Name: Metody in vitro Badanie pompy wypływowej MexAB z Pseudomonas aeruginosa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-17T21:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 40 s
Description: Poznaj metodę badania pompy wypływowej MexAB z Pseudomonas aeruginosa przy użyciu liposomów i rekonstrukcji białek błonowych. Ta technika umożliwia generowanie odwracalnego gradientu protonowego do analizy aktywności transportowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania były wspierane przez Agence Nationale de la Recherche (projekt ANR-2010-BLAN-1535) oraz przez grant z Région Ile-de-France (DIM-Malinf 110058).

1. Produkcja i oczyszczanie białek
<ol>
	<li>MexA, MexB z Pseudomonas aeruginosa
	<ol>
		<li>Przekształć plazmidy zawierające geny MexA i MexB w szczepie produkcyjnym E. coli (np. C43 DE3). Talerz na podłożu LB Agar uzupełniony odpowiednim antybiotykiem. Wybierz pojedynczą kolonię, aby zaszczepić prekulturę O/N. Następnego ranka zaszczepić prekulturę w 1 l LB i rosnąć w temperaturze 37 °C pod mieszaniem (240 obr./min).</li>
		<li>Gdy komórki osiągną fazę wykładniczą (OD600 = 0,6-0,8), indukuj 1 mM IPTG. Przeprowadzać indukcję przez 2-3 godziny w temperaturze 30 °C pod wpływem mieszania.</li>
		<li>Odwirować komórki (9 000 x g przez 20 min) i ponownie zawiesić w 30 ml Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCl 150 mM.</li>
		<li>Rozbij komórki za pomocą prasy francuskiej (10 000 psi, 4 przejścia). Odrzucić nieuszkodzone komórki i inkluzje przez odwirowanie przy 9 000 x g przez 20 minut.</li>
		<li>Membrany do granulek 1 godzinę przy 100 000 x g i ponownie zawiesić każdą granulkę w 30 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerol 20% (w/v), imidazol 10 mM, NaCl 500 mM.</li>
		<li>Oznaczyć całkowite stężenie białka błonowego za pomocą testu kolorymetrycznego BCA i rozpuścić błony O/N z 2% maltozydem dodecylu (DDM) w końcowej objętości oznaczonej tak, aby białko detergentu wynosiło 1:1,5 (w/w).</li>
		<li>Ultrawirować przy 100 000 x g przez 1 godzinę, aby odrzucić nierozpuszczony i zagregowany materiał.</li>
		<li>Inkubować supernatant przez 2 godziny w temperaturze 4 °C z żywicą niklową (oczyszczanie MexA) lub żywicą kobaltową (oczyszczanie MexB) zrównoważoną z Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerolem 5% (w/v), imidazolem 10 mM, NaCl 500 mM, DDM 0,2%.</li>
		<li>Wlej żywicę do pustej kolumny. Zbierz przepływ.</li>
		<li>Żywicę przemyć 50 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerolu 20% (w/v), imidazolu 10 mM, NaCl 500 mM, DDM 0,2%, następnie 25 ml Bis-Tris 10 mM pH 6, glicerolu 5% (w/v), imidazolu 10 mM, NaCl 500 mM, DDM 0,2%.</li>
		<li>Eluować białko za pomocą 20 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerolu 5% (w/v), imidazolu 300 mM, NaCl 500 mM, DDM 0,2%.</li>
		<li>Zagęścić białko za pomocą urządzenia do ultrafiltracji do 3 ml i załadować na kolumnę odsalającą zrównoważoną buforem bez imidazolu. Tuż przed rozpuszczeniem (patrz poniżej) należy ultraodwirować rozpuszczone białka (100 000 x g przez 20 minut), aby pozbyć się lipidów i nierozpuszczonych białek. Następnie ponownie zagęścić białko do 0,3 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bakteriorodopsyna z Halobacter salinarium
	<ol>
		<li>Hodować komórki Halobacter salinarium pod oświetleniem w temperaturze 37 °C przez 10 dni w płynnej pożywce wzrostowej zawierającej NaCl 4 M, MgSO4 150 mM, cytrynian 10 mM, KCl 30 mM, ekstrakt drożdżowy 5 g/l i pepton 5 g/l.</li>
		<li>Rozbijaj komórki poprzez dializę przeciwko wodzie dejonizowanej.</li>
		<li>Oczyść fioletową błonę na gradiencie sacharozy 30-40% (w/v) (100 000 x g przez 17 godzin).</li>
		<li>Zawiesinę błonową rozpuścić z 2% oktyloglukozydem przez 24 godziny w temperaturze 37 °C (objętość do rozpuszczania w celu ponownego zawieszenia membrany w stosunku 2:1 (m/w) detergentu do białka). Oszacuj stężenie rozpuszczonego BR za pomocą ε (570 nm) = 54 000 M-1 cm-1. Tuż przed rozpuszczeniem (patrz poniżej) należy ultraodwirować rozpuszczony BR (100 000 x g przez 20 minut), aby pozbyć się lipidów i nierozpuszczonych białek. 
		Uwaga: Natywne membrany są naturalnie wzbogacone w BR, więc nie jest potrzebne dalsze oczyszczanie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie proteoliposomów
<ol>
	<li>Tworzenie liposomów: Umieść 400 μl DOPC rozpuszczonego w chloroformie (25 mg/ml) w szklanej zlewce i dodaj 1,5 mg cholesterolu przechowywanego w postaci proszku. Wysuszyć je tuż przed manipulacją pod parą azotu lub odkurzyć przez co najmniej 1 godzinę w szklanej zlewce. Stosunek DOPC do mola cholesterolu wynosi 3,3:1.
	<ol>
		<li>Po wyschnięciu należy uwodnić lipidy 1 ml HEPES 25 mM pH 7, K2SO4 100 mM, MgCl2 2 mM, piraniny 2 mM. Na tym etapie zawieszenie powinno wydawać się mętne.</li>
		<li>Podgrzewać roztwór przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Sonikować przez 10 minut przy 40 W z 30-sekundowym impulsem, 30-sekundowe cykle przerwy w temperaturze pokojowej. Na tym etapie zawieszenie powinno wydawać się jasne.</li>
		<li>Aby uzyskać monodyspersyjną populację liposomów, należy wykonać dwa cykle ekstruzji i dla każdego cyklu przepuścić zawiesinę liposomów przez filtr co najmniej 11x. W pierwszym cyklu należy użyć porów membrany o wielkości 200 nm, a w drugim cyklu o wielkości porów membrany 100 nm. Na tym etapie można przeprowadzić pomiary dynamicznego rozpraszania światła w celu sprawdzenia jednorodności zawieszenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włączenie białka 
	Zasada: białka błonowe można odtworzyć w liposomach dzięki solubilizującemu działaniu detergentów. Liposomy rozpuszczone w detergentach są inkubowane z białkiem błonowym rozpuszczonym w detergentach, a tworzenie proteoliposomów jest wywoływane przez szybką eliminację detergentu za pomocą kulek polistyrenowych9.
	<ol>
		<li>Dodać 28 mg Triton X-100 (0,56% końcowy) i inkubować O/N w temperaturze 4 °C (temperaturę rozpuszczania można dostosować do badanego białka).</li>
		<li>Dodać rozpuszczone w detergentach białko (BR, MexB i MexA) do rozpuszczonych liposomów i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Dodać białka do rozpuszczonej zawiesiny liposomów w następujących proporcjach (w/w): lipidy/MexB = 20, MexB/MexA = 2,5 i lipidy/BR = 30.</li>
		<li>Dodaj kulki polistyrenowe w stosunku 30:1 kulki do detergentu (w/w, biorąc pod uwagę całkowitą masę detergentu, w tym detergentu dodanego z oczyszczonymi białkami) i inkubować przez 5 godzin, w ciemności (ze względu na BR) w temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem. Przed tą procedurą aktywuj biokulki inkubacją metanolu i etanolu i dokładnie przemyj wodą.</li>
		<li>Oczyść białka proteoliposomów i wolne substraty za pomocą kolumny odsalającej PD-10 zrównoważonej HEPES 25 mM pH 7, K2SO4 100 mM i MgCl2 2 mM.</li>
		<li>Przechowuj proteoliposomy w temperaturze 18 °C w ciemności przez okres do 2-3 tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena skuteczności rekonstytucji w gradieniu sacharozy. 
	Aby sprawdzić, czy zarówno MexB, jak i BR zostały odtworzone w liposomach, należy oczyścić zawiesinę proteoliposomów w nieciągłym gradiencie sacharozy.
	<ol>
		<li>Delikatnie osadź proteoliposomy na pięciowarstwowym gradiencie sacharozy (60%, 20%, 10%, 5% i 2,5%, w/v).</li>
		<li>Ultrawirowanie przez 17 godzin przy 100 000 x g (przy minimalnych prędkościach przyspieszania i zwalniania).</li>
		<li>Ostrożnie zbierz różne frakcje gradientowe (zwłaszcza interfejsy między każdą warstwą sacharozy) i przeanalizuj je na SDS-PAGE (10%) za pomocą barwienia Coomassie lub Western blot. Zagregowane białka znajdują się na dnie tuby, podczas gdy niewłączone, rozpuszczone w detergentach białka znajdują się na górze probówki. Proteoliposomy i liposomy znajdują się na granicy faz sacharozy, które odpowiadają ich wewnętrznej gęstości. Puste liposomy są odzyskiwane dalej w gradiencie niż proteoliposomy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pomiar fluorescencji
<ol>
	<li>Pomiary fluorescencji należy wykonywać w temperaturze 25,0 °C za pomocą spektrofluorometru pozwalającego na pomiary podwójnej długości fali (lampa Xe, 150 W). Naprzemienne okresy oświetlenia (w celu aktywacji BR o długości fali wzbudzenia / emisji 550 nm / 550 nm) oraz pomiary fluorescencji przy długościach fal wzbudzenia / emisji 455 nm / 509 nm przez 2 sekundy w celu pomiaru fluorescencji piraniny. Ustaw pasmo wzbudzenia i emisji na 5 nm. Pomiary należy wykonać w obecności 50 nM walinomycyny, aby zapobiec tworzeniu się odwrotnego potencjału błonowego ΔΨ, 
	Uwaga: Rzeczywiście, ponieważ BR pompuje protony, wewnątrz liposomu jest więcej ładunków dodatnich niż na zewnątrz. Ten gradient ładunku można odrzucić za pomocą walinomycyny, która jest jonoforem selektywnym K+. Po dodaniu do zawiesiny liposomów walinomycyna, jako cząsteczka hydrofobowa, wprowadzi się do błony liposomowej, biernie transportując K+, a tym samym rozpraszając potencjał błonowy ΔΨ.</li>
</ol>

