Name: Identyfikacja interakcji białko-białko u dorosłych głów Drosophila za pomocą tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Poznaj metodę TAP do identyfikacji interakcji białko-białko w mózgach dorosłych muszek Drosophila. Technika ta umożliwia oczyszczanie kompleksów białkowych w warunkach fizjologicznych i analizę spektrometryczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy EUROSARF za przesłanie nam plazmidów ekspresyjnych TAP drożdży. Jesteśmy również wdzięczni za pomoc redakcyjną ze strony Ryana Labadensa. Praca ta została wsparta grantem NIH/NINDS (R01NS070962) dla C.W.

1. Generuj transgeniczne muchy oznaczone tagiem UAS-TAP
<ol>
	<li>Generuj konstrukty DNA oznaczone pUAST-TAP.
	<ol>
		<li>Zdecyduj, po której stronie (N- lub C-końcu) białka przynęty powinien być połączony znacznik TAP, w oparciu o strukturę/funkcję białka. Zobacz dyskusję, aby uzyskać więcej informacji.</li>
		<li>Subklonuj region kodujący cDNA genu będącego przedmiotem zainteresowania do wielu miejsc klonowania (MCS) wektorów pUAST-NTAP lub pUAST-CTAP w celu wygenerowania odpowiednio transgenów UAS-TAP znakowanych N- lub C-końcowymi. Na rysunku 1 przedstawiono szczegółowe mapy i użyteczne miejsca ograniczeń oraz ramki do odczytu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generuj transgeniczne muchy oznaczone tagiem UAS-TAP.
	<ol>
		<li>Generuj transgeniczne muchy zgodnie ze standardowymi protokołami przy użyciu insercji za pośrednictwem elementu P11. Na rynku dostępnych jest wiele usług iniekcji.</li>
		<li>Krzyżuj neuronalny sterownik GAL4 (tj. BG380-GAL4) z każdą pojedynczą linią transgeniczną i określ poziomy ekspresji białka każdej linii za pomocą western blot (z przeciwciałem przeciwko peroksydazie) i/lub barwienia immunologicznego (z przeciwciałem anty-TAP). Ogólnie rzecz biorąc, do zabiegów TAP zaleca się linię transgeniczną o poziomie ekspresji białka zbliżonym do białka endogennego. Zobacz dyskusję, aby uzyskać więcej informacji.</li>
		<li>Przeprowadzenie eksperymentów ratowniczych opartych na GAL4/UAS w celu potwierdzenia funkcjonalności transgenów znakowanych TAP, jeśli dostępne są mutanty genów będących przedmiotem zainteresowania z utratą funkcji. Wybierz transgen, który może w znacznym stopniu uratować zmutowane fenotypy w następujących eksperymentach TAP.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek do procedury TAP
<ol>
	<li>Wygeneruj stado much, które zawiera zarówno neuronalny sterownik GAL4 (np. BG380-Gal4), jak i wybrany transgen znakowany TAP, aby ułatwić ekspansję próbek much. Zbierz potomstwo F1 kierowcy GAL4 i krzyżówki UAS-transgen w rzadkich przypadkach, gdy powyższa kombinacja powoduje niekorzystną sytuację w zakresie przeżycia i wzrostu.</li>
	<li>Zbieraj próbki na małą skalę i optymalizuj warunki lizy w celu rozpuszczania białka znakowanego TAP.
	<ol>
		<li>Wykonaj serię do lizy, używając kombinacji niejonowych detergentów NP-40 (0,1-1%), NaDOC (0,1-1%) i Triton X-100 (0,05-0,5%). Więcej informacji można znaleźć w Tabeli 1 i dyskusji.</li>
		<li>Na wierzchu podkładki CO2 użyj kleszczy #5, aby wyciąć 20 dorosłych głów z muszek eksprymujących transgen TAP i zebrać je w probówce o pojemności 1,5 ml, aby przetestować każdy stan bufora do lizy.</li>
		<li>Dodaj 100 ul bufor do lizy testowej do probówki i homogenizuj głowy, głaszcząc w górę iw dół plastikowym tłuczkiem, a następnie dodaj kolejny bufor testowy 100 ul.</li>
		<li>Wirować lizat głowiasty o stężeniu 21 500 x g przez 10 minut (4 °C), a po odwirowaniu oddzielić supernatant od osadu. Dodaj odpowiednio 25 ul 2x bufor ładujący SDS do osadu i 10 ul 4x bufor ładujący SDS do 30 ul supernatantu.</li>
		<li>Gotuj dwie próbki przez 5 minut i analizuj je obok siebie za pomocą SDS-PAGE, a następnie Western Blot z przeciwciałem PAP. Określić rozpuszczalność na podstawie stosunku poziomów białka TAP w supernatancie w porównaniu z osadem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj próbkę w dużej skali
	<ol>
		<li>Rozwijaj się i zbieraj dorosłe muchy.
		<ol>
			<li>Rozwiń zapas transgenu neuronal-GAL4 / UAS-TAP w butelkach i przewracaj butelki co 3 dni, aż do zebrania łącznie 250 butelek.</li>
			<li>Zbierz 1-3 dniowe dorosłe muchy do stożkowych probówek o pojemności 50 ml, natychmiast umieść probówkę w ciekłym azocie, aby głęboko zamrozić muchy. Przechowuj muchy w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Należy pamiętać, że objętość much nie może przekraczać 2/3 probówki o pojemności 50 ml.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zbierz głowice muchowe (wykonaj ten krok na sproszkowanym suchym lodzie).
