Name: Podsiatkówkowy przeszczep oczyszczonych komórek prekursorowych fotoreceptorów MACS do siatkówki dorosłej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Poznaj metodę podsiatkówkowego przeszczepu komórek prekursorowych fotoreceptorów MACS do siatkówki myszy. Technika ta umożliwia badanie regeneracji siatkówki i potencjału przywracania wzroku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Anandowi Swaroopowi za dostarczenie myszy Nrl-GFP, Jochenowi Haasowi za wsparcie techniczne, oraz Sindy Böhme i Emely Lessmann za hodowlę zwierząt.	
	Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - Centrum Terapii Regeneracyjnych Drezno, CRTD Seed Grant Program, SFB 655 oraz ProRetina e.V. fundacji, DIGS-BB Graduate Program Dresden oraz Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)

Oświadczenie dotyczące etycznego użytkowania i opieki nad zwierzętami:
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były przeprowadzane w ścisłej zgodności z prawem Unii Europejskiej i niemieckim (Tierschutzgesetz) i przestrzegały Oświadczenia ARVO dotyczącego wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Technicznego w Dreźnie i Landesdirektion Dresden (numer zgody: 24D-9168.11-1/2008-33).
1. Przed rozpoczęciem dysocjacji komórek i sortowania komórek
<ol>
	<li>Oznaczyć trzy probówki reakcyjne o pojemności 15 ml za pomocą: Wash (W), Frakcji dodatniej (+) i Frakcji ujemnej (-).</li>
</ol>
2. Dysocjacja siatkówki
<ol>
	<li>Odetnij głowę PN 4 szczeniakom za pomocą nożyczek.</li>
	<li>Krótko opłucz głowę szczeniąt w 70% etanolu, a następnie umyj w PBS.</li>
	<li>Przenieś głowę do zimnego HBSS i wyłuszczej oko (powtórz ten krok dla wszystkich głów). Aby wyłuszczyć, otwórz powieki i przymocuj oko zakrzywionymi kleszczami w okolicy nerwu wzrokowego. Następnie ostrożnie wyciągnij oko z orbity.</li>
	<li>Po wyłuszczeniu wszystkich oczu wyizoluj siatkówkę: wprowadź zamknięte nożyczki do nerwu wzrokowego i otwórz ostrza. Wyrzuć RPE/chorid. Usuń soczewki i naczynia krwionośne za pomocą zakrzywionych kleszczy.</li>
	<li>Przenieś izolowane siatkówki do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml zawierającej roztwór papainy (dostarczany przez zestaw do dysocjacji papainy).</li>
	<li>Inkubować siatkówki w roztworze papainy przez 30-60 minut w łaźni wodnej lub wytrząsarce (400 obr./min) w temperaturze 37 °C.
		<ol>
			<li>Podczas inkubacji siatkówki w roztworze papainy, należy pobrać pipetą 1 ml roztworu ovomukoid do 15 ml probówki reakcyjnej (etykieta "1").</li>
			<li>Dodać 60 μl DNazy I (10 mg/ml) + 60 μl roztworu ovomukoid (dostarczonego przez zestaw) + 520 μl EBSS do 15 ml probówki reakcyjnej (etykieta "2").</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Po inkubacji papainy przenieść roztwór papainy zawierający częściowo strawione siatkówki do probówki reakcyjnej "2".</li>
	<li>Za pomocą wypolerowanej pipety wykonaj dysocjację mechaniczną (10x w górę iw dół).</li>
	<li>Odpipetować zawiesinę pojedynczej komórki do probówki reakcyjnej "1". Spróbuj wygenerować 2 warstwy, delikatnie nakładając zawiesinę komórkową na roztwór ovomukoid.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 300 x g (około 1 300 obr./min).</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu MACS.</li>
</ol>
3. Sortowanie komórek za pomocą magnetycznego sortowania komórek powiązanych (MACS)
<ol>
	<li>Dodać X μl szczurzego przeciwciała anty-CD73 do 500 μl w celu uzyskania końcowego stężenia 10 μg/ml.</li>
	<li>Inkubować 5 minut na lodzie.</li>
	<li>Napełnić 15 ml probówki reakcyjnej do 10 ml buforem MACS i odwirować ją przez 5 minut z prędkością 300 x g.</li>
	<li>Usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 480 μl buforu MACS i dodać 120 μl kozich mikrogranulek IgG przeciwko szczurom.</li>
	<li>Inkubować 15 minut na lodzie, nie mieszać, nie wstrząsać ani nie mieszać.</li>
	<li>Napełnić 15 ml probówki reakcyjnej do 5 ml buforem MACS i odwirować ją przez 5 minut przy 300 x g.</li>