<ol><li>Granseth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+structural+biology+-+How+far+can+the+bugs+take+us%3F+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane protein structural biology - How far can the bugs take us? (Review).</a> Molecular Membrane Biology. 24 (5-6), 329 (2007).</li>
<li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+resistance+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Multidrug resistance in bacteria.</a> Annu Rev Biochem. 78, 119 (2009).</li>
<li>Pos, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+transport+mechanism+of+the+AcrB+efflux+pump%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Drug transport mechanism of the AcrB efflux pump.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 782 (2009).</li>
<li>Murakami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+a+multidrug+transporter+reveal+a+functionally+rotating+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of a multidrug transporter reveal a functionally rotating mechanism.</a> Nature. 443 (7108), 173 (2006).</li>
<li>Seeger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Asymmetry+of+AcrB+Trimer+Suggests+a+Peristaltic+Pump+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural Asymmetry of AcrB Trimer Suggests a Peristaltic Pump Mechanism.</a> Science. 313 (5791), 1295 (2006).</li>
<li>Sennhauser, G., Bukowska, M. A., Briand, C., Grutter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+multidrug+exporter+MexB+from+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the multidrug exporter MexB from Pseudomonas aeruginosa.</a> J Mol Biol. 389 (1), 134(2009).</li>
<li>Su, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+CusBA+heavy-metal+efflux+complex+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the CusBA heavy-metal efflux complex of Escherichia coli.</a> Nature. 470 (7335), (2011).</li>
<li>Nikaido, H., Takatsuka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+RND+multidrug+efflux+pumps%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of RND multidrug efflux pumps.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 769 (2009).</li>
<li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods in enzymology. 372, 65 (2003).</li>
<li>Aires, J. R., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminoglycosides+are+captured+from+both+periplasm+and+cytoplasm+by+the+AcrD+multidrug+efflux+transporter+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Aminoglycosides are captured from both periplasm and cytoplasm by the AcrD multidrug efflux transporter of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 187 (6), 1923 (2005).</li>
<li>Picard, M., Verchere, A., Broutin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+active+transport+of+efflux+pumps+after+their+reconstitution+into+proteoliposomes%3A+caveats+and+keys%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Monitoring the active transport of efflux pumps after their reconstitution into proteoliposomes: caveats and keys.</a> Anal Biochem. 420 (2), 194 (2012).</li>
<li>Verchere, A., Dezi, M., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Protein+Purification+and+Analysis%2C+edited+by+iConcept+Press%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Protein Purification and Analysis, edited by iConcept Press.</a> , (2012).</li>
<li>Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+proton+gradients+for+the+in+vitro+investigation+of+bacterial+efflux+pumps%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps.</a> Sci Rep. 2, 306 (2012).</li>
</ol>