		<ol>
			<li>Z zamrażarki o temperaturze -80 °C wyjąć schłodzone sita oraz moździerz i tłuczek i ułożyć je na suchym lodzie, najlepiej w dużym wiaderku na lód. Ułóż dwa standardowe sita testowe w USA z nr 25 na górze i nr 40 na dole.</li>
			<li>Wyjmij zamrożone muchy i wrzuć je do ciekłego azotu i trzymaj je tam przez około 10 minut. Energicznie wiruj lub potrząsaj rurkami, aby odłamać głowy, nogi i skrzydła od ciał.</li>
			<li>Wlej mieszaninę na górne sito, a następnie energicznie potrząśnij sitami, trzymając oba sita razem. Po przesianiu ciała pozostaną na górnym sicie, głowy much zostaną zatrzymane na dolnym sicie, a nogi, skrzydła i inne zanieczyszczenia spadną na suchy lód. Oddziel dwa sita i ostrożnie przenieś głowice muchowe do zimnej zaprawy.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Homogenizacja głowic muchowych
		<ol>
			<li>Na wierzchu suchego lodu zmiel główki moździerzem i tłuczkiem na sproszkowane cząstki, a następnie przenieś proszek do 15 ml szklanego młynka do tkanek Dounce, który został wstępnie schłodzony na lodzie.</li>
			<li>Zmierz wagę młynka przed i po wlaniu do niego próbki głowicy, a następnie oblicz, ile waży próbka głowicy. W sumie 6-15 gramów głów much będzie wystarczające do każdego eksperymentu TAP, dostosowując się odpowiednio do poziomu ekspresji białka. Dodać 15 ml lodowatego buforu homogenizacyjnego (bufor do lizy zoptymalizowany w kroku 2.2) do proszku, a następnie uderzać tłuczkiem o dużym prześwicie, aż tłuczek będzie mógł łatwo poruszać się w górę i w dół. Utrzymuj szklany młynek na lodzie przez cały czas.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotowanie supernatantu do TAP
		<ol>
			<li>Przenieść homogenat do probówki wirówkowej o dużej prędkości i wirować przez 20 minut w temperaturze ~50 000 x g (4 °C). Przenieść supernatant do nowej probówki wirówki o dużej prędkości i powtórzyć wirowanie jeszcze raz.</li>
			<li>Przenieś supernatant do probówki ultrawirówkowej i wykonaj 40-minutowy wir ~250 000 x g, aby jeszcze bardziej oczyścić supernatant. Supernatant jest gotowy do procedur oczyszczania powinowactwa tandemowego po ultrawirowaniu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Oczyszczanie TAP
Następujące sekcje pochodzą z protokołu Séraphin lab TAP12 (http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf )
<ol>
	<li>Wykonaj oczyszczanie powinowactwa do kulek IgG
	<ol>
		<li>Przygotować kulkę sefarozy IgG podczas wirowania próbek. Przemyć 400 μl kulki IgG 3x w 15 ml probówce Falcon z 10 ml zimnego buforu do przemywania IgG. Przy każdym praniu delikatnie kołysz tubką przez 2 minuty, a następnie odwirowuj kulki o sprężystości 1 000 x g przez kolejne 2 minuty. Pod koniec trzeciego prania wyjmij bufor i pozostaw w tubie tylko koraliki.</li>
		<li>Ostrożnie przenieść oczyszczony supernatant (~15 ml) do 15 ml probówki zawierającej kulki IgG. Inkubować mieszaninę kulek i lizatu mózgowego w temperaturze 4 °C na nutatorze przez 2 godziny.</li>
		<li>Ustawić czystą i pustą mikrokolumnę o całkowitej objętości około 15 ml w chłodni. Załadować mieszaninę kulek IgG, równomiernie wlewając mieszaninę do kolumny; Staraj się nie uwięzić żadnych pęcherzyków powietrza wewnątrz kolumny. Pozwól, aby kulki osiadły w kolumnie, a bufor powoli spłynął przez przepływ grawitacyjny.</li>
		<li>Dokładnie przemyć kolumnę 10 ml zimnego buforu do przemywania IgG po tym, jak cały lizat mózgowy przepłynie przez osadzoną kolumnę IgG. Powtórz pranie 2x. Uwaga: nigdy nie pozwól, aby koralik wyschł na powietrzu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj dekolt TEV
	<ol>
		<li>Po trzecim płukaniu ponownie przemyć kolumnę 10 ml buforu do rozszczepiania TEV. Ten krok przygotowuje kulkę IgG, która sekwestruje kompleks przynęty do rozszczepienia TEV.</li>
		Tuż przed wypłynięciem <li>ostatniej kropli buforu TEV umieść nasadkę na dnie kolumny, aby zablokować przepływ, dodaj 1,3 ml buforu TEV zawierającego 130 jednostek enzymu TEV do kolumny, a następnie bezpiecznie zakryj górną część kolumny. Upewnij się, że kolumna jest dobrze uszczelniona na obu końcach.</li>
		<li>Obracać kolumnę w temperaturze 18 °C przez 2 godziny, aby umożliwić enzymowi TEV rozszczepienie peptydu w miejscu TEV i uwolnienie kompleksu białkowego, pozostawiając peptyd domeny białka A związany z kulkami sefarozy IgG.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj oczyszczanie powinowactwa kulek Calmodulin