	<li>Podczas odwirowania probówki reakcyjnej:
		<ol>
			<li>Dopasuj kolumnę LS do stojaka magnetycznego.</li>
			<li>Umieść filtr separacji wstępnej na górze kolumny LS.</li>
			<li>Uwodnić filtr wstępnego rozdzielania i kolumnę LS 3 ml buforu MACS i zebrać bufor MACS do probówki do przemywania (W).</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Usunąć supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w buforze MACS o pojemności 500 μl.</li>
	<li>Załadować zawiesinę komórek o objętości 500 μl do filtra, następnie dodać 1 ml buforu MACS do filtra i zebrać frakcję ujemną do probówki reakcyjnej frakcji ujemnej (-).</li>
	<li>Następnie dodaj 3 x 3 ml buforu MACS do kolumny, aby zmyć komórki, które nie są związane z kolumną</li>
	<li>Gdy te 9 ml przejdzie przez kolumnę LS, wyjmij kolumnę ze stojaka magnetycznego i zainstaluj ją na górze probówki reakcyjnej frakcji dodatniej (+).</li>
	<li>Szybko załaduj 5 ml buforu MACS do kolumny LS i umieść tłok w kolumnie LS i dociśnij go, aż cały bufor przejdzie przez kolumnę.</li>
	<li>Odwirować probówkę reakcyjną zawierającą frakcję dodatnią przez 5 minut przy 300 x g.</li>
	<li>Usunąć supernatant, zawiesić ponownie w 500 μl buforu MACS i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Policz całkowitą liczbę komórek za pomocą zwykłego urządzenia do liczenia komórek.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę komórek z frakcji sortowanej dodatnio, zawierającej 2 x10,5 komórek/μl w buforze MACS i przechowywać w temperaturze 4 °C</li>
</ol>
4. Przeszczepienie komórek prekursorowych fotoreceptorów posortowanych przez MAC do siatkówki myszy
<ol>
	<li>Upewnij się, że masz przygotowane wszystkie następujące roztwory: 1 ml sterylnego PBS lub HBSS, 10 μl DNAse I, 1-2 ml sterylnego dejonizowanegoH2O, podwielokrotności frakcji zawiesiny komórek w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Znieczulenie dorosłej myszy (tj. w wieku 2-4 miesięcy) za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia chlorowodorku medetomidyny (0,01 mg/10 g masy ciała), ketaminy (0,75 mg/10 g masy ciała). Następnie należy wykonać podskórne wstrzyknięcie buprenorfiny (0,05 mg/kg masy ciała) w celu złagodzenia bólu.</li>
	<li>Rozszerz źrenice kroplą Fenylefryny 2,5%-Tropicamidu 0,5%.</li>
	<li>Zamocuj mysz w uchwycie na głowę myszy i umieść pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Nałóż kroplę żelu Visidic, aby zapobiec wysuszeniu oka.</li>
	<li>Zrób mały otwór na granicy między twardówką a rogówką (odpowiednio lub serrata) za pomocą sterylnej igły 30 G 1/2 cala.</li>
	<li>Pokrój zwykły szkiełko okładki na małe (około 5 mm x 5 mm) kawałki za pomocą pisaka diamentowego, umieść jeden z tych kawałków na rogówce, umożliwiając bezpośrednią wizualizację siatkówki.</li>
	<li>Przepłucz kilkakrotnie wstępnie wysterylizowaną strzykawkę mikrolitrową wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Załadować strzykawkę mikrolitrową 1 μl zawiesiny komórek, skierować igłę stycznie przez spojówkę i twardówkę i umieścić pod kontrolą wzrokową w nosowej połowie siatkówki.</li>
	<li>Delikatnie przebij otwór w siatkówce, aż dotrze do przestrzeni podsiatkówkowej, wstrzyknij zawiesinę komórkową do przestrzeni podsiatkówkowej.</li>
	<li>Obserwuj pęcherzowe odwarstwienie siatkówki, które powinno być jednolite, pokrywające około 1/4 przestrzeni siatkówki bez krwawienia.</li>
	<li>Delikatnie wyjmij strzykawkę, otwór siatkówki zamknie się automatycznie.</li>
	<li>Przepłukać strzykawkę z mikrolitrami kilkakrotnie wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Odłącz mysz od uchwytu na głowę.</li>
	<li>Obudź mysz, wstrzykując chlorowodorek atipamozolu w celu odwrócenia działania chlorowodorku medetomidyny.</li>
	<li>Umieść mysz na czas budzenia w ciepłej, ciemnej komorze (około 25 °C).</li>
	<li>Następne 2 dni po przeszczepieniu buprenorfinę (0,05 mg/kg masy ciała) należy podawać we wstrzyknięciu podskórnym rano i po południu w celu złagodzenia bólu.</li>
</ol>