Nie ma nic do ujawnienia.

Opisujemy procedurę rekonstytucji przeznaczoną do oznaczania transportu białek błonowych. Po ustaleniu, procedura rekonstytucji białka prowadzi do pomiarów, które są bardzo powtarzalne. Jednak dokładne warunki odtworzenia białka będą się różnić w zależności od białka. Należy zwrócić dużą uwagę na optymalizację następujących parametrów: i) jakość oczyszczania (czystość i brak zagregowanego materiału); ii) skuteczność etapu solubilizacji detergentu (jeśli to możliwe, należy preferować detergent o niskiej CMC, ponieważ łatwiej się ich pozbyć); iii) desorpcja detergentu (możliwe jest na przykład połączenie stosowania kulek polistyrenowych z etapem dializy, ale może to wpływać na szybkość desorpcji, parametr krytyczny dla późniejszej aktywności białka, patrz odnośnik [9]); iv) Rekonstytucja lipidów (charakter chemiczny lipidów, stosunek lipidów do białek, obecność dodatkowych amfifilów to krytyczne parametry, które należy zmieniać i optymalizować). Ponadto temperatura i czas inkubacji wpływają na wszystkie te kwestie.
Kontrola jakości jest zatem pierwszorzędna na każdym etapie procesu rekonstytucji. Z tego punktu widzenia rozpraszanie światła jest bardzo wygodną techniką, ponieważ jest szybkie, nieniszczące i wymaga jedynie 20 μl próbki o stężeniu w zakresie mikromolowym. Po utworzeniu proteoliposomów bardzo pomocny jest również gradient sacharozy, który otwiera drogę do systematycznej weryfikacji rekonstytucji: jakościowej (czy białko jest rzeczywiście osadzone w błonie liposomowej), a także ilościowej (ile białka w jednym liposomie). Tym ostatnim rozwiązaniem zostałby rozwiązany poprzez precyzyjny pomiar stężeń białek i lipidów.
Nasz test nie opiera się na miareczkowaniu samego substratu, co pozwala uniknąć niełatwych rozważań dotyczących możliwej sztucznej biernej dyfuzji cząsteczki z powodu hydrofobowego podziału w błonach. Test wykorzystuje właściwości piraniny jako wiarygodnej i ilościowej sondy do monitorowania zmian pH. Nasze wyniki są zgodne z wynikami uzyskanymi za pomocą innej procedury, w której tworzenie gradientu protonów przeprowadzono przy użyciu walinomycyny10, ale pozwala to na uzyskanie bardziej wytrzymałego i powtarzalnego gradientu11. Ponadto, gradient protonów może być precyzyjnie dostrojony, po prostu zmieniając stężenie bufora (więcej szczegółów patrz Verchere et al.Rozdział 12).
W procedurze najpierw wykonuje się pomiar kontrolny przy braku substratu (daje to dostęp do biernej aktywności białka). Rzeczywista aktywność transportera białek błonowych jest następnie mierzona po dodaniu substratu do tej samej kuwety. Jest to naprawdę atut, ponieważ eksperyment można uznać za autentyczny, jednoznaczny wynik wywołany substratem.
Protokół można dostosować do automatyzacji o wysokiej i średniej przepustowości (na przykład pomiary 96-dołkowe), ponieważ oświetlenie próbki wyzwala reakcję. Automatyzacja i zrównoleglenie polegałyby na przygotowaniu dużej partii proteoliposomu i dozowaniu porcji w 96-dołkowej płytce. Następnie dodawane byłyby substraty (a także ewentualne inhibitory) i po inkubacji w ciemności przez 45 minut płytka byłaby poddawana cyklom pomiaru oświetlenia / fluorescencji piraniny na czytniku mikropłytek.
Aby uzyskać dodatkowe informacje na temat protokołu, czytelnicy są proszeni o zapoznanie się z Verchere i wsp. 12,13

