Nowy paradygmat uszkodzeń spowodowanych światłem do wykorzystania w badaniach nad regeneracją siatkówki u dorosłych danio pręgowanych
24 października 2013
Opisano wiele protokołów uszkodzeń światłem, które uszkadzają fotoreceptory i w konsekwencji wywołują reakcję regeneracji siatkówki u dorosłych ryb pręgowanych. Protokół ten opisuje ulepszoną metodę, która może być stosowana u zwierząt pigmentowanych i która uszkadza zdecydowaną większość fotoreceptorów pręcików i czopków w całej siatkówce.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest połączenie dwóch wcześniej opisanych protokołów indukcji degeneracji siatkówki za pomocą światła w celu uszkodzenia zarówno fotoreceptorów pręcikowych, jak i czopkowych w całej siatkówce. Jest to realizowane poprzez wstępną ekspozycję zaadaptowanych do ciemności dorosłych danio pręgowanych na światło UV przez 30 minut. W drugim kroku ryby poddane działaniu UV są niezwłocznie przenoszone do zbiorników otoczonych czterema lampami halogenowymi o mocy 250 watt i eksponowane na ciągłe światło przez okres do czterech dni.
Ostatnim krokiem jest eutanazja ryb oraz nukleacja oczu w celu przeprowadzenia dalszych analiz. W końcowym etapie wykorzystuje się mikroskopię immunofluorescencyjną, aby wykazać spójną utratę fotoreceptorów pręcikowych i czopkowych w całej siatkówce. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak naświetlanie światłem UV lub lampami halogenowymi, jest to, że połączenie tych dwóch metod prowadzi do ablacji zarówno pręcików, jak i czopków w całej siatkówce.
Uszkodzenie fotoreceptorów indukuje szeroką odpowiedź proliferacyjną, która ostatecznie prowadzi do regeneracji utraconych fotoreceptorów. Technikę tę zaprezentuje Jennifer Thomas, doktorantka w moim laboratorium. Na początek należy użyć odwróconej szklanej szalki Petriego o średnicy 15 centymetrów jako podstawki i przymocować ją taśmą do blatu laboratoryjnego w celu ekspozycji na światło UV.
Wyjmij włókno lampy UV z fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego. Następnie przymocuj włókno lampy UV taśmą nad odwróconą szalką Petriego, pozostawiając około dwóch milimetrów końca włókna wystających poza obrys szalki. Po tym czasie oklej połowę bocznych ścianek oraz tył zlewki szklanej o pojemności 250 mililitrów folią aluminiową, upewniając się, że błyszcząca strona folii jest skierowana do wnętrza zlewki.
Następnie należy napełnić zlewkę 100 mililitrami wody z systemu w hodowli ryb. Umieść tę zlewkę w zlewce o pojemności czterech litrów. Następnie dolej wody do zlewki czterolitrowej, aż poziom wody zrówna się z linią 100 mililitrów w zlewce o pojemności 250 mililitrów.
Wprowadzając maksymalnie 10 ryb poddanych działaniu ciemności do zlewki o pojemności 250 ml, przykryto zlewkę małym kawałkiem folii aluminiowej. Następnie cały zestaw ze zlewką umieszczono bezpośrednio obok włókna UV. Włókno powinno stykać się z zewnętrzną ścianką zlewki o pojemności 4 l i być skierowane w stronę odsłoniętej części zlewki o pojemności 250 ml.
Upewnij się, że zlewka o pojemności 250 ml znajduje się w centrum dna zlewki o pojemności czterech litrów. Następnie umieść duży nieprzezroczysty ekran za zlewką o pojemności czterech litrów, co umożliwi ekspozycję zwierząt, a jednocześnie uniemożliwi personelowi laboratoryjnemu widzenie końcówki włókna UV. Następnie włącz źródło zasilania UV.
Ustaw timer na 30 minut i umieść odpowiednie etykiety ostrzegawcze, aby upewnić się, że nieświadomy personel laboratoryjny nie wystawi się przypadkowo na promieniowanie UV. Po 30 minutach wyłącz źródło zasilania lampy UV. Następnie wyjmij zlewkę o pojemności 250 mililitrów z rybami.
