Name: Produkcja królików z nokautem apolipoproteiny C-III przy użyciu nukleaz palca cynkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-18T21:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Naucz się produkcji królików z nokautem apolipoproteiny C-III przy użyciu nukleaz palca cynkowego. Ta metoda umożliwia tworzenie modeli zwierzęcych do badań nad chorobami układu krążenia u ludzi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została częściowo sfinansowana z grantów z National Institutes of Health (HL105114, HL088391, NS066652, and HL068878 to Y.E.C.), American Heart Association (National Scientist Development 0835237N to J.Z.). Y.E.C. jest wspierany finansowo jako fundowany przez Fredericka Huetwella profesora medycyny sercowo-naczyniowej w University of Michigan Medical Center (UMMC). W pracach wykorzystano usługi podstawowe wspierane przez Centrum Zaawansowanych Modeli Nauk Translacyjnych i Terapii (CAMTraST) na UMMC.

Wszystkie procedury dotyczące utrzymania, opieki i użytkowania zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Uniwersytecką Komisję ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Michigan.
1. Projekt i wybór ZFN
<ol>
	<li>Należy dostarczyć producentowi informacje o sekwencji genomowej genu będącego przedmiotem zainteresowania (np. królika ApoCIII). Wybierz zestawy ZFN do eksperymentów na podstawie wyników ZFN.</li>
</ol>
2. Kolekcja zarodków królika
<ol>
	<li>Dojrzałe płciowo (6-18 miesięcy) samice królików nowozelandzkich białych (NZW) superowulować przez podskórne (s.c.) wstrzyknięcie FSH dwa razy na dobę w dawce 3 mg na pierwsze dwa wstrzyknięcia, 5 mg na następne dwa wstrzyknięcia i 6 mg na ostatnie dwa wstrzyknięcia.</li>
	<li>Podać pojedyncze wstrzyknięcie dożylne (dożylnie) 200 j.m. hCG po 72 godzinach od pierwszego wstrzyknięcia FSH w celu wywołania owulacji. Skojarzyć samice z superowulacją z samcem królika natychmiast po wstrzyknięciu hCG.</li>
	<li>Króliki dawcy z superowulacją należy poddać eutanazji pentobarbitalem sodu (150 mg/kg, dożylnie) po 16-18 godzinach od inseminacji (p.s.i.).</li>
	<li>Odzyskaj bańki jajowodu, ostrożnie zbierając całe jajowody i strukturę jajników.</li>
	<li>Przepłukać każdy jajowód 10 ml pożywki manipulacyjnej TCM 199 z buforem HEPES, uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą, wstrzykując pożywkę z końca jajowodu. Zebrać przepłukaną pożywkę w otworze jajowodu na końcu jajnika do szalki Petriego.</li>
	<li>Obserwować i identyfikować odzyskane zarodki w przepłukanej pożywce, trzykrotnie umyć zarodki w pożywce do manipulacji, przechowywać je w pożywce do manipulacji w temperaturze 38,5 °C na powietrzu i obserwować pod mikroskopem stereoskopowym pod kątem wystąpienia zapłodnienia. Przygotować do mikroiniekcji na zarodki w stadium przedjądrzastym 19-21 h p.s.i.</li>
</ol>
3. Przygotowanie mRNA ZFN
<ol>
	<li>Oczyść powstałe mRNA przed ponownym zawieszeniem w wolnym od RNAzy 0,1X TE (1 mM Tris-Cl pH 8,0, 0,1 mM EDTA). Zmierz stężenie i przechowuj mRNA w temperaturze -80°C do czasu użycia.</li>
	<li>Przygotować mRNA kodujące parę ZFN (4-10 ng/μl w 1 mMTris-Cl, 0,1 mM EDTA przy pH 7,5), podwielokrotność do 10 μl fiolek. Przechowywać je w temperaturze -80 ºC, aż będą gotowe do użycia. Przed mikrowstrzyknięciem należy rozmrozić fiolkę (fiolki) z RNA i przechowywać ją na lodzie.</li>
</ol>
4. Mikroiniekcja zarodka
<ol>
	<li>Przygotować platformę do mikroiniekcji, umieszczając kroplę 5 μl pożywki manipulacyjnej na 1-dołkowym szkiełku podstawowym, z którego usunięto komorę na pożywkę. Przykryj kroplę pożywki olejem mineralnym i umieść na podgrzewanym stoliku mikroskopu.</li>
	<li>Umieścić pipetę przytrzymującą (o średnicy 120 μm) w uchwycie mikromanipulatora i umieścić ją w kropli medium manipulacyjnego.</li>
	<li>Wytwarzanie mikropipet iniekcyjnych poprzez podgrzewanie i wyciąganie kapilar ze szkła borokrzemianowego w urządzeniu do ściągania mikropipet. Załaduj mRNA do wstrzyknięcia do pipety iniekcyjnej.</li>
	<li>Włączyć dopływ sprężonego powietrza, który jest podłączony do mikrowtryskiwacza.</li>
	<li>Umieścić pipetę iniekcyjną w uchwycie do wstrzykiwań, umieścić ją na mikromanipulatorze i umieścić w kropli medium manipulacyjnego.</li>
	<li>Ustaw mikrowtryskiwacz z następującymi sugerowanymi parametrami: holdP=2 p.s.i., InjP=20 p.s.i., ClearP= 60 p.s.i., Injtime= 1 s, co spowoduje objętość wstrzyknięcia 1-5 pl.</li>
	<li>Otwórz końcówkę pipety iniekcyjnej, delikatnie stukając nią o pipetę przytrzymującą.</li>
	<li>Przenieś zarodki (30-50) do kropli mikromanipulacji na platformie. Za pomocą pipety przytrzymującej uchwycić zarodek i wyrównać igłę do wstrzykiwań, zarodek i pipetę przytrzymującą wzdłuż osi x.</li>
	<li>W powiększeniu 400x przesunąć pipetę iniekcyjną przez zarodek. Uważaj, aby uniknąć jądra. Po przebiciu błony plazmatycznej naciśnij pedał nożny, aby wykonać wstrzyknięcie. Po wstrzyknięciu należy wyjąć igłę, uwolnić zarodek. Powtórz ten proces dla wszystkich pozostałych zarodków.</li>
	<li>Umyj wstrzyknięte zarodki trzykrotnie w pożywce do hodowli zarodków, która składa się ze zbilansowanego roztworu soli Earle'a (EBSS) uzupełnionego aminokwasami endogennymi (NEAA), aminokwasami egzogennymi (EAA), 1 mM L-glutaminy, 0,4 mM pirogronianu sodu i 10% FBS.</li>
	<li>Inkubować zarodki w temperaturze 38,5 °C w 5% CO2 w powietrzu przez 1-2 godziny, zanim zostaną chirurgicznie przeniesione do jajowodów zsynchronizowanej samicy królika NZW biorcy (patrz krok 5.1). Alternatywnie, hoduj zarodki do momentu osiągnięcia stadium blastocysty, zanim zostaną wykorzystane do walidacji in vitro lub testów.</li>
</ol>
5. Transfer zarodków
<ol>
	<li>Jako biorcę należy wybrać samicę królika NZW w wieku 5-12 miesięcy, w dobrym zdrowiu, o wadze ok. 4,0 do 5,0 kg. Hormon uwalniający gonadotropiny (GnRH) należy podać domięśniowo (i.m., 50 mcg/ml, 0,3 ml/zwierzę) biorcy w tym samym czasie, w którym wstrzykuje się hCG zwierzęciu(om) dawcy (patrz krok 2.2).</li>
	<li>Po zakończeniu mikroiniekcji należy przygotować królika biorcę do transferu zarodków (zwykle 16-24 godziny po wstrzyknięciu GnRH). Znieczulić królika 10-40 mg/kg ketaminy (domięśniowo) i/lub odparowanego izofluranu (2-4%) przez drogi oddechowe. Chroń oczy królika przed nadmiernym wysuszeniem poprzez nałożenie sterylnej maści okulistycznej. Obserwuj zwierzę aż do całkowitej utraty przytomności, tj. nie reaguje na odruchy pedałowania; Ściskanie podkładki pod stopę służy do sprawdzenia, czy nie ma odruchu pedałowania, co wskazuje na odpowiednie znieczulenie.</li>
	<li>Ogolić brzuch królika, umyć go peelingiem antyseptycznym, a następnie roztworem antyseptycznym i wytrzeć ogolony obszar sterylnymi gąbkami z gazy.</li>
	<li>Wykonaj operację w sterylnych warunkach, rejestruj parametry życiowe królika biorcy mniej więcej co 15 minut przez cały czas trwania operacji.</li>
	<li>Przenieść 10-25 zarodków do jednego zwierzęcia biorcy, w zależności od dostępnej liczby zarodków.</li>
	<li>Pod koniec zabiegów chirurgicznych należy zamknąć warstwę mięśniową powlekanym szwem wchłanialnym. Zszyć skórę szwem podskórnym za pomocą szwu wchłanialnego lub za pomocą prostych szwów przerywanych za pomocą szwów niewchłanialnych (np. nylonu monofilamentowego lub podobnego).</li>
	<li>Utrzymuj zwierzę w cieple i monitoruj je, aż do osiągnięcia pozycji mostkowej.</li>
	<li>Codziennie monitoruj zwierzę. Postępuj zgodnie z instrukcjami lekarza weterynarii, aby opiekować się zwierzęciem. Meloksykam (podp. 1,0 mg/kg) należy podawać codziennie po operacji w celu złagodzenia bólu i/lub obniżenia gorączki, jeśli lekarz weterynarii uzna to za konieczne.</li>
	<li>Niewchłanialne szwy skórne należy usunąć po około 10-14 dniach od operacji.</li>
</ol>
6. Wykrywanie zaburzeń genów wywołanych przez ZFN
<ol>
	<li>W celu walidacji in vitro należy przeprowadzić genotypowanie zarodków hodowanych in vitro. Lizować poszczególne zarodki, które rozwinęły się do stadium moruli/blastocysty w 5 μl roztworu NP40 (1% NP40 plus 1 ug/ml proteinazy K w buforze Taq) przez 0,5-1 godzinę w temperaturze 55 °C i 10 minut w temperaturze 95 °C.</li>
	<li>W celu genotypowania potomstwa należy pobrać próbki skóry uszu od noworodków, wyodrębnić genomowe DNA i użyć ich jako matryc do sekwencjonowania PCR. Po pobraniu próbek należy zastosować Kwik-Stop w miejscu pobierania próbek, aby zatrzymać krwawienie i zmniejszyć dyskomfort.</li>
	<li>Użyj lizy z kroku 6.2 lub 6.3 jako matrycy do PCR przy użyciu pary starterów LA-Taq i PCR, które znajdują się przed (5'- TGAGGCCGGGAAGGGAGCAGTCG-3') i za (5'-GCCAGGCCCACCCACACGGAACAGC-3') od miejsca docelowego ZFN.</li>
	<li>Oczyść produkty PCR i zsekwencjonuj je za pomocą startera sekwencjonującego (5'-TCTGCACGCTTGGGGCTGGAG-3').</li>
	<li>Zidentyfikuj próbki zmutowanych substancji, szukając podwójnej krzywej na diagramie sekwencji wokół miejsca docelowego. Oznacz te z podwójnymi krzywymi jako "pozytywne".</li>
	<li>Sklonuj "pozytywne" produkty PCR do wektora klonowania TA, wybierz 10-20 klonów, zsekwencjonuj wstawki i potwierdź mutacje wokół miejsca docelowego.</li>
</ol>