Integralne białka błonowe reprezentują do 30% genów kodowanych w genomach eukariotycznych. Pełnią one kluczowe role, takie jak utrzymywanie bramek (receptorów), transport składników odżywczych, jonów lub szkodliwych związków (transportery) lub utrzymywanie przepuszczalności przez dwuwarstwy błonowe (kanały) między wszystkimi żywymi komórkami1. Pompy wypływowe odgrywają kluczową rolę w oporności na antybiotykoterapię2. U bakterii Gram-ujemnych Pseudomonas aeruginosa, która jest chroniona przez błonę zewnętrzną, transportery wypływu są zorganizowane jako systemy trójdzielne, w których MexB, pompa wypływowa znajdująca się w błonie wewnętrznej, działa w połączeniu z MexA, białkiem peryplazmatycznym i OprM, zewnętrznym kanałem błonowym. Cytoplazmatyczne białko błony wewnętrznej działa jak zależna od energii pompa o szerokiej specyficzności substratowej. Białko błony zewnętrznej działa jak poryna, podczas gdy trzecie znajduje się w przestrzeni peryplazmatycznej i uważa się, że stabilizuje cały kompleks3. W dalszej części skupimy się na zaprojektowaniu testu funkcjonalnego dla zestawu MexA MexB.
Informacje strukturalne zostały zgromadzone w ciągu ostatnich 5 lat dzięki rentgenowskiemu określeniu homologicznego białka AcrB z Escherichia coli4-7. Chociaż niewątpliwie ważne jest powiązanie takich informacji z danymi dynamicznymi i kinetycznymi, zaprojektowanie testu funkcjonalnego dla tego transportera jest prawdziwym wyzwaniem8. Rzeczywiście, białka błonowe muszą być utrzymywane w środowisku błoniastym, a zamknięta komora musi być utrzymywana, aby można było osiągnąć wektorowy transport substratu.
Rekonstytucja białek błonowych w proteoliposomach została szeroko przedstawiona i przejrzana (zobacz Rigaud i Levy9). Takie protokoły pozwalają na monitorowanie aktywności białek błonowych, na przykład poprzez śledzenie substratów w poprzek błony liposomowej. W tym przypadku ograniczenia wynikają z dostępności substratów dających się miareczkować (fluorescencyjnych, radioaktywnych itp.) oraz z faktu, że bardzo często podłoża te są hydrofobowe i mają tendencję do przenikania przez błony niezależnie od obecności transportera. Alternatywnie można śledzić spektroskopowe zmiany barwnika raportującego wrażliwego na zmiany chemiczne, które zachodzą w wyniku transportu. Jak wspomniano powyżej, protony zasilają transport przez MexB. W związku z tym istotną opcją jest monitorowanie zmian spektroskopowych barwnika raportującego wrażliwego na pH w celu śledzenia zmian pH spowodowanych transportem substratu przez protony. Wybór barwnika fluorescencyjnego pozwala uniknąć jakichkolwiek efektów sztucznych ze względu na hydrofobowy charakter podłoża.
Dodatkowym utrudnieniem jest generowanie gradientu protonów. W literaturze można znaleźć kilka protokołów. Wśród nich szeroko rozpowszechnione jest stosowanie techniki walinomycyny, ale wykazaliśmy, że wykonywanie10-11 jest żmudne. Co więcej, nie jest ona odtwarzalna i nie jest odwracalna. Uciekliśmy się do użycia bakteriorodopsyny (BR), aktywowanej światłem pompy protonowej z Halobacter salinarium, halofilnego morskiego imperatywnego archeonu tlenowego Gram-ujemnego. Białko to jest rdzeniowo tworzone w liposomach za pomocą MexB, a po oświetleniu BR pompuje protony do wnętrza liposomów, a tym samym wytwarza ∆pH (kwaśne wnętrze) potrzebne białku do transportu substratu12-13.

<table><tbody><tr><td>DOPC (1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93427</td><td></td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Invitrogen</td><td>V-1644</td><td></td></tr><tr><td>Piranina (8- kwas hydroksypireno-1,3,6-trisulfonowy)</td><td>Invitrogen</td><td>H-348</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-dodecyl-&beta;-D-maltopyranozyd)</td>Zestaw ekstrudera <td>Affymetrix</td><td>D310LA</td><td></td></tr><tr><td>(wytłaczarka, gazoszczelne strzykawki Hamilton)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads SM-2 Adsorbenty</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac Chromatografia pusta kolumna</td><td>Biorad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny odsalające</td><td>Bio-Rad</td><td>54805</td><td></td></tr><tr><td>Dynamiczny przyrząd do rozpraszania światła</td><td>Wyatt Technology</td><td>DynaPro NanoStar</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometr JASCO FP-6200</td><td>JASCO</td><td>6816-J002A</td><td></td></tr></tbody></table>

metody in vitro badanie pompy wypływowej mexab z pseudomonas aeruginosa

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

Pojawia się naukowe zapotrzebowanie na niezawodne narzędzia do monitorowania transportu białek błonowych. Przedstawiono metodykę prowadzącą do rekonstytucji pomp wypływowych bakterii Gram-ujemnych Pseudomonas aeruginosa w środowisku biomimetycznym, które pozwala na dokładne zbadanie ich aktywności transportowej. Spełnione są trzy warunki wstępne: podział na przedziały w środowisku lipidowym, zastosowanie odpowiedniego wskaźnika do transportu oraz wygenerowanie gradientu protonów. Transporter białek błonowych jest odtwarzany w liposomach wraz z bakteriorodopsyną, aktywowaną światłem pompą protonową, która generuje gradient protonów, który jest solidny, a także odwracalny i przestrajalny. Aktywność białka określa się na podstawie zmian pH zachodzących w liposomie, przy użyciu piraniny, sondy fluorescencyjnej zależnej od pH. Opisujemy krok po kroku procedurę, w której omówiono oczyszczanie białek błonowych, tworzenie liposomów, rekonstytucję białek i analizę transportu. Chociaż zostały one specjalnie zaprojektowane dla transportera RND, opisane metody mogą być potencjalnie zaadaptowane do użytku z dowolnym innym transporterem białek błonowych zasilanym przez gradient protonów.

