Name: Spektrometria mas MALDI-TOF dla całych komórek jest dokładną i szybką metodą analizy różnych trybów aktywacji makrofagów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-26T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Poznaj spektrometrię mas MALDI-TOF dla całych komórek jako szybką metodę analizy stanów aktywacji makrofagów. Technika ta pozwala na dokładne rozróżnienie różnych fenotypów komórek immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Richard Ouedraogo jest wspierany przez grant z Ministère de la Santé (PHRC 2010). Dziękujemy Laurentowi Gorvelowi, Christophe'owi Flaudropsowi i Nicolasowi Amstrongowi za pomoc techniczną.

W obecnym protokole, technika MALDI-TOF dla całej komórki jest używana do uzyskania widma masowego traktowanego jako odcisk palca próbki. Analiza bioinformatyczna pozwoliła na porównanie i sklasyfikowanie tych odcisków palców. Protokół ten składał się z trzech głównych części:
<ol>
	<li>Przygotowanie próbek biologicznych: makrofagi kontrolne i makrofagi stymulowane różnymi agonistami.</li>
	<li>Analiza każdego rodzaju próbki z kontrpróbami technicznymi za pomocą całokomórkowych MALDI-TOF MS.</li>
	<li>Bioinformatyczna analiza surowych danych.</li>
</ol>
Przygotuj sterylne roztwory do izolacji komórek i hodowli. Przygotować i przechowywać wszystkie odczynniki w temperaturze 4 °C
1. Przygotowanie ludzkich monocytów
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych. Dodać 55 ml ludzkiej surowicy AB+ lub płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 5 ml roztworu antybiotyku (penicylina w stężeniu 10 000 j.m./ml i streptomycyna w stężeniu 10 000 μg/ml; stężenie końcowe 100 j.m./ml dla penicyliny i 100 μg/ml dla streptomycyny) do pożywki RPMI 1640 (500 ml).
	<ol>
		<li>Wyizolować komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) z leukopacków (koncentratów leukocytów).
		<ol>
			<li>Przygotować 50 ml probówek zawierających 15 ml Ficollu. Rozcieńczyć krew w roztworze soli fizjologicznej (obj./obj., 1/10). Umieść 30 ml rozcieńczonych PBMC na Ficoll, jak opisano wcześniej26.</li>
			<li>Wirować przy 700 x g przez 20 min. Odzyskać PBMC na granicy faz między Ficollem (gęstość 1,077 g/ml) a rozcieńczonym osoczem. Rozcieńczyć PBMC w pożywce hodowlanej i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj monocyty CD14+ z PBMC za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami anty-CD14. 
		Uwaga: Produkty i komórki należy przechowywać w temperaturze 4 °C aż do ustąpienia monocytów.
		<ol>
			<li>Przygotować bufor do pracy składający się z buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (PBS) o pH 7,2, 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).</li>
			<li>Delikatnie zdysocjuj granulowane PBMC (107 komórek na test) na 80 μl działającego buforu.</li>
			<li>Dodaj 20 μl mikrokulek CD14 do PBMC. Mieszać i inkubować PBMC przez 15 minut. Przemyć PBMC 5 ml bieżącego buforu i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Delikatnie zdysocjować granulowane PBMC na 500 μl buforu roboczego dla 108 PBMCs. 
			Uwaga: należy użyć 500 μl buforu bieżącego dla stężeń PBMC niższych niż 108 PBMC.</li>
			<li>Przejdź do separacji magnetycznej. 
			Uwaga: w przypadku mniej niż 2 x 108 PBMC należy użyć kolumny MS; dla więcej niż 2 x 108 PBMC i mniej niż 2 x 109 PBMC użyj kolumny LS.</li>
			<li>Przepłukać kolumnę wstępną i kolumnę działającym buforem (500 μl dla kolumny MS lub 3 ml dla kolumny LS).Dodaj PBMC do kolumny wstępnej (poczekaj, aż komórki bez etykiet przejdą przez kolumnę). Przepłukać 3 razy bieżącym buforem (500 μl dla kolumny MS lub 3 ml dla kolumny LS). Usuń kolumnę wstępną.</li>
			<li>Umieścić kolumnę na probówkach o pojemności 15 ml. Dodaj bufor do biegania (1 ml dla kolumny MS lub 5 ml dla kolumny LS) na kolumnę i eluuj komórki CD14 +, wywierając nacisk na kolumnę.</li>
			<li>Odwirować eluat o stężeniu 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant. Przemyć osad monocytów 10 ml pożywki hodowlanej. 
			Uwaga: Przeanalizuj czystość preparatu monocytów przy użyciu przeciwciał anty-CD14 i cytometrii przepływowej (klasycznie wyższej niż 95%).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Różnicowanie monocytów w makrofagi.
	<ol>
		<li>Inkubować monocyty (10-6 monocytów na basenie na płytkach 6-dołkowych) w 3 ml pożywki zawierającej 10% ludzkiej surowicy AB+ w temperaturze 37 °C. Po 4 dniach należy zastąpić pożywkę zawierającą surowicę ludzką pożywką hodowlaną zawierającą 3 ml pożywki zawierającej 10% FBS na dodatkowe 3 dni.</li>