<ol><li>Ooi, E. M., Barrett, P. H., Chan, D. C., Watts, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+C-III%3A+understanding+an+emerging+cardiovascular+risk+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein C-III: understanding an emerging cardiovascular risk factor.</a> Clinical Science. 114, 611-624 (2008).</li>
<li>Pollin, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+null+mutation+in+human+APOC3+confers+a+favorable+plasma+lipid+profile+and+apparent+cardioprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A null mutation in human APOC3 confers a favorable plasma lipid profile and apparent cardioprotection.</a> Science. 322, 1702-1705 (2008).</li>
<li>Ginsberg, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+B+metabolism+in+subjects+with+deficiency+of+apolipoproteins+CIII+and+AI.+Evidence+that+apolipoprotein+CIII+inhibits+catabolism+of+triglyceride-rich+lipoproteins+by+lipoprotein+lipase+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein B metabolism in subjects with deficiency of apolipoproteins CIII and AI. Evidence that apolipoprotein CIII inhibits catabolism of triglyceride-rich lipoproteins by lipoprotein lipase in vivo.</a> The Journal of Clinical Investigation. 78, 1287-1295 (1986).</li>
<li>Cohn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+apoC-III+production+is+a+characteristic+feature+of+patients+with+hypertriglyceridemia%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Increased apoC-III production is a characteristic feature of patients with hypertriglyceridemia.</a> Atherosclerosis. 177, 137-145 (2004).</li>
<li>Cohn, J. S., Patterson, B. W., Uffelman, K. D., Davignon, J., Steiner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+production+of+plasma+and+very-low-density+lipoprotein+%28VLDL%29+apolipoprotein+C-III+is+strongly+related+to+the+concentration+and+level+of+production+of+VLDL+triglyceride+in+male+subjects+with+different+body+weights+and+levels+of+insulin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Rate of production of plasma and very-low-density lipoprotein (VLDL) apolipoprotein C-III is strongly related to the concentration and level of production of VLDL triglyceride in male subjects with different body weights and levels of insulin sensitivity.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 89, 3949-3955 (2004).</li>
<li>Maeda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+apolipoprotein+C-III+gene+in+mice+results+in+hypotriglyceridemia+and+protection+from+postprandial+hypertriglyceridemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the apolipoprotein C-III gene in mice results in hypotriglyceridemia and protection from postprandial hypertriglyceridemia.</a> The Journal of Biological Chemistry. 269, 23610-23616 (1994).</li>
<li>Jong, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+C-III+deficiency+accelerates+triglyceride+hydrolysis+by+lipoprotein+lipase+in+wild-type+and+apoE+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein C-III deficiency accelerates triglyceride hydrolysis by lipoprotein lipase in wild-type and apoE knockout mice.</a> Journal of Lipid Research. 42, 1578-1585 (2001).</li>
<li>James, J. F., Hewett, T. E., Robbins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+physiology+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac physiology in transgenic mice.</a> Circ. Res. 82, 407-415 (1998).</li>
<li>Duranthon, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+emerging+role+of+rabbit+as+human+disease+model+and+the+instrumental+role+of+novel+transgenic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">On the emerging role of rabbit as human disease model and the instrumental role of novel transgenic tools.</a> Transgenic Research. 21, 699-713 (2012).</li>
<li>Fan, J., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+rabbits+as+therapeutic+protein+bioreactors+and+human+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Transgenic rabbits as therapeutic protein bioreactors and human disease models.</a> Pharmacol. Ther. 99, 261-282 (2003).</li>
<li>Shiomi, M., Ito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Watanabe+heritable+hyperlipidemic+%28WHHL%29+rabbit%2C+its+characteristics+and+history+of+development%3A+a+tribute+to+the+late+Dr.+Yoshio+Watanabe%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">The Watanabe heritable hyperlipidemic (WHHL) rabbit, its characteristics and history of development: a tribute to the late Dr. Yoshio Watanabe.</a> Atherosclerosis. 207, 1-7 (2009).</li>
<li>Morehouse, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+CETP+activity+by+torcetrapib+reduces+susceptibility+to+diet-induced+atherosclerosis+in+New+Zealand+White+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Inhibition of CETP activity by torcetrapib reduces susceptibility to diet-induced atherosclerosis in New Zealand White rabbits.</a> Journal of Lipid Research. 48, 1263-1272 (2007).</li>
<li>Getz, G. S., Reardon, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Animal models of atherosclerosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32, 1104-1115 (2012).</li>
<li>Carlson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+TALEN-mediated+gene+knockout+in+livestock%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).</li>
<li>Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+editing+of+bacterial+genomes+using+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems.</a> Nature Biotechnology. 31, 233-239 (2013).</li>
<li>Petersen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+%27molecular+scissors%27+for+transgenic+farm+animal+production%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility%2C+and+Development%22%5BJournal%5D)">Update on 'molecular scissors' for transgenic farm animal production.</a> Reproduction, Fertility, and Development. 25, 317-318 (2012).</li>
<li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+PPARgamma+mono-allelic+knockout+pigs+via+zinc-finger+nucleases+and+nuclear+transfer+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Generation of PPARgamma mono-allelic knockout pigs via zinc-finger nucleases and nuclear transfer cloning.</a> Cell Research. 21, 979-982 (1038).</li>
<li>Flisikowska, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+immunoglobulin+gene+disruption+and+targeted+replacement+in+rabbit+using+zinc+finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient immunoglobulin gene disruption and targeted replacement in rabbit using zinc finger nucleases.</a> PLoS ONE. 6, e21045(2011).</li>
<li>Foley, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+zebrafish+using+customized+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in zebrafish using customized zinc-finger nucleases.</a> Nature Protocols. 4, 1855-1867 (2009).</li>
<li>Carbery, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+modification+in+mice+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 186, 451-459 (2010).</li>
<li>Mashimo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+knockout+rats+with+X-linked+severe+combined+immunodeficiency+%28X-SCID%29+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Generation of knockout rats with X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) using zinc-finger nucleases.</a> PLoS ONE. 5, e8870(2010).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertriglyceridemia+and+delayed+clearance+of+fat+load+in+transgenic+rabbits+expressing+human+apolipoprotein+CIII%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Hypertriglyceridemia and delayed clearance of fat load in transgenic rabbits expressing human apolipoprotein CIII.</a> Transgenic Research. 20, 867-875 (2011).</li>
<li>Hauschild, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+a+biallelic+knockout+in+pigs+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of a biallelic knockout in pigs using zinc-finger nucleases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 12013-12017 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszej pracy, przy użyciu technologii ZFN, wygenerowano pięć królików ApoCIII KO. Wcześniej jedyny raport dotyczący produkcji królików GTT również wykorzystywał technologię ZFN18. Niniejsza praca potwierdziła, że ZFN jest użyteczna do efektywnego celowania w geny u królików.
W niniejszym badaniu odsetek transgeniczności (pozytywne zestawy/wszystkie urodzone) wyniósł 23,8% (5/21), co jest porównywalne z poprzednim raportem dotyczącym ZFN u królików (30,8%, 16/52)18 oraz wynikami zgłaszanymi przy użyciu ZFN u innych gatunków zwierząt, w tym u danio-pręgowanych19, myszy20, szczurów21 i świń17. W rzeczywistości odsetek ten jest wyższy niż w wielu konwencjonalnych badaniach nad produkcją królików transgenicznych, gdzie zazwyczaj mieści się on w zakresie 5-20%. Na przykład w próbie uzyskania transgenicznych królików ApoCIII poprzez konwencjonalną mikroiniekcję DNA, Ding et al. otrzymali 3 pozytywne osobniki założycielskie spośród 54 urodzonych młodych (5,6%)22.
Zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami, mutacje w miejscach celowania są zmienne i obejmują delecje lub insercje składające się z różnej liczby zasad (od 1-21 u pięciu królików KO). Na podstawie informacji o konkretnych sekwencjach zwierząt założycielskich przewiduje się, że co najmniej cztery z nich (i.e. te z mutacjami Δ1, +1, +1 lub Δ20) wykażą utratę funkcji ApoCIII. Zwierzę R-16 z mutacją Δ21 może nie wykazywać utraty funkcjonalności, ponieważ przewiduje się, że mutacja ta spowoduje jedynie utratę siedmiu aminokwasów, a nie przesunięcie ramki odczytu. Ostatecznie niezbędne są testy fenotypowe, aby ustalić, czy zwierzęta założycielskie rzeczywiście wykazują utratę funkcji ApoCIII.
Żaden z pięciu królików KO wygenerowanych w niniejszym badaniu nie posiada modyfikacji biallelicznych. Co ciekawe, tak samo było w przypadku poprzedniego raportu dotyczącego królików ZFN. W przeciwieństwie do tego, gdy zastosowano ZFN celujące w α1,3-galaktozylotransferazę w komórkach świńskich, częstotliwość celowania w pojedynczy allel wynosiła od 7 do 46%, przy czym około jedna trzecia mutacji tworzyła jednostopniowe nokauty bialleliczne 23. Zgodnie z tym, gdy zastosowano TALEN w komórkach fibroblastów świńskich, modyfikacje bialleliczne stwierdzono w około 15-40% wszystkich pozytywnych klonów14. Możliwe, że brak możliwości wygenerowania biallelicznych królików KO w niniejszym badaniu może wskazywać na różnice międzygatunkowe (i.e. króliki vs. świnie) w zakresie takiej wydajności celowania genowego opartego na nukleazach. Bardziej prawdopodobne jest jednak, że wynika to po prostu z faktu, iż liczba królików KO wygenerowanych w tym projekcie jest stosunkowo niewielka. Uważamy, że ZFN jest w stanie generować mutacje bialleliczne u królików, co powinno być rozważane jako kolejna potencjalna zaleta produkcji królików GTT w oparciu o ZFN. W celu potwierdzenia takiej zdolności ZFN u królików niezbędne są dalsze eksperymenty.
Podsumowując, niniejsza praca wykazuje, że podejście do celowania w geny oparte na ZFN jest skuteczne w tworzeniu królików KO. W szczególności wygenerowaliśmy pięć królików ApoCIII KO z satysfakcjonującą stopą transgenizacji wynoszącą 23,8%. Przewiduje się, że zwierzęta te dostarczą bardziej istotnych informacji na temat roli tego białka w metabolizmie lipidów u ludzi niż odpowiadające im modele mysie. Przewidujemy, że celowanie w geny oparte na ZFN, a także inne technologie oparte na nukleazach, takie jak TALEN i RGEN, u zwierząt niemysich znacząco ułatwią opracowanie nowych modeli zwierzęcych do badania różnych ludzkich chorób.
<img alt="Schemat procesu edycji genów z użyciem ZFN; mikroiniekcja, walidacja embrionów, etapy genotypowania." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig1.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat produkcji królików z nokautem genowym przy użyciu technologii ZFN. Produkcja królików KO przy użyciu technologii ZFN rozpoczyna się od wyboru interesującego genu. Po dostarczeniu informacji o sekwencji projektowane są zestawy ZFN, które następnie poddawane są wewnętrznej walidacji w drożdżach. W punkcie kontrolnym 1 (CP-1) użytkownikom do wyboru zostaną udostępnione tylko te zestawy, które przeszły walidację wewnętrzną (50% lub więcej w stosunku do wewnętrznej kontroli pozytywnej). Jeśli żadne zestawy nie przejdą CP-1, do zaprojektowania skutecznych zestawów ZFN może być potrzebna dodatkowa sekwencja. Następnie przeprowadza się walidację embrionów in vitro, aby upewnić się, że wybrany zestaw ZFN może indukować mutacje w wybranych miejscach (CP-2). Zestawy ZFN zostaną wykorzystane tylko wtedy, gdy przejdą CP-2 (wskaźniki mutacji >=10% w embrionach in vitro). Niepowodzenie w CP-2 będzie wymagało ponownego zaprojektowania zestawów ZFN. Przygotowane zostaną dawcy embrionów, a embriony w stadium pronukleusowym zostaną poddane mikroiniekcji zwalidowanych zestawów ZFN. Mikroiniekcyjne embriony zostaną przeniesione do zsynchronizowanych biorców. Po miesięcznym okresie ciąży noworodki zostaną poddane genotypowaniu (CP-3). Jeśli żadne z noworodków nie będą pozytywne, wykonana zostanie dodatkowa mikroiniekcja. Od rozpoczęcia projektu do etapu CP-2 mija 2-3 miesiące, zakładając brak błędów w procesie. Od CP-2 do CP-3 mija dodatkowe 2-3 miesiące. Zatem przy użyciu technologii ZFN możliwe jest wytworzenie królika z nokautem genowym w czasie od 4 do 6 miesięcy. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Schemat edycji genów z miejscami wiązania ZFN, strukturą eksonów i tabelą analizy wyników aktywności." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig2.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Projekt ZFN. Zaprojektowano trzy zestawy ZFN (Zestaw 1, 2 i 3) celujące w różne sekwencje w eksonie 1 lub eksonie 2 genu ApoCIII królika (A). Wszystkie trzy zestawy poddano testowi reporterowemu MEL-1 w drożdżach w celu określenia aktywności ZFN. Zgodnie z protokołami producenta, ZFN wykazujące aktywność &gt;50% w stosunku do wewnętrznej kontroli pozytywnej producenta są uważane za użyteczne w eksperymentach edycji genomu in vitro i in vivo. Aktywność ZFN wyniosła 224,2% dla Zestawu 1, 196,9% dla Zestawu 2 oraz 177,8% dla Zestawu 3 (B), w związku z czym w niniejszym badaniu wybrano Zestaw 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Edycja genów ZFN; tabela danych o mutacjach i dopasowanie sekwencji; analiza DNA dla badania naukowego." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig3.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. In vitro walidacja ZFN w embrionach. mRNA (5 μg/ml) z zestawu Set 1 wstrzyknięto do cytoplazmy 35 embrionów królika w stadium pronuklearnym (A). Jako grupę kontrolną wykorzystano wypłukane embriony bez mikroiniekcji (n=31). Odsetek rozwoju BL w grupie kontrolnej wyniósł 77,4%. W grupie poddanej mikroiniekcji odsetek BL wyniósł 51,4%. Spośród 16 BL poddanych sekwencjonowaniu PCR, 8 (50%) zidentyfikowano jako pozytywne, co wskazuje, że Set 1 jest skutecznym zestawem ZFN indukującym mutacje w miejscu celowania (B, apoc3wt.seq, zaznaczone czarną ramką) genu ApoCIII u królików. BL zawierające mutacje to BL#apoc-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15 i 17 (B, podkreślone na czerwono). Pozostałe BL (#apoc-2, 6, 9, 10, 12, 14 i 16) nie posiadają mutacji w miejscu celowania. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz</a>.
<img alt="Wyniki edycji genów za pomocą nukleazy z palcem cynkowym (ZFN); tabela przeniesionych zarodków i wykres analizy sekwencji DNA." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50957/50957fig4.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Produkcja królików KO ApoCIII. Sto czterdzieści pięć zarodków po mikroiniekcji mRNA ZFN Set 1 przeniesiono do 7 pseudaciąży królików biorców (A). Świeżo wypłukane zarodki (n=75) bez mikroiniekcji ZFN przeniesiono do biorców (n=6) jako grupę kontrolną. Odsetek urodzeń pełnoterminowych obliczony jako całkowita liczba miotów pełnoterminowych / całkowita liczba zarodków w grupie eksperymentalnej wynosi 14,5% (21/145), podczas gdy w grupie kontrolnej wskaźnik ten wynosi 29,3% (22/75) (A). Z 21 miotów urodzonych w grupie po mikroiniekcji pięć (R1, R9, R11, R12 i R16) zidentyfikowano jako pozytywne mioty KO po sekwencjonowaniu PCR (B). Indele w miejscu celowania obejmują dwie insercje (+1 dla R9 i R11) oraz trzy delecje (Δ1, Δ 20, Δ 21 odpowiednio dla R1, R12 i R16). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50957/50957fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz</a>.