Analiza polega na monitorowaniu fluorescencji pyraniny w funkcji czasu podczas generowania gradientu protonowego. W tym celu próbki poddawane są naprzemiennie oświetleniu (co uruchamia pompowanie protonów przez BR), a następnie pomiarowi fluorescencji z wykorzystaniem długości fal wzbudzenia i emisji pyraniny (λex = 455 nm i λem = 509 nm).
Rysunek 1 przedstawia reprezentatywną próbę kontrolną uzyskaną w tym teście w obecności MexA/MexB, potwierdzającą, że gradient protonowy generowany przez BR jest odwracalny. Po jednym cyklu zakwaszania proteoliposomy są przechowywane w ciemności przez 45 min, aby BR przestało pompować protony (protony dyfundują powoli i pasywnie przez dwuwarstwy lipidowe zgodnie z gradientem stężeń). Po tym czasie regeneracji ponowna aktywacja BR jest możliwa poprzez ponowne naświetlenie tej samej zawiesiny.
Rycina 2 przedstawia rzeczywisty pomiar transportu. Kontrola negatywna z liposomami wolnymi od białek pokazuje, że zgodnie z oczekiwaniami pH pozostaje stałe podczas naświetlania (Ryciny 2A i 2B, pomarańczowe okręgi). Jednak proteoliposomy zawierające BR w swoich błonach pompują protony, w związku z czym pH wewnątrz liposomu spada i tworzy się stabilny gradient (Ryciny 2A i 2B, fioletowe kwadraty). Szare trójkąty i czerwone romby (Rycina 2A) reprezentują pH wewnątrz proteoliposomów zawierających BR i MexB, odpowiednio w obecności lub w nieobecności Hoechst 33342. Obserwujemy aktywność niezależną od substratu, w której gradient protonowy jest tylko częściowo rozpraszany przez kontratransport MexB. Obserwację tę przypisujemy aktywności podstawowej MexB.
Aby zbadać wpływ MexA na aktywność MexB, do rekonstytucji dodano MexA, najpierw w obecności samego białka, bez żadnego substratu (Rysunek 2B, niebieskie romby). Ponownie gradient protonowy generowany przez BR zostaje rozproszony tylko częściowo. Właściwy pomiar transportu przeprowadzono na tej samej próbce. Wcześniej należy ponownie zainicjować gradient protonowy i dodać substrat do zawiesiny, aby dotarł on do miejsca wiązania w białku. W tym celu zawiesinę inkubowano w ciemności w obecności substratu przez 45 min. Po następnym naświetleniu można zauważyć, że gradient protonowy generowany przez BR jest teraz całkowicie rozproszony przez MexAB (Rysunek 2B, zielone trójkąty), co jest następstwem transportu substratu przez pompę.
<img alt="Wykres zmiany pH liposomów, schemat efektu inkubacji na wewnętrzne pH w czasie." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Odwracalność gradientu protonowego wytworzonego przez naświetlanie BR: Fluorescencja pyraniny w proteoliposomach BR mierzona w funkcji czasu. Od 0 do 15 min BR pompuje protony w wyniku aktywacji światłem. Od 15 do 60 min proteoliposomy są inkubowane w ciemności; w tym czasie protony pasywnie opuszczają liposomy, aż do momentu wyrównania pH wewnątrz pęcherzyków i pH na zewnątrz. Od 60 do 75 min BR nadal pozostaje funkcjonalny i pompuje protony po naświetleniu.
<img alt="Wykres pH liposomów w funkcji czasu; porównanie aktywności enzymatycznej; wykres z danymi kontrolnymi i substratowymi." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Analiza transportu: fluorescencja pyraniny, przeliczona na odpowiadające jej zmiany pH, w funkcji czasu. A>) pH wewnątrz liposomów kontrolnych (pomarańczowe koła); pH wewnątrz proteoliposomów zawierających BR w błonie (fioletowe kwadraty); pH wewnątrz proteoliposomów zawierających BR i MexB w błonie bez Hoechst 33342 (czerwone romby); pH wewnątrz proteoliposomów zawierających BR i MexB w błonie z Hoechst 33342 (szare trójkąty). B>) pH wewnątrz liposomów kontrolnych (pomarańczowe koła); pH wewnątrz proteoliposomów zawierających BR w błonie (fioletowe kwadraty); pH wewnątrz proteoliposomów zawierających BR, MexB i MexA w błonie bez Hoechst 33342 (niebieskie romby); pH wewnątrz proteoliposomów zawierających BR, MexB i MexA w błonie z Hoechst 33342 (zielone trójkąty).

Przedstawiamy protokół do badania in vitro pomp wypływowych z Pseudomonas aeruginosa. Protokół ten pozwala na generowanie solidnego, odwracalnego i przestrajalnego gradientu protonów w błonie liposomowej, a zatem powinien być przystosowany do dowolnego białka błonowego zasilanego siłą protomotoryczną.