W tej procedurze należy przenieść ryby z zlewki o pojemności 250 ml do przezroczystego akrylowego akwarium o pojemności 1,8 l. Następnie należy napełnić zbiornik do poziomu przelewu, aby przygotować obszar do naświetlania lampami halogenowymi. Dwie halogenowe lampy robocze o mocy 250 W należy ustawić w tym samym kierunku, w odległości 29 cm od zbiornika.
Następnie w podobny sposób ustaw pozostałe dwie lampy po przeciwnej stronie, zachowując odstęp około 73 centymetrów pomiędzy dwoma zestawami lamp. Po tym ustaw wentylator w równej odległości od obu zestawów lamp, tuż poza obszarem naświetlania. Następnie w centrum obszaru naświetlania, w równej odległości od obu zestawów lamp, umieść dwa zbiorniki o pojemności 1,8 litra wypełnione wodą.
Następnie w każdym zbiorniku należy umieścić napowietrzacz tlenu. Każdy zbiornik należy przykryć przezroczystymi akrylowymi pokrywami, pozostawiając dwucentymetrową szczelinę przy krawędzi najbliższej wentylatora. Wentylator należy ustawić tak, aby wydmuchiwał powietrze do tej szczeliny, a w jednym lub obu zbiornikach należy umieścić termometr.
Następnie włącz zasilanie oświetlenia, wentylatora i napowietrzaczy. Kontynuuj naświetlanie przez maksymalnie cztery dni. Ryb nie należy karmić podczas zabiegu świetlnego, ponieważ wpłynęłoby to na jakość wody i spowodowało większy stres u zwierząt.
Codziennie monitoruj temperaturę i poziom wody, utrzymując temperaturę w zakresie od 30 do 33 °C. W razie potrzeby dostosuj prędkość wentylatora oraz odległość między zbiornikami a lampami. Dodatkowo codziennie uzupełniaj wodę systemową w każdym zbiorniku.
48 godzin po rozpoczęciu naświetlania światłem halogenowym należy wyjąć ryby z obszaru traktowania. Następnie, przygotowując świeży fiksatyw na bazie formaliny w etanolu, należy uśmiercić danio pręgowane poprzez przedawkowanie anestetyku w postaci eutanazji za pomocą trietanolu. Po tym zabiegu uśmiercone ryby należy przenieść na ręcznik papierowy, a następnie przeprowadzić enukleację oka za pomocą zakrzywionej pęsety.
Przechowywać znukleowane oczy i utrwalacz przez noc w temperaturze 4 °C do krioterapii. Chronić oczy. Przemywać je w 5% sacharozie w 1x PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie należy zastąpić go świeżym roztworem 1x PBS z 5% sacharozą i inkubować oczy przez dwie godziny. Po dwóch godzinach oczy należy przemyć w roztworze 1x PBS z 30% sacharozą przez noc w temperaturze 4°C. Następnego dnia oczy należy przemyć w roztworze składającym się z medium do mrożenia tkanek i roztworu 1x PBS z 30% sacharozą w stosunku 1:1 przez noc w temperaturze 4°C.
Następnie oczy zatopić w 100% medium do zamrażania tkanek, orientując je wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej. Przechowywać je w temperaturze -80 °C przez co najmniej dwie godziny przed kriosekcjonowaniem tkanki. Następnie wykonać kriosekcje tkanki i umieścić preparaty na szkiełkach przedmiotowych.
Następnie ogrzewaj preparaty przez dwie godziny w temperaturze 55 °C. Po tym czasie przechowuj preparaty w temperaturze -80 °C lub niezwłocznie przeprowadź standardową immunohistochemię i wykonaj obrazowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Rysunek ten przedstawia zmiany w odpowiedzi proliferacyjnej po zastosowaniu różnych modeli uszkodzeń światłem.
Przedstawiono przekroje siatkówki dorosłego albinotycznego danio pręgowanego, znakowane immunochemicznie przeciwciałem PCNA w celu wykazania proliferacji komórek (oznaczonej kolorem czerwonym) w połowach grzbietowej i brzusznej siatkówki po różnych paradygmatach uszkodzeń światłem w czasie zero godzin. Proliferacja nie występowała w warstwie międzyjądrowej w 48 HLT. Pojedyncze komórki progenitorowe były obecne w INL w całej siatkówce grzbietowej oraz w niewielkiej części siatkówki brzusznej.