		<li>Zidentyfikuj uzyskaną populację komórek jako makrofagi pochodzące z monocytów (MDM) za pomocą cytometrii przepływowej (patrz ryc. 1).
		<ol>
			<li>Zastąp pożywkę hodowlaną 3 ml PBS. Zeskrob MDM z gumowym policjantem i zbieraj zawieszenia MDM. Wirować przy 400 x g przez 5 min. Dodać PBS zawierający 2% BSA do granulowanych MDM i delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową. Dostosować stężenie komórek (10-6 MDM w 200 ml PBS) i inkubować w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Dodać 10 ml przeciwciał anty-CD14 i 10 ml przeciwciał anty-CD68 do zawiesiny MDM i inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut w ciemności. 
			Uwaga: przeciwciała te muszą być znakowane dwoma różnymi fluorochromami zgodnymi z analizą cytometrii przepływowej. Na przykład przeciwciała anty-CD14 mogą być sprzężone z fikoerytryną (do barwienia monocytów), a przeciwciała anty-CD68 sprzężone z Alexa Fluor 647 (do barwienia makrofagów).</li>
			<li>Odwirować MDM przy 400 x g przez 5 minut. Usunąć supernatanty. Delikatnie zdysocjuj osad komórkowy i inkubuj MDM w 250 ml 3% paraformaldehydu (PFA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować MDM z utrwalonym PFA przy 400 x g przez 5 min. Przemyć MDM 3 ml PBS i odwirować MDM przy 400 x g przez 5 minut. Delikatnie zdysocjować osad MDM w 400 ml PBS.</li>
			<li>Przeanalizuj różnicowanie monocytów (które wyrażają CD14, ale nie CD68) w monocyty (które wyrażają CD68, ale nie CD14). Uwaga: klasycznie ponad 95% komórek to MDM.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>18 godzinna stymulacja MDM.
	<ol>
		<li>Zastąp pożywkę z przylegających MDM świeżą pożywką o pojemności 3 ml (zawierającą 10% FBS).</li>
		<li>Aby wywołać polaryzację M1 lub M2, użyj następujących ludzkich rekombinowanych cytokin: IFN-γ i TNF do polaryzacji M1 oraz IL-4 do polaryzacji M2. Makrofagi M1 uzyskuje się również przez stymulację LPS. Należy zauważyć, że roztwory podstawowe cytokin są konserwowane w temperaturze -80 °C, a roztwór podstawowy LPS zachowuje się w temperaturze -20 °C.
		<ol>
			<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy IFN-gγ (1 mg/ml) w stosunku 1:100 w pożywce hodowlanej w celu uzyskania rozcieńczenia 10 ng/ml. Dodać 6 μl tego rozcieńczenia IFN-γ do MDM, aby uzyskać końcowe stężenie IFN-γ 20 ng/ml.</li>
			<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy TNF (1 mg/ml) w stosunku 1:100 w pożywce hodowlanej w celu uzyskania rozcieńczenia 10 ng/ml. Dodać 6 μl tego rozcieńczenia TNF do MDM, aby uzyskać końcowe stężenie TNF 20 ng/ml.</li>
			<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy IL-4 (1 mg/ml) w stosunku 1:100 w pożywce hodowlanej, aby uzyskać rozcieńczenie 10 ng/ml. Dodać 6 μl tego rozcieńczenia IL-4 do MDM, aby uzyskać końcowe stężenie IL-4 20 ng/ml.</li>
			<li>Dodać 3 μl roztworu podstawowego LPS (1 mg/ml) do MDM, aby uzyskać końcowe stężenie LPS 1 μg/ml.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aby stymulować MDM bakteriami, użyj bakterii zabitych termicznie. Umyj żywe bakterie PBS i podgrzewaj je w temperaturze 95 °C przez 1 godzinę. Użyj Orientia tsutsugamushi (szczep Kato (CSUR R163), Mycobacterium bovis (Bacillus Calmette-Guérin, BCG szczep 671203) i Coxiella burnetii (Nine Mile w fazie I), ponieważ wiadomo, że te patogeny infekują makrofagi. W ten sposób należy przygotować zawiesinę O. tsutsugamushi o stężeniu 109 bakterii/ml. Dodaj 50 μl do MDM. Powtórz ten sam krok dla M. bovis i C. burnetii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbek biologicznych do MALDI-TOF MS.
	<ol>
		<li>Przemyt stymulowane MDM PBS bez Ca2+ lub Mg2+ (komórki mogą aglutynować w obecności Ca2+ lub Mg2+). Zeskrob MDM z gumowym policjantem i zbieraj zawieszenia MDM. Odwirować MDM. Ponownie umyć MDM w PBS bez Ca2+ lub Mg2+ w 400 x g przez 5 minut, aby usunąć zanieczyszczenie FBS.</li>
		<li>Dostosuj stężenie komórek (2 x 106 MDM na test). Odwirować MDM przy 400 x g przez 5 minut i odrzucić supernatanty. Zebrać granulki komórek w 20 μl PBS bez Ca2+ lub Mg2+.</li>
		<li>Przed analizą należy natychmiast przeanalizować próbki lub przechowywać je w PBS w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza makrofagów przez całe komórki Maldi-TOF MS
<ol>
	<li>Przygotowanie matrycy CHCA.
	<ol>
		<li>Do fiolki dodać 500 μl acetonitrylu, 250 μl 10% kwasu trifluorooctowego i 250 μl wody z wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Rozcieńczyć 10 mg CHCA w tym roztworze do końcowego stężenia 10 mg/ml. Mieszać i sonikować przez co najmniej 20 minut. 