<ol><li>Bartsch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+cells+integrate+into+the+outer+nuclear+layer+and+differentiate+into+mature+photoreceptors+after+subretinal+transplantation+into+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice.</a> Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).</li>
<li>MacLaren, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+repair+by+transplantation+of+photoreceptor+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors.</a> Nature. 444, 203-207 (2006).</li>
<li>Eberle, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+segment+formation+of+transplanted+photoreceptor+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Lakowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+and+rod+photoreceptor+transplantation+in+models+of+the+childhood+retinopathy+Leber+congenital+amaurosis+using+flow-sorted+Crx-positive+donor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).</li>
<li>Barber, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+the+degenerate+retina+by+photoreceptor+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).</li>
<li>Pearson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+vision+after+transplantation+of+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoration of vision after transplantation of photoreceptors.</a> Nature. , (2012).</li>
<li>Singh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+end-stage+retinal+degeneration+and+restoration+of+visual+function+by+photoreceptor+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).</li>
<li>Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+integration+of+transplanted+CD73-positive+photoreceptor+precursors+into+adult+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).</li>
<li>Koso, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD73%2C+a+novel+cell+surface+antigen+that+characterizes+retinal+photoreceptor+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).</li>
<li>Lakowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+transplantation+of+photoreceptor+precursor+cells+selected+via+cell+surface+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression.</a> Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).</li>
<li>Akimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+GFP+to+newborn+rods+by+Nrl+promoter+and+temporal+expression+profiling+of+flow-sorted+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472, 51-56 (2011).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).</li>
<li>Osakada, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+generation+of+rod+and+cone+photoreceptors+from+mouse%2C+monkey+and+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).</li>
<li>Lee, M. Y., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+%26%2334%3BThree-step+MACS%26%2334%3B%3A+a+novel+strategy+for+isolating+rare+cell+populations+in+the+absence+of+known+cell+surface+markers+from+complex+animal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Development of the &#34;Three-step MACS&#34;: a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue.</a> J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Przeszczepienie podsiatkówkowe komórek prekursorowych fotoreceptorów stanowi niezawodne narzędzie do osiągnięcia integracji tych wrażliwych na światło komórek z siatkówkami gospodarza w znacznej liczbie1,2. Może to pozwolić na opracowanie terapii komórkowej do leczenia chorób zwyrodnieniowych siatkówkiw przyszłości 6. Populacja komórek dawcy, obecnie izolowana z siatkówki PN 4, jest mieszaniną różnych typów komórek, z których integrują się tylko komórki prekursorowe fotoreceptorów po wstrzyknięciu podsiatkówkowym. Dzięk...