Apolipoproteina (Apo) C-III (ApoCIII) to małe O-glikozylowane białko wydzielnicze, które jest syntetyzowane głównie w wątrobie i jelicie. Znajduje się na powierzchni chylomikronu osocza (CM), lipoprotein o bardzo niskiej gęstości (VLDL) i lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL). ApoCIII został uznany za czynnik ryzyka chorób sercowo-naczyniowych1. Pacjenci z dziedzicznym niedoborem ApoCIII mają niski poziom trójglicerydów (TG) w osoczu i zmniejszoną subkliniczną miażdżycę tętnic wieńcowych2,3 . Z drugiej strony podwyższony poziom ApoCIII w osoczu często koreluje z insulinoopornością, otyłością i hipertriglicerydemią (HTG)4,5 .
Nokaut genowy (KO) to potężny sposób na badanie funkcji genu. Zgodnie z obserwacjami w populacjach zmutowanych ludzi, nokaut genu ApoCIII u myszy doprowadził do zmniejszenia TG w osoczu i ochrony przed poposiłkowym HTG6. Tak pozytywna rola ApoCIII wydaje się być niezależna od Apolipoproteiny E (ApoE), ponieważ myszy z niedoborem zarówno ApoE, jak i ApoCIII są również chronione przed hiperlipidemiąpoposiłkową 7. Chociaż te mysie modele ApoCIII KO dostarczyły bezcennych informacji na temat możliwych funkcji ApoCIII u ludzi, należy zauważyć, że metabolizm lipoprotein myszy różni się od metabolizmu ludzi w wielu aspektach. Na przykład myszy nie ma białka przenoszącego ester cholesterolu w osoczu (CETP), głównego enzymu biorącego udział w transporcie VLDL, LDL i HDL8. W związku z tym konieczne jest opracowanie odpowiedniego modelu zwierzęcego, aby lepiej zrozumieć fizjologiczną rolę ApoCIII in vivo.
Królik to klasyczny model gatunku zwierząt9-11. Ma krótki okres ciąży (30-31 dni), dużą wielkość miotu (4-12 na miot) i może być wygodnie trzymany w pomieszczeniu. W porównaniu z myszami, króliki są filogenetycznie bliższe ludziom10. Co ważne, podobnie jak ludzie, ale w przeciwieństwie do myszy, króliki są ssakami bogatymi w LDL i mają znaczny poziom CETP10,12 . Ponadto są podatne na miażdżycę tętnic wywołaną dietą bogatą w cholesterol ze zmianami podobnymi do tych obserwowanych w ludzkiej miażdżycy13. Z tych powodów postawiliśmy hipotezę, że króliki ApoCIII KO mogą służyć jako lepszy model niż ich mysie odpowiedniki do badania ról ApoCIIIplay w metabolizmie lipidów i miażdżycy u ludzi.
Produkcja genowo ukierunkowanych królików transgenicznych (GTT) była wyzwaniem. Wynika to głównie z braku embrionalnych komórek macierzystych przekazujących linię zarodkową (ESC) oraz wyjątkowo niskiej skuteczności transferu jądra komórki somatycznej (SCNT) u królików. ESC jest podstawowym narzędziem do generowania myszy GTT, podczas gdy SCNT został z powodzeniem zastosowany do generowania zwierząt KO u gatunków pozbawionych ESC przenoszących linię zarodkową, w tym świń, owiec i bydła, ale nie królików. Ostatnio nukleaza palca cynkowego (ZFN), nukleaza efektorowa podobna do aktywatora transkrypcji (TALEN)14 i endonukleaza sterowana RNA (RGEN)15okazały się potężnymi środkami do edycji genomu. Te nukleazy, tak zwane "nożyczki molekularne", są skuteczne w generowaniu pęknięć dwuniciowych (DSB) w genomie, które mogą prowadzić do funkcjonalnego KO docelowego genu lub wykorzystywane do integracji sekwencji DNA w określonym miejscu w genomie u wielu gatunków16. W 2011 roku, jako jedni z pierwszych adaptatorów technologii ZFN, wygenerowaliśmy komórki świń KO aktywowane proliferatorami peroksysomów (PPARγ) KO za pomocą tego podejścia i z powodzeniem wygenerowaliśmy świnie PPARγ KO po użyciu tych komórek do SCNT17. W tym samym roku stwierdzono skuteczne rozrywanie genów immunoglobulin i celowaną ich zastępstwo u królików również stosującychZFN18.
W obecnym badaniu, pięć królików ApoCIII KO zostało wygenerowanych, co zostało potwierdzone przez sekwencjonowanie PCR, przy użyciu ZFN Set 1 (patrz Rysunek 1. dla ilustracji schematu blokowego). Zwierzęta te są nowymi zasobami do badania roli ApoCIII w metabolizmie lipidów.