W 48 HPUV w części grzbietowej siatkówki obecne były kolumny komórek progenitorowych, podczas gdy w niewielkiej części siatkówki brzusznej występowały jedynie pojedyncze komórki progenitorowe. W punkcie UV plus 48 duże kolumny komórek progenitorowych były obecne w całej części grzbietowej i brzusznej siatkówki.
Rycina ta przedstawia utratę fotoreceptorów pręcikowych i czopkowych u pigmentowanych rybek danio pręgowanych po zastosowaniu różnych paradygmatów uszkadzania światłem. Przedstawiono przekroje siatkówki barwione Propidium Iodide (Pro3), aby uwidocznić jądra komórkowe na niebiesko, oraz znakowane immunohistochemicznie przeciwciałem zprR3, aby ukazać zewnętrzne odcinki pręcików na purpurowo, lub zprR1, aby ukazać czopki podwójne na złoto, po każdym z paradygmatów uszkadzania światłem. Znaczące spadki liczby jąder fotoreceptorów pręcikowych wystąpiły w grzbietowej części siatkówki w 48 HLT oraz w grzbietowej i brzusznej części siatkówki w UV plus 48 HLT.
Mimo że w grzbietowej części siatkówki w 48 HPUV stwierdzono przerost jąder, w 48 HLT lub 48 HPUV nie odnotowano istotnych spadków liczby jąder podwójnych czopków. Istotne spadki liczby jąder wystąpiły w grzbietowej i brzusznej części siatkówki w UB plus osiem H lt. Połączenie tej procedury z innymi metodami, takimi jak genowo specyficzne inhibitory farmakologiczne lub in vivo wyciszanie białek, może ujawnić rolę poszczególnych genów w degeneracji fotoreceptorów i następującej po niej odpowiedzi regeneracyjnej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje udoskonaloną metodę indukowania degeneracji siatkówki u dorosłych danio pręgowanych poprzez uszkadzanie fotoreceptorów czopkowych oraz pręcikowych. Technika ta łączy ekspozycję na światło UV z ciągłym naświetlaniem w celu uzyskania rozległej utraty fotoreceptorów w obrębie siatkówki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Regeneracja siatkówki
- Biologia fotoreceptorów
Wprowadzenie
- Fotoreceptory są kluczowe dla wzroku, a ich uszkodzenie może prowadzić do znacznego upośledzenia widzenia.
- Danio przeławny stanowi cenny model badania regeneracji siatkówki ze względu na swoje zdolności regeneracyjne.
- Istniejące metody indukcji uszkodzeń siatkówki wykazują ograniczenia pod względem skuteczności.
- Celem niniejszego badania jest udoskonalenie metod w celu lepszej ablacji fotoreceptorów.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego protokołu indukowania degeneracji siatkówki u rybek danio.
- Zapewnienie uszkodzenia zarówno fotoreceptorów pręcikowych, jak i czopkowych.
- Umożliwienie dalszej analizy mechanizmów regeneracji siatkówki.
Zastosowane Metody
- Zaadaptowane do ciemności dorosłe rybki danio są poddawane działaniu światła UV przez 30 minut.
- Następnie ryby przenosi się do zbiorników z lampami halogenowymi w celu ciągłej ekspozycji na światło przez okres do czterech dni.
- Po ekspozycji ryby są uśmiercane, a gałki oczne wyłuskiwane do dalszej analizy.
- W celu oceny utraty fotoreceptorów stosuje się mikroskopię immunofluorescencyjną.
Główne wyniki
- W całej siatkówce zaobserwowano jednorodną utratę zarówno fotoreceptorów pręcikowych, jak i czopkowych.
- Zastosowana metoda łączonej ekspozycji na światło okazała się skuteczniejsza od wcześniejszych protokołów.
- Technika ta umożliwia kompleksową analizę degeneracji i regeneracji siatkówki.
- Wyniki potwierdzają zasadność stosowania tej metody w przyszłych badaniach nad biologią siatkówki.
Wnioski
- Udoskonalony protokół skutecznie uszkadza oba typy fotoreceptorów.
- Metoda ta może być wykorzystywana w różnych badaniach dotyczących regeneracji siatkówki.