	<ol>
		<li>Przygotuj kulki kalmoduliny, podczas gdy kulki IgG są inkubowane z enzymem TEV. Przemyj 200 μl kulek Calmodulin w 15 ml probówce Falcon 3x, za każdym razem z 10 ml zimnego buforu wiążącego Calmodulin. Przy każdym praniu delikatnie kołysz rurką przez 2 minuty na nutatorze, a następnie odwirowuj kulki o masie 1 000 x g przez 2 minuty. Pod koniec trzeciego prania wyjmij cały bufor i pozostaw tylko koraliki w tubce.</li>
		<li>Pod koniec inkubacji TEV (krok 3.2.3) należy umieścić kolumnę IgG z powrotem w chłodni i ustawić ją prosto do góry. Pozwól koralikom osiąść na 10 minut.</li>
		<li>Zdejmij górną nakrętkę, a następnie dolną nakrętkę, a następnie zbierz 1,3 ml produktu do rozszczepienia TEV w 15 ml tubce Falcon. Poczekaj, aż bufor całkowicie spłynie. Dodać dodatkowy bufor TEV o pojemności 200 μl do kolumny, aby wypchnąć martwą objętość kolumny, zebrać wypływ w tej samej probówce.</li>
		<li>Dodać 4,5 ml buforu wiążącego kalmodulinę i 4,5 μl 1 M CaCl2 do 1,5 ml produktu do rozszczepienia TEV zebranego powyżej. CaCl2 służy do miareczkowania EDTA w buforze TEV. Przenieść mieszaninę o objętości 6 ml do probówki zawierającej kulki kalmoduliny i obracać probówkę w temperaturze 4 °C na nutatorze przez 1 godzinę.</li>
		<li>Ustaw kolejną czystą i pustą mikrokolumnę o całkowitej objętości około 10 ml w komorze chłodniczej. Załaduj mieszaninę kulek Calmoduliny do kolumny i pozwól jej spłynąć grawitacyjnie.</li>
		<li>Gdy cały roztwór przepłynie przez osadzoną kolumnę kalmoduliny, przemyć kolumnę dwa razy, każdy 10 ml zimnego buforu wiążącego kalmodulinę. Uwaga: unikaj naruszania koralików Calmodulin i staraj się, aby powierzchnia koralików była jak najbardziej płaska podczas prania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eluować kompleks przynęty z kolumny kalmoduliny. 
	Zaraz po przemyciu wymyć kolumnę kalmoduliny pięcioma frakcjami 200 μl zimnego buforu elucyjnego kalmoduliny. Dla każdej frakcji delikatnie dodać 200 μl buforu elucyjnego do kolumny i zebrać eluat za pomocą oznaczonej probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml. Powtórz to 4 razy.</li>
	<li>Analiza kompleksu białkowego za pomocą SDS-PAGE
	<ol>
		<li>Weź małą porcję z każdej z pięciu frakcji (około 30 μl) i dodaj bufor ładujący SDS. Gotuj próbki przez 5 minut i załaduj je obok siebie markerami molekularnymi białka w gradientowym (4-15%) żelu SDS-PAGE.</li>
		<li>Po całkowitym rozpuszczeniu próbek w żelu należy przerwać elektroforezę i zabarwić żel dowolnymi, wrażliwymi koloidalnymi procedurami barwienia Coomassie na bazie G-250, takimi jak barwienie "niebieskim srebrem"13. Barwienie srebrem jest opcjonalne, ale nie jest preferowane, ponieważ nie jest w pełni kompatybilne z późniejszą analizą spektrometrii mas. Resztę eluatu należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C do dalszej analizy, takiej jak spektrometria mas w celu odkrycia tożsamości molekularnej oczyszczonego kompleksu białkowego. Zobacz dyskusję.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).</li>
<li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+comprehensive+atlas+of+the+physical+interactome+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6, 439-450 (1074).</li>
<li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+survey+reveals+modularity+of+the+yeast+cell+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery.</a> Nature. 440, 631-636 (2006).</li>
<li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440, 637-643 (2006).</li>
<li>Forler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+protein+complex+purification+method+for+functional+proteomics+in+higher+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes.</a> Nat. Biotechnol. 21, 89-92 (2003).</li>
<li>Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+protein+complexes+in+Drosophila+with+tandem+affinity+purification-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry.</a> Dev. Dyn. 232, 827-834 (2005).</li>
<li>Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+technology%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification technology: an overview.</a> Biotechnol. Lett. 33, 1487-1499 (2011).</li>