		Uwaga: sonikacja poprawi nasycenie matrycy, ale ten krok nie jest obowiązkowy.</li>
		<li>Wirować przy 13 000 x g przez 5 minut. Wyrzucić osad i zachować supernatant. 
		Uwaga: roztwór matrycy należy przygotować tuż przed użyciem. Roztwór matrycy zawierający kryształy nie pozwala na dobrą jonizację cząsteczek próbki, a to może mieć wpływ na jakość widm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie tarczy stalowej MALDI.
	<ol>
		<li>Zwilż tarczę z polerowanej stali gorącą wodą z kranu. Przetrzyj precyzyjnym papierem do wycierania. Dodaj 70% etanolu i natrzyj. Spłucz wodą przez pocieranie. Dodaj 70% etanolu i przetrzyj precyzyjnym papierem.</li>
		<li>Zanurz tarczę w 70% etanolu i poddaj sonikacji na co najmniej 15 minut. Przykryj tarczę 500 μl do 1 ml kwasu trifluorooctowego w stężeniu 80%. Przetrzyj i wytrzyj precyzyjnym papierem. Spłucz wodą HPLC bez pocierania. Wysuszyć tarczę w temperaturze pokojowej. 
		Uwaga: niewłaściwie oczyszczony cel może wpłynąć na jakość widm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie depozytów.
	<ol>
		<li>Umieść czysty cel na poziomym i równym wsporniku, aby uzyskać jednolite osady.</li>
		<li>Delikatnie rozmrozić próbki MDM na lodzie. Uwaga: szybkie i energiczne rozmrażanie może zmienić próbki, wpływając w ten sposób na jakość widm. Homogenizować MDM (przez pipetowanie tam i z powrotem zawiesiny komórek) przed nałożeniem 1 μl (zawierającego około 1 x 105 komórek) na tarczę MALDI. Dodać 1 μl roztworu matrycy MALDI na próbkę. Unikać mieszania miejsca z pipetą. Mieszanie plam za pomocą pipet zmienia jakość widm. Umieścić 12-16 próbek/test (kontrpróby techniczne).</li>
		<li>Odparować samoistnie w temperaturze pokojowej. Uwaga: parowanie odbywa się stopniowo i prowadzi do powstania kryształów matrycy/próbki. Osady mogą być natychmiast analizowane lub przechowywane w ciemności przez kilka dni przed analizą (do 2 tygodni).</li>
		<li>Użytkownik powinien sprawdzić, czy cytokiny lub bakterie zabijane termicznie użyte w eksperymencie nie zapewniają pików w zakresie widm stymulowanych makrofagów. W tym przypadku sprawdziliśmy, czy same cytokiny i bakterie zabijane termicznie nie dostarczały żadnego sygnału w badanym zakresie (0-20 kDa).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostrajanie spektrometru mas i akwizycja danych.
	<ol>
		<li>Wprowadzić stalową tarczę zawierającą próbki do spektrometru masowego.</li>
		<li>Skonfiguruj spektrometr mas i uruchom akwizycję danych. Użyj konfiguracji domyślnej do automatycznego pobierania danych.</li>
		<li>Uwaga: szczegółowy widok konfiguracji oprogramowania flexControl znajduje się w dodatku/tabeli 1. Może się to różnić w zależności od używanego spektrometru mas i oprogramowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza bioinformatyczna
Uwaga: analiza bioinformatyczna została przeprowadzona przy użyciu darmowego oprogramowania do analizy statystycznej R o otwartym kodzie źródłowym, wraz ze specyficznymi bibliotekami analiz (MALDIquant). R można pobrać bezpłatnie z jego strony internetowej <a href="http://cran.r-project.org/">http://cran.r-project.org/</a>. Szczegółowy opis skryptu znajduje się pod następującym <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50926/50926_MALDI_Ouedraogo_JoVE.tar.gz" target="_blank">materiał uzupełniający.</a>
<ol>
	<li>Wczytywanie i wstępne przetwarzanie surowych danych.
	<ol>
		<li>Przechowuj surowe dane na komputerze powiązanym ze spektrometrem mas w wielu plikach i folderach. Pobierz folder główny eksperymentu ze wszystkimi podfolderami. Skopiuj folder główny na komputer osobisty w celu analizy.</li>
		<li>Użyj bibliotek readBrukerFlexData i MALDIquant, aby załadować i przeanalizować surowe dane. 
		Uwaga: readBrukerFlexData umożliwia załadowanie surowych danych ze spektrometru mas do określonego obiektu w R w celu dalszej analizy. Więcej informacji można znaleźć w opisie MALDIquant 27.</li>
		<li>Analiza wygenerowanych widm. 
		Uwaga: każde widmo składa się z listy pików wraz z ich odpowiednimi masami i intensywnościami (obfitość względna). Użyj pierwiastka kwadratowego z intensywności, aby poprawić graficzną wizualizację widm. Skoryguj tło przy użyciu wrażliwego statystycznie nieliniowego algorytmu obcinania pików w celu oszacowania linii bazowej27. Użyj stosunku sygnału do szumu wynoszącego 6, aby wykryć szczyty. Weź pod uwagę, że wykryte piki są podobne we wszystkich widmach, gdy wartości masy/ładunku (m/z) mieszczą się w oknie 2,000 ppm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Definiowanie i obliczanie wyników. Klasyfikuj widma za pomocą hierarchicznego grupowania z algorytmem totema dla aglomeracji i macierzą odmienności opartą na odległości Jaccarda. 
