Name: Spektrometria mas MALDI-TOF dla całych komórek jest dokładną i szybką metodą analizy różnych trybów aktywacji makrofagów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-26T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Poznaj spektrometrię mas MALDI-TOF dla całych komórek jako szybką metodę analizy stanów aktywacji makrofagów. Technika ta pozwala na dokładne rozróżnienie różnych fenotypów komórek immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Richard Ouedraogo jest wspierany przez grant z Ministère de la Santé (PHRC 2010). Dziękujemy Laurentowi Gorvelowi, Christophe'owi Flaudropsowi i Nicolasowi Amstrongowi za pomoc techniczną.

W obecnym protokole, technika MALDI-TOF dla całej komórki jest używana do uzyskania widma masowego traktowanego jako odcisk palca próbki. Analiza bioinformatyczna pozwoliła na porównanie i sklasyfikowanie tych odcisków palców. Protokół ten składał się z trzech głównych części:
<ol>
	<li>Przygotowanie próbek biologicznych: makrofagi kontrolne i makrofagi stymulowane różnymi agonistami.</li>
	<li>Analiza każdego rodzaju próbki z kontrpróbami technicznymi za pomocą całokomórkowych MALDI-TOF MS.</li>
	<li>Bioinformatyczna analiza surowych danych.</li>
</ol>
Przygotuj sterylne roztwory do izolacji komórek i hodowli. Przygotować i przechowywać wszystkie odczynniki w temperaturze 4 °C
1. Przygotowanie ludzkich monocytów
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych. Dodać 55 ml ludzkiej surowicy AB+ lub płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 5 ml roztworu antybiotyku (penicylina w stężeniu 10 000 j.m./ml i streptomycyna w stężeniu 10 000 μg/ml; stężenie końcowe 100 j.m./ml dla penicyliny i 100 μg/ml dla streptomycyny) do pożywki RPMI 1640 (500 ml).
	<ol>
		<li>Wyizolować komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) z leukopacków (koncentratów leukocytów).
		<ol>
			<li>Przygotować 50 ml probówek zawierających 15 ml Ficollu. Rozcieńczyć krew w roztworze soli fizjologicznej (obj./obj., 1/10). Umieść 30 ml rozcieńczonych PBMC na Ficoll, jak opisano wcześniej26.</li>
			<li>Wirować przy 700 x g przez 20 min. Odzyskać PBMC na granicy faz między Ficollem (gęstość 1,077 g/ml) a rozcieńczonym osoczem. Rozcieńczyć PBMC w pożywce hodowlanej i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj monocyty CD14+ z PBMC za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami anty-CD14. 
		Uwaga: Produkty i komórki należy przechowywać w temperaturze 4 °C aż do ustąpienia monocytów.
		<ol>
			<li>Przygotować bufor do pracy składający się z buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (PBS) o pH 7,2, 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).</li>
			<li>Delikatnie zdysocjuj granulowane PBMC (107 komórek na test) na 80 μl działającego buforu.</li>
			<li>Dodaj 20 μl mikrokulek CD14 do PBMC. Mieszać i inkubować PBMC przez 15 minut. Przemyć PBMC 5 ml bieżącego buforu i odwirować przy 300 x g przez 5 minut. Delikatnie zdysocjować granulowane PBMC na 500 μl buforu roboczego dla 108 PBMCs. 
			Uwaga: należy użyć 500 μl buforu bieżącego dla stężeń PBMC niższych niż 108 PBMC.</li>
			<li>Przejdź do separacji magnetycznej. 
			Uwaga: w przypadku mniej niż 2 x 108 PBMC należy użyć kolumny MS; dla więcej niż 2 x 108 PBMC i mniej niż 2 x 109 PBMC użyj kolumny LS.</li>
			<li>Przepłukać kolumnę wstępną i kolumnę działającym buforem (500 μl dla kolumny MS lub 3 ml dla kolumny LS).Dodaj PBMC do kolumny wstępnej (poczekaj, aż komórki bez etykiet przejdą przez kolumnę). Przepłukać 3 razy bieżącym buforem (500 μl dla kolumny MS lub 3 ml dla kolumny LS). Usuń kolumnę wstępną.</li>
			<li>Umieścić kolumnę na probówkach o pojemności 15 ml. Dodaj bufor do biegania (1 ml dla kolumny MS lub 5 ml dla kolumny LS) na kolumnę i eluuj komórki CD14 +, wywierając nacisk na kolumnę.</li>
			<li>Odwirować eluat o stężeniu 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant. Przemyć osad monocytów 10 ml pożywki hodowlanej. 
			Uwaga: Przeanalizuj czystość preparatu monocytów przy użyciu przeciwciał anty-CD14 i cytometrii przepływowej (klasycznie wyższej niż 95%).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Różnicowanie monocytów w makrofagi.
	<ol>
		<li>Inkubować monocyty (10-6 monocytów na basenie na płytkach 6-dołkowych) w 3 ml pożywki zawierającej 10% ludzkiej surowicy AB+ w temperaturze 37 °C. Po 4 dniach należy zastąpić pożywkę zawierającą surowicę ludzką pożywką hodowlaną zawierającą 3 ml pożywki zawierającej 10% FBS na dodatkowe 3 dni.</li>
		<li>Zidentyfikuj uzyskaną populację komórek jako makrofagi pochodzące z monocytów (MDM) za pomocą cytometrii przepływowej (patrz ryc. 1).
		<ol>
			<li>Zastąp pożywkę hodowlaną 3 ml PBS. Zeskrob MDM z gumowym policjantem i zbieraj zawieszenia MDM. Wirować przy 400 x g przez 5 min. Dodać PBS zawierający 2% BSA do granulowanych MDM i delikatnie wymieszać zawiesinę komórkową. Dostosować stężenie komórek (10-6 MDM w 200 ml PBS) i inkubować w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Dodać 10 ml przeciwciał anty-CD14 i 10 ml przeciwciał anty-CD68 do zawiesiny MDM i inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut w ciemności. 
			Uwaga: przeciwciała te muszą być znakowane dwoma różnymi fluorochromami zgodnymi z analizą cytometrii przepływowej. Na przykład przeciwciała anty-CD14 mogą być sprzężone z fikoerytryną (do barwienia monocytów), a przeciwciała anty-CD68 sprzężone z Alexa Fluor 647 (do barwienia makrofagów).</li>
			<li>Odwirować MDM przy 400 x g przez 5 minut. Usunąć supernatanty. Delikatnie zdysocjuj osad komórkowy i inkubuj MDM w 250 ml 3% paraformaldehydu (PFA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować MDM z utrwalonym PFA przy 400 x g przez 5 min. Przemyć MDM 3 ml PBS i odwirować MDM przy 400 x g przez 5 minut. Delikatnie zdysocjować osad MDM w 400 ml PBS.</li>
			<li>Przeanalizuj różnicowanie monocytów (które wyrażają CD14, ale nie CD68) w monocyty (które wyrażają CD68, ale nie CD14). Uwaga: klasycznie ponad 95% komórek to MDM.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>18 godzinna stymulacja MDM.
	<ol>
		<li>Zastąp pożywkę z przylegających MDM świeżą pożywką o pojemności 3 ml (zawierającą 10% FBS).</li>
		<li>Aby wywołać polaryzację M1 lub M2, użyj następujących ludzkich rekombinowanych cytokin: IFN-γ i TNF do polaryzacji M1 oraz IL-4 do polaryzacji M2. Makrofagi M1 uzyskuje się również przez stymulację LPS. Należy zauważyć, że roztwory podstawowe cytokin są konserwowane w temperaturze -80 °C, a roztwór podstawowy LPS zachowuje się w temperaturze -20 °C.
		<ol>
			<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy IFN-gγ (1 mg/ml) w stosunku 1:100 w pożywce hodowlanej w celu uzyskania rozcieńczenia 10 ng/ml. Dodać 6 μl tego rozcieńczenia IFN-γ do MDM, aby uzyskać końcowe stężenie IFN-γ 20 ng/ml.</li>
			<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy TNF (1 mg/ml) w stosunku 1:100 w pożywce hodowlanej w celu uzyskania rozcieńczenia 10 ng/ml. Dodać 6 μl tego rozcieńczenia TNF do MDM, aby uzyskać końcowe stężenie TNF 20 ng/ml.</li>
			<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy IL-4 (1 mg/ml) w stosunku 1:100 w pożywce hodowlanej, aby uzyskać rozcieńczenie 10 ng/ml. Dodać 6 μl tego rozcieńczenia IL-4 do MDM, aby uzyskać końcowe stężenie IL-4 20 ng/ml.</li>
			<li>Dodać 3 μl roztworu podstawowego LPS (1 mg/ml) do MDM, aby uzyskać końcowe stężenie LPS 1 μg/ml.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aby stymulować MDM bakteriami, użyj bakterii zabitych termicznie. Umyj żywe bakterie PBS i podgrzewaj je w temperaturze 95 °C przez 1 godzinę. Użyj Orientia tsutsugamushi (szczep Kato (CSUR R163), Mycobacterium bovis (Bacillus Calmette-Guérin, BCG szczep 671203) i Coxiella burnetii (Nine Mile w fazie I), ponieważ wiadomo, że te patogeny infekują makrofagi. W ten sposób należy przygotować zawiesinę O. tsutsugamushi o stężeniu 109 bakterii/ml. Dodaj 50 μl do MDM. Powtórz ten sam krok dla M. bovis i C. burnetii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbek biologicznych do MALDI-TOF MS.
	<ol>
		<li>Przemyt stymulowane MDM PBS bez Ca2+ lub Mg2+ (komórki mogą aglutynować w obecności Ca2+ lub Mg2+). Zeskrob MDM z gumowym policjantem i zbieraj zawieszenia MDM. Odwirować MDM. Ponownie umyć MDM w PBS bez Ca2+ lub Mg2+ w 400 x g przez 5 minut, aby usunąć zanieczyszczenie FBS.</li>
		<li>Dostosuj stężenie komórek (2 x 106 MDM na test). Odwirować MDM przy 400 x g przez 5 minut i odrzucić supernatanty. Zebrać granulki komórek w 20 μl PBS bez Ca2+ lub Mg2+.</li>
		<li>Przed analizą należy natychmiast przeanalizować próbki lub przechowywać je w PBS w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza makrofagów przez całe komórki Maldi-TOF MS
<ol>
	<li>Przygotowanie matrycy CHCA.
	<ol>
		<li>Do fiolki dodać 500 μl acetonitrylu, 250 μl 10% kwasu trifluorooctowego i 250 μl wody z wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Rozcieńczyć 10 mg CHCA w tym roztworze do końcowego stężenia 10 mg/ml. Mieszać i sonikować przez co najmniej 20 minut. 
		Uwaga: sonikacja poprawi nasycenie matrycy, ale ten krok nie jest obowiązkowy.</li>
		<li>Wirować przy 13 000 x g przez 5 minut. Wyrzucić osad i zachować supernatant. 
		Uwaga: roztwór matrycy należy przygotować tuż przed użyciem. Roztwór matrycy zawierający kryształy nie pozwala na dobrą jonizację cząsteczek próbki, a to może mieć wpływ na jakość widm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie tarczy stalowej MALDI.
	<ol>
		<li>Zwilż tarczę z polerowanej stali gorącą wodą z kranu. Przetrzyj precyzyjnym papierem do wycierania. Dodaj 70% etanolu i natrzyj. Spłucz wodą przez pocieranie. Dodaj 70% etanolu i przetrzyj precyzyjnym papierem.</li>
		<li>Zanurz tarczę w 70% etanolu i poddaj sonikacji na co najmniej 15 minut. Przykryj tarczę 500 μl do 1 ml kwasu trifluorooctowego w stężeniu 80%. Przetrzyj i wytrzyj precyzyjnym papierem. Spłucz wodą HPLC bez pocierania. Wysuszyć tarczę w temperaturze pokojowej. 
		Uwaga: niewłaściwie oczyszczony cel może wpłynąć na jakość widm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie depozytów.
	<ol>
		<li>Umieść czysty cel na poziomym i równym wsporniku, aby uzyskać jednolite osady.</li>
		<li>Delikatnie rozmrozić próbki MDM na lodzie. Uwaga: szybkie i energiczne rozmrażanie może zmienić próbki, wpływając w ten sposób na jakość widm. Homogenizować MDM (przez pipetowanie tam i z powrotem zawiesiny komórek) przed nałożeniem 1 μl (zawierającego około 1 x 105 komórek) na tarczę MALDI. Dodać 1 μl roztworu matrycy MALDI na próbkę. Unikać mieszania miejsca z pipetą. Mieszanie plam za pomocą pipet zmienia jakość widm. Umieścić 12-16 próbek/test (kontrpróby techniczne).</li>
		<li>Odparować samoistnie w temperaturze pokojowej. Uwaga: parowanie odbywa się stopniowo i prowadzi do powstania kryształów matrycy/próbki. Osady mogą być natychmiast analizowane lub przechowywane w ciemności przez kilka dni przed analizą (do 2 tygodni).</li>
		<li>Użytkownik powinien sprawdzić, czy cytokiny lub bakterie zabijane termicznie użyte w eksperymencie nie zapewniają pików w zakresie widm stymulowanych makrofagów. W tym przypadku sprawdziliśmy, czy same cytokiny i bakterie zabijane termicznie nie dostarczały żadnego sygnału w badanym zakresie (0-20 kDa).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostrajanie spektrometru mas i akwizycja danych.
	<ol>
		<li>Wprowadzić stalową tarczę zawierającą próbki do spektrometru masowego.</li>
		<li>Skonfiguruj spektrometr mas i uruchom akwizycję danych. Użyj konfiguracji domyślnej do automatycznego pobierania danych.</li>
		<li>Uwaga: szczegółowy widok konfiguracji oprogramowania flexControl znajduje się w dodatku/tabeli 1. Może się to różnić w zależności od używanego spektrometru mas i oprogramowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza bioinformatyczna
Uwaga: analiza bioinformatyczna została przeprowadzona przy użyciu darmowego oprogramowania do analizy statystycznej R o otwartym kodzie źródłowym, wraz ze specyficznymi bibliotekami analiz (MALDIquant). R można pobrać bezpłatnie z jego strony internetowej <a href="http://cran.r-project.org/">http://cran.r-project.org/</a>. Szczegółowy opis skryptu znajduje się pod następującym <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50926/50926_MALDI_Ouedraogo_JoVE.tar.gz" target="_blank">materiał uzupełniający.</a>
<ol>
	<li>Wczytywanie i wstępne przetwarzanie surowych danych.
	<ol>
		<li>Przechowuj surowe dane na komputerze powiązanym ze spektrometrem mas w wielu plikach i folderach. Pobierz folder główny eksperymentu ze wszystkimi podfolderami. Skopiuj folder główny na komputer osobisty w celu analizy.</li>
		<li>Użyj bibliotek readBrukerFlexData i MALDIquant, aby załadować i przeanalizować surowe dane. 
		Uwaga: readBrukerFlexData umożliwia załadowanie surowych danych ze spektrometru mas do określonego obiektu w R w celu dalszej analizy. Więcej informacji można znaleźć w opisie MALDIquant 27.</li>
		<li>Analiza wygenerowanych widm. 
		Uwaga: każde widmo składa się z listy pików wraz z ich odpowiednimi masami i intensywnościami (obfitość względna). Użyj pierwiastka kwadratowego z intensywności, aby poprawić graficzną wizualizację widm. Skoryguj tło przy użyciu wrażliwego statystycznie nieliniowego algorytmu obcinania pików w celu oszacowania linii bazowej27. Użyj stosunku sygnału do szumu wynoszącego 6, aby wykryć szczyty. Weź pod uwagę, że wykryte piki są podobne we wszystkich widmach, gdy wartości masy/ładunku (m/z) mieszczą się w oknie 2,000 ppm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Definiowanie i obliczanie wyników. Klasyfikuj widma za pomocą hierarchicznego grupowania z algorytmem totema dla aglomeracji i macierzą odmienności opartą na odległości Jaccarda. 
	Uwaga: indeks Jaccarda mierzy podobieństwo między zestawami próbek logicznych (tj. obecność/brak listy pików).</li>
	<li>Porównanie widm i oglądanie.
	<ol>
		<li>Analizuj surowe wykresy widm. Uwaga: oś x reprezentuje stosunek m/z (w daltonach), a oś y reprezentuje intensywność (obfitość względną).</li>
		<li>Oceń podobieństwo między widmami za pomocą hierarchicznego grupowania. Reprezentują podobieństwo (lub rozbieżność) jako dendrogram.</li>
		<li>Oceń odtwarzalność za pomocą wirtualnej reprezentacji żelowej. Uwaga: wirtualna reprezentacja gel-view to zmodyfikowany wykres mapy cieplnej, na którym względna obfitość jest oznaczona kolorem o rosnącej intensywności koloru niebieskiego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mass Gross, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMass+Gross%2C+J+%22Spectrometry%3A+A+Textbook%22">Spectrometry: A Textbook</a>. , Springer-Verlag. Berlin. (2011).</li>
<li>Villanueva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+Peptide+Profiling+by+Magnetic+Particle-Assisted%2C+Automated+Sample+Processing+and+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry.%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Serum Peptide Profiling by Magnetic Particle-Assisted, Automated Sample Processing and MALDI-TOF Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 76 (6), 1560-1570 (2004).</li>
<li>Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry+as+a+Diagnostic+and+a+Cancer+Biomarker+Discovery+Tool+Opportunities+and+Potential+Limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Molec.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry as a Diagnostic and a Cancer Biomarker Discovery Tool Opportunities and Potential Limitations.</a> Molec. Cell. Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).</li>
<li>Pusch, W., Kostrzewa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry+in+Screening+and+Diagnostic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Application of MALDI-TOF Mass Spectrometry in Screening and Diagnostic.</a> 11 (20), 2577-2591 (2005).</li>
<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li>
<li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry+and+Protein+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry and Protein Analysis.</a> Science. 312 (5771), 212-217 (2006).</li>
<li>Carbonnelle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+two+MALDI-TOF+mass+spectrometry+systems+for+bacterial+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Robustness of two MALDI-TOF mass spectrometry systems for bacterial identification.</a> J. Microbiol. Methods. 89 (2), 133-136 (2012).</li>
<li>Bizzini, A., Jaton, K., Romo, D., Bille, J., Prod’hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization%E2%80%93Time+of+Flight+Mass+Spectrometry+as+an+Alternative+to+16S+rRNA+Gene+Sequencing+for+Identification+of+Difficult-To-Identify+Bacterial+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry as an Alternative to 16S rRNA Gene Sequencing for Identification of Difficult-To-Identify Bacterial Strains.</a> J. Clin. Microbiol. 49 (2), 693-696 (2011).</li>
<li>Buchanan, C. M., Malik, A. S., Cooper, G. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualisation+of+peptide+hormones+in+cultured+pancreatic+islet+alpha-+and+beta-cells+by+intact-cell+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Direct visualisation of peptide hormones in cultured pancreatic islet alpha- and beta-cells by intact-cell mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 21 (21), 3452-3458 (2007).</li>
<li>Ouedraogo, R., Flaudrops, C., Ben Amara, A., Capo, C., Raoult, D., Mege, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+circulating+immune+cells+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Global analysis of circulating immune cells by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> PloS One. 5 (10), 13691 (2010).</li>
<li>Munteanu, B., von Reitzenstein, C., Hänsch, G. M., Meyer, B., Hopf, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+robust+and+automated+protein+analysis+of+cell+differentiation+and+of+primary+human+blood+cells+by+intact+cell+MALDI+mass+spectrometry+biotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Sensitive robust and automated protein analysis of cell differentiation and of primary human blood cells by intact cell MALDI mass spectrometry biotyping.</a> Anal. Bioanal. Chem. 404 (8), 2277-2286 (2012).</li>
<li>Feng, H., Sim, L. C., Wan, C., Wong, N. S. C., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+characterization+of+protein+productivity+and+production+stability+of+CHO+cells+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Rapid characterization of protein productivity and production stability of CHO cells by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 25 (10), 1407-1412 (2011).</li>
<li>Ouedraogo, R., Daumas, A., Ghigo, E., Capo, C., Mege, J. -L., Textoris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+MALDI-TOF+MS%3A+A+new+tool+to+assess+the+multifaceted+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Whole-cell MALDI-TOF MS: A new tool to assess the multifaceted activation of macrophages.</a> J. Proteomics. 75 (18), 5523-5532 (2012).</li>
<li>Amann, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+profiling+of+proteins+in+lung+cancer+cells+from+fine-needle+aspirates+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Selective profiling of proteins in lung cancer cells from fine-needle aspirates by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Clin. Cancer Res. 12 (17), 5142-5150 (2006).</li>
<li>Maurer, K., Eschrich, K., Schellenberger, W., Bertolini, J., Rupf, S., Remmerbach, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+brush+biopsy+analysis+by+MALDI-ToF+Mass+Spectrometry+for+early+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncol%22%5BJournal%5D)">Oral brush biopsy analysis by MALDI-ToF Mass Spectrometry for early cancer diagnosis.</a> Oral Oncol. 49 (2), 152-156 (2013).</li>
<li>Ishii, K. J., Koyama, S., Nakagawa, A., Coban, C., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+innate+immune+receptors+and+beyond%3A+making+sense+of+microbial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Host innate immune receptors and beyond: making sense of microbial infections.</a> Cell Host Microbe. 3 (6), 352-363 (2008).</li>
<li>Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization comes of age.</a> Immunity. 23 (4), 344-346 (2005).</li>
<li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization.</a> Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat. Rev. Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nat. Rev. Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).</li>
<li>Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in bacterial infections.</a> J. Immunol. 181 (6), 3733-3739 (2008).</li>
<li>Biswas, S. K., Sica, A., Lewis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+macrophage+function+during+tumor+progression%3A+regulation+by+distinct+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of macrophage function during tumor progression: regulation by distinct molecular mechanisms.</a> J. Immunol. 180 (4), 2011-2017 (2008).</li>
<li>Cassetta, L., Cassol, E., Poli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+World+J%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in health and disease.</a> Sci. World J. 11, 2391-2402 (2011).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).</li>
<li>Mantovani, A., Sica, A., Sozzani, S., Allavena, P., Vecchi, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemokine+system+in+diverse+forms+of+macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization.</a> Trends Immunol. 25 (12), 677-686 (2004).</li>
<li>Delaby, A., Gorvel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+monocyte+dynamics+in+Q+fever+granuloma+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Defective monocyte dynamics in Q fever granuloma deficiency.</a> J. Infect. Dis. 205 (7), 1086-1094 (2012).</li>
<li>Gibb, S., Strimmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDIquant%3A+a+versatile+R+package+for+the+analysis+of+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MALDIquant: a versatile R package for the analysis of mass spectrometry data.</a> Bioinformatics. 28 (17), 2270-2271 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów. RO, JLM i CC są wynalazcami międzynarodowego patentu WO 2011/154650 o nazwie "Procédé d'identification de cellules de mammifères par spectrométrie de masse MALDI-TOF".

Protokół ten opisuje zastosowanie MALDI-TOF-MS na całych komórkach eukariotycznych. W tym miejscu ilustrujemy dokładność metody, analizując wielokrotne stany aktywacji makrofagów w odpowiedzi na ich mikrośrodowisko.
Sukces protokołu zależy od kilku krytycznych kroków. Po pierwsze, każde zanieczyszczenie roztworem może zmienić widma. Na przykład ważne jest, aby umyć komórki w PBS w celu usunięcia pożywki hodowlanej i białek surowicy przed osadzaniem na celu. Aby zapewnić powtarzalne wyniki, pot...

Laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana matrycą spektrometria mas czasu przelotu (MALDI-TOF MS) jest popularną techniką spektrometrii mas do badania próbek biologicznych. Zastosowanie wiązki laserowej i matrycy pochłaniającej energię umożliwia miękki proces jonizacji: parowanie i genezę dużych, w większości jednoładowanych biomolekuł. Proces ten nazywa się desorpcją/jonizacją, co uzasadnia akronim MALDI. Jony te są następnie przyspieszane przez przyłożenie napięcia i wprowadzane do analizatora TOF, który umożliwia oddzielenie tych jonów i ilościowe określenie ich odpowiednich mas1.
MALDI-TOF MS jest szeroko stosowany w biologii, chemii i medycynie do identyfikacji molekuł i biomarkerów2-4 lub do monitorowania modyfikacji potranslacyjnych na proteins5,6. Ostatnio kilka grup zastosowało MALDI-TOF MS do identyfikacji mikroorganizmów z próbek klinicznych7,8. To zastosowanie mikrobiologiczne jest obecnie rutynowo stosowane w warunkach klinicznych. Cała komórka MALDI-TOF ma wiele zalet w porównaniu z klasycznymi zastosowaniami MALDI-TOF MS. Próbki zawierające całe komórki są przetwarzane bezpośrednio, co pozwala uniknąć czasochłonnych etapów frakcjonowania lub oddzielania dużych ilości materiału. Co więcej, nie jest potrzebna charakterystyka różnych pików: całe widmo jest traktowane jako odcisk palca próbki, a algorytmy dopasowywania porównują badane widmo z bazą danych widm referencyjnych.
My i inni zastosowaliśmy tę technikę analizy całych komórek do komórek eukariotycznych. Technika ta może mieć wiele zastosowań: (1) identyfikacja głównych typów komórek z próbki mieszanej9-11; 2) ocena żywotności kultur komórkowych w czasie (w tym zastosowania przemysłowe w zakresie kontroli jakości)12; (3) monitorowanie stanów aktywacji pojedynczego ogniwa typu13; (4) ocenić złośliwą przemianę próbki klinicznej14,15.
Tutaj opisujemy użycie całokomórkowego MALDI-TOF MS do badania różnych fenotypów polaryzacji makrofagów w odpowiedzi na cytokiny lub bakterie zabijane termicznie. Makrofagi odgrywają kluczową rolę w odpowiedzi immunologicznej na patogeny drobnoustrojowe. Wykrywają czynniki zakaźne w tkankach za pomocą receptorów rozpoznawania wzorców, które są w stanie wykryć konserwatywne wzorce mikrobiologiczne, takie jak lipopolisacharyd (LPS)16. Makrofagi to profesjonalne komórki prezentujące antygen, które oddziałują z limfocytami T w celu wytworzenia adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Limfocyty T wpływają na makrofagi poprzez uwalnianie cytokin, które wzmacniają lub regulują aktywność mikrobójczą makrofagów. Analogicznie do polaryzacji limfocytów Th1 / Th2, makrofagi zapalne, bakteriobójcze i rakobójcze zostały sklasyfikowane jako makrofagi M1, a makrofagi immunoregulacyjne jako makrofagi M217-19. Termin M1 odnosi się do klasycznej aktywacji makrofagów przez cytokiny typu I, takie jak interferon (IFN)-γ i czynnik martwicy nowotworu (TNF) lub produkty bakteryjne, takie jak LPS18,20-23, podczas gdy makrofagi aktywowane przez alternatywne szlaki (interleukina (IL)-4, IL-10, transformujący czynnik wzrostu-β1 są uważane za makrofagi M219,24,25. Wysoka plastyczność fenotypowa i funkcjonalna makrofagów w odpowiedzi na ich mikrośrodowisko sprawia, że makrofagi te są przydatne do analizy subtelnych zmian za pomocą podejścia MALDI-TOF MS.

spektrometria mas maldi-tof dla całych komórek jest dokładną i szybką metodą analizy różnych trybów aktywacji makrofagów

Whole-cell MALDI-TOF Mass Spectrometry is an Accurate and Rapid Method to Analyze Different Modes of Macrophage Activation

MALDI-TOF jest szeroko stosowaną techniką spektrometrii mas w chemii i biochemii. Znalazł również zastosowanie w medycynie do identyfikacji cząsteczek i biomarkerów. Ostatnio znalazł zastosowanie w mikrobiologii do rutynowej identyfikacji bakterii wyhodowanych z próbek klinicznych, bez etapów przygotowania lub frakcjonowania. My i inni z powodzeniem zastosowaliśmy tę technikę spektrometrii mas MALDI-TOF dla całych komórek do komórek eukariotycznych. Obecne zastosowania obejmują zarówno identyfikację typów komórek, jak i kontrolę jakości, ocenę hodowli komórkowych i zastosowania diagnostyczne. Tutaj opisujemy jego zastosowanie do badania różnych fenotypów polaryzacji makrofagów w odpowiedzi na cytokiny lub bakterie zabijane termicznie. Pozwoliło to na zidentyfikowanie odcisków palców specyficznych dla makrofagów, które są reprezentatywne dla różnorodności odpowiedzi proteomicznych makrofagów. Ta aplikacja ilustruje dokładność i prostotę metody. Opisany tutaj protokół może być przydatny do badania odpowiedzi immunologicznej gospodarza w stanach patologicznych lub może zostać rozszerzony na szersze zastosowania diagnostyczne.

Celem niniejszego protokołu jest wykazanie dokładności metody MALDI-TOF MS całych komórek w ocenie reaktywności makrofagów na ich mikrośrodowisko.
Rycina 1 przedstawia przygotowanie stymulowanych makrofagów z próbek krwi. Rycina 2 obrazuje analizę monocytów oraz MDM za pomocą cytometrii przepływowej. Należy zauważyć, że monocyty wykazywały ekspresję CD14, ale nie CD68 (Rycina 1A). Z kolei MDM wykazywały ekspresję CD68, ale nie CD14 (Ry...

Ten protokół opisuje użycie spektrometrii mas MALDI-TOF na komórkach eukariotycznych. Tutaj ilustrujemy dokładność tej techniki, analizując wielokrotne stany aktywacji makrofagów w odpowiedzi na ich mikrośrodowisko.

Spektrometria mas MALDI-TOF dla całych komórek jest dokładną i szybką metodą analizy różnych trybów aktywacji makrofagów

MALDI-TOF is an extensively used mass spectrometry technique in chemistry and biochemistry. It has been also applied in medicine to identify molecules and ...

W tym eksperymencie zastosowano spektrometrię mas całych komórek. Aby dokładnie przeanalizować wiele stanów aktywacji makrofagów, należy najpierw wyizolować makrofagi z monocytów CD 14 dodatnich, a następnie stymulować komórki agonistami, takimi jak cytokiny i bakterie. Próbki należy przeanalizować metodą MALDI na tarczy stalowej, oddzielając białka i uzyskując widmo dla każdej próbki.Wyniki specyficznych odcisków palców mogą pozwolić na rozróżnienie różnych stanów aktywacji pojedynczej komórki eukariotycznej, makrofaga, w oparciu o analizę bioinformatyczną widm uzyskanych za pomocą spektrometrii mas całych komórek. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak cytometria przepływowa, jest to, że jest ona szybka, łatwa i niedroga. W niniejszym doświadczeniu wykazujemy, że z makrofagów uzyskano powtarzalne widma oraz że różne stany aktywacji zostały rozróżnione za pomocą analizy całych komórek.Uzyskujemy również widma z BBMC, które mogą być przydatne w diagnostyce odpowiedzi gospodarza na infekcję. Metoda ta może dostarczyć informacji o stanach aktywacji komórek odpornościowych. Można ją zastosować także w innych systemach, np. do profilowania koncepcyjnego w celu zastąpienia analizy ex extra podczas operacji. Izolujemy komórki z opax w probówkach 50 milliliter.Dodać 15 ml, rozcieńczając krew dziesięciokrotnie w soli fizjologicznej. Następnie oddzielić 30 ml rozcieńczonej krwi na gradiencie gęstości. Po odzyskaniu pierścienia PBMC, przechowywać komórki w lodzie.Delikatnie zdysocjuj osad BMCs z krwi obwodowej w 80 µL buforu do analizy. Dodaj 20 µL kuleczek magnetycznych pokrytych przeciwciałami przeciwko CD 14. Wymieszaj i inkubuj przez 15 minut.Przemyj raz 5 mL buforu do elektroforezy i wiruj przy 300 G przez pięć minut. Delikatnie zresuspenduj osad komórkowy w 500 µL buforu do elektroforezy. Wybierz odpowiednią kolumnę do separacji magnetycznej.Przepłucz preco i kolumnę buforem roboczym. Następnie nanieś PBMC na preco. Przyłóż pole magnetyczne i przepłucz trzykrotnie buforem roboczym.Zdejmij kolumnę z etapu wstępnej kalibracji i umieść ją na probówce o pojemności 15 ml. Dodaj bufor do elucji i eluuj komórki CD 14 pozytywne, wywierając nacisk na kolumnę. Następnie odwiruj próbkę w wirówce.Wiruj przy 300 Gs przez pięć minut. Odrzuć nadosad. Przemyj osad monocytów 10 mililitrami pożywki.Pobrać alikwot medium w celu określenia czystości preparatu monocytów za pomocą cytometrii przepływowej z wykorzystaniem przeciwciał anty-CD 14. Wysiać monocyty w 3 mL pożywki hodowlanej zawierającej 10% ludzkiej surowicy grupy AB dodatniej na cztery dni. Następnie wymienić medium na RPMI uzupełnione o 10% FBS i zidentyfikować uzyskaną populację komórek jako makrofagi pochodzenia monocytowego za pomocą cytometrii przepływowej.Stymuluj próbki zgodnie z planem doświadczalnym. Po przemyciu stymulowanych MDM buforem PBS, zeskrob komórki za pomocą gumowego skrobaka (rubber policeman) i zbierz zawiesiny MDM. Odwiruj komórki w celu otrzymania osadu, a następnie przemyj je raz w PBS, aby usunąć pozostałości FBS.Odwiruj M dms, aby uzyskać osad, a następnie resuspenduj osady w 20 µL PBS. Przystąp do analizy komórek niezwłocznie lub przechowuj je w PBS w temperaturze -80 °C do czasu analizy. Aby przygotować macierz CHCA, dodaj do fiolki 500 µL acetonitrylu, 250 µL 10% kwasu trifluorooctowego oraz 250 µL wody klasy HPLC.Następnie dodać 10 µL mieszaniny CHCA i sonikować matrycę przez co najmniej 20 minut. Odwirować z prędkością 13 000 G przez pięć minut, zebrać nadsącz, a osad odrzucić. Następnie zwilżyć polerowany stalowy cel gorącą wodą z kranu i przetrzeć precyzyjnym białym papierem.Nanieś 70% etanol i przemyj RINs wodą. Następnie nanieś 70% etanol i przetrzyj papierem precyzyjnym. Zanurz obiekt w 70% etanolu i poddaj sonikacji przez co najmniej 15 minut.Przykryć próbkę od 500 µL do 1 mL 80% kwasu fluorowodorowego, pocierać i wytrzeć papierem precyzyjnym. Następnie przepłukać wodą klasy HPLC, nie pocierając powierzchni. Próbkę wysuszyć w temperaturze pokojowej.Następnie powoli rozmrozić próbki MDM na lodzie. Wymieszać zawiesinę komórek MDM za pomocą pipety i nanieść jeden mikrolitr na tarczę MALDI. Dodać jeden mikrolitr roztworu matrycy MALDI na próbkę.W przypadku powtórzeń technicznych należy nanieść od 12 do 16 próbek na analizę; odparowanie następuje samoistnie w temperaturze pokojowej. Następnie wprowadź stalowy uchwyt z próbkami do spektrometru mas.Skonfiguruj spektrometr mas i przeprowadź akwizycję danych. Każde widmo składa się z listy pików z odpowiadającymi im masami i intensywnościami wskazującymi na obfitość względną. Użyj pierwiastka kwadratowego z intensywności, aby poprawić wizualizację graficzną widm.Następnie skoryguj tło, stosując statystycznie czuły nieliniowy algorytm przycinania pików. Do estymacji linii bazowej zastosuj stosunek sygnału do szumu równy sześciu w celu wykrycia pików. Przyjmij, że wykryte piki są podobne w różnych widmach, gdy wartości masy do ładunku mieszczą się w oknie 2000 PM.W tym doświadczeniu przygotowano stymulowane makrofagi z próbek krwi. Monocyty wyselekcjonowano na podstawie ekspresji CD 14 przy jednoczesnym braku ekspresji CD 68. Z kolei makrofagi pochodzenia monocytarnego zidentyfikowano na podstawie ekspresji CD 68 przy braku ekspresji CD 14.Dane te ilustrują rolę przygotowania próbek w interpretacji wyników MALDI toff MS. Spektrum dobrej jakości zazwyczaj zawiera główny pik w okolicach 5 kDa. Aby uzyskać dobre próbki, wymagane jest minimalne stężenie komórek, co obrazuje poniższe spektrum słabej jakości, uzyskane przy niskim stężeniu komórek.Podobne słabe wyniki uzyskuje się, gdy próbka jest mieszana z matrycą przed naniesieniem na płytkę docelową. Tutaj widma z różnych próbek przedstawiono w formie mapy ciepła. Względna obfitość jest zakodowana kolorystycznie odcieniami niebieskiego.Ta reprezentacja w formie wirtualnego żelu obrazuje powtarzalność próbek w obrębie każdej klasy. Analiza nienadzorowana z wykorzystaniem klastrowania hierarchicznego została podsumowana w formie agramu. Wszystkie próbki pogrupowały się w trzy różne grupy.Niepobudzone MDM, MDM pobudzone IFN gamma lub MDM pobudzone IL four. Co istotne, analiza MALDI TOF pozwala na rozróżnienie makrofagów M1 od makrofagów M two oraz niepobudzonych MDM. Reprezentacja pików w widmie referencyjnym dla MDM pobudzonych IFN gamma, IL four lub niepobudzonych wykazuje specyficzne piki dla każdej klasy.Specyficzne sygnatury mogą być indukowane przez kilka agonistów, co ilustruje dokładność analizy całych komórek metodą MALDI-TOF MS. Widma ze wszystkich stymulowanych próbek były wyraźnie oddzielone od widm niestymulowanych makrofagów. MDM wykazywały również specyficzne sygnatury indukowane przez bakterie zabite termicznie.Wyniki te wspierają hipotezę, że MALDI-TOF może być wykorzystywane do analizy krążących komórek w celu oceny odpowiedzi gospodarza na infekcję lub choroby zapalne w warunkach klinicznych, gdy próbka jest gotowa. Technika ta może zostać przeprowadzona w ciągu jednej godziny, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak oceniać stany aktywacji komórek poprzez spektrometrię mas całych komórek.

whole-cell-maldi-tof-mass-spectrometry-is-an-accurate-rapid-method-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Spektroskopia masowa MALDI-TOF z zastosowaniem całych komórek jest dokładną i szybką metodą analizy różnych trybów aktywacji makrofagów

Makrofagi są kluczowymi komórkami zaangażowanymi w patogeniczność gospodarza. Makrofagi wykazują różnorodność fenotypową i funkcjonalną, którą można analizować i wykrywać za pomocą analizy proteomicznej. W artykule opisano, jak przeprowadzić elektroforezę 2D pierwotnych kultur ludzkich makrofagów zróżnicowanych do fenotypu M1 lub M2.

Profilowanie proteomiczne makrofagów za pomocą elektroforezy 2D

Przeprogramowanie metaboliczne jest cechą charakterystyczną i warunkiem wstępnym polaryzacji makrofagów M1 i M2. Niniejszy manuskrypt opisuje test do pomiaru podstawowych parametrów glikolizy i funkcji mitochondriów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Narzędzie to można zastosować do zbadania, w jaki sposób poszczególne czynniki wpływają na metabolizm i fenotyp makrofagów.

Charakterystyka metaboliczna spolaryzowanych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego M1 i M2 przy użyciu analizy strumienia zewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym

Opisujemy wykrywanie aktywacji inflamasomu NLRP3 na bazie komórkowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i barwienia dla aktywnej kaspazy-1 i adaptera, ASC. Przedstawiono test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w celu wykrycia lizy piroptotycznej w skali populacji. Techniki te można dostosować do badania wielu aspektów biologii inflamasomów.

Wykrywanie aktywacji inflamasomu i śmierci komórek piroptotycznych w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy

Nowatorska metoda przygotowania próbki została opracowana w celu dostosowania kokultury komórek i tkanek do wykrywania wymiany małych cząsteczek za pomocą obrazowania spektrometrii mas.

Uchwycenie komunikacji małych cząsteczek między tkankami a komórkami za pomocą obrazowej spektrometrii mas

Ten raport opisuje zautomatyzowany protokół do multipleksowych testów immunofluorescencyjnych (mIF) na automatycznym barwniku do szkiełek. Wykazano wysoką odtwarzalność proteomiki przestrzennej na standardowych autostainerach tkankowych o wysokiej przepustowości i obrazach fluorescencyjnych na całych szkiełkach, co jest idealne do niestandardowych testów mIF na dużej liczbie szkiełek tkankowych w badaniach translacyjnych.

Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

Tutaj szczegółowo opisujemy metody ekstrakcji makrofagów ze szpiku kostnego, śledziony i serca po zawale serca, a następnie oceny przepływu metabolicznego w żywych komórkach.

Analiza przepływu metabolicznego ex vivo w makrofagach śledziony i serca oraz monocytach szpiku kostnego

Ten protokół opisuje użycie mikroMS do sterowanej fluorescencją, jednokomórkowej spektrometrii mas MALDI-2, umożliwiając lepsze profilowanie molekularne pierwotnych komórek neuronalnych szczura.

Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą pod wpływem fluorescencji ze spektrometrią mas z indukowaną laserem spektrometrią mas z jonizacji poszczególnych komórek nerwowych szczura

Niniejszy protokół opisuje prostą metodę opartą na zastosowaniu taśmy klejącej do pobierania próbek z powierzchni pomidorów oraz innych świeżych produktów rolnych, a następnie szybką detekcję całych komórek Salmonella przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Połączenie pobierania próbek za pomocą taśmy klejącej i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu szybkiego wykrywania Salmonella na świeżych produktach rolnych

Makrofagi pochodzące z monocytów są ważnymi komórkami wrodzonego układu odpornościowego. W tym miejscu opisujemy łatwy w użyciu model in vitro do generowania tych komórek. Korzystając z wirowania gradientowego, izolacji ujemnych kulek i określonych warunków hodowli komórek, można wygenerować makrofagi pochodzące z monocytów do badań fenotypowych i funkcjonalnych.

Model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

Neutrofile to najliczniejsze leukocyty we krwi. Neutrofile pełnią funkcje regulowane transkrypcją, takie jak produkcja cytokin prozapalnych i hamowanie apoptozy. Funkcje te można badać za pomocą przedstawionej tutaj metody, która umożliwia wykrywanie i kwantyfikację czynników jądrowych za pomocą cytometrii przepływowej w izolowanych...

Prosta i skuteczna metoda wykrywania aktywacji czynnika jądrowego w ludzkich neutrofilach za pomocą cytometrii przepływowej

Poznaj spektrometrię mas MALDI-TOF dla całych komórek jako szybką metodę analizy stanów aktywacji makrofagów. Technika ta pozwala na dokładne rozróżnienie różnych fenotypów komórek immunologicznych.

Spektrometria mas MALDI-TOF dla całych komórek jest dokładną i szybką metodą analizy różnych trybów aktywacji makrofagów

Przeglądaj więcej filmów