek do interakcji z celem FK BP 12 i ilustrują, w jaki sposób to podejście może rozszerzyć zakres zastosowań SPR.

Główną zaletą tej wbudowanej w chip techniki capture cycle edition jest to, że umożliwia ona szybką odwracalną i mobilizację małych cząsteczek z kontrolą nad orientacją i gęstością mobilizacji I. Zazwyczaj proces edycji cyklu wychwytywania można przeprowadzić w ciągu kilku minut, co znacznie skraca czas przygotowania powierzchni, demonstrując procedurę Jason Sandler, student z naszego laboratorium Aby rozpocząć tę procedurę od ośmiu mikrolitrów 50-milimolowego roztworu T-C-O-N-H-S w DMSO do 100 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr roztworu GST w PBS. Po potrząsaniu mieszaniną w temperaturze pokojowej przez godzinę usunąć nadmiar odczynnika za pomocą wirowej kolumny odsalającej Zeba.

Następnie dodaj sześć mikrolitrów 25-milimolowego roztworu estru tetra NHS w DMF do 75 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr roztworu GST w PBS i wstrząśnij mieszaniną w temperaturze pokojowej po jednej godzinie. Rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną 25 mikrolitrami PBS i oczyścić za pomocą wirowej kolumny odsalającej. Następnie dodać 100 mikrolitrów 50-milimolowego roztworu T-C-O-N-H-S do 150 mikrolitrów wyemanowanego roztworu nanocząstek i wstrząsnąć mieszaniną w taki sam sposób jak poprzednio.

Po wymieszaniu usunąć nadmiar odczynnika przez filtrację żelową za pomocą kolumny NAP 10. Nawiązanie do bufora PBS. Zbierz kolorową opaskę zawierającą produkt N-P-T-C-O.

Przenieść oczyszczoną próbkę do probówki wirówkowej zawierającej filtr odśrodkowy o granicy masy cząsteczkowej 100 000. Następnie po odwirowaniu zagęścić próbkę do końcowej objętości około 150 mikrolitrów. Dodać 50 mikrolitrów 0,1-molowego roztworu bezwodnika cynowego w DMSO do roztworu N-P-T-C-O.

Po wytrząsaniu mieszaniny w temperaturze pokojowej przez godzinę, oczyścić produkt N-P-T-C-O za pomocą kolumny NAP 10 wymykającej się PBS za pomocą plazmy powierzchniowej w przyrządzie rezonansowym, wybrać immobilizację na komórkach przepływowych pierwszej i drugiej w szablonie kreatora immobilizacji AM. Zmodyfikuj metodę Amina, aby aktywować powierzchniowe grupy karboksylowe przez wstrzyknięcie roztworu jeden do jednego 0,4 molowego EDC i 0,1 molowego NHS przez 480 sekund. Przy natężeniu przepływu 10 mikrolitrów na minutę należy ustawić wstrzyknięcie etanoloaminy, aby schłodzić pozostałe aktywowane estry do 422. czasu kontaktu przy natężeniu przepływu 10 mikrolitrów na minutę.

Wprowadź nazwę liganda anty GST i ustaw na wstrzykiwanie na czas kontaktu 420 sekund przy natężeniu przepływu 10 mikrolitrów na minutę. Następnie umieść wcześniej przygotowane fiolki z roztworem w drugim stojaku na odczynniki. Upewnij się, że pozycje są zgodne z listą zawartości po przypisaniu nazwy pliku i miejsca docelowego, w którym zostaną zapisane dane.

Rozpocznij unieruchomienie. Edytuj kreatora unieruchomienia, aby wstrzykiwać tylko 20 mikrogramów na mililitr roztworu liganda GST przez 420 sekund z prędkością pięciu mikrolitrów na minutę przez referencyjną komórkę przepływową. Umieścić fiolki zawierające uprzednio przygotowany 10-mikromolowy roztwór olainy TERAZ i roztwór regeneracyjny w drugim stojaku na odczynniki.

Wybierz metodę uruchamiania ręcznego, ustaw natężenie przepływu na pięć mikrolitrów na minutę, a ścieżkę przepływu na komórkę przepływu numer dwa. Wstrzykiwać roztwór G-S-T-T-C-O przez 420 sekund, a następnie roztwór Teraz Benz Lamine przez 600 sekund. Następnie zregeneruj powierzchnię za pomocą dwóch 32. wstrzyknięć roztworu regeneracyjnego.