	Uwaga: indeks Jaccarda mierzy podobieństwo między zestawami próbek logicznych (tj. obecność/brak listy pików).</li>
	<li>Porównanie widm i oglądanie.
	<ol>
		<li>Analizuj surowe wykresy widm. Uwaga: oś x reprezentuje stosunek m/z (w daltonach), a oś y reprezentuje intensywność (obfitość względną).</li>
		<li>Oceń podobieństwo między widmami za pomocą hierarchicznego grupowania. Reprezentują podobieństwo (lub rozbieżność) jako dendrogram.</li>
		<li>Oceń odtwarzalność za pomocą wirtualnej reprezentacji żelowej. Uwaga: wirtualna reprezentacja gel-view to zmodyfikowany wykres mapy cieplnej, na którym względna obfitość jest oznaczona kolorem o rosnącej intensywności koloru niebieskiego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mass Gross, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMass+Gross%2C+J+%22Spectrometry%3A+A+Textbook%22">Spectrometry: A Textbook</a>. , Springer-Verlag. Berlin. (2011).</li>
<li>Villanueva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+Peptide+Profiling+by+Magnetic+Particle-Assisted%2C+Automated+Sample+Processing+and+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry.%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Serum Peptide Profiling by Magnetic Particle-Assisted, Automated Sample Processing and MALDI-TOF Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 76 (6), 1560-1570 (2004).</li>
<li>Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry+as+a+Diagnostic+and+a+Cancer+Biomarker+Discovery+Tool+Opportunities+and+Potential+Limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Molec.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry as a Diagnostic and a Cancer Biomarker Discovery Tool Opportunities and Potential Limitations.</a> Molec. Cell. Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).</li>
<li>Pusch, W., Kostrzewa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry+in+Screening+and+Diagnostic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Application of MALDI-TOF Mass Spectrometry in Screening and Diagnostic.</a> 11 (20), 2577-2591 (2005).</li>
<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li>
<li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry+and+Protein+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry and Protein Analysis.</a> Science. 312 (5771), 212-217 (2006).</li>
<li>Carbonnelle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+two+MALDI-TOF+mass+spectrometry+systems+for+bacterial+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Robustness of two MALDI-TOF mass spectrometry systems for bacterial identification.</a> J. Microbiol. Methods. 89 (2), 133-136 (2012).</li>
<li>Bizzini, A., Jaton, K., Romo, D., Bille, J., Prod’hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization%E2%80%93Time+of+Flight+Mass+Spectrometry+as+an+Alternative+to+16S+rRNA+Gene+Sequencing+for+Identification+of+Difficult-To-Identify+Bacterial+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry as an Alternative to 16S rRNA Gene Sequencing for Identification of Difficult-To-Identify Bacterial Strains.</a> J. Clin. Microbiol. 49 (2), 693-696 (2011).</li>
<li>Buchanan, C. M., Malik, A. S., Cooper, G. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualisation+of+peptide+hormones+in+cultured+pancreatic+islet+alpha-+and+beta-cells+by+intact-cell+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Direct visualisation of peptide hormones in cultured pancreatic islet alpha- and beta-cells by intact-cell mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 21 (21), 3452-3458 (2007).</li>
<li>Ouedraogo, R., Flaudrops, C., Ben Amara, A., Capo, C., Raoult, D., Mege, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+circulating+immune+cells+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Global analysis of circulating immune cells by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> PloS One. 5 (10), 13691 (2010).</li>