<table><tbody><tr><td>APOC3-ZFN</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CSTZFNY-1KT</td><td>Gen docelowy: APOC3, Numer partii: 12201118MN</td></tr><tr><td>Zestaw mMESSAGE</td><td>Zestaw Invitrogen</td><td>AM1344M</td><td>synteza mRNA</td></tr><tr><td>MEGAclear Kit&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM1908M</td><td>oczyszczanie mRNA Hormon</td></tr><tr><td>folikulotropowy</td><td>Bioniche Life</td><td>Sciences Folltropin-V</td><td>Leczenie królików dawców zarodków</td></tr><tr><td>Ludzka gonadotropina kosmówkowa</td><td>Intervet</td><td>Chorulon</td><td>Leczenie królików dawców zarodków</td></tr><tr><td>Hormon uwalniający gonadotropiny</td><td>Prospecbio</td><td>HOR-255</td><td>Leczenie królików biorców zarodków</td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Earle'a (EBSS)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30029.02</td><td>Hodowla zarodków, podłoże</td></tr><tr><td>bazowe MEM (aminokwas endogenny)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7145</td><td>Hodowla zarodków, suplementy</td></tr><tr><td>Roztwór aminokwasów BME</td><td>Sigma</td><td>Aldrich B6766</td><td>Hodowla zarodków, suplementy</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-149</td><td>Hodowla zarodków, suplementy</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>Hodowla zarodków, suplementy</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Sigma Aldrich</td><td>12003C</td><td>Hodowla zarodków, suplementy</td></tr><tr><td>HEPES buforowane TCM 199&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12350039</td><td>Pożywka do manipulacji zarodkami</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Eppendorf</td><td>Galaxy 170</td><td>Sprzęt do hodowli zarodków</td></tr><tr><td>Mikromanipulator&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>TransferMan NK 2</td><td>Sprzęt do manipulacji zarodkami</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments Inc.</td><td>P-1000</td><td>Sprzęt do manipulacji zarodkami</td></tr><tr><td>Mikroiniektor&nbsp;</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-D</td><td>Sprzęt do manipulacji zarodkami</td></tr><tr><td>Rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowego&nbsp;</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne, Inc.</td><td>TW100F-6</td><td>Zaopatrzenie do manipulacji zarodkami</td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbitol sodu)</td> <td>Virbac AH, Inc.</td><td>ANADA#200-071</td><td>Eutanazja zarodków królików-dawców</td></tr></tbody></table>