Po umieszczeniu fiolek z roztworem GST TERAZ, N-P-T-C-O, teraz Belamine i roztworu regeneracyjnego w drugim stojaku na odczynniki, wybierz metodę ręcznego uruchamiania przyrządu, a następnie ustaw natężenie przepływu na pięć mikrolitrów na minutę, a ścieżkę przepływu na drugą komórkę przepływu. Wstrzyknąć roztwór zinu GST Tetra przez 60 sekund, a następnie roztwór N-P-T-C-O przez 60 sekund. Na koniec wstrzyknąć roztwór belaminy tetras zine na 60 sekund.

Po zakończeniu zregeneruj powierzchnię w taki sam sposób, jak wcześniej. Następnie wybierz nową metodę i wprowadź ogólne parametry, które obejmują zbieranie danych, wykrywanie szybkości, komorę próbki, temperaturę, jednostki stężenia i ustawienia bufora. W panelu kroków testu utwórz nowy krok i nadaj mu nazwę sample.

Następnie ustaw cel i ustawienia oparte na połączeniu do próbkowania w panelu typów cykli, utwórz nowy krok cyklu i wstaw następujące polecenia. Przechwyć próbkę regeneracji pierwszej i regeneracji drugiej. Wybierz polecenie przechwytywania i wprowadź G-S-T-T-C-O jako ligand.

Wymień 120 sekund jako czas kontaktu, pięć mikrolitrów na minutę jako natężenie przepływu. I ustaw ścieżkę przepływu na sekundę. Następnie wybierz polecenie próbki i wprowadź 182. czas kontaktu, 62. czas dysocjacji, natężenie przepływu 30 mikrolitrów na minutę i ustaw ścieżkę przepływu na oba.

Następnie wybierz jedno polecenie regeneracji i wprowadź rozwiązanie do regeneracji. Nazwij 32. czas kontaktu na 30 mikrolitrów na minutę i ustaw ścieżkę przepływu na sekundę. Powtórz tę samą procedurę dla regeneracji.

Dwa polecenia wybierz ustawienie, uruchom i ustaw ścieżkę przepływu na dwa kreski jeden. Wybrać następny i wypełnić listę próbek roztworem analitu tetra Belaminy i szeregiem stężeń od 1,5 do 20 mikromolów w rozcieńczeniu jeden do dwóch. Następnie wybierz obok panelu pozycji stojaka.

Po umieszczeniu fiolek z roztworem w drugim stojaku na odczynniki, umieścić serię rozcieńczeń. W płytce 96-dołkowej. Upewnij się, że pozycje są zgodne z listą zawartości.

Zapisz szablon metody i rozpocznij test wiązania. Powiedzmy, że po wybraniu nowej metody i parametrów ogólnych utwórz i nazwij kroki pobierania próbki i regeneracji w panelu kroków testu. Następnie wybierz odpowiedni cel i podłącz ustawienia podstawowe.

Następnie wybierz panel Typy cykli i utwórz trzy kroki cyklu. Przechwytywanie, pobieranie próbek i regeneracja. Wstaw polecenie przechwytywania dwukrotnie w cyklu przechwytywania.

Wejdź do panelu przechwytywania jednego. Wybierz rozwiązanie przechwytywania jako zmienną. Następnie ustaw czas kontaktu na 300 sekund przy natężeniu przepływu pięciu mikrolitrów na minutę i ustaw ścieżkę przepływu na sekundę w panelu przechwytywania dwóch.

Wybierz rozwiązanie przechwytywania jako zmienną. Ustaw czas kontaktu na 250 sekund przy natężeniu przepływu pięciu mikrolitrów na minutę i ustaw ścieżkę przepływu na sekundę. Następnie wstaw przykładowe polecenie w kroku cyklu próbki.

Wybierz panel próbki i ustaw czas kontaktu na 60 sekund. Czas dysocjacji do 200 sekund przy natężeniu przepływu 30 mikrolitrów na minutę i ustaw ścieżkę przepływu na oba. Wstaw dwukrotnie polecenie regeneracji pod krokiem cyklu regeneracji, wybierz jeden panel regeneracji, wprowadź rozwiązanie regeneracji.