<li>Munteanu, B., von Reitzenstein, C., Hänsch, G. M., Meyer, B., Hopf, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+robust+and+automated+protein+analysis+of+cell+differentiation+and+of+primary+human+blood+cells+by+intact+cell+MALDI+mass+spectrometry+biotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sensitive robust and automated protein analysis of cell differentiation and of primary human blood cells by intact cell MALDI mass spectrometry biotyping.</a> Anal. Bioanal. Chem. 404 (8), 2277-2286 (2012).</li>
<li>Feng, H., Sim, L. C., Wan, C., Wong, N. S. C., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+characterization+of+protein+productivity+and+production+stability+of+CHO+cells+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Rapid characterization of protein productivity and production stability of CHO cells by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 25 (10), 1407-1412 (2011).</li>
<li>Ouedraogo, R., Daumas, A., Ghigo, E., Capo, C., Mege, J. -L., Textoris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+MALDI-TOF+MS%3A+A+new+tool+to+assess+the+multifaceted+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Whole-cell MALDI-TOF MS: A new tool to assess the multifaceted activation of macrophages.</a> J. Proteomics. 75 (18), 5523-5532 (2012).</li>
<li>Amann, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+profiling+of+proteins+in+lung+cancer+cells+from+fine-needle+aspirates+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Selective profiling of proteins in lung cancer cells from fine-needle aspirates by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Clin. Cancer Res. 12 (17), 5142-5150 (2006).</li>
<li>Maurer, K., Eschrich, K., Schellenberger, W., Bertolini, J., Rupf, S., Remmerbach, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+brush+biopsy+analysis+by+MALDI-ToF+Mass+Spectrometry+for+early+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncol%22%5BJournal%5D)">Oral brush biopsy analysis by MALDI-ToF Mass Spectrometry for early cancer diagnosis.</a> Oral Oncol. 49 (2), 152-156 (2013).</li>
<li>Ishii, K. J., Koyama, S., Nakagawa, A., Coban, C., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+innate+immune+receptors+and+beyond%3A+making+sense+of+microbial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Host innate immune receptors and beyond: making sense of microbial infections.</a> Cell Host Microbe. 3 (6), 352-363 (2008).</li>
<li>Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization comes of age.</a> Immunity. 23 (4), 344-346 (2005).</li>
<li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization.</a> Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat. Rev. Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nat. Rev. Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).</li>
<li>Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in bacterial infections.</a> J. Immunol. 181 (6), 3733-3739 (2008).</li>
<li>Biswas, S. K., Sica, A., Lewis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+macrophage+function+during+tumor+progression%3A+regulation+by+distinct+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of macrophage function during tumor progression: regulation by distinct molecular mechanisms.</a> J. Immunol. 180 (4), 2011-2017 (2008).</li>
<li>Cassetta, L., Cassol, E., Poli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+World+J%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in health and disease.</a> Sci. World J. 11, 2391-2402 (2011).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).</li>
<li>Mantovani, A., Sica, A., Sozzani, S., Allavena, P., Vecchi, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemokine+system+in+diverse+forms+of+macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization.</a> Trends Immunol. 25 (12), 677-686 (2004).</li>
<li>Delaby, A., Gorvel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+monocyte+dynamics+in+Q+fever+granuloma+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Defective monocyte dynamics in Q fever granuloma deficiency.</a> J. Infect. Dis. 205 (7), 1086-1094 (2012).</li>
<li>Gibb, S., Strimmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDIquant%3A+a+versatile+R+package+for+the+analysis+of+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MALDIquant: a versatile R package for the analysis of mass spectrometry data.</a> Bioinformatics. 28 (17), 2270-2271 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów. RO, JLM i CC są wynalazcami międzynarodowego patentu WO 2011/154650 o nazwie "Procédé d'identification de cellules de mammifères par spectrométrie de masse MALDI-TOF".