produkcja królików z nokautem apolipoproteiny c-iii przy użyciu nukleaz palca cynkowego

Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases

Apolipoproteina (Apo) C-III (ApoCIII) znajduje się na powierzchni lipoprotein o bardzo niskiej gęstości (CM), lipoprotein o bardzo niskiej gęstości (VLDL) i lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL). Stwierdzono, że wysoki poziom ApoCIII w osoczu stanowi czynnik ryzyka chorób sercowo-naczyniowych (CVD). Podwyższony poziom ApoCIII w osoczu często koreluje z insulinoopornością, otyłością i hipertriglicerydemią. Bezcenną wiedzę na temat roli ApoCIII w metabolizmie lipidów i CVD uzyskano z transgenicznych modeli mysich, w tym myszy z nokautem ApoCIII (KO); Należy jednak zauważyć, że metabolizm lipoprotein u myszy różni się od metabolizmu ludzi pod wieloma względami. Do tej pory nie wiadomo, czy podwyższone stężenie ApoCIII w osoczu ma bezpośrednie działanie miażdżycowe. W niniejszym badaniu pracowaliśmy nad opracowaniem królików ApoCIII KO w oparciu o hipotezę, że króliki mogą służyć jako rozsądny model do badania metabolizmu lipidów i miażdżycy u ludzi. Zestawy nukleazy palca cynkowego (ZFN) ukierunkowane na króliczy gen ApoCIII poddano walidacji in vitro przed mikroiniekcją zarodka. MRNA wstrzyknięto do cytoplazmy 35 króliczych zarodków w stadium przedjądrowym i oceniono tempo mutacji w stanie blastocysty. Spośród szesnastu blastocyst, które poddano testom, osiągnięto zadowalający 50% wskaźnik mutacji (8/16) w miejscu docelowym, co przemawia za zastosowaniem zestawu 1 w eksperymentach in vivo. Następnie wykonaliśmy mikroiniekcję 145 zarodków z mRNA Set 1 i przenieśliśmy te zarodki do 7 królików biorców. Po 30 dniach ciąży urodziło się 21 kociąt, z których pięć zostało potwierdzonych jako króliki ApoCIII KO po testach sekwencjonowania PCR. Odsetek zwierząt KO (#KO młodych/łączną liczbę urodzeń) wyniósł 23,8%. Ogólna wydajność produkcji wynosi 3,4% (5 zestawów/145 przetransferowanych zarodków). Przedstawione prace wykazały, że ZFN jest wysoce wydajną metodą produkcji królików KO. Te króliki ApoCIII KO są nowymi zasobami do badania roli ApoCIII w metabolizmie lipidów.