Nazwij czas kontaktu 30 sekund na 30 mikrolitrów na minutę i ustaw ścieżkę przepływu na sekundę. Powtórz tę samą procedurę dla regeneracji. Dwa panele wybierają, konfigurują, uruchamiają i ustawiają ścieżkę przepływu na dwie kreski, jeden wybiera następny i wprowadzaj G-S-T-T-C-O i teraz AP 1, 497 sprzężone jako nazwy roztworu wychwytującego FKBP 12 jako nazwę próbki i 1,5 do 96 nanomolowców w rozcieńczeniu jeden do dwóch jako szereg stężeń.

Po umieszczeniu fiolek z roztworem w stojaku na odczynniki w dwóch i serii rozcieńczeń na płytce 96-dołkowej, należy zapisać szablon metody i rozpocząć test wiązania. Skuteczna odwracalna immobilizacja bioaktywnych małych cząsteczek z kontrolą orientacji i gęstości odgrywa kluczową rolę w rozwoju nowych zastosowań bioczujników. Pokazano tutaj monitorowanie w czasie rzeczywistym immobilizacji benzoesu.

Roztwór G-S-T-T-C-O jest wstrzykiwany na wstępnie unieruchomioną powierzchnię anty GST, co powoduje wzrost o około 400 R RU. W odpowiedzi, drugi zastrzyk z Teraz zine Benzo Lamine pokazuje szybki wzrost o 15 RU w odpowiedzi. Nie zaobserwowano dysocjacji antygenu dert po przełączeniu na bufor roboczy, co świadczy o stabilności struktury.

Powierzchnia została zregenerowana w ostatnim kroku cyklu, aby umożliwić wielokrotne cykle przechwytywania cyclo edition. Stosując tę procedurę i zastępując tetrazynę, ugrupowanie benzylloloaminy koniugatem teraz zine AP 1, 497 generuje bioaktywną powierzchnię, która jest wykorzystywana do badań interakcji z celem. Zakłócenie oddziaływania antygenu przeciwciała przez FK BP 12 regeneruje powierzchnię anty GST, umożliwiając zbudowanie nowego zespołu molekularnego.

W tym przypadku po wstrzyknięciu zinu GST TERAZ następuje wstrzyknięcie N-P-T-C-O, skutecznie unieruchamiając nanocząstkę do powierzchni czujnika. Nieprzereagowane grupy TCO na nanocząstkach są dostępne w edycji cyklo z wstrzykiwanym teraz zinem benzo laminy. Alternatywnie, koniugat TET INE AP 1, 497 służy do monitorowania funkcjonalizowanych oddziaływań nanocząstek FK BP 12.

Nie zaobserwowano dysocjacji struktur wieloskładnikowych, co dostarcza dowodów na stabilność struktury i bioaktywność z możliwością monitorowania reakcji unieruchomienia w czasie rzeczywistym i regeneracji powierzchni. Prosta charakterystyka wskaźnika asocjacji KA jest realizowana, jak pokazano tutaj. Wiedza na temat kinetyki reakcji dostarcza wskazówek do kontrolowania gęstości unieruchomienia i ważnego parametru w testach biosensorowych.

Wstrzykiwanie rosnących stężeń teraz BELAMINE lub N-P-T-C-O w duplikacie na powierzchnie G-S-T-T-C-O lub GST teraz odpowiednio generuje dane wiążące. Dane wiązania dla dwóch sekwencyjnych próbek analitu o tym samym stężeniu na tej samej powierzchni są prawie niemożliwe, co odzwierciedla minimalną utratę zdolności wiązania przeciwciał. Ze względu na wiele cykli edycji cyclo i regeneracji, oprogramowanie ewaluacyjne zapewnia najlepiej dopasowaną analizę kinetyczną dla szybkości reakcji cyclo edition.

Opracowaliśmy podejście, które wykorzystuje wychwytywanie antygenu przeciwciała, w połączeniu z szybkimi, wysoce specyficznymi reakcjami edycji cyklo między teraz zinem a transcykliną, co umożliwia szybką odwracalną immobilizację małych cząsteczek. W przypadku badań opartych na chipach SPR, metoda edycji cyklu wychwytywania wymaga krótkich czasów kontaktu przy stężeniach mniejszych niż 10 mikromolowych ligandów drobnocząsteczkowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak unieruchamiać małe cząsteczki lub struktury wieloskładnikowe na powierzchni czujnika za pomocą metody capture cyclo edition.

Aby to osiągnąć, ważne jest, aby używać dobrej jakości odczynników do reakcji koniugacyjnych i odpowiednio ustawić parametry testu na instrumencie SPR.