- Dalsze badania mogą opierać się na tych wynikach w celu eksploracji podejść terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół odnosi się do kluczowego problemu w badaniach nad regeneracją siatkówki, umożliwiając spójną ablację zarówno fotoreceptorów pręcikowych, jak i czopkowych u dorosłych ryb zebrafish, które stanowią model o wysokim znaczeniu translacyjnym dla chorób siatkówki u ludzi. Połączone zastosowanie światła UV i halogenowego zwiększa wiarygodność przewidywań w badaniach mechanistycznych poprzez zmniejszenie zmienności zakresu degeneracji, co pozwala na bardziej niezawodną walidację celów oraz analizę szlaków sygnałowych. Dzięki temu metoda ta stanowi skalowalne narzędzie ograniczające ryzyko na wczesnych etapach prac nad strategiami naprawy fotoreceptorów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez indukowanie rozległej i powtarzalnej utraty fotoreceptorów w celu badania mechanizmów regeneracji.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowany paradygmat degeneracji, który pozwala na spójną kwantyfikację odpowiedzi progenitorów w różnych eksperymentach.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa wiarygodność badań nad oddziaływaniem na cel terapeutyczny poprzez zapewnienie jednolitego uszkodzenia zarówno szlaków pręcików, jak i czopków.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie mierzalnego odczytu degeneracji i regeneracji, który jest zgodny z testami proliferacji i markerami fotoreceptorów opartymi na immunofluorescencji.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację testów dzięki zdefiniowanym parametrom ekspozycji na światło (30 min UV + do 4 dni halogen), które można zastosować w przypadku szczepów pigmentowanych i albinosów.
- Skalowalność: Eliminuje potrzebę stosowania transgenicznych linii albinosów, co umożliwia wykorzystanie metody w zróżnicowanych genetycznie tłach lub modelach chorób.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy indukcję degeneracji z mierzalnymi efektami regeneracji, co wspiera przedkliniczną ocenę związków pro-regeneracyjnych.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia łączenie z inhibitorami specyficznymi dla genów lub metodami wyciszania genów w celu przeanalizowania roli poszczególnych genów w procesach degeneracji i naprawy.
- Pewność prognostyczna: Umożliwia analizę proliferacji progenitorów oraz reformowania się fotoreceptorów w zależności od dawki i czasu, co służy optymalizacji wiodących kandydatów na leki.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania leków, służąc jako standaryzowany model uszkodzenia do inicjowania badań nad regeneracją przed rozpoczęciem screeningu związków lub prób walidacji celu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków degeneracji fotoreceptorów oraz aktywacji progenitorów pośredniczonej przez glej.
- Przesiew: Generuje mierzalne wyniki (np. liczbę progenitorów PCNA+, utratę markerów fotoreceptorów) w celu oceny działania związków.
- Analityka: Umożliwia porównanie zakresu degeneracji i kinetyki regeneracji w różnych warunkach za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez modelowanie procesów utraty i naprawy fotoreceptorów istotnych dla ludzi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do badania degeneracji, którą można zastosować w wielu projektach ukierunkowanych na naprawę siatkówki.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez zapewnienie spójnej ablacji wszystkich fotoreceptorów.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzacji ekspozycji na światło oraz kontroli warunków środowiskowych (temperatura, jakość wody, karmienie).
- Wartość strategiczna: Zwiększa niezawodność decyzji typu go/no-go poprzez minimalizację szumu biologicznego w odczytach regeneracji.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o skuteczność regeneracji w zwalidowanym systemie istotnym dla danej choroby.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w hodowli rybek danio (*zebrafish*), protokołach bezpieczeństwa przy pracy ze światłem oraz przetwarzaniu tkanek do kriosekcjonowania.
- Wymagane jest źródło światła UV, lampy halogenowe, zbiorniki z kontrolą temperatury oraz infrastruktura do mikroskopii immunofluorescencyjnej.
- Konieczna jest standaryzacja adaptacji do ciemności, czasu ekspozycji na światło oraz monitorowania środowiska we wszystkich zespołach.
- Przy adaptacji do innych modeli należy uwzględnić specyficzną dla gatunku wrażliwość na światło.
- Metoda jest ograniczona koniecznością adaptacji do ciemności i specjalistycznej konfiguracji sprzętu, choć wspierana jest przez szczegółowe wytyczne proceduralne.