Metody in vitro Badanie pompy wypływowej MexAB z Pseudomonas aeruginosa

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie pompy FLX mi AB z Pseudomonas aosa za pomocą testu funkcjonalnego opartego na rekonstytucji białek błonowych. W liposomach. Osiąga się to poprzez najpierw nadekspresję i oczyszczanie białek błonowych, zmieszany B i bakteryjny Rodin w białkach błonowych bakterii, a następnie ekstrahowany z błon i oczyszczany za pomocą chromatografii powinowactwa.Drugim krokiem jest przygotowanie liposomów poprzez połączenie wysuszonego filmu lipidowego z buforem zawierającym purynę, co prowadzi do powstania pęcherzyków multilamowych. Po sonikacji liposomy są wytłaczane w celu uzyskania jednorodnej populacji liposomów. Następnie do roztworu liposomu dodaje się białka błony detergentowej, a następnie kulki polistyrenu.Hydrofobowe ogonki detergentu dodają absorpcję na kulkach polistyrenu, umożliwiając białkom błonowym poluzowanie paska detergentu i włożenie go do membrany liposomowej. Ostatnim krokiem jest usunięcie niekapsułkowanej puryny Uruchamiając liposomy protei na kolumnie odsalającej, duże liposomy prot docierają do dna kolumny znacznie szybciej niż niekapsułkowana puryna, która pozostaje przywiązana do górnej części kolumny. Ostatecznie pobiera się liposomy protalowe, a ich fluorescencję wykorzystuje się do badania aktywności Mex AB poprzez zmianę pH powstałą po oświetleniu opsyny bakteryjnej.Pompy Rodin Effects są transporterami, które promują oporność na antybiotyki ze względu na rozpoznawanie i transport szerokiej gamy substratów ze wszystkich rodzin antybiotyków, istnieje pilna potrzeba nowych i wiarygodnych testów aktywności in vitro pod kątem wpływu białek błonowych. Transportery. Rzeczywiście, takie testy dostarczyłyby nowych informacji na temat molekularnych mechanizmów transportu i pomogłyby w farmakologicznych badaniach przesiewowych nowych potencjalnych inhibitorów. Skupiamy się na mix a mix, B-O-P-R-M, eFlex Perm od ginu Pseudomona.Przedstawiamy porady techniczne i metodę niezbędną do spełnienia trzech wymagań dotyczących zaprojektowania skutecznego testu funkcjonalnego in vitro dla pompy mix a B ffl, w tym składu białka w błonie, zastosowania zamkniętej komory niezbędnej do wektorowego transportu substratu, drobnych pokazów przewodów kominowych i matrycy, która pozwala uniknąć efektu artefaktu ze względu na adro charakter substratu i generowanie gradientu białka potrzebnego do mieszanki AB do funkcja. Mocną stroną naszego testu jest sposób, w jaki generujemy powtarzalny gradient T i odwracalny gradient pro w celu wytworzenia pH delta, które nazywamy bakteriami nstitute lub VR z mieszanką AB w błonie liposomowej. BR jest białkiem błonowym oczyszczonym z fioletowej błony aob salinium allic Marin gram-ujemnego, obligatoryjnego aansa tlenowego.Po oświetleniu białko to aktywnie pompuje białka. Dlatego, jeśli BR ukonstytuuje się razem z białkiem w liposomie, eliminacja liposomu stworzy pH delta ze względu na br, który pompuje białka do liposomów. Przygotowanie czystego i stabilnego materiału białkowego ma pierwszorzędne znaczenie.Procedura oczyszczania białka błonowego sprawia, że B została ładnie opisana w poprzedniej publikacji filmowej J ovy, a także w protokole tekstowym dołączonym do tego filmu, w którym można również znaleźć opis oczyszczania mieszanki białek błonowych A Aby przygotować bakteryjnego Rodina z Halabach Salinium hoduj komórki salinium w halabach pod oświetleniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 dni. W płynnej pożywce wzrostowej rozerwij komórki poprzez dializację z wodą dejonizowaną. Oczyść fioletową błonę w gradiencie sacharozy od 30 do 40%.Następnie rozpuść zawiesinę błonową za pomocą 2% oktalnego glukozydu. Były 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Chroń rurkę przed światłem, owijając ją folią aluminiową.Oszacuj stężenie rozpuszczonych bakterii lub dawki, używając współczynnika ekstynkcji podanego w protokole tekstowym tuż przed rozpuszczeniem. Ultraodwiruj rozpuszczoną opsynę bakteryjną, aby pozbyć się lipidów i rozpuścić białka. Aby przygotować liposomy w szklanym głośniku, odważ 1,5 miligrama cholesterolu przechowywanego w postaci proszku i dodaj 400 mikrolitrów diolu fosfatydylocholiny lub DOPC rozpuszczonego w chloroformie w szklanej zlewce, wysusz je w próżni przez co najmniej godzinę w szklanej zlewce tuż przed manipulacją.Wynikowy stosunek DOPC do mola cholesterolu wynosi 3,3 do jednego. Po wysuszeniu uwodnienia lipidów jednym mililitrem buforu hebes, zawiesina powinna wydawać się twarda. Na tym etapie podgrzewać roztwór przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, sonikować przez 10 minut przy 40 watach z naprzemiennymi 32. impulsami, 32. cyklami pauzy w temperaturze pokojowej, zawiesina powinna wydawać się klarowna.Na tym etapie najbardziej krytycznym aspektem zabiegu jest uzyskanie szczelnej i mono rozproszonej zawiesiny liposomów. W tym celu dokładamy wszelkich starań, aby ustawić urządzenie z dodatkowym pierścieniem, aby nie doszło do wycieku. Dodatkowo po każdym użyciu czyścimy urządzenie bardzo skrupulatnie.Aby uzyskać mono rozproszoną populację liposomów, wykonaj dwa cykle ekstruzji dla każdego