Walidacja par ZFN in vitro 
Początkowo zaprojektowano szesnaście par ZFN. Ukierunkowana sekwencja rozerwania zestawu 1 znajduje się w eksonie 2 królika ApoCIII (ryc. 2A). Wybrano trzy pary (zestaw 1, 2 i 3, rysunek 2A) i poddano je testowi reporterowemu drożdży MEL-1 w celu określenia aktywności ZFN (figura 2B). Zestaw 1 ma wynik ZFN wynoszący 224,2%, wyższy niż w przypadku zestawu 2 (196,9%) i zestawu 3 (177,8%) oraz znacznie wyższy niż próg selekcji (tj. 50% wewnętrznej kontroli dodatniej). W związku z tym zestaw 1 został wybrany do eksperymentów walidacyjnych in vitro.
Konkretny zestaw musi skutkować dodatnim wskaźnikiem u zarodków wynoszącym 10% lub wyższym, aby przejść walidację zarodków in vitro, w oparciu o wewnętrzne kryteria walidacji. mRNA (5 μg / ml) z zestawu 1 zostało mikrowstrzyknięte do cytoplazmy 35 zarodków królika w stadium przedjądrowym (ryc. 3A). Jako grupę kontrolną wykorzystano zarodki wypłukane bez leczenia mikroiniekcją (n=31). Osiemnaście zarodków z grupy mikrowstrzykniętych rozwinęło się do stadium BL na D5, z których szesnaście zostało zsekwencjonowanych, a osiem (BL#apoc-3, 4, 5, 7, 11, 13, 15, 17, Figura 3B, podkreślone na czerwono) wykazywało zmutowane sekwencje w miejscu docelowym (czarne pole, Figura 2B, górny rząd, apoC3wt.seq). Odsetek BL w grupie mikroiniekcji (51,4%) jest niższy niż w grupie kontrolnej (77,4%), co wskazuje na nieznacznie upośledzoną kompetencję rozwojową zarodków z mikrowstrzyknięciem. Wskaźnik pozytywnych mutacji zarodków z mikrowstrzykniętymi zarodkami wynosi 50,0% (8/16), znacznie więcej niż próg selekcji (tj. 10%). Wyniki te ujawniły, że zestaw 1 jest skutecznym zestawem ZFN do indukowania mutacji w miejscu docelowym królika ApoCIII. W związku z tym do produkcji in vivo królików ApoCIII KO wybrano Zestaw 1.
Produkcja królików ApoCIII KO 
mRNA ZFN Set 1 zostało mikrowstrzyknięte do cytoplazmy zarodków w stadium przedjądrowym królika i przeniesione 145 mikrowstrzykniętych zarodków do 7 królików biorców w pseudociąży (Figura 4A). Świeżo wypłukane zarodki (n=75) bez mikroiniekcji ZFN przeniesiono do biorców (n=6) jako grupę kontrolną. Po 30 dniach ciąży w grupie mikroiniekcji urodziło się 21 kociąt. Sekwencjonowanie PCR zidentyfikowało pięć (apoC3-R1, R9, R11, R12 i R16) jako dodatnie zestawy KO (Figura 4B). Odsetek terminów liczony jako łączna liczba donoszonych kociąt/całkowita liczba zarodków wynosi 14,5% (21/145), podczas gdy w grupie kontrolnej wynosi 29,3% (22/75). Wskaźnik KO liczony jako suma zestawów KO na łączny termin wynosi 23,8% (5/21). Jeden zestaw KO (apoC-R16) zmarł pięć dni po porodzie (20,0%, 1/5). Indelsat w miejscu docelowym zawiera dwie insercje i trzy delecje; są to odpowiednio Δ1, +1, +1, Δ20 i Δ21 dla królików # R1, R9, R11, R12 i R16 (rysunek 4B).
Analiza bioinformatyczna została użyta do zidentyfikowania potencjalnych niezgodności ZFN z 7 lub mniej niezgodnościami z sekwencją Zestawu 1, jak opisano wcześniej17. Tylko jedno przewidywane możliwe miejsce poza celem, zlokalizowane na chromosomie 14, zostało zidentyfikowane z 7 niedopasowanymi bps. Test PCR nie wykrył żadnych zdarzeń niedocelowych u żadnego ze zwierząt założycielskich.

Niedawny rozwój narzędzi do celowania w geny umożliwia produkcję królików nokautujących (KO). W niniejszej pracy wygenerowaliśmy pięć królików Apolipoproteiny (Apo) C-III KO przy użyciu nukleaz palca cynkowego (ZFN). Prace te wykazały, że ZFN jest wysoce wydajną metodą produkcji królików KO.

Produkcja królików z nokautem apolipoproteiny C-III przy użyciu nukleaz palca cynkowego

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) resides on the surface of plasma chylomicron (CM), very low density lipoprotein (VLDL) and high density lipoproteins ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie nowych modeli króliczych do badania ludzkich chorób układu sercowo-naczyniowego. Jest to realizowane poprzez wstępne zaprojektowanie i syntezę nukleaz z motywem palca cynkowego, które celują w wybrany gen. Drugim krokiem procedury jest mikroiniekcja RNA ZFN do cytoplazmy embrionów w stadium pronukleusowym.Trzecim krokiem jest chirurgiczne przeniesienie embrionów do królika biorcy. Ostatnim etapem jest genotypowanie noworodków w celu zidentyfikowania zwierząt transgenicznych. Ogólnie rzecz biorąc, celowane modyfikowanie genów za pomocą ZFN jest bardzo skuteczne, co zostało tutaj zademonstrowane poprzez stworzenie królika z nokautem genu A OC three.Technika ta stanowi kamień milowy w inżynierii genetycznej, będąc pierwszą metodą umożliwiającą wytworzenie królika bez konkretnego genu (no-code rabbit). Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię wielu ludzkich schorzeń, takich jak choroby układu sercowo-naczyniowego. Coraz częściej uświadamia się, że modele dużych zwierząt są niezbędne do lepszego odwzorowania fizjologii i patologii człowieka.Pomysł na tę metodę pojawił się u nas po przeczytaniu artykułu z 2009 roku, w którym opisano skuteczne celowanie w geny z wykorzystaniem nukleazy w organizmach czerwonych. Zazwyczaj osoby znające tę metodę spodziewają się trudności, ponieważ wiąże się ona z mikroiniekcją konstruktu do cytoplazmy. Choć metoda ta może dostarczyć cennych informacji na temat celowania w geny u królików, można ją również zastosować w innych systemach, na przykład u świń.Rozpocznij od dojrzałych płciowo królików białych nowozelandzkich, u których wywołano superowulację poprzez podskórne wstrzyknięcie FSH dwa razy dziennie przez trzy dni, zwiększając codziennie dawkę. 72 godziny po ostatnim wstrzyknięciu FSH podaj dożylnie 200 IU HCG, aby wywołać owulację u każdej z superowulowanych samic. W tym samym czasie należy przygotować zwierzę biorcę.Od 16 do 18 godzin po inseminacji uśmierć superowulowane króliki dawców za pomocą pentobarbitalu sodowego. Pozyskaj rogi macicy, ostrożnie wycinając całą macicę. Wraz ze strukturą jajników wypłucz każdy róg macicy 10 mililitrami medium do manipulacji, wstrzykując medium od strony trzonu macicy.Zebraną po wypłukaniu pożywkę z końca jajnika UCT należy przelać do szalki Petriego. Odzyskane embriony znajdują się w wypłukanej pożywce. Następnie embriony należy przemyć trzykrotnie pożywką manipulacyjną.Następnie inkubować zarodki w medium do manipulacji w temperaturze 38,5 °C w normalnym powietrzu. Od 19 do 21 godzin po inseminacji wyselekcjonować zarodki za pomocą stereomikroskopu.Zabierz około 30 embrionów w stadium pronuklearnym dla każdego wariantu iniekcji; należy spodziewać się od 30 do 40 takich embrionów od jednej samicy poddanej superowulacji. Z wyprzedzeniem zamów zestawy ZFN dla interesującego genu od producenta.Wybór tych z najlepszymi wynikami ZFN. W tym przykładzie genem zainteresowania jest A OC trzy. Aby przygotować mRNA ZFN, najpierw przeprowadź transkrypcję posłańca RNA ZFN in vitro, a następnie przeprowadź poliadenylację transkryptyów.Następnie oczyść otrzymiane mRNA i zawieś je w buforze RNA spree 0.1 xte E. Po tym zmierz stężenie RNA za pomocą spektrofotometru i przygotuj alikwoty mRNA kodujących pary ZFN w stężeniu od 4 do 10 ng/µL w fiolkach o pojemności 10 µL do przechowywania. Rozpocznij od podgrzania stolika do mikroiniekcji do 38 °C.Aby przygotować platformę do mikroiniekcji, najpierw należy wyjąć komorę z pożywką z szkiełka z jedną komorą, następnie nanieść na szkiełko kroplę medium do manipulacji o objętości 5 µL i przykryć ją olejem mineralnym. Przygotowane szkiełko należy umieścić na podgrzewanym stoliku mikroskopu.Następnie przymocuj pipetę podtrzymującą o średnicy 120 micron do mikromanipulatora i umieść ją w kropli pożywki na platformie. Teraz rozmroź na lodzie mRNA przeznaczone do iniekcji. Napełnij nimi pipetę iniekcyjną, wykonaną z kapilary ze szkła borokrzemowego przy użyciu wyciągarki do mikropipet.Następnie włącz dopływ sprężonego powietrza podłączony do mikroinjektora. Potem zamocuj pipetę do wstrzykiwania w jej uchwycie, a następnie przymocuj go do drugiego mikromanipulatora. Umieść tę pipetę również w kropli pożywki.Następnie skonfiguruj mikroinżektor na objętość wstrzykiwania od 1 do 5 picoliters. Aby otworzyć końcówkę pipety iniekcyjnej, delikatnie uderz nią o pipetę trzymającą.Za pomocą szklanej pipety przenieś od 30 do 50 embrionów do urządzenia do mikromanipulacji. Umieść je na platformie. Następnie ustaw powiększenie 100 x.Użyj pipety holdingowej, aby uchwycić embrion. Pod powiększeniem 400 x ustaw pipetę holdingową i embrion w jednej osi z igłą do iniekcji. Wprowadź pipetę do iniekcji w głąb embrionu.Należy uważać, aby nie uszkodzić jądra komórkowego. Po przebiciu błony plazmatycznej należy nacisnąć pedał, aby wstrzyknąć mRNA; po zakończeniu iniekcji należy wycofać igłę i zwolnić embrion. Powtórzyć ten proces dla wszystkich pozostałych embrionów.Po zakończeniu wszystkich iniekcji, przemyj zarodki trzykrotnie w pożywce do hodowli zarodków, przez 30 sekund podczas każdego płukania. Następnie inkubuj zarodki w temperaturze 38.5 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2 przez jedną do dwóch godzin przed przeniesieniem zarodków do zsynchronizowanej biorczyni.Samica królika. Aby hodować zarodki do stadium blastocysty, inkubator musi posiadać nawilżone powietrze. Należy wybrać zdrową samicę królika rasy NZW w wieku od 5 do 12 miesięcy, o masie ciała od 4 do 5 kg.Przygotuj samicę jako zwierzę biorcę, podając najpierw wewnątrzmięśniowo hormon uwalniający gonadotropiny. Od 16 do 24 godzin po wstrzyknięciu hormonu zanieść królika ketaminą i/lub odparowanym izofluranem. Gdy królik straci całkowicie przytomność, nie będzie wykazywał odruchów stóp.Przed operacją, po uciśnięciu poduszki stopy, należy zabezpieczyć oczy maścią oftalmiczną i przygotować brzuch. W trakcie operacji należy monitorować parametry życiowe królika. Co 15 minut należy wykonać nacięcie skóry o długości około 2,5 centymetra, a następnie nacięcie wzdłuż warstwy mięśniowej.Wyprowadź każdy jajnik wraz z przyległym rogiem macicy, trzymając jajnik między kciukiem a palcem wskazującym. Przenieś embriony do jajowodu za pomocą ostrożnie wprowadzonej sterylnej pipety. Zazwyczaj od 10 do 25 z każdych 30 wstrzykniętych embrionów jest żywotnych i wszystkie mogą zostać przeniesione do jednego biorcy.Zakończ operację, zamykając warstwę mięśniową za pomocą powlekanej nici wchłanialnej. Zaszyj skórę, stosując albo wchłanialny szew śródskórny, albo proste szwy przerywane nicią niewchłanialną. Następnie zapewnij zwierzęciu ciepło i monitoruj jego stan do momentu pełnego wybudzenia.Uzyskano osobników recesywnych. Początkowo zaprojektowano 16 par ZFN. Docelowa sekwencja przerwania dla pierwszego zestawu znajduje się w eksonie dwa z trzech zestawów OC.Zestawy jeden, dwa i trzy wybrano i poddano analizie reporterowej MEL w drożdżach w celu określenia aktywności ZFN. Zestaw jeden uzyskał wynik ZFN o 224,2% wyższy niż zestawy dwa i trzy oraz znacznie wyższy niż próg selekcji, który wynosi 50% wewnętrznej kontroli pozytywnej. W związku z tym zestaw jeden wybrano do eksperymentów walidacyjnych in vitro; mRNA z zestawu jeden wstrzyknięto metodą mikroiniekcji do 35 embrionów królika.Wskaźnik BL w grupie mikroiniekcyjnej wydawał się niższy w porównaniu z grupą, w której nie przeprowadzono mikroiniekcji, co wskazuje na nieco upośledzoną zdolność rozwojową. W piątym dniu 18 embrionów z grupy mikroiniekcyjnej rozwinęło się do stadium BL, z czego 16 zostało poddanych sekwencjonowaniu. Częstotliwość występowania czterech mutacji w miejscu docelowym była znacznie wyższa niż próg selekcji, co wykazało, że pierwsza para ZFN była skuteczna. Łącznie przebadano 145 embrionów.Zarodki mikroiniekcyjne z pierwszym zestawem mRNA ZFN przeniesiono do siedmiu pseudociążnych królików biorców. W ramach grupy kontrolnej, po 30 dniach okresu inkubacji, do biorców przeniesiono świeżo przepłukane embriony bez mikroiniekcji ZFN. W grupie mikroiniekcyjnej urodziło się 21 młodych.Sekwencjonowanie PCR zidentyfikowało pięć osobników jako pozytywne nokauty. Indele w miejscu docelowym obejmowały dwie insercje i trzy delecje. Analizę bioinformatyczną wykorzystano do identyfikacji potencjalnych miejsc poza docelowych dla ZFN z siedmioma lub mniejszą liczbą niedopasowań względem sekwencji zestawu pierwszego; zidentyfikowano tylko jedno możliwe miejsce poza docelowe, a PCR nie wykrył żadnych zdarzeń w tym miejscu u żadnego z zwierząt założycielskich.Obejrzyj ten film. Powinieneś uzyskać dobrą wiedzę na temat tego, jak wytwarzać króliki z nokautem genowym poprzez mikroiniekcję jądra za pomocą nukleazy ZFN.Po opanowaniu techniki, pobieranie zarodków, mikroiniekcja i transfer mogą zostać przeprowadzone w ciągu czterech godzin, jeśli proces przebiega prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że materiałem do iniekcji jest RNA, co wymaga zachowania szczególnej ostrożności. Po zakończeniu tej procedury zostanie przeprowadzone fenotypowanie, aby zrozumieć biologiczne zasady działania docelowych genów.

production-apolipoprotein-c-iii-knockout-rabbits-using-zinc-finger

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Produkcja królików z nokautowanym genem apolipoproteiny C-III za pomocą nukleaz z palcami cynkowymi

Usługa CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) umożliwia precyzyjną edycję genomu w dowolnym organizmie lub linii komórkowej w dowolnym locus zdefiniowanym przez użytkownika. Niniejszy artykuł opisuje proces projektowania, produkcji, walidacji i wdrażania usługi CompoZr Custom ZFN.

Edycja genomu przy użyciu niestandardowych nukleaz z palcami cynkowymi (ZFN) CompoZr

Designerskie nukleazy, takie jak nukleazy palców cynkowych (ZFN) i aktywatory transkrypcji podobne do efektorów (TALENs) mogą być używane do modyfikacji genomu mysich zarodków preimplantacyjnych poprzez aktywowanie zarówno szlaku niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), jak i homologicznej rekombinacji (HR). Postępy te umożliwiają szybkie generowanie myszy z precyzyjnymi modyfikacjami genetycznymi.

Inżynieria genomu myszy przy użyciu nukleaz projektanta

Opisujemy metodę generowania możliwego modelu wielotorbielowatości nerek dla danio pręgowanego. Użyliśmy ryb Tg(wt1b:GFP) do wizualizacji struktury nerek. Knockdown wnt5a nastąpił przez wstrzyknięcie morfolino. Powstawanie torbieli pronefrycznej po knockdownie wnt5a zaobserwowano u tego transgenicznego danio pręgowanego GFP.

Możliwy model wielotorbielowatości nerek u danio pręgowanego: knockdown wnt5a powoduje torbiele w nerkach danio pręgowanego

Prezentowany jest tutaj protokół do efektywnej edycji genów za pośrednictwem rybonukleoproteiny CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków za pomocą elektroporacji rurkowej.

CRISPR/Cas9 Precyzyjna edycja genów za pośrednictwem rybonukleoprotein za pomocą elektroporacji rurkowej

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę kriokonserwacji jednokomórkowych zarodków, a także protokół, który łączy użycie zamrożonych i rozmrożonych embrionów z elektroporacją w celu efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy.

Wykorzystanie zamrożonych i rozmrożonych zarodków do wysokowydajnej produkcji genetycznie zmodyfikowanych myszy

Do analizy lipoprotein osocza użyto kilku metod; jednak ultrawirowanie jest nadal jedną z najbardziej popularnych i niezawodnych metod. W tym miejscu opisujemy metodę izolowania lipoprotein z osocza za pomocą sekwencyjnego ultrawirowania o gęstości oraz jak analizować apolipoproteiny zarówno do celów diagnostycznych, jak i badawczych.

Izolacja i analiza lipoprotein osocza metodą ultrawirowania

Obecny protokół opisuje mikroiniekcję zygoty z CRISPR-Cas9 i DNA dawcy w celu efektywnej produkcji myszy z kasetą z genami i myszami z klapkami.

Mikroiniekcja zygoty do tworzenia alleli knock-in i flox kasety genów u myszy

Tutaj opisujemy prostą technikę przeznaczoną do efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy o nazwie CRISPR RNP Electroporation of Zygot (CRISPR-EZ). Metoda ta zapewnia edycję odczynników poprzez elektroporację do zarodków z wydajnością bliską 100%. Protokół ten jest skuteczny w przypadku mutacji punktowych, małych insercji genomowych i delecji w zarodkach ssaków.

Wydajna edycja genomu myszy za pomocą elektroporacji zygot CRISPR

W tym protokole opisujemy procedury techniczne do generowania myszy z nokautem specyficznym dla brązowej tkanki tłuszczowej (BAT), wykorzystując połączony system Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 i systemu jednoprowadnicowego RNA (sgRNA) związanego z adenowirusem (AAV). Opisane etapy obejmują projektowanie sgRNA, przygotowanie cząstek AAV-sgRNA oraz mikroiniekcję AAV do płatów BAT.

Generowanie myszy z nokautem specyficznych dla brązowego tłuszczu przy użyciu połączonego systemu Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 i jednoprzewodnikowego systemu RNA wirusa związanego z adenowirusem

W tym miejscu opisujemy protokół generowania matczynego mutanta, który łączy stabilną linię knock-in zpc: cas9 z dostarczaniem kaset ekspresyjnych sgRNA za pośrednictwem Tol2.

Generowanie matczynych mutantów przy użyciu zpc:cas9 Knock-in Danio pręgowanego

Efektywność metody Improved Genome Editing za pomocą dostarczania kwasów nukleinowych w jajowódku (I-GONAD) jest porównywalna z tradycyjną mikroiniekcją, która wymaga pobrania zygot od samic dawców i przekazania ich do kobiet pseudo-ciężarnych. Protokół ten wykazuje swoją skuteczność, wprowadzając mutacje indukowane przez CRISPR/Cas9 do locus ROSA26 na chromosomie 6.

Ulepszona edycja genomu za pomocą techniki dostarczania kwasów nukleinowych jajowódkowych oparta na elektroporacji in vivo dla generowania myszy knockout

Naucz się produkcji królików z nokautem apolipoproteiny C-III przy użyciu nukleaz palca cynkowego. Ta metoda umożliwia tworzenie modeli zwierzęcych do badań nad chorobami układu krążenia u ludzi.

Produkcja królików z nokautem apolipoproteiny C-III przy użyciu nukleaz palca cynkowego

Przeglądaj więcej filmów