Protokół ten opisuje zastosowanie MALDI-TOF-MS na całych komórkach eukariotycznych. W tym miejscu ilustrujemy dokładność metody, analizując wielokrotne stany aktywacji makrofagów w odpowiedzi na ich mikrośrodowisko.
Sukces protokołu zależy od kilku krytycznych kroków. Po pierwsze, każde zanieczyszczenie roztworem może zmienić widma. Na przykład ważne jest, aby umyć komórki w PBS w celu usunięcia pożywki hodowlanej i białek surowicy przed osadzaniem na celu. Aby zapewnić powtarzalne wyniki, pot...

Laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana matrycą spektrometria mas czasu przelotu (MALDI-TOF MS) jest popularną techniką spektrometrii mas do badania próbek biologicznych. Zastosowanie wiązki laserowej i matrycy pochłaniającej energię umożliwia miękki proces jonizacji: parowanie i genezę dużych, w większości jednoładowanych biomolekuł. Proces ten nazywa się desorpcją/jonizacją, co uzasadnia akronim MALDI. Jony te są następnie przyspieszane przez przyłożenie napięcia i wprowadzane do analizatora TOF, który umożliwia oddzielenie tych jonów i ilościowe określenie ich odpowiednich mas1.
MALDI-TOF MS jest szeroko stosowany w biologii, chemii i medycynie do identyfikacji molekuł i biomarkerów2-4 lub do monitorowania modyfikacji potranslacyjnych na proteins5,6. Ostatnio kilka grup zastosowało MALDI-TOF MS do identyfikacji mikroorganizmów z próbek klinicznych7,8. To zastosowanie mikrobiologiczne jest obecnie rutynowo stosowane w warunkach klinicznych. Cała komórka MALDI-TOF ma wiele zalet w porównaniu z klasycznymi zastosowaniami MALDI-TOF MS. Próbki zawierające całe komórki są przetwarzane bezpośrednio, co pozwala uniknąć czasochłonnych etapów frakcjonowania lub oddzielania dużych ilości materiału. Co więcej, nie jest potrzebna charakterystyka różnych pików: całe widmo jest traktowane jako odcisk palca próbki, a algorytmy dopasowywania porównują badane widmo z bazą danych widm referencyjnych.
My i inni zastosowaliśmy tę technikę analizy całych komórek do komórek eukariotycznych. Technika ta może mieć wiele zastosowań: (1) identyfikacja głównych typów komórek z próbki mieszanej9-11; 2) ocena żywotności kultur komórkowych w czasie (w tym zastosowania przemysłowe w zakresie kontroli jakości)12; (3) monitorowanie stanów aktywacji pojedynczego ogniwa typu13; (4) ocenić złośliwą przemianę próbki klinicznej14,15.
Tutaj opisujemy użycie całokomórkowego MALDI-TOF MS do badania różnych fenotypów polaryzacji makrofagów w odpowiedzi na cytokiny lub bakterie zabijane termicznie. Makrofagi odgrywają kluczową rolę w odpowiedzi immunologicznej na patogeny drobnoustrojowe. Wykrywają czynniki zakaźne w tkankach za pomocą receptorów rozpoznawania wzorców, które są w stanie wykryć konserwatywne wzorce mikrobiologiczne, takie jak lipopolisacharyd (LPS)16. Makrofagi to profesjonalne komórki prezentujące antygen, które oddziałują z limfocytami T w celu wytworzenia adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Limfocyty T wpływają na makrofagi poprzez uwalnianie cytokin, które wzmacniają lub regulują aktywność mikrobójczą makrofagów. Analogicznie do polaryzacji limfocytów Th1 / Th2, makrofagi zapalne, bakteriobójcze i rakobójcze zostały sklasyfikowane jako makrofagi M1, a makrofagi immunoregulacyjne jako makrofagi M217-19. Termin M1 odnosi się do klasycznej aktywacji makrofagów przez cytokiny typu I, takie jak interferon (IFN)-γ i czynnik martwicy nowotworu (TNF) lub produkty bakteryjne, takie jak LPS18,20-23, podczas gdy makrofagi aktywowane przez alternatywne szlaki (interleukina (IL)-4, IL-10, transformujący czynnik wzrostu-β1 są uważane za makrofagi M219,24,25. Wysoka plastyczność fenotypowa i funkcjonalna makrofagów w odpowiedzi na ich mikrośrodowisko sprawia, że makrofagi te są przydatne do analizy subtelnych zmian za pomocą podejścia MALDI-TOF MS.