cyklu. Przepuść zawiesinę liposomów przez filtr co najmniej 11 razy. W pierwszym cyklu należy użyć porów membrany o wielkości 200 nanometrów, a w drugim cyklu o wielkości porów membrany wynoszącej 100 nanometrów.W tym momencie można wykonać pomiary dynamicznego rozpraszania światła w celu sprawdzenia jednorodności zawiesiny. Pokazany tutaj jest typowy wynik tego kroku. Białka błonowe mogą być odtwarzane w liposomach ze względu na solubilizujące działanie detergentów, detergentów.Rozpuszczone liposomy są inkubowane z detergentem, rozpuszczonym białkiem błonowym i tworzeniem protei. Liposomy są wywoływane przez szybką eliminację detergentu za pomocą kulek polistyrenowych. Aby dodać białko, dodaj 28 miligramów Tritton X 100 i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Dodaj rozpuszczone białko detergentu, w tym bakterie opsyny Mex B i Mex A do rozpuszczonych liposomów i inkubuj przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodaj wcześniej aktywowane kulki polistyrenowe. Dodaj stosunek 30 do jednej pszczoły do detergentu i inkubuj przez pięć godzin w ciemności w temperaturze pokojowej.Pod delikatnym mieszaniem oczyść białko liposomów protia i wolne substraty za pomocą kolumny odsalającej PD 10 zrównoważonej buforem Hessa. Aby sprawdzić, czy zarówno Mex B, jak i opsyna bakteryjna zostały odtworzone w liposomach, należy oczyścić zawiesinę liposomów protei na nieciągłym gradiencie sacharozy. Delikatnie osadź proteosom na pięciowarstwowym gradiencie sacharozy.Następnie ultra wirować przez 17 godzin w temperaturze stu tysięcy G po ultra ifikacji, zagregowane białka znajdują się na dnie probówki, podczas gdy niewłączone białka rozpuszczalne w detergentach znajdują się w górnej części probówki. Protea, liposomy i liposomy znajdują się na granicy faz sacharozy, które odpowiadają ich wewnętrznej gęstości. Puste liposomy są odzyskiwane wyżej w gradiencie niż liposomy prot.Ostrożnie zbierz różne frakcje gradientowe przed analizą ich za pomocą siarczanu dylu. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym przy użyciu barwienia kumasi lub western blotting. Wykonuj pomiary fluorescencji w temperaturze 25 stopni Celsjusza za pomocą fluorymetru spektralnego, co pozwala na pomiary podwójnej długości fali.Naprzemiennie zmieniaj okresy oświetlenia, aby aktywować bakteryjną rodynę charakteryzującą się długościami fal wzbudzenia i emisji 550 nanometrów z pomiarami fluorescencji puryny, które charakteryzują się długością fali wzbudzenia 455 nanometrów i długością fali emisji 509 nanometrów przez dwie sekundy. Ustaw pasma wzbudzenia i emisji na pięć nanometrów. Pomiary należy wykonać w obecności 50 nanomolowych lin, aby zapobiec tworzeniu się odwrotnego potencjału błonowego.Pokazane tutaj westchnienie Delta jest reprezentatywną kontrolą uzyskaną za pomocą testu pod nieobecność Mex a, Mex B, sprawdzającego, czy gradient protonów generowany przez bakteryjną opsynę pręcików jest odwracalny. Po jednym cyklu zakwaszania liposomy Oreo są trzymane w ciemności przez 45 minut, aby bakterie opsyna przestały pompować protony. Po tym czasie rekonwalescencji aktywacja opsyny bakteryjnej jest możliwa po prostu poprzez oświetlenie tej samej zawiesiny.Ponownie, rzeczywisty pomiar transportu pokazuje, że kontrola ujemna z liposomami wolnymi od białek ma stałe pH po oświetleniu zgodnie z oczekiwaniami. Jednak liposomy protei zawierające bakterie lub opsynę w swoich błonach pompują protony. W ten sposób pH wewnątrz liposomów spada i budowany jest stabilny gradient.Szare trójkąty reprezentują pH wewnątrz liposomów protei zawierających bakterie lub opsynę i mex B w obecności mistyfikacji. 3, 3, 3, 4, 2 barwnik. Podczas gdy czerwone diamenty reprezentują pH pod nieobecność barwnika, aktywność niezależna od substratu A obserwuje się, gdy gradient protonów jest tylko częściowo rozpraszany przez przeciwtransport Mex B, co przypisuje się podstawowej aktywności Mex B.In celu zbadania wpływu Mex A na aktywność Mex b Mex A został dodany do rekonstytucji jako pierwszy.W przypadku braku jakiegokolwiek substratu, gradient protonów generowany przez bakteryjną opsynę jest tylko częściowo rozpraszany. Rzeczywisty pomiar transportu jest wykonywany na tej samej próbce, a proton jest inicjowany w wodzy, a substrat jest dodawany do zawiesiny, aby dotrzeć do miejsca wiązania w białku. Po kolejnym naświetleniu można zauważyć, że gradient protonów generowany przez bakteryjną opsynę jest teraz całkowicie rozpraszany przez Mex AB w wyniku transportu substratu przez pompę, Ważne jest, aby pamiętać, że dokładny warunek niezbędny do adaptacji tego protokołu do innego białka może różnić się od tego, co zostało tutaj opisane.Należy zwrócić uwagę na optymalizację następujących parametrów: jakości oczyszczania, skuteczności detergentu, etapu solubiizacji desorpcji detergentu, składu lipidowego i stosunku lipidów do białka. Ponadto temperatura i okresy inkubacji mają wpływ na wszystkie te parametry. Nasz protokół otwiera drogę do lepszego zrozumienia aktywności mieszanki pomp r and d flix B. Niemniej jednak, jeśli została ona sprzedana specjalnie dla transportera r and d, metoda ta może zostać dostosowana do dowolnego transportera spamu FFL aktywowanego przez PMF.