<li>Volkel, P., Le Faou, P., Angrand, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+proteomics%3A+characterization+of+protein+complexes+using+tandem+affinity+purification-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Interaction proteomics: characterization of protein complexes using tandem affinity purification-mass spectrometry.</a> Biochem. Soc. Trans. 38, 883-887 (2010).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+method%3A+an+efficient+system+for+protein+complex+purification+and+protein+interaction+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification.</a> Protein Expr. Purif. 72, 149-156 (2010).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Bachmann, A., Knust, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+P-element+transposons+to+generate+transgenic+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of P-element transposons to generate transgenic flies.</a> Methods Mol. Biol. 420, 61-77 (2008).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Candiano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+silver%3A+a+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Blue silver: a very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).</li>
<li>Tian, X., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ubiquitin-mediated+pathways+in+regulating+synaptic+development%2C+axonal+degeneration+and+regeneration%3A+insights+from+fly+and+worm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The role of ubiquitin-mediated pathways in regulating synaptic development, axonal degeneration and regeneration: insights from fly and worm.</a> J. Physiol. , (2013).</li>
<li>Wu, C., Wairkar, Y. P., Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highwire+function+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+spatial%2C+structural%2C+and+temporal+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Highwire function at the Drosophila neuromuscular junction: spatial, structural, and temporal requirements.</a> J. Neurosci. 25, 9557-9566 (2005).</li>
<li>Wu, C., Daniels, R. W., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DFsn+collaborates+with+Highwire+to+down-regulate+the+Wallenda%2FDLK+kinase+and+restrain+synaptic+terminal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">DFsn collaborates with Highwire to down-regulate the Wallenda/DLK kinase and restrain synaptic terminal growth.</a> Neural Dev. 2, 16(2007).</li>
<li>Tian, X., Li, J., Valakh, V., DiAntonio, A., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Rae1+controls+the+abundance+of+the+ubiquitin+ligase+Highwire+in+post-mitotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drosophila Rae1 controls the abundance of the ubiquitin ligase Highwire in post-mitotic neurons.</a> Nat. Neurosci. 14, 1267-1275 (2011).</li>
<li>Burckstummer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+tandem+affinity+purification+procedure+for+interaction+proteomics+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 3, 1013-1019 (2006).</li>
<li>Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+affinity+purification+in+Drosophila%3A+the+advantages+of+the+GS-TAP+system%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Tandem affinity purification in Drosophila: the advantages of the GS-TAP system.</a> Fly. 2, 229-235 (2008).</li>
<li>Bailey, D., Urena, L., Thorne, L., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+interacting+partners+using+tandem+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Identification of protein interacting partners using tandem affinity purification.</a> J. Vis. Exp. (60), e3643(2012).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+for+Angelman+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model for Angelman syndrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 12399-12404 (2008).</li>
<li>Liao, L., McClatchy, D. B., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+proteomics+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Shotgun proteomics in neuroscience.</a> Neuron. 63, 12-26 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP) oferuje protokół podwójnego oczyszczania, który umożliwia izolację i wzbogacanie kompleksów białkowych poprzez dwa niezależne etapy oczyszczania powinowactwa. Konstrukcja znacznika TAP nie jest ograniczona do tego, co jest przedstawione w tym protokole, inne domeny i motywy wiążące białka mają również zastosowanie, jeśli warunki buforowe zostaną odpowiednio dostosowane. Dobrym przykładem innych znaczników TAP jest znacznik GS-TAP, połączenie białka G i motywu wiążącego s...