spektrometria mas maldi-tof dla całych komórek jest dokładną i szybką metodą analizy różnych trybów aktywacji makrofagów

Whole-cell MALDI-TOF Mass Spectrometry is an Accurate and Rapid Method to Analyze Different Modes of Macrophage Activation

MALDI-TOF jest szeroko stosowaną techniką spektrometrii mas w chemii i biochemii. Znalazł również zastosowanie w medycynie do identyfikacji cząsteczek i biomarkerów. Ostatnio znalazł zastosowanie w mikrobiologii do rutynowej identyfikacji bakterii wyhodowanych z próbek klinicznych, bez etapów przygotowania lub frakcjonowania. My i inni z powodzeniem zastosowaliśmy tę technikę spektrometrii mas MALDI-TOF dla całych komórek do komórek eukariotycznych. Obecne zastosowania obejmują zarówno identyfikację typów komórek, jak i kontrolę jakości, ocenę hodowli komórkowych i zastosowania diagnostyczne. Tutaj opisujemy jego zastosowanie do badania różnych fenotypów polaryzacji makrofagów w odpowiedzi na cytokiny lub bakterie zabijane termicznie. Pozwoliło to na zidentyfikowanie odcisków palców specyficznych dla makrofagów, które są reprezentatywne dla różnorodności odpowiedzi proteomicznych makrofagów. Ta aplikacja ilustruje dokładność i prostotę metody. Opisany tutaj protokół może być przydatny do badania odpowiedzi immunologicznej gospodarza w stanach patologicznych lub może zostać rozszerzony na szersze zastosowania diagnostyczne.

Celem niniejszego protokołu jest wykazanie dokładności metody MALDI-TOF MS całych komórek w ocenie reaktywności makrofagów na ich mikrośrodowisko.
Rycina 1 przedstawia przygotowanie stymulowanych makrofagów z próbek krwi. Rycina 2 obrazuje analizę monocytów oraz MDM za pomocą cytometrii przepływowej. Należy zauważyć, że monocyty wykazywały ekspresję CD14, ale nie CD68 (Rycina 1A). Z kolei MDM wykazywały ekspresję CD68, ale nie CD14 (Ry...

Ten protokół opisuje użycie spektrometrii mas MALDI-TOF na komórkach eukariotycznych. Tutaj ilustrujemy dokładność tej techniki, analizując wielokrotne stany aktywacji makrofagów w odpowiedzi na ich mikrośrodowisko.

Spektrometria mas MALDI-TOF dla całych komórek jest dokładną i szybką metodą analizy różnych trybów aktywacji makrofagów

MALDI-TOF is an extensively used mass spectrometry technique in chemistry and biochemistry. It has been also applied in medicine to identify molecules and ...

W tym eksperymencie zastosowano spektrometrię mas całych komórek. Aby dokładnie przeanalizować wiele stanów aktywacji makrofagów, należy najpierw wyizolować makrofagi z monocytów CD 14 dodatnich, a następnie stymulować komórki agonistami, takimi jak cytokiny i bakterie. Próbki należy przeanalizować metodą MALDI na tarczy stalowej, oddzielając białka i uzyskując widmo dla każdej próbki.Wyniki specyficznych odcisków palców mogą pozwolić na rozróżnienie różnych stanów aktywacji pojedynczej komórki eukariotycznej, makrofaga, w oparciu o analizę bioinformatyczną widm uzyskanych za pomocą spektrometrii mas całych komórek. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak cytometria przepływowa, jest to, że jest ona szybka, łatwa i niedroga. W niniejszym doświadczeniu wykazujemy, że z makrofagów uzyskano powtarzalne widma oraz że różne stany aktywacji zostały rozróżnione za pomocą analizy całych komórek.Uzyskujemy również widma z BBMC, które mogą być przydatne w diagnostyce odpowiedzi gospodarza na infekcję. Metoda ta może dostarczyć informacji o stanach aktywacji komórek odpornościowych. Można ją zastosować także w innych systemach, np. do profilowania koncepcyjnego

whole-cell-maldi-tof-mass-spectrometry-is-an-accurate-rapid-method-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Spektroskopia masowa MALDI-TOF z zastosowaniem całych komórek jest dokładną i szybką metodą analizy różnych trybów aktywacji makrofagów

Makrofagi są kluczowymi komórkami zaangażowanymi w patogeniczność gospodarza. Makrofagi wykazują różnorodność fenotypową i funkcjonalną, którą można analizować i wykrywać za pomocą analizy proteomicznej. W artykule opisano, jak przeprowadzić elektroforezę 2D pierwotnych kultur ludzkich makrofagów zróżnicowanych do fenotypu M1 lub M2.