in-vitro-investigation-mexab-efflux-pump-from-pseudomonas

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

In vitro Badanie pompy efektorowej MexAB z Pseudomonas aeruginosa

W niniejszym protokole przedstawiamy ekspresję, solubilizację i oczyszczanie rekombinowanego białka błonowego MexB w formie rozpuszczalnego kompleksu białko-detergent. MexB jest błonowym transporterem oporności wielolekowej pochodzącym z oportunistycznego patogenu bakteryjnego Pseudomonas aeruginosa.

Ekspresja, solubilizacja w detergencie i oczyszczanie transportera błonowego – białka oporności wielolekowej MexB

Źródło: Bru, J., et.al. Obrazowanie poklatkowe rojów bakterii i zbiorowej reakcji na stres. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje, jak wizualizować i mierzyć zachowanie unikania roju u Pseudomonas aeruginosa za pomocą testu roju na płytkach agarowych. Pokazuje konfigurację obrazowania poklatkowego w kontrolowanych warunkach i wyjaśnia, w jaki sposób sygnały stresu wywołanego antybiotykiem przekierowują ruch bakterii, który jest określany ilościowo za pomocą analizy obrazu.

Obrazowanie i ilościowe określanie reakcji unikania roju na stres antybiotykowy u Pseudomonas aeruginosa

Ten artykuł wideo opisuje potok o wysokiej przepustowości, który został pomyślnie ustanowiony do infekowania i analizowania dużej liczby zarodków danio pręgowanego, dostarczając nowego potężnego narzędzia do testowania związków i odkrywania leków przy użyciu całego organizmu kręgowców zwierzęcych.

Opracowanie i optymalizacja wysokoprzepustowej konfiguracji do badania zakażeń Staphylococcus epidermidis i Mycobacterium marinum jako modelu do odkrywania leków

Tutaj prezentujemy eksperymentalną metodę testowania roli wielokopijnych plazmidów w ewolucji oporności na antybiotyki.

Badanie roli plazmidów wielokopijnych w ewolucji oporności na antybiotyki

Tutaj opisujemy prosty i powtarzalny protokół mysiego modelu infekcji do oceny osłabienia genetycznie zmodyfikowanych szczepów Pseudomonas aeruginosa w porównaniu z zatwierdzonymi przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) Escherichia coli do zastosowań komercyjnych.

Generowanie mutantów delecji genów w ramce u Pseudomonas aeruginosa i testowanie tłumienia wirulencji w prostym mysim modelu infekcji

Ten protokół opisuje, jak mierzyć przepuszczalność jelit Caenorhabditis elegans. Metoda ta jest pomocna w podstawowych badaniach biologicznych nad zdrowiem jelit związanych z interakcją między bakteriami jelitowymi a ich gospodarzem oraz w badaniach przesiewowych w celu identyfikacji czynników probiotycznych i chemicznych w leczeniu zespołu nieszczelnego jelita i chorób zapalnych jelit.

Pomiar wpływu bakterii i substancji chemicznych na przepuszczalność jelit Caenorhabditis elegans

Fluorescencyjnie oznaczone antybiotyki są potężnymi narzędziami, które mogą być używane do badania wielu aspektów oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. W artykule opisano przygotowanie antybiotyków znakowanych fluorescencyjnie i ich zastosowanie do badania antybiotykooporności bakterii. Sondy mogą być wykorzystywane do badania mechanizmów oporności bakterii (np. wypływu) za pomocą spektrofotometrii, cytometrii przepływowej i mikroskopii.

Wizualizacja oporności bakterii za pomocą fluorescencyjnych sond antybiotykowych

Ten przepływ pracy może być wykorzystany do przeprowadzenia testów wrażliwości na antybiotyki przy użyciu ustalonego modelu ex vivo biofilmu bakteryjnego w płucach osób z mukowiscydozą. Zastosowanie tego modelu może zwiększyć ważność kliniczną testów MBEC (minimalne stężenie eradykacji biofilmu).

Badanie skuteczności antybiotyków w modelu ex vivo biofilmów Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus w płucach mukowiscydozy

Opisujemy łatwą procedurę jednokopijnego uzupełniania chromosomalnego genu pompy wypływu za pomocą systemu ekspresji opartego na mini-Tn7 do zmodyfikowanego szczepu Acinetobacter baumannii, z niedoborem wypływu. To precyzyjne narzędzie genetyczne pozwala na kontrolowaną ekspresję genów, co ma kluczowe znaczenie dla scharakteryzowania pomp wypływowych w patogenach opornych na wiele leków.

Charakterystyka wielolekowych systemów wypływu u Acinetobacter baumannii przy użyciu szczepu bakteryjnego z niedoborem wypływu i systemu ekspresji genów z pojedynczą kopią

Obecnie brakuje modeli in vivo , które można by poddać badaniom przesiewowym w kierunku przewlekłych zakażeń bakteryjnych. W tym miejscu opisujemy protokół zakażenia rany za pomocą izolatu klinicznego Pseudomonas aeruginosa w celu wywołania trwałej infekcji u larw danio pręgowanego.

Modelowanie uporczywego zakażenia Pseudomonas aeruginosa u zranionych larw danio pręgowanego

Oporność na antybiotyki wśród szczepów Escherichia coli adhezywno-inwazyjnych stanowi wyzwanie dla oceny inwazji bakteryjnej przy użyciu tradycyjnego testu ochrony gentamycyną. Opisano ulepszoną metodę oceny ilościowej inwazji bakteryjnej poprzez liczenie jednostek tworzących kolonie i oceny jakościowej poprzez wizualizację zakażonych komórek za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Test ochrony amikacyny do ilościowego i wizualnego określenia Escherichia coli inwazji komórkowej

Poznaj metodę badania pompy wypływowej MexAB z Pseudomonas aeruginosa przy użyciu liposomów i rekonstrukcji białek błonowych. Ta technika umożliwia generowanie odwracalnego gradientu protonowego do analizy aktywności transportowej.

Metody in vitro Badanie pompy wypływowej MexAB z Pseudomonas aeruginosa

Przeglądaj więcej filmów