Zdefiniowanie molekularnych ścieżek lub sieci, które pośredniczą w określonym procesie biologicznym, jest jednym z głównych celów badań biomedycznych. Genetycy muchy w dużym stopniu polegali na genetyce postępowej, zwłaszcza na genetycznych badaniach przesiewowych modyfikatorów (zarówno ekranów wzmacniających, jak i supresorowych), aby zidentyfikować czynniki, które działają razem, równolegle lub przed lub za genem będącym przedmiotem zainteresowania. Jednak badania przesiewowe genetyki często nie identyfikują podstawowych genów, które po mutacji powodują śmiertelność we wczesnych stadiach rozwoju, lub genów z funkcjonalną redundancją i kompensacją, których utrata funkcji powoduje tylko subtelne defekty, które są trudne do oceny. Jednym ze sposobów przezwyciężenia tej trudności jest badanie przesiewowe pod kątem bezpośrednich interakcji białko-białko. Od ponad dekady do badania interakcji białko-białko stosuje się rosnącą listę metod biochemicznych, w tym dwuhybrydowe drożdże, wyświetlanie fagów, chemiczne sieciowanie, Co-IP, tandemowe oczyszczanie powinowactwa (TAP) itp. Każde z tych podejść ma swój własny zestaw mocnych i słabych stron w odniesieniu do czułości i swoistości. Wśród nich metoda TAP pozwala na wykrycie interakcji fizycznej w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, zachowuje swoistość i spójność2 oraz umożliwia rozszerzenie na analizy o wysokiej przepustowości3,4.
Metoda TAP została pierwotnie opracowana na drożdżach przez kolegów z Rigautand1. W tej metodzie białko będące przedmiotem zainteresowania jest wyrażane za pomocą znacznika TAP. Znacznik TAP zawiera dwie niezależne domeny wiążące powinowactwo: domenę białka A, która wiąże się z IgG i domenę wiążącą kalmodulinę. Obie domeny są oddzielone miejscem rozszczepienia TEV (Tobacco Etch Virus). Taka kombinacja pozwala na dwie niezależne rundy oczyszczania powinowactwa w celu wystarczającej redukcji niespecyficznych wiązań i wzbogacenia specyficznych wiązań1. W tym przypadku metoda TAP jest bardzo skuteczną metodą identyfikacji interakcji in vivo danego białka, chociaż nadekspresja białka egzogennego może sprawić, że będzie ono bardziej podatne na kojarzenie się z białkami, które normalnie nie łączą się z jego endogennym odpowiednikiem. Od czasu jej opracowania, metoda TAP została zastosowana w wielu innych systemach, w tym w systemach opartych na kulturach komórkowych5,6 i innych systemach modelowych in vivo 6-9. Tutaj opisujemy adaptację metody TAP u Drosophila. Najpierw generujemy wektory pUAST-NTAP i pUAST-CTAP, aby ułatwić klonowanie i fuzję znacznika TAP z N- lub C-końcowym genem będącym przedmiotem zainteresowania. Transgen znakowany UAS-TAP ulega następnie ekspresji w układzie nerwowym pod kontrolą neuronalnego sterownika GAL410. Następnie zostanie zebrana duża liczba dorosłych głów much, które mają wysoką zawartość komórek nerwowych i są łatwe do oddzielenia od innych części ciała po zamrożeniu na podstawie różnic wielkości. Dorosłe głowy są homogenizowane i oczyszczane przez sekwencyjne wirowanie, a supernatant jest poddawany procedurze TAP opisanej poniżej.