Profilowanie proteomiczne makrofagów za pomocą elektroforezy 2D

Przeprogramowanie metaboliczne jest cechą charakterystyczną i warunkiem wstępnym polaryzacji makrofagów M1 i M2. Niniejszy manuskrypt opisuje test do pomiaru podstawowych parametrów glikolizy i funkcji mitochondriów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Narzędzie to można zastosować do zbadania, w jaki sposób poszczególne czynniki wpływają na metabolizm i fenotyp makrofagów.

Charakterystyka metaboliczna spolaryzowanych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego M1 i M2 przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Opisujemy wykrywanie aktywacji inflamasomu NLRP3 na bazie komórkowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i barwienia dla aktywnej kaspazy-1 i adaptera, ASC. Przedstawiono test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w celu wykrycia lizy piroptotycznej w skali populacji. Techniki te można dostosować do badania wielu aspektów biologii inflamasomów.

Wykrywanie aktywacji inflamasomu i śmierci komórek piroptotycznych w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy

Nowatorska metoda przygotowania próbki została opracowana w celu dostosowania kokultury komórek i tkanek do wykrywania wymiany małych cząsteczek za pomocą obrazowania spektrometrii mas.

Uchwycenie komunikacji małych cząsteczek między tkankami a komórkami za pomocą obrazowej spektrometrii mas

Ten raport opisuje zautomatyzowany protokół do multipleksowych testów immunofluorescencyjnych (mIF) na automatycznym barwniku do szkiełek. Wykazano wysoką odtwarzalność proteomiki przestrzennej na standardowych autostainerach tkankowych o wysokiej przepustowości i obrazach fluorescencyjnych na całych szkiełkach, co jest idealne do niestandardowych testów mIF na dużej liczbie szkiełek tkankowych w badaniach translacyjnych.

Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

Tutaj szczegółowo opisujemy metody ekstrakcji makrofagów ze szpiku kostnego, śledziony i serca po zawale serca, a następnie oceny przepływu metabolicznego w żywych komórkach.

Analiza przepływu metabolicznego ex vivo w makrofagach śledziony i serca oraz monocytach szpiku kostnego

Ten protokół opisuje użycie mikroMS do sterowanej fluorescencją, jednokomórkowej spektrometrii mas MALDI-2, umożliwiając lepsze profilowanie molekularne pierwotnych komórek neuronalnych szczura.

Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą pod wpływem fluorescencji ze spektrometrią mas z indukowaną laserem spektrometrią mas z jonizacji poszczególnych komórek nerwowych szczura

Ten protokół opisuje bezznacznikowy przepływ pracy oparty na optycznej tomografii dyfrakcyjnej do obrazowania w czasie rzeczywistym i ilościowej analizy morfodynamiki makrofagów. Metoda umożliwia ciągłe śledzenie morfologii pojedynczych komórek i ich migracji, zapewniając pomiary w czasie rzeczywistym powierzchni rzutowanych, obwodu i średniej prędkości migracji podczas długotrwałego obrazowania żywych komórek.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym bez etykiet i analizy ilościowej morfodynamiki makrofagów z wykorzystaniem tomografii dyfrakcyjnej optycznej

Niniejszy protokół opisuje prostą metodę opartą na zastosowaniu taśmy klejącej do pobierania próbek z powierzchni pomidorów oraz innych świeżych produktów rolnych, a następnie szybką detekcję całych komórek Salmonella przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Połączenie pobierania próbek za pomocą taśmy klejącej i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu szybkiego wykrywania Salmonella na świeżych produktach rolnych

Makrofagi pochodzące z monocytów są ważnymi komórkami wrodzonego układu odpornościowego. W tym miejscu opisujemy łatwy w użyciu model in vitro do generowania tych komórek. Korzystając z wirowania gradientowego, izolacji ujemnych kulek i określonych warunków hodowli komórek, można wygenerować makrofagi pochodzące z monocytów do badań fenotypowych i funkcjonalnych.

Model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

Poznaj spektrometrię mas MALDI-TOF dla całych komórek jako szybką metodę analizy stanów aktywacji makrofagów. Technika ta pozwala na dokładne rozróżnienie różnych fenotypów komórek immunologicznych.

Spektrometria mas MALDI-TOF dla całych komórek jest dokładną i szybką metodą analizy różnych trybów aktywacji makrofagów

Przeglądaj więcej filmów