Wzrok jest jednym z podstawowych zmysłów człowieka. Upośledzenie tego zmysłu i ślepota są jedną z głównych przyczyn niepełnosprawności w krajach uprzemysłowionych. Dominującą przyczyną upośledzenia wzroku lub ślepoty jest zwyrodnienie siatkówki, charakteryzujące się utratą komórek fotoreceptorów, co można zaobserwować w zwyrodnieniu plamki żółtej, barwnikowym zwyrodnieniu siatkówki, dystrofii czopkowo-pręcikowej i innych schorzeniach. Do tej pory skuteczna terapia przywracająca utracony wzrok nie jest dostępna. W 2006 i 2008 roku dwa różne laboratoria poinformowały, niezależnie od siebie, o udanym przeszczepie komórek prekursorowych fotoreceptorów pręcikowych do siatkówki dorosłych myszy typu dzikiego1,2. W ten sposób pojawia się możliwość przeszczepu komórek prekursorowych fotoreceptorów również do zdegenerowanej siatkówki, w celu zastąpienia zdegenerowanych fotoreceptorów i przywrócenia wzroku. Rzeczywiście, niedawno wykazano, że takie przeszczepione komórki prekursorowe fotoreceptorów wywołują kryteria morfologiczne dojrzałych fotoreceptorów typu dzikiego, takie jak prawidłowo rozwinięte segmenty zewnętrzne3, zakończenia synaptyczne w bliskim sąsiedztwie endogennych komórek dwubiegunowych i okrągłe ciało komórki znajdujące się w zewnętrznej warstwie jądrowej2-4, a także zdolność do funkcjonalnej integracji z obwodami neuronalnymi gospodarza5-7. Jedną z głównych zasad tej strategii jest wykorzystanie siatkówki młodych myszy w 4. dniu po urodzeniu (PN 4, PN0 definiuje się jako dzień urodzenia), w wyniku czego powstaje mieszanina różnych typów komórek do przeszczepu. Na tle przyszłego zastosowania terapeutycznego, mieszanina ta musi zostać oczyszczona pod kątem komórek prekursorowych fotoreceptorów. CD73 został opisany jako pierwszy marker powierzchniowy komórki specyficzny dla młodych fotoreceptorów w siatkówce8-10. W tym miejscu demonstrujemy metodę oczyszczania komórek prekursorowych fotoreceptorów w oparciu o ten marker powierzchni komórki i z wykorzystaniem techniki sortowania komórek związanych z magnesem (MACS). MACS może mieć zalety w porównaniu z technikami sortowania komórek aktywowanymi fluorescencyjnie, ze względu na krótki czas sortowania i łatwiejsze dostosowanie do warunków GMP. Mogliśmy wykazać ~90% wzbogacenie i do 3-krotnie wyższy współczynnik integracji podczas przeszczepiania wzbogaconej populacji do przestrzeni podsiatkówkowej w dorosłej siatkówce typu dzikiego. W związku z tym wzbogacanie komórek prekursorowych fotoreceptorów w oparciu o MACS i przeszczep podsiatkówkowy są niezawodnymi i obiecującymi technikami opracowywania regeneracyjnej strategii terapeutycznej w leczeniu zwyrodnienia siatkówki.

<table><tbody><tr><td>System dysocjacji papainy</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td>dostarczony DNaza I nie jest stosowana w metodzie</td></tr><tr><td>Oczyszczony szczur anty-mysz CD73, klon TY/23</td><td>BD Pharmingen</td><td>550738</td><td>Stężenie podstawowe 0,5 mg / ml</td></tr><tr><td>Kozie mikrokulki anty-szczurze</td><td>IgG Miltenyi</td><td>130-048-501</td><td>Całkowita objętość 2 ml</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td>Służy do zliczania całkowitej liczby komórek</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025050</td><td>Służy do dysocjacji siatkówki</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>Fluka93595</td><td>Służy do liczenia całkowitej liczby komórek</td></tr><tr><td>Vidisic</td><td>Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Domitor</td><td>Pfizer</td><td>76579</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina 10%</td><td>Ratiopharm</td><td>7538843</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan</td><td>Pfizer</td><td>76590</td><td></td></tr><tr><td>Fenylefryna 2,5%-Tropicamid 0,5%</td><td>Kliniki uniwersyteckie Drezno Apteka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtry do wstępnej separacji</td><td>Miltenyi</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny LS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Separator QuadroMACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Szkło ogniopolskie Pipeta Pasteura</td><td>Marka</td><td>74777 20</td><td>Pipeta" Końcówki muszą być polerowane ogniowo i sterylizowane w autoklawie.</td></tr><tr><td>Stojak na probówki MACS 15 ml</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-052</td><td></td></tr><tr><td>Komora do zliczania komórek</td><td>Carl Roth</td><td>T728.1</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki 15 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Leica M651 MSD</td><td>Leica</td><td>M651 MSD</td><td>może być używany zamiast Olympus SZX10</td></tr><tr><td>Olympus SZX10</td><td>Olympus</td><td>SZX10</td><td>może być używany zamiast Leica M651 MSD</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop stereoskopowy Olympus CKX41</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Kaptur do hodowli komórkowych Thermo Scientific MSC-Advance</td><td>Thermo Scientific</td><td>51025411</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówka reakcyjna</td><td>Sarstedt</td><td>727706400</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Probówka reakcyjna</td><td>Sarstedt</td><td>72695</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Wirówka 5702</td><td>VWR (Eppendorf)</td><td>521-0733</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na głowę myszy</td><td>myNeurolab</td><td>471030</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 3 30 G 1/2 cala</td><td>BD Pharmingen</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka mikrolitrowa Hamilton 5 i mikro; l, 75RN</td><td>Hamilton</td><td>065-7634-01</td><td>dostarczany bez igieł</td></tr><tr><td>Igła specjalna Hamilton RN 34 G</td><td>Hamilton</td><td>065-207434</td><td>Blunt, długość 12 mm</td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; Nożyczki sprężynowe bingen - Ostrza 5 mm Proste</td><td>narzędzia do nauki</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #7 - Titanium Biologie</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>Pióro diamentowe</td><td>Tools-tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mm x 15 mm Szkiełka nakrywkowe</td><td>Iskry</td><td>MIC3366</td><td></td></tr></tbody></table>

podsiatkówkowy przeszczep oczyszczonych komórek prekursorowych fotoreceptorów macs do siatkówki dorosłej myszy

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

Upośledzenie wzroku i ślepota spowodowane utratą komórek światłoczułych siatkówki, tj. fotoreceptorów, stanowi główną przyczynę niepełnosprawności w krajach uprzemysłowionych. Zastąpienie zdegenerowanych fotoreceptorów przeszczepem komórek stanowi możliwą opcję leczenia w przyszłych zastosowaniach klinicznych. Rzeczywiście, ostatnie badania przedkliniczne wykazały, że niedojrzałe fotoreceptory, wyizolowane z siatkówki noworodka myszy w 4. dniu po urodzeniu, mają potencjał do integracji z siatkówką dorosłej myszy po przeszczepie podsiatkówkowym. Komórki dawcy wygenerowały dojrzałą morfologię fotoreceptorów, w tym segmenty wewnętrzne i zewnętrzne, okrągłe ciało komórki znajdujące się w zewnętrznej warstwie jądrowej oraz zakończenia synaptyczne w bliskiej odległości od endogennych komórek dwubiegunowych. Rzeczywiście, ostatnie doniesienia wykazały, że fotoreceptory dawcy funkcjonalnie integrują się z obwodami neuronalnymi myszy gospodarzy. W celu przyszłego zastosowania klinicznego takiego podejścia do wymiany komórek, oczyszczone zawiesiny wybranych komórek muszą zostać wygenerowane i umieszczone we właściwej pozycji w celu prawidłowej integracji z okiem. W celu wzbogacenia prekursorów fotoreceptorów sortowanie powinno opierać się na specyficznych antygenach powierzchniowych komórek, aby uniknąć genetycznej modyfikacji reporterowej komórek dawcy. Tutaj pokazujemy sortowanie komórek związanych z magnesem (MACS) - wzbogacanie prekursorów fotoreceptorów pałeczkowych do przeszczepu wyizolowanych z siatkówki noworodka myszy reporterowych specyficznych dla fotoreceptorów na podstawie markera powierzchni komórki CD73. Inkubacja z przeciwciałami anty-CD73, a następnie przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z mikrokulkami pozwoliła na wzbogacenie prekursorów fotoreceptorów pręcików przez MACS do około 90%. W porównaniu z cytometrią przepływową, MACS ma tę zaletę, że można ją łatwiej zastosować do standardów GMP i że duże ilości komórek można sortować w stosunkowo krótkich odstępach czasu. Wstrzyknięcie wzbogaconych zawiesin komórkowych do przestrzeni podsiatkówkowej dorosłych myszy typu dzikiego spowodowało 3-krotnie wyższy współczynnik integracji w porównaniu z niesortowanymi zawiesinami komórek.

Aby ocenić zdolność fotoreceptorów pręcikowych do integracji z siatkówką myszy, wykorzystano linię reporterową myszy, w której ekspresja GFP jest sterowana przez promotor białka Nrl (neural retina leucine zipper; Nrl-GFP)11. Nrl jest najwcześniejszym markerem fotoreceptorów pręcikowych, którego ekspresja rozpoczyna się w dniu E12.5 i trwa przez cały okres dorosłości, co umożliwia specyficzne znakowanie komórek fotoreceptorów pręcikowych dawcy.
Szczenięta PN 4 Nrl-GFP poddano dekapit...

Przeszczep komórek stanowi strategię leczenia zwyrodnienia siatkówki charakteryzującego się utratą fotoreceptorów. W tym miejscu opisujemy metodę wzbogacania fotoreceptorów do przeszczepiania i ich przeszczepiania podsiatkówkowego dorosłym myszom.

Podsiatkówkowy przeszczep oczyszczonych komórek prekursorowych fotoreceptorów MACS do siatkówki dorosłej myszy

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest przeszczepienie wzbogaconych komórek prekursorowych fotoreceptorów do siatkówki myszy biorcy. Jest to osiągane poprzez wstępne wyizolowanie siatkówki oka młodych zwierząt dawców. W drugim kroku postnatalne komórki prekursorowe fotoreceptorów są izolowane z populacji komórek siatkówki za pomocą magnetycznej separacji komórek opartej na markerze CD 73.Następnie prekursory fotoreceptorów zostają przeszczepione do przestrzeni podsiatków zwierząt biorców, aby ułatwić ich integrację z siatkówką biorcy. Ostatecznie potencjał integracyjny i zachowanie przeszczepionych prekursorowych komórek fotoreceptorów można przeanalizować za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji siatkówki, takie jak zdolność przeszczepionych fotoreceptorów do integracji w obwodach neuronalnych gospodarza w celu przywrócenia wzroku.Zastosowania tej techniki wykraczają poza leczenie chorób degeneracyjnych siatkówki. Gdy instalacja i wzbogacanie prekursorów fotoreceptorów przez max zostaną łatwo dostosowane do warunków GMP, wizualna prezentacja tej metody stanie się krytyczna. Ponieważ etapy transplantacji są trudne do opanowania, precyzyjne posługiwanie się igłą i jej umieszczenie w przestrzeni podsiatkówkowej jest kluczowe dla zapewnienia maksymalnego sukcesu i powtarzalności. Aby rozdzielić siatkówki, należy najpierw krótko opłukać głowy szczurząt w 4. dobie postnatalnej w 70% ethanol, a następnie przemyć je roztworem PBS.Następnie przenieś głowy do zimnego roztworu HBSS, aby zaszczepić oczy. Najpierw otwórz powiekę, a następnie użyj zakrzywionej pęsety.Chwyć narząd w obrębie nerwu wzrokowego i ostrożnie wyciągnij oko z oczodołu. Następnie, aby wyizolować siatkówkę, wprowadź czubek zamkniętych nożyczek do nerwu wzrokowego i rozchyl ostrza. Oddziel nabłonek pigmentowy siatkówki oraz naczyniówkę, a następnie za pomocą zakrzywionej pęsety usuń soczewkę i naczynia krwionośne.Inkubować wyizolowane siatkówki w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml zawierającej roztwór papainy przez 30 do 60 minut w wytrząsarce przy 400 RPM i 37°C. Podczas inkubacji siatkówek odmierzyć jeden ml roztworu OVO moid do probówki reakcyjnej o pojemności 15 ml oznaczonej numerem jeden, a następnie do probówki reakcyjnej o pojemności 2 ml oznaczonej numerem dwa dodać 60 µl DNAs one, 60 µl roztworu OVO MOID oraz 520 µl EBSS. Po inkubacji przenieść roztwór papainy z częściowo strawionymi siatkówkami do probówki reakcyjnej numer dwa, a następnie potraktować siatkówki 10-krotnym pipetowaniem przy użyciu wypalanej końcówki pipety.Ostrożnie nanieś zawiesinę pojedynczych komórek na powierzchnię roztworu OVO MOID w probówce reakcyjnej numer jeden, a następnie wiruj zawiesinę komórek przez pięć minut przy 300 Gs w temperaturze pokojowej. Następnie odlej nadsącz i resuspenduj komórki w 500 µL buforu max. Aby przeprowadzić sortowanie według max, najpierw inkubuj komórki w 10 µg/mL przeciwciała szczurzego anty-CD 73 w temperaturze 0°C.Po pięciu minutach przemyj komórki w 10 mililitrach buforu max. Następnie resuspenduj osad w 480 mikrolitrach buforu max i inkubuj komórki w 120 mikrolitrach mikrokulek go anti RET IgG na lodzie, bez agitacji, wstrząsania lub mieszania. Po 15 minutach przemyj komórki w pięciu mililitrach buforu max; podczas płukania umieść kolumnę LS na magnesie max i nałóż filtr do preseparacji na górną część kolumny.Następnie nawilżamy filtr i kolumnę za pomocą 3 mL buforu max. Bufor zbieramy do probówki o pojemności 15 mL oznakowanej jako W (płukanie). Po zakończeniu wirowania komórek, pellet resuspendujemy w 500 µL buforu max i przenosimy komórki na filtr.Dodaj 1 ml buforu max na komórki, a następnie zbierz frakcję negatywną do probówki reakcyjnej o pojemności 15 ml oznakowanej jako „minus” dla frakcji negatywnej. Następnie trzykrotnie dodaj po 3 ml buforu max do kolumny w celu jej przemycia. Teraz zdejmij kolumnę ze statywu magnetycznego.Zainstaluj go na 15 mililitrowej probówce reakcyjnej z oznaczeniem plus dla próby dodatniej. Szybko nanieś 5 mililitrów buforu max do kolumny. Przepuść cały bufor przez kolumnę, a następnie, po odwirowaniu frakcji dodatniej, resuspenduj osad w 500 mikrolitrów buforu max.Umieść komórki w temperaturze 4 °C i dokonaj ich obliczenia. Następnie dostosuj stężenie do 2 × 10⁵ komórek na µL w buforze max, utrzymując komórki w temperaturze 4 °C. W celu transplantacji wyizolowanych komórek prekursorowych fotoreceptorów, rozszerz źrenice zsedowanej dorosłej myszy za pomocą kropli fenylefryny, podczas gdy źrenice będą się rozszerzać. Użyj rylca diamentowego, aby pociąć szkiełko nakrywkowe na kawałki o wymiarach około 5 × 5 mm.Umieść mysz pod mikroskopem stereoskopowym, unieruchom zwierzę w uchwycie do głowy myszy, a następnie nanieś kroplę żelu ICIC do każdego oka, aby zapobiec wysychaniu. Następnie użyj igły 30 G o długości pół cala, aby wykonać niewielki otwór na granicy twardówki i rogówki. Po tym umieść jeden z kawałków szkiełka zakryjącego o wymiarach pięć na pięć milimetrów na rogówce, co umożliwi bezpośrednią wizualizację siatkówki.Następnie kilka razy przepłucz wysterylizowaną strzykawkę mikrolitrową sterylną wodą dejonizowaną, a potem nabierz do niej jedną z posortowanych zawiesin komórkowych. Wprowadź igłę ukośnie przez spojówkę i twardówkę, kierując ją w stronę nosowej połowy siatkówki. Następnie delikatnie przebij siatkówkę, aby dotrzeć do przestrzeni podsiatkówkowej, i wstrzyknij komórki.Potwierdź pęcherzykowate, jednolite odklejenie siatkówki, które powinno obejmować około jednej czwartej powierzchni siatkówki, bez występowania krwawienia. Następnie ostrożnie wyjmij strzykawkę i kilkukrotnie wypłucz ją wodą jonizowaną. Na koniec zwolnij mysz z immobilizatora.Wstrzyknij zwierzęciu chlorowodorek aamaz oil, aby odwrócić działanie znieczulenia, a następnie pozostaw je do wybudzenia w ciemnej komorze o temperaturze 25 degrees Celsius, co pozwoli na ocenę zdolności fotoreceptorów pręcikowych do integracji z siatkówką myszy. Wykorzystano linię reporterową myszy, w której ekspresja GFP jest sterowana przez promotor neural retina losing zipper lub NRL, co przedstawiono na tych histogramach. Początkowa zawiesina komórek siatkówki zawierała 30.4% GFP-dodatnich fotoreceptorów pręcikowych.Po sortowaniu MACS w oparciu o CD 73 zaobserwowano wzbogacenie do 86,9% komórek prekursorowych fotoreceptorów dodatnich dla GFP w frakcji dodatniej dla CD 73. W frakcji ujemnej dla CD 73 tylko 9,9% komórek było dodatnich dla GFP. Zaobserwowano również wzbogacenie komórek dodatnich dla N-R-L-G-F-P po sortowaniu MACS w oparciu o CD 73.Po wysiewaniu in vitro komórki dawcy pozostają w miejscu wstrzyknięcia, zdefiniowanym przez pęcherzykowate oddzielenie siatkówki gospodarza, i integrują się z zewnętrzną warstwą jądrową siatkówki gospodarza, przyjmując morfologię dojrzałych fotoreceptorów. Po opanowaniu techniki sortowanie komórek z użyciem magnesu może zostać przeprowadzone w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Procedurę tę można również dostosować do wzbogacania populacji fotoreceptorów pochodzenia komórek macierzystych lub nawet innych macierzystych komórek siatkówki.Biorąc pod uwagę dostępność specyficznych przeciwciał pozwalających na udzielenie odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące regeneracji lub ratowania siatkówki poprzez transmutację komórkową. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat sposobu transplantacji wzbogaconych prekursorów fotoreceptorów Photo max do przestrzeni podsiatkówkowej myszy biorcy.