<table><tbody><tr><td>Standardowe sito testowe USA nr 25</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-881-18</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe sito testowe USA nr 40</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-881-21</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Młynki do tkanek Kontes Dounce 15 ml</td><td>Kimble Chase</td><td>885300-0015</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki sefarozy IgG</td><td>Pharmacia</td><td>17-0969-01</td><td></td></tr><tr><td>Ekonomiczna kolumna 0,7 cm x 20 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>737-4721</td><td></td></tr><tr><td>Ekonomiczna kolumna 0,5 cm x 15 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>737-4716</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki kalmoduliny</td><td>Stratagene</td><td>214303</td><td></td></tr><tr><td>Coors Moździerz i tłuczek</td><td>CoorsTek</td><td>60311</td><td></td></tr><tr><td>AcTEV Proteaza</td><td>Invitrogen</td><td>12575-015</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanka inhibitorów proteazy</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja interakcji białko-białko u dorosłych głów drosophila za pomocą tandemowego oczyszczania powinowactwa (tap)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Badania genetyczne przeprowadzone przy użyciu muszki owocowej Drosophila melanogaster przyniosły wiele przełomowych odkryć w dziedzinie nauk biologicznych. Jednak dopiero niedawno zbadano możliwość wykorzystania biochemicznych badań przesiewowych mających na celu poszerzenie wiedzy uzyskanej z analizy genetycznej. Tutaj opisujemy metodę oczyszczania kompleksu białkowego, który wiąże się z dowolnym białkiem będącym przedmiotem zainteresowania dorosłych głów much. Metoda ta wykorzystuje system Drosophila GAL4/UAS do ekspresji białka przynęty połączonego ze znacznikiem Tandem Affinity Purification (TAP) w neuronach much in vivo, a następnie wdraża dwie rundy oczyszczania przy użyciu procedury TAP podobnej do pierwotnie ustalonej dla drożdży1 w celu oczyszczenia oddziałującego kompleksu białkowego. Pod koniec tej procedury otrzymuje się mieszaninę wielu kompleksów białkowych, których tożsamości molekularne można określić za pomocą spektrometrii mas. Walidacja białek kandydujących przyniesie korzyści dzięki zasobom i łatwości przeprowadzania badań nad utratą funkcji u muszek. Podobne podejścia można zastosować do innych tkanek much. Wierzymy, że połączenie manipulacji genetycznych i tego proteomicznego podejścia w systemie modelu muchy ma ogromny potencjał w rozwiązywaniu podstawowych problemów w dziedzinie neurobiologii i poza nią.

W niniejszej pracy prezentujemy nasze działania mające na celu identyfikację białek oddziałujących z Highwire w mózgu muchy. Highwire (Hiw) oraz jego homologi u kręgowców i bezkręgowców to ogromne ligazy ubikwitynowe, które regulują rozwój i naprawę układu nerwowego14. Posiadają one szereg wysoce konserwatywnych domen funkcjonalnych. Jednak ich działanie molekularne nie jest w pełni jasne. Badania prowadzone na nicieniach, muchach i myszach doprowadziły do obecnego modelu roboczego, według którego Hiw funkcjon...

Drosophila słynie z potężnej manipulacji genetycznej, ale nie z przydatności do dogłębnej analizy biochemicznej. W tym miejscu przedstawiamy procedurę opartą na TAP, która ma na celu identyfikację oddziałujących partnerów dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania w mózgu muchy. Procedura ta może potencjalnie prowadzić do powstania nowych kierunków badań.

Identyfikacja interakcji białko-białko u dorosłych głów Drosophila za pomocą tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Ogólnym celem tej procedury jest oczyszczanie białek oddziałujących in vivo z białkiem kodowanym przez wybrany gen w dorosłym mózgu muszki owocowej. Osiąga się to najpierw poprzez wytworzenie transgenicznych much wyrażających białko-przynętę z tagiem TAP oraz pobranie głów dorosłych osobników tych much. Drugim krokiem jest przygotowanie supernatantu z lizatu głowy muchy do procedury TAP, a następnie przeprowadzenie sekwencyjnego oczyszczania za pomocą immunoglobulin G, cięcia proteazą TEV oraz oczyszczania za pomocą kalmoduliny.Kolejne pięć frakcji elucji zebranym z końcowego etapu procedury uwalniania razem z całkowitym lizatem mózgu i kompleksem białkowym. Po trawieniu za pomocą proteazy TEV są one rozdzielane za pomocą elektroforezy SDS-PAGE i wizualizowane metodą barwienia srebrem. Ostatecznie druga elucja jest zazwyczaj poddawana spektrometrii mas w celu identyfikacji białek.Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod, takich jak eksperymenty TAL hybrid oraz core IP, jest fakt, że oddziaływania białko-białko wykrywane za pomocą tap zachodzą w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, co pomaga zachować specyficzność tych oddziaływań. Dwie rundy etapów oczyszcz

identifying-protein-protein-interaction-drosophila-adult-heads-tandem

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Identyfikacja interakcji białko-białko w Drosophila głowach dorosłych przy użyciu tandemowej czystości pokrewieństwa (TAP)

W niniejszej pracy opisujemy nową ilościową technikę proteomiczną służącą do identyfikacji kompleksów białkowych u Saccharomyces cerevisiae. W badaniu tym wykorzystaliśmy metodę SILAC wraz z oczyszczaniem powinowactwowym, a następnie tandemową spektrometrią mas, aby z wysoką specyficznością zidentyfikować partnerów wiążących białko ER, Scs2p.

Identyfikacja kompleksów białkowych z wykorzystaniem proteomiki ilościowej u S. cerevisiae

Tandemowa puryfikacja powinowactwa (TAP) jest skuteczną metodą identyfikacji białek wiążących. W ramach dowodu koncepcji metodologię tę zastosowano do dobrze scharakteryzowanego czynnika inicjacji translacji eIF4E w celu koprecypitacji czynników komórkowych gospodarza zaangażowanych w inicjację translacji. Metoda ta może być łatwo zaadaptowana do dowolnego białka komórkowego lub wirusowego.

Identyfikacja partnerów oddziaływań białkowych z wykorzystaniem tandemowej oczyszczania powinowactwa

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Ten film demonstruje tandemowe oczyszczanie powinowactwa — technikę oczyszczania kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych w celu zbadania interakcji białko-białko. Kompleks zawiera dwa białka znakowane różnymi znacznikami epitopów. Po oczyszczeniu kompleksu za pomocą dwóch żywic o powinowactwie do dwóch różnych znaczników w sposób sekwencyjny, obecność obu białek w elucie potwierdza oddziaływanie między nimi.

Tandemowy test oczyszczania powinowactwa do badania interakcji białko-białko

Ten film przedstawia wizualizację interakcji białko-białko w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila (NMJ) przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej (PLA). Po wyizolowaniu ścian ciała, oddziałujące białka są badane za pomocą przeciwciał pierwszorzędowych i przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z PLA. Bliskość oddziałujących białek ułatwia ligację sond z oligonukleotydami konektorowymi, tworzącymi koliste DNA, które jest następnie amplifikowane przez amplifikację toczącego się koła. Sondy...

Wykrywanie interakcji białko-białko u larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Wieloskładnikowe kompleksy białkowe odgrywają kluczową rolę podczas funkcjonowania i rozwoju komórek. W tym miejscu opisujemy metodę stosowaną do izolowania natywnych kompleksów białkowych z zarodków Drosophila po sieciowaniu in vivo, a następnie oczyszczeniu usieciowanych kompleksów w celu późniejszej analizy strukturalno-funkcjonalnej.<br...

Sieciowanie in vivo w celu wyizolowania kompleksów białkowych z zarodków Drosophila

Korzystając z mikromacierzy białkowych zawierających prawie cały proteom S. cerevisiae, sonduje się szybkie, bezstronne badanie tysięcy równoległych interakcji białko-białko. Metoda ta może być stosowana do małych cząsteczek białek, modyfikacji potranslacyjnych i innych testów o wysokiej przepustowości.

Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko

MyoD to miogenny czynnik transkrypcyjny o dużej zdolności do indukowania miogennego transdyferencjacji wielu w pełni zróżnicowanych linii komórkowych niezwiązanych z mięśniami. Mechanizmy epigenetyczne zaangażowane w tę transdyferencjację są w dużej mierze nieznane. Tutaj opisujemy metodę oczyszczania z podwójnym powinowactwem, a następnie spektrometrię mas, aby wyczerpująco scharakteryzować partnerów MyoD.

Identyfikacja interaktomii MyoD za pomocą tandemowego oczyszczania powinowactwa sprzężonego ze spektrometrią mas

Metoda Tandem Affinity Purification (TAP) była szeroko stosowana do izolowania natywnych kompleksów z ekstraktu komórkowego, głównie eukariotycznego, do proteomiki. W tym miejscu przedstawiamy protokół metody TAP zoptymalizowany pod kątem oczyszczania kompleksów natywnych do badań strukturalnych.

Oczyszczanie kompleksów natywnych do badań strukturalnych za pomocą metody tandemowego znacznika powinowactwa

Opisujemy tutaj nowatorską, solidną i efektywną metodę tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP) do ekspresji, izolacji i charakterystyki kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych. Protokół ten może być wykorzystany do biochemicznej charakterystyki dyskretnych kompleksów, a także do identyfikacji nowych interaktorów i modyfikacji potranslacyjnych, które regulują ich funkcję.

Tandemowe oczyszczanie kompleksów białkowych z komórek eukariotycznych

Celem tego protokołu jest zapewnienie prostego i taniego podejścia do zbierania zarodków Drosophila na średnią skalę (0,5-1 g) i przygotowywania ekstraktów białkowych, które mogą być używane w dalszych zastosowaniach proteomicznych, takich jak spektrometria mas z oczyszczaniem powinowactwa (AP-MS).

Przygotowanie na średnią skalę ekstraktów z zarodków Drosophila do eksperymentów proteomicznych

Poznaj metodę TAP do identyfikacji interakcji białko-białko w mózgach dorosłych muszek Drosophila. Technika ta umożliwia oczyszczanie kompleksów białkowych w warunkach fizjologicznych i analizę spektrometryczną.

Identyfikacja interakcji białko-białko u dorosłych głów Drosophila za pomocą tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP)

Przeglądaj więcej filmów