subretinal-transplantation-macs-purified-photoreceptor-precursor

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przeszczepienie podsiatkówkowe wyczyszczonych metodą MACS komórek prekursorowych fotoreceptorów w siatkówkę dorosłych myszy

Tutaj prezentujemy akceptowany przez społeczność protokół w formacie multimedialnym do podsiatkówkowego wstrzykiwania bolusa komórek RPE szczurom i myszom. Podejście to można wykorzystać do określenia potencjałów ratunkowych, profili bezpieczeństwa i zdolności przeżycia przeszczepionych komórek RPE po implantacji w zwierzęcych modelach zwyrodnienia siatkówki.

Wykonywanie iniekcji podsiatkówkowych u gryzoni w celu dostarczenia komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w zawiesinie

Strategie wymiany nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) i terapia oparta na genach są brane pod uwagę w przypadku kilku stanów zwyrodnieniowych siatkówki. Do translacji klinicznej wymagane są modele zwierzęce z dużymi oczami do badania technik chirurgicznych stosowanych u pacjentów. W tym miejscu przedstawiamy model królika do chirurgii podsiatkówkowej ukierunkowany na przeszczep RPE, który jest wszechstronny i opłacalny.

Protokół krok po kroku dla chirurgii podsiatkówkowej u królików

Wstrzyknięcie podsiatkówkowe jest szeroko stosowane w badaniach przedklinicznych terapii zastępczej komórkami macierzystymi w przypadku zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem. W tym zwizualizowanym artykule opisujemy mniej ryzykowną, powtarzalną i precyzyjnie zmodyfikowaną technikę wstrzykiwania podsiatkówkowego za pomocą podejścia przeztwardówkowego w celu dostarczenia komórek do oczu szczura.

Opracowanie udoskonalonego protokołu przeztwardówkowego przeszczepu podsiatkówkowego ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki do oczu szczurów

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki mogłyby służyć jako terapia zastępcza dla zaawansowanej formy suchego, związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej. Protokół ten opisuje generowanie wielkookiego modelu atrofii geograficznej i podsiatkówkowy przeszczep ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do tego modelu choroby.

Przeszczep podsiatkówkowy ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z komórek macierzystych siatkówki do wielkookiego modelu atrofii geograficznej

Prezentowana tutaj jest chirurgiczna technika przeszczepiania tkanki siatkówki pochodzącej z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) do przestrzeni podsiatkówkowej dużego modelu zwierzęcego.

Podsiatkówkowy przeszczep ludzkiej embrionalnej tkanki siatkówki pochodzącej z komórek macierzystych w modelu dużego zwierzęcia kota

Naczelny (NHP) jest idealnym modelem do badania terapii komórkowej ludzkiej siatkówki ze względu na podobieństwa anatomiczne i genetyczne. W artykule opisano metodę podplamkowego przeszczepu komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w oku NHP oraz strategie zapobiegania powikłaniom śródoperacyjnym związanym z manipulacją plamki żółtej.

Przeszczep nabłonka barwnikowego siatkówki w modelu naczelnych innych niż człowiek w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki

Ten protokół przedstawia przezźrenicowe, sterowane widzeniem podejście przeztwardówkowe do bezpiecznego i precyzyjnego dostarczania przeszczepów komórkowych podsiatkówkowych, z niskim wskaźnikiem powikłań chirurgicznych, u myszy, biorców ze zwyrodnieniem siatkówki lub bez.

Przezźrenicowe przeszczepienie przeztwardówkowe przeszczepów podsiatkówkowych w mysim modelu zwyrodnienia siatkówki

Opisujemy szczegółowy protokół przygotowania komórek progenitorowych fotoreceptorów pochodzących z kriokonserwacji hESC oraz dostarczania tych komórek do tkanki podsiatkówkowej u myszy rd10.

Podsiatkówkowe dostarczanie progenitorów fotoreceptorów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych u myszy rd10

Myszowy model transplantacji in utero jest wszechstronnym narzędziem, które może być wykorzystywane do badania potencjalnych zastosowań klinicznych transplantacji komórek macierzystych oraz terapii genowej u płodu. W niniejszym protokole przedstawiamy ogólne podejście do wykonania tej...

Model mysi transplantacji in utero

Niniejsza technika chirurgiczna przedstawia wstrzykiwanie wektorów terapii genowej oraz komórek macierzystych do przestrzeni podsiatkówkowej oka myszy.

Podsiatkówkowe wstrzykiwanie wektorów terapii genowej i komórek macierzystych do oka myszy w okresie okołodniowym

Poznaj metodę podsiatkówkowego przeszczepu komórek prekursorowych fotoreceptorów MACS do siatkówki myszy. Technika ta umożliwia badanie regeneracji siatkówki i potencjału przywracania wzroku.

Podsiatkówkowy przeszczep oczyszczonych komórek prekursorowych fotoreceptorów MACS do siatkówki dorosłej myszy

Przeglądaj